中国组织工程研究杂志
Chinese Journal of Tissue Engineering Research 중국조직공정구여림상강복
- 主管单位： 中华人民共和国卫生部
- 主办单位： 中国康复医学会,《中国组织工程研究与临床康复》杂志社
- 影响因子： 1.38
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 2095-4344
- 国内刊号： 21-1581/R
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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细胞移植治疗帕金森病的相关因素
目的:用于治疗帕金森病的胚胎或干细胞移植方法尚未有标准化操作模式,分析与临床预后有关的因素为该方法的标准化提供预期依据.资料来源:应用计算机检索Medline 1998-01/2005-01与帕金森病及移植治疗相关的文献,检索词为"Parkinson's disease,cell transplantation",并限定文献语言种类English.同时,计算机检索CHKD 2002-01/2005-01相关文献,检索词为"帕金森氏病,移植",并限定语言种类为中文.资料选择:对资料进行初审,选取包括帕金森病及组织移植的文献,开始查找全文.纳入标准:①与帕金森病相关.②与移植治疗相关.排除标准:重复研究、综述、Meta分析.资料提炼:共收集到37篇符合标准的文献.37篇文献包括临床实验22例,随机对照实验8例,其中动物6例,临床实验2例.纳入13篇,分别对其所用实验方法及临床预后进行讨论分析.资料综合:组织移植治疗帕金森病的方法多样,包括干细胞移植,胚胎组织移植等.而治疗效果也因所取标本位置及具体处理方法不同而有一定的差异.研究者通过结合取材、标本处理、移植部位、移植方式等多种方法和技术细节的探讨,试图分析移植结果与具体操作细节之间的关系.结论:细胞移植是帕金森病治疗的有效方法之一,但方法的标准化将使治疗预后更加安全有效.
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雌激素影响肌力与骨量间的关系
目的:在研究原发性骨质疏松的发生及防治时,肌力与骨量的关系的影响因素值得关注.本文拟探讨雌激素作为非力学因素影响肌力与骨量之间关系的机制.方法:通过计算机检索肌力与骨量的关系,雌激素对肌力与骨量之间关系的影响的相关文献,结合作者以往的研究工作,论述雌激素对肌力与骨量间关系的影响.结果:肌力决定骨结构和骨量,使骨强度适应运动负荷.雌激素主要通过影响骨应变阈值来调整肌力与骨量之间的关系.雌激素疗法有益于骨组织,部分通过保护肌力实现.结论:雌激素能够影响肌力与骨量的关系,雌激素疗法可能有保护肌力的作用.
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改进Tripure法提取鉴定小鼠组织总RNA
目的改进从新鲜动物组织提取、鉴定纯度及完整性较高总RNA的技术方法.方法实验于2005-05-16/08-25在解放军第三军医大学大坪医院创伤分子生物学实验室进行.用健康4～6周龄昆明种小鼠70只,颈椎脱臼法处死,取肺组织约100 mg.在Tripure Isolation试剂说明书基础上,对提取组织RNA的操作步骤进行调整改进,包括:①迅速组织取材,可不将组织切割成碎块而直接中速匀浆.②匀浆头夹层每次使用前后一定要彻底清洗干净;新鲜组织使用5 mL离心管匀浆.③吸取含RNA的三相分层上清液时,吸取250μL即可.④RNA沉淀后,用无水乙醇再洗1次.并对常规琼脂糖凝胶电泳做适当改进用于鉴定RNA的质量,改进的电泳方法:①电泳RNA所用器械均用肥皂水、体积分数为0.03的H2O2清洗2遍,1g/L焦碳酸二乙酯处理的灭菌双蒸水冲洗,室温晾干备用.②用新配的0.5×TBE配制10g/L琼脂糖凝胶,倒胶时Goldview核酸染料直接加入凝胶中.③琼脂糖凝胶板放入电泳槽后再加入经灭菌的0.5×TBE.电泳电压5 V/cm,电泳时间1.5 h后凝胶成像系统拍照记录.结果①取提取的总RNA 5 μg进行电泳1.5 h后,可见28S,18S,5S 3条清晰的RNA条带,其中28S条带的亮度约为18S条带的2倍,5S条带隐约可见.②用该法提取的新鲜组织RNA,经电泳鉴定及反转录-聚合酶链反应检测,显示RNA的纯度及模板性较好.全部操作过程可在2.5 h内完成.结论用改进方法提取的新鲜组织RNA质量稳定,电泳鉴定快速可靠.
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应用颞颌关节骨性标志测量确定咬颌重建的颌位关系
目的利用颞颌关节骨性关系测量对需要进行咬颌重建的患者确定颌位关系.方法选取2003-09/2006-02沈阳市和平区坚果口腔诊所收治的48例咬颌重建患者,分别拍摄原有咬颌状态、垂直距离升高1,2,3 mm颞颌关节X线片并进行描记,通过描记出的关节间隙前、后腔面积的比值,选择比值接近1.0即髁状突位于关节凹中央状态下的颌位关系为终的颌位关系.按确定的终颌位关系常规制作暂时义齿.试戴1周后若无任何不适感觉再进行永久性修复.结果 48例患者中,40例原咬颌关系状态下髁状突位于关节凹后位,其中18例升高1 mm后髁状突居中,15例升高2 mm后髁状突居中,9例升高3 mm后髁状突居中.另外8例患者原咬颌关系状态下髁状突位于关节凹中央,其中3例升高1 mm后仍然为居中关系,5例升高1 mm后髁状突位于关节凹前位.结论应用颞颌关节骨性关系测量为需要咬颌重建的患者确定颌位关系的方法客观而准确.
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构建含人血管内皮细胞生长因子121腺病毒表达载体的体外表达实验
目的:构建携带人血管内皮细胞生长因子121 cDNA的腺病毒表达载体,探讨应用血管内皮细胞生长因子基因治疗缺血性疾患的可行性.方法:实验于2003-05/2004-02于解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所第6研究室(创伤烧伤复合伤国家重点实验室)完成.穿梭质粒pDC315和Ad5腺病毒基因组质粒pBHGloxdeltaE1,3Cre由解放军第三军医大学免疫学教研室邹强博士惠赠.pUC18-血管内皮细胞生长因子由第三军医大学高原医学教研室惠赠.BamHⅠ,XbaⅠ,NcoⅠ DNA限制性内切酶均购自Takara公司;鼠抗人血管内皮细胞生长因子121单克隆抗体购自ROCHE公司;用双酶切法将pUC18-人血管内皮细胞生长因子121质粒中的人血管内皮细胞生长因子121 cDNA克隆到穿梭质粒pDC315中,与腺病毒质粒pBHGloxdeltaE1,3Cre共同转染293细胞并反复扩增,构建携带目的基因的重组腺病毒,并进行滴度测定.用重组腺病毒感染NTH3T3细胞,用免疫组化方法检测人血管内皮细胞生长因子121在NTH3T3细胞中的表达.结果:①重组质粒pDC315-人血管内皮细胞生长因子121的鉴定:重组质粒经XbaⅠ和NcoⅠ酶切后,得到酶切片段长度为651 bp的正向连接重组质粒.测序结果也证实作者重组质粒pDC315-人血管内皮细胞生长因子121序列正确.②Ad-血管内皮细胞生长因子重组腺病毒构建及滴度测定:pDC315-人血管内皮细胞生长因子121重组质粒和pBHGloxdeltaE1,3Cre质粒共转染293细胞后7 d,部分293细胞出现CPE,10 d后出现CPE的细胞明显增多,约2周时绝大多数细胞出现CPE,而对照组未转染质粒的细胞未见CPE现象.终重组腺病毒Ad-人血管内皮细胞生长因子121滴度为1.0×1010～4.3×1011PFU/mL.③血管内皮细胞生长因子基因在NIH3T3细胞中的表达:重组腺病毒转染NIH3T3细胞48 h后行细胞免疫组织化学染色,结果显示细胞人血管内皮细胞生长因子121染色阳性,阳性染色主要位于细胞浆中,而未转染病毒的细胞染色极弱.结论:构建的携带人血管内皮细胞生长因子121基因的腺病毒表达载体可在真核细胞表达,有可能用于缺血性疾患的基因治疗.
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鸡肌腱的玻璃化冷冻保存
目的:筛选出适合于肌腱玻璃化冷冻保存的溶液及保存程序,并通过细胞培养来进一步检测玻璃化肌腱的活性.方法:实验于2003-11/2005-02在解放军总医院骨科研究所完成.实验包括①筛选与检测:取来亨鸡30只,切取屈趾深肌腱,按随机数字法分为2组,新鲜鸡肌腱组,玻璃化组.运用正交设计和肌腱活性快速检测技术,筛选出适合鸡屈趾肌腱玻璃化保存程序,再从6种玻璃化溶液中(二甲基亚砜+乙酰胺+丙二醇+聚乙二醇;乙二醇+二甲基亚砜+蔗糖;乙二醇+二甲基亚砜+丁二醇;丙二醇+二甲基亚砜+蔗糖;二甲基亚砜+乙酰胺+丙二醇;二甲基亚砜+丙二醇)筛选出适于肌腱玻璃化保存的配比方案.②细胞培养:将玻璃化法保存鸡屈趾深肌腱进行细胞培养,观察培养后细胞的存活情况,以了解玻璃化法保存肌腱的细胞活性.结果:①通过统计学分析,肌腱玻璃化保存的佳程序为平衡处理选择4℃3个浓度梯度、平衡时间选择4℃30 min、洗脱处理选择4℃3个浓度梯度、洗脱时间选择4℃20 min.玻璃化溶液二甲基亚砜+丙二醇为的佳配比方案.②应用酶消法测得新鲜肌腱活性为89.26%,玻璃化法优化组合所保存肌腱的活性为78.49%.③将玻璃化组肌腱进行细胞培养,细胞第8天自组织块周边长出,第21天后传代,培养3代后出现明显的退化现象,玻璃化组肌腱细胞的生物学特性与新鲜肌腱组相似.④将两组肌腱所培养的细胞分别进行免疫组织化学染色,经鉴定均为肌腱细胞.结论:玻璃化法冷冻保存的肌腱具有良好的细胞活性,经细胞培养获得成功,其生物学特性无明显变异.
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灵长类细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ基因的进化分析
目的:利用玻璃粉吸附法扩增人静脉血中的线粒体氧化酶亚基Ⅱ基因片段,对灵长类氧化酶亚基Ⅱ基因进行分子系统学分析.方法:实验于2003-03/2004-10在南方医科大学解剖教研室完成.①玻璃粉吸附法扩增人静脉血中的线粒体氧化酶亚基Ⅱ基因片段.②通过Genbank数据库,采用"Blast"的方法进行相似性数据搜寻,选择合适的16种灵长类生物氧化酶亚基Ⅱ基因的686碱基序列片段;采用PAUP4.0 DNA序列分析软件进行分析.结果:①利用玻璃粉吸附法成功扩增出了人的氧化酶亚基Ⅱ全基因片段,并对扩增片段进行了序列分析.②根据序列测定结果,结合生物信息学技术研究16种灵长类动物之间的分子进化关系,建立了新的分子进化树,其中一致性指数为0.560 8,相似性指数为0.439 2.结论:线粒体氧化酶亚基Ⅱ基因片段可以作为进化分析的分子指标.
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人血小板源性生长因子B基因的体外扩增以及克隆和鉴定
目的:自行构建人血小板源性生长因子B(PDGF-B)真核表达载体,为人血小板源性生长因子B基因转染真核细胞的实验研究及基因治疗奠定基础.方法:实验于2002-01/2005-01在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成.①根据Genbank的人血小板源性生长因子B的全长基因序列,设计合成一对附加BamHⅠ,XhoⅠ两个限制性内切酶酶切位点的特异性引物.②采用反转录聚合酶链反应从人胎盘mRNA中扩增出人血小板源性生长因子B基因片段,将其插入真核表达载体PcDNA4构建成重组真核表达载体PcDNA4/PDGF-B.③经测序鉴定后,再用双酶切和聚合酶链反应对插入片段进行分析和验证.结果:反转录-聚合酶链反应产物经琼脂糖电泳结果显示在预期位置有相对分子质量为725 bp的特异性扩增带.②序列分析、双酶切和聚合酶链反应结果证实插入片段序列正确.结论:成功扩增出完整的人血小板源性生长因子B基因,构建了基因重组真核表达载体PcDNA4/PDGF-B.为人及动物细胞的转基因研究,在基因水平改变其遗传性状打下基础.
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应用生物发光法监测CD4+细胞三磷酸腺苷水平评估肝移植术后患者的免疫功能
目的:评估三磷酸腺苷生物发光法检测肝移植受者早期CD4+细胞免疫功能的变化.方法:选择2004-06/10在解放军第二军医大学长征医院器官移植研究所进行的30例肝移植受者手术前后(0,1,2,4周)和50例健康志愿者.采用三磷酸腺苷生物发光法通过植物凝血素刺激后CD4+细胞三磷酸腺苷量的变化来监测细胞的免疫功能.①三磷酸腺苷标准品的检测:用培养基将三磷酸腺苷标准品配制成系列浓度:1,10,1×102,1×103和1×104μg/L,加入等量的Celltiter-Gl0TM荧光试剂混匀,取200μL进行测定,取对数制作标准曲线.②样本三磷酸腺苷检测:采集两组人员全血样本(肝素抗凝),置于细胞培养板过夜,加入含有洗涤过的抗人CD4单抗免疫磁粒悬浮液,用磁珠强效分离磁架将CD4+细胞吸于培养孔的一侧,用磷酸盐缓冲液洗3～5次,加入培养基(+体积分数为0.1的胎牛血清),加入Celltiter-Gl0TM试剂,1 h内用荧光仪(发射波长562 nm)读取荧光发光信号,计算其平均数值.③外周血T淋巴细胞亚群检测:肝素钠抗凝血加相应的抗体,放于Q-prep,workstation上处理后上机,计算出阳性细胞的百分率;或标记后的标本同样处理后,加混匀的Flow-Count标准荧光小球到标本管2 h内上机,计算出CD4+细胞的绝对计数.④检测他克莫司血药浓度.结果:①在三磷酸腺苷浓度为1×(100～104)μg/L之间时,三磷酸腺苷标准品与荧光发光信号呈线性关系.直线方程为Y=0.75X+2.37(r=.994 84).②移植组患者三磷酸腺苷明显低于健康人群[(350±191),(735±370)μgL,P＜0.05],术后1周显著下降为(161±107)μg/L,而后逐渐提高.表明肝移植受者的细胞免疫功能术后第1周明显下降,以后逐渐恢复,第4周仍低于术前水平.③反应细胞免疫功能的三磷酸腺苷量与免疫抑制剂他克莫司血药浓度缺乏直接的相关性(r2=0.02).结论:三磷酸腺苷生物发光法有利于正确评估肝移植后患者的细胞免疫功能.
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前列腺素E1对腹主动脉球囊损伤大鼠血管内膜、中膜增生及血浆相关因子水平的影响
目的:观察前列腺素E1对腹主动脉球囊损伤大鼠血管内膜、中膜增生及对血浆内皮素、血小板颗粒膜蛋白和D-二聚体的干预作用,并了解其作用是否有剂量依赖性.方法:实验于2003-03/2004-04在郑州大学医学院药理学教研室心血管实验室进行.①取雄性Wistar大鼠160只随机分为假手组、模型组、前列腺素E18,24,72 μg/kg组5组,每组32只;每组又分术后6,24 h、10,21 d共4个时间点,每个时间点8只.②前列腺素E1 8,24,72 μg/kg组大鼠连续5 d经尾静脉给予前列腺素E18,24,72μg/kg,其他两组给予等容积生理盐水.③后一次给药24 h后进行大鼠腹主动脉球囊损伤手术,假手术组仅作左颈总动脉结扎.④各组动物于术后6 h取血,测定血浆中血小板颗粒膜蛋白、D-二聚体水平;于术后6,24 h、10,21 d各时间点心脏取血测定血浆中内皮素水平;并在以上4个时间点取出腹主动脉下段,进行病理分析.结果:160只大鼠进入结果分析.①球囊损伤术后可使血管内皮剥脱,内弹力板断裂,模型组术后21 d可见受损血管内膜、中膜明显增厚,狭窄形成.前列腺素E1 3个剂量组内膜及中膜增生程度均较模型组有不同程度的减轻,前列腺素E1 24,72μg/kg组与模型组比较差异显著(P＜0.01).②血浆内皮素:模型组术后6,24 h显著高于假手术组(P＜0.01),前列腺素E1 24,72μg/kg组术后6,24 h,10 d显著低于模型组(P＜0.01,0.05),前列腺素E1 8μg/kg组仅在术后24 h,10 d显著低于模型组(P＜0.01,0.05).③模型组术后6 h血浆血小板颗粒膜蛋白和D-二聚体水平显著高于假手术组(P＜0.01),前列腺素E1各组均低于模型组(P＜0.01).结论:前列腺素E1对球囊损伤术后腹主动脉血管内膜、中膜增生有干预作用,其作用与降低血浆内皮素水平、血小板颗粒膜蛋白和D-二聚体水平有关,且与用药剂量有关.
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聚羟基丁酸酯-聚羟基己酸酯共聚物/氧化异丙烯F-127复合支架构建人组织工程软骨
目的:探讨聚羟基丁酸酯-聚羟基己酸酯共聚物/氧化异丙烯F-127复合支架作为软骨组织工程支架的可行性.方法:实验于2004-09/2005-04在中国医科大学整形外科医院外耳整形与再造中心完成.①选取4周龄无胸腺雄性裸鼠8只,左侧背部皮下为软骨细胞-支架复合物组,右侧背部皮下为单纯支架对照组.人软骨细胞来源于中国医科大学整形外科医院外耳整形与再造中心临床小耳畸形患者行肋软骨移植时剩余的边脚料分离软骨细胞.聚羟基丁酸酯-聚羟基己酸酯共聚物泡沫材料由清华大学化工系提供,1.0 cm×1.0cm×0.3 cm大小,环氧乙烷消毒后备用.②消化、分离、培养人肋软骨细胞,将第3代细胞制成悬液,细胞浓度为5×1010L-1.取1 mL软骨细胞悬液与少量30%氧化异丙烯F-127溶液(4℃)均匀混合后接种至聚羟基丁酸酯-聚羟基己酸酯共聚物支架上,形成细胞-生物材料复合物,体外培养1周后植入软骨细胞-支架复合物组,单纯支架对照组植入单纯聚羟基丁酸酯-聚羟基己酸酯共聚物/氧化异丙烯F-127复合支架.③术后12周取材,行大体观察.利用苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色、阿尔辛蓝-丽春红染色对再生的软骨组织进行组织学检测.结果:实验选取4周龄无胸腺雄性裸鼠8只,全部进入结果分析.①术后12周大体标本观察结果:软骨细胞-支架复合物组形成了与支架形态相同的乳白色类似软骨样组织,表面光滑有弹性.单纯支架对照组呈褐色,质地较软.②再生的软骨组织术后12周组织学检查结果:组织学检查证实软骨细胞-支架复合物组有软骨细胞存在,并且有基质分泌.单纯支架对照组无新生软骨组织形成.结论:利用聚羟基丁酸酯-聚羟基己酸酯共聚物/氧化异丙烯F-127复合支架可在裸鼠体内形成人组织工程化软骨.
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胶原/羟基磷灰石复合支架负载软骨细胞构建组织工程软骨
背景:新型复合软骨组织工程支架克服了传统支架的诸多不足,如组织相容性差、生物力学性能不足、降解过快、材料单一、难与关节软骨的分层结构相匹配等,为软骨组织工程的发展提供新的途径.目的:观察具有柱状分层结构的胶原/羟基磷灰石复合支架对软骨细胞的吸附作用,以及对软骨细胞生物学性状的影响,评价其作为软骨组织工程支架的可行性与价值.设计:开放性实验.单位:中山大学附属第三医院骨科,华南理工大学材料学院.材料:实验于2004-06/11在中山大学附属第三医院动物实验中心完成.选取2周龄普通级健康新西兰白兔1只,雄性,饲养环境温度20℃,湿度40%.方法:①在羟基磷灰石中加入少量的去离子水,分散后加入Ⅰ型胶原溶液搅拌复合,并按一定比例加入碳二亚氨,调配形成不同比例的胶原/羟基磷灰石复合物,并逐层加入模具,上层采用纯胶原,底层为纯羟基磷灰石.将制备好的柱状分层的胶原/羟基磷灰石复合材料冷冻干燥后,经环氧乙烷气体消毒后备用.②体外培养幼兔关节软骨细胞并扩增,吸附于多孔胶原/羟基磷灰石复合支架上三维立体培养,通过相差倒置显微镜、组织学、扫描电镜及免疫组织化学检测支架对软骨细胞的表型、增殖及功能的影响.主要观察指标:①胶原/羟基磷灰石多孔支架的形貌观察.②体外培养的软骨细胞生物学性状观察.③胶原/羟基磷灰石多孔支架材料与软骨细胞相容性的观察.结果:①胶原/羟基磷灰石多孔支架的形貌观察:胶原/羟基磷灰石为具有一定力学强度的柱状分层的三维多孔支架,上层为纯胶原,底层为纯羟基磷灰石,中间为胶原与羟基磷灰石复合.扫描电镜可见支架内具有不规则的通孔结构,孔径较均匀,相互连通,平均孔径约为147μm.②体外培养的软骨细胞生物学性状观察:刚分离的软骨细胞为球形,活细胞率达95%.24 h后细胞开始贴壁,逐渐伸展为三角或多角形,内含分泌颗粒.细胞保持单层生长,传代后增殖速度加快,4 d铺满培养瓶.随着传代次数的增加,增殖速度开始减慢,当传到第6代时,细胞分裂能力明显下降,细胞变形明显,体积变大,梭形为主,边沿模糊,折光性弱,表现出细胞老化和向成纤维细胞反分化的趋势.③胶原/羟基磷灰石多孔支架材料与软骨细胞相容性的观察:多孔胶原/羟基磷灰石复合支架亲水性好,软骨细胞吸附于支架表面,增殖并逐渐顺孔隙迁徙至支架内部,在孔壁贴附良好,表型维持稳定,分泌胞外基质.结论:柱状分层结构的胶原/羟基磷灰石复合支架具有良好的细胞相容性,较单纯胶原力学性能更强,是比较理想的软骨组织工程支架材料.
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布比卡因聚乳酸微球在家兔体内的缓释效应
背景:布比卡因广泛应用于治疗及缓解因手术、炎症、肿瘤等引起的急、慢性疼痛,其镇痛作用时间不能满足临床对药物缓慢释放延长镇痛时间的要求.目的:采用高效液相色谱法和仿豚鼠皮丘法,检测以高分子聚合物--聚乳酸为载体制成的布比卡因聚乳酸微球在家兔体内所具有的缓释效应.设计:完全随机对照动物实验.单位:解放军第二军医大学药学院.材料:新西兰兔16只,体质量(2.58±0.17)kg.干预:实验于2002-09/11在解放军第二军医大学药学院药剂教研室完成.①采用仿豚鼠皮丘法建立动物模型.①新西兰兔16只,随机分为两组,每组8只.注射组皮下注射布比卡因注射液5 mg/kg;微球组皮下植入布比卡因微球5 mg/kg.注射组兔于射液后5,10,20,30,45 min,1,2,3,4,6,8,12,24 h及微球组兔于给药后0.5,1,2,3,4,5,6,8,12,24,36,48和60 h耳缘静脉采血1.5 mL进行指标测定.③高效液相色谱法测定血浆中布比卡因浓度及进行药物缓释作用测定.主要观察指标:血浆中布比卡因浓度的变化和局麻药作用直径.结果:16只兔进入结果分析.①血药浓度变化结果:注射组血药浓度迅速达到峰值,且浓度较高,为2.466 4 mg/L,随后浓度快速下降.微球组血药浓度相对较平稳,达峰较晚,峰浓度=0.778 1 mg/L,且血药浓度一直维持较低水平,平均滞留时间明显延长(P＜0.05).②药效缓释作用结果:发现布比卡因微球组的镇痛作用时间较布比卡因注射液组明显延长(P＜0.05).结论:布比卡因微球制剂在家兔体内具有缓慢释放镇痛效应的作用.
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抑癌基因p53与p16及PCNA蛋白在皮肤增生期血管瘤中的表达及其对血管内皮细胞的干预
目的:应用免疫组化法检测抑癌基因p16,p53及DNA聚合酶δ的辅助蛋白PCNA在增生期血管瘤中的表达,及其对血管内皮细胞的影响.方法:实验选取2001-01/2005-04北京世纪坛医院病理科收集的手术切除皮肤增生期血管瘤组织标本36例作为增生期血管瘤组(患者术前均未经任何辅助性治疗),以痔静脉标本30例作为痔静脉对照组.患者均知情同意.①两组标本切片均采用DAKO Envisions二步法进行免疫组化处理.切片以体积分数为0.03的过氧化氢消除内源性过氧化物酶,微波法抗原修复,92～95℃于pH 6.0枸盐酸缓冲液浸泡10 min;室温冷却10 min,双蒸水洗涤,pH 7.2磷酸盐缓冲液浸泡5 min;体积分数为0.1的山羊血清(磷酸盐缓冲液稀释)封闭,去血清,加入Ⅰ抗,37℃浸泡30 min;pH 7.2磷酸盐缓冲液冲洗;Envision孵育,37℃下放置30 min;二氨基联苯胺显色,苏木精复染后,脱水、透明、封固.免疫组化阴性对照以磷酸盐缓冲液代替Ⅰ抗,其他步骤维持不变,以确认试剂质量及控制染色效果.②p16,p53阳性信号为棕黄色,以内皮细胞浆和/或核染成棕黄色为阳性细胞.阴性对照除细胞核染成蓝色外,无棕黄色反应物.血管内皮细胞核内见棕黄色颗粒者为PCNA蛋白染色阳性.采用CMIAS高清晰彩色病理图像分析系统分别对两组切片p53,p16及PCNA蛋白的表达进行图像检测,测定每个视野下p16和p53阳性细胞的平均吸光度以及PCNA蛋白阳性表达指数.结果:实验选取手术切除皮肤增生期血管瘤组织标本36例,痔静脉标本30例,全部进入结果分析.①两组p53阳性表达检测及平均吸光度的比较:增生期血管瘤组内皮细胞核内有较多棕黄色颗粒,p53表达强;痔静脉对照组血管内皮细胞核内无棕黄色颗粒沉积,p53表达极弱.增生期血管瘤组p53阳性表达的平均吸光度明显强于痔静脉对照组(6.423±1.415,1.036±0.131,P＜0.05).②两组p16阳性表达检测及平均吸光度的比较:两组切片组织中除细胞核着色外,部分细胞浆有着色.p16的阳性表达在增生期血管瘤组和痔静脉对照组中基本相同,平均吸光度分别为1.241±0.373和1.206±0.267.③两组PCNA蛋白阳性表达指数的比较:PCNA蛋白阳性表达的细胞光镜下可见核内弥漫分布细小的棕黄色颗粒,这些内皮细胞围成血管腔及团块状,核椭圆,体积较大.增生期血管瘤组PCNA蛋白阳性表达指数明显高于痔静脉对照组(67.40±8.79,38.41±9.89,P＜0.01).结论:抑癌基因p53在增生期血管瘤组织中呈高表达,能够促进血管内皮细胞的增殖,但p16的表达与血管内皮细胞增殖的关系不明显.此外PCNA蛋白可作为增生期血管瘤的可靠标志物.
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睾酮对动脉粥样硬化内皮功能的影响
目的:探讨睾酮在雄兔动脉粥样硬化模型中是否具有保护内皮细胞功能的作用.方法:实验于2003-10/2004-06在哈尔滨医科大学第一临床医学院动物实验中心完成.选择雄性哈尔滨大耳白兔45只,随机分为5组,分别为安慰剂组、丙酸睾酮0.25,2.5,12.5 mg/(kg·d)组及假手术组,每组9只.安慰剂组去势并给安慰剂;丙酸睾酮0.25,2.5,12.5 mg/(kg·d)组家兔去势并分别予丙酸睾酮0.25 mg/(kg·d),2.5 mg/(kg·d),12.5 mg/(kg·d)肌肉注射.3个月后,采集动物血样,检测血中睾酮水平、血脂浓度、纤溶酶原激活物抑制物活性,一氧化氮、内皮素、血管紧张素Ⅱ含量.麻醉后气栓法处死动物,分离主动脉,纵向剖开固定,计算斑块占总内膜面积的百分比.另外利用western blot方法比较各组家兔雄激素受体表达量的变化.结果:进入结果分析安慰剂组、丙酸睾酮0.25,2.5,12.5 mg/(kg·d)组及假手术组家兔数量分别为8,8,7,7及7只.①安慰剂组血清睾酮水平、一氧化氮含量显著低于其他组(P＜0.05～0.01).②安慰剂组纤溶酶原激活物抑制物活性、内皮素、血管紧张素Ⅱ含量及主动脉斑块面积百分比均显著高于其他组(P＜0.05～0.01).接近生理浓度[0.25 mg/(kg·d)]的外源性睾酮可抑制兔纤溶酶原激活物抑制物活性,剂量增至10倍[2.5 mg/(kg·d)]作用反而减弱,剂量再次增大至50倍[1.25 mg/(kg·d)]又抑制纤溶酶原激活物抑制物活性[(0.334 4±0.051 3,0.505 1±0.050 4,0.374 2±0.106 9)U/mL].③各组家兔的主动脉雄激素受体表达量差异无显著性意义(P＞0.05).结论:在高脂饮食诱发的兔动脉硬化模型中,睾酮可以保护内皮细胞功能,从而减轻动脉粥样硬化的程度.但外源性睾酮的作用并未随着剂量的增加而成倍增加,而且并未发现各组雄激素受体表达量有不同,考虑这种作用差别的原因位于受体后.
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蛋白胶联剂京尼平与戊二醛的生物学特性比较
目的:从交联度、细胞毒性、溶胀率与降解率方面比较京尼平和戊二醛交联明胶的生物学特性.方法:实验于2005-06/2006-01在哈尔滨医科大学附属第二医院实验中心完成.①材料分为两组,京尼平组用10g/L京尼平交联明胶72 h,戊二醛组用10 g/L戊二醛交联明胶24 h.②检测交联度:每组材料取8个样本,其中5个加入碳酸氢钠和三硝基苯磺酸,再加盐酸,在346 nm测吸光度值(A三硝基苯磺酸).另取3个样本先加盐酸,然后再加三硝基苯磺酸,其余步骤相同,测得吸光度取平均值作为对照(A对),交联后吸光度值为:A交联后=A三硝基苯磺酸-A 对.再取11mg明胶加19 μL水,不加京尼平,同样步骤测吸光度,得到交联前吸光度(A交联前).交联度=(A交联前-A交联后)/A 交联前×100%.③细胞毒性试验:按照1 cm2/mL比例用培养液浸提5组材料制备浸提液,将中国仓鼠V-79细胞种植于96孔板,分为3组:阴性组(单纯培养液)、京尼平组(加京尼平明胶浸提液)、戊二醛组(加戊二醛明胶浸提液),48 h后做四甲基氮唑蓝检测.细胞相对增殖率=浸提液组平均A值/阴性对照组平均A值×100%.各组的细胞相对增殖率转换成6级(0～5级)细胞毒性以评定材料的毒性程度.④溶胀度与降解率:材料交联完成后立即称重(W0).然后在离心管中加2 mL无菌磷酸盐缓冲液,24 h后两组各取8个材料,用无菌滤纸擦干水分后称重(W1).溶胀率=(Wi-W0)/Wo×100%.其他材料3d换液1次,于1,2,3,4,8,12周分别取出两组材料各8个,用无菌滤纸擦干水分后称重(W2).降解率=(W1-W2)/W 1×100%.结果:①京尼平和戊二醛交联明胶材料的交联度分别为79.1%和52.3%.②京尼平材料的溶胀度高于戊二醛材料[(166±38)%,(133±31)%,P＜0.05].③京尼平和戊二醛材料在磷酸盐缓冲液中浸泡12周,降解率差异无显著性(14.1%,12.6%).④戊二醛交联明胶的浸提液培养的细胞出现坏死现象,而京尼平材料浸提液培养的细胞生长良好.京尼平和戊二醛材料的细胞增殖度分别为96.6和23.1.结论:京尼平交联明胶材料与戊二醛交联明胶材料比较,交联度降低,溶胀度增加,但二者制成的材料在磷酸盐缓冲液中浸泡12周都仅有少量降解,差异无显著性.京尼平的细胞毒性明显低于戊二醛.
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三种化学方法处理异体小血管移植的实验
目的:比较3种化学方法处理异体小血管移植后血管通畅状态以及病理变化.方法:实验于2005-03/09在中山大学医学院动物实验中心完成.①采用随机数字表法将64只新西兰白兔随机分成4组,自体组,甘油组,乙醇组和戊二醛组,每组16只.②自体组以自体股动脉移植作为对照;甘油组,乙醇组和戊二醛组,分别将980 g/L甘油、体积分数为0.95的乙醇、5 g/L戊二醛保存的异体兔股动脉,移植桥接于兔股动脉.③各组兔分别于术后7,14,28,56 d观察血管通畅情况,同时取移植体标本观察其病理变化.结果:①各组兔股动脉通畅率:甘油组和自体血管移植8周后通畅率均为100%;乙醇组8周后通畅率为69%,戊二醛组通畅率为6%;甘油通畅率明显高于乙醇组和戊二醛组(P＜0.01).②各组兔移植前血管组织学变化:甘油浸泡后的血管复苏后外观颜色、质地与正常血管相同,血管弹性良好.乙醇浸泡后的血管其外观颜色、质地与正常血管相同,但血管弹性稍差.戊二醛组血管颜色略变黄,血管弹性欠佳.③异体血管移植后组织学检查结果:甘油组术后2周开始,血管内壁内皮细胞开始增生,至8周时明显.弹力纤维8周时仍可见排列尚整齐.乙醇组术后移植血管内壁内皮细胞变化基本同甘油组.中层平滑肌细胞以及弹力纤维移植后2周开始出现变性或结构紊乱.戊二醛组从2周开始,管腔封闭,弹力纤维结构紊乱.4～8周管腔内充满较多的成纤维细胞.结论:3种化学方法中,甘油处理的异体小动脉移植在8周内与自体血管移植通畅率无明显差别,在8周内可保证通畅.
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生物材料Sapeptide的体外塑型及在体毒性实验
目的:观察生物材料Sapeptide的大体形状及其表面结构特性,并进行在体毒性实验,评测其生物相容性.方法:实验于2004-08/2005-09在解放军第三军医大学外科研究所完成.①采用等渗盐水作为Sapeptide塑型剂,塑型后分别进行大体、光镜和电镜观察材料表面结构.②对成年Wistar大鼠分组进行腿部肌肉注射毒性实验.取成年Wistar大鼠4只,标记后分为2组.A组:左前肢为RAD16-Ⅱ,右前肢为RAD16-Ⅰ,左后肢为RAD16-Ⅱ和RAD16-Ⅰ的均等合剂,右后肢为生理盐水对照.B组:左前肢为RAD16-Ⅱ,左后肢为RAD16-Ⅰ,右前肢和右后肢为1.25 g/L胰酶作对照.其中RAD16-Ⅱ和RAD16-Ⅰ水溶液浓度为2g/L,每个肢体注射液体量均为20 μL.每组分为两个时相点(9 d和35 d)用剪刀按照标记部分取出被注射的整条肌肉组织,切片后做苏木精-伊红染色和刚果红染色,观察肌肉组织结构的改变及有无炎症反应.结果:①Sapeptide的大体形状与表面结构:Sapeptide材料表面呈网状,网孔直径约54 μm,纤维的直径约为9 μm.②毒性实验结果:大体观察,各组标本材料植入部位未见出血、积液和组织坏死,注射部位肌肉组织质地光泽正常;刚果红染色,可见所有注射Sapeptide材料的肢体切片中均有片状的红色物质,9 d时面积大于35 d所见;生理盐水对照组和胰蛋白酶组未见红染物质;苏木精-伊红染色,A组,第9天和第35天四肢肌肉组织取材标本见肌肉纤维形态正常,未见炎性细胞浸润;B组,注射胰蛋白酶侧肢体在第9天可见局部组织有炎症反应,见少量淋巴细胞浸润,但第35天,组织炎症已基本消退.Sapeptide注射处肌肉组织未观察到炎症反应和免疫排斥反应.结论:Sapeptide材料具有生物相容性好,可同种子细胞和宿主组织很好的整合;合适的生物可降解性,降解产物对人体无不良反应,有良好的可塑性;并且应用简便,在神经组织工程中是一种具有良好特性的组织工程材料.
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超声和微泡超声造影剂介导核因子κB圈套寡核苷酸抗大鼠肝移植后的急性排斥
目的:观察经超声介导的核转移因子κB圈套寡核苷酸作用后大鼠移植肝的肝功能变化、急性排斥的病理情况及受体的生存时间,探讨超声介导的核因子κB圈套寡核苷酸抗大鼠肝移植急性排斥的作用.方法:实验于2005-04/11在南京医科大学第一附属医院动物实验中心完成.①DA大鼠和Lewis大鼠各36只随机分为3组;每组DA大鼠(供体)、Lewis大鼠(受体)各12只,行DA大鼠至Lewis大鼠的原位肝移植.①对照组:对供肝无干预处理.②生理盐水组:生理盐水1 mL+核因子κB圈套寡核苷酸100μg灌注供肝,并在冰水浴中经超声(频率2 MHz)处理1 min.③10%声诺维组:10%声诺维生理盐水1 mL+核因子κB圈套寡核苷酸100 μg灌注供肝,并在冰水浴中经超声(频率2 MHz)处理1 min.④检测各组受体大鼠(n=4)术后第1,4,7天的肝功能(天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸转氨酶)变化、病理组织学检查术后第4天移植肝的排斥情况(n=4,按Banff标准进行程度分级,分为0,Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,0级:无排斥证据;Ⅲ级:严重排斥)、统计各组受体大鼠生存率.结果:生理盐水组和10%声诺维组各有1只受体大鼠在术后3 d内死亡,未纳入统计.进入结果分析34只.①肝移植术后各组受体大鼠天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸转氨酶术后第1天便有不同程度的升高;10%声诺维组各时间点的天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸转氨酶值明显低于对照组和生理盐水组(P＜0.01);对照组和生理盐水组的转氨酶变化差异无显著性.②术后第4天病理组织学检查各组急性排斥情况:10%声诺维组急性排斥较对照组轻(P＜0.05),与生理盐水组比较差异无显著性(P＞0.05).③10%声诺维组肝移植术后受体生存时间较对照组和生理盐水组明显延长(P＜0.01);对照组与生理盐水组之间术后生存时间差异无显著性.结论:超声和微泡超声造影剂介导的核因子κB圈套寡核苷酸处理大鼠移植肝,能够改善术后移植肝功能、减轻术后移植肝的急性排斥反应、延长受体大鼠的术后生存期.
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雌激素对糖尿病患者内皮祖细胞数量和功能的影响
目的:观察雌激素对2型糖尿病患者外周血内皮祖细胞数量和功能的改变,并检测趋化因子受体CXCR4的表达.方法:实验于2005-02/09在华中科技大学同济医学院附属协和医院完成.选取武汉市中心医院收治的20例2型糖尿病患者,均根据1999年中国糖尿病学会新的诊断标准确诊.①抽取2型糖尿病患者外周静脉血,常规密度梯度离心法获取单个核细胞,进行内皮祖细胞的分离培养.加入雌二醇培养3 d,按其浓度分为雌激素0 nmol/L组、雌激素50 nmol/L组、雌激素100 nmol/L组.②检测内皮祖细胞的生长增殖和凋亡情况,测定其黏附能力.分别以反转录-聚合酶链法及流式细胞术对内皮祖细胞表达CXCR4的水平进行检测.结果:按意向处理分析,实验选取20例2型糖尿病患者血样全部进入结果分析.①内皮祖细胞的培养、鉴定及计数情况:培养4 d后可见贴壁的单个核细胞,7 d后细胞变为梭形,并慢慢变长.流式细胞仪鉴定细胞表型,可见内皮祖细胞大多表达CD34,且60%～80%表达CD133.对贴壁细胞行荧光染色后,＞80%的细胞双染色阳性,可认为是正在分化的内皮祖细胞.计数结果显示,随着加入雌激素浓度的增加,各组内皮祖细胞数量差异具有显著性意义(P＜0.05).②内皮祖细胞增殖及凋亡的检测结果:各组内皮祖细胞增殖率基本相似(P＞0.05).随着雌激素浓度的增加,雌激素0 nmol/L组、雌激素50 nmol/L组、雌激素100nmol/L组的凋亡率呈下降趋势,差异有显著性意义(P＜0.05).③内皮祖细胞黏附能力检测结果:各组内皮祖细胞黏附能力基本相似(P＞0.05).④CXCR4在内皮祖细胞上的表达情况:流式细胞术检测各组内皮祖细胞上CXCR4的表达阳性率,可见随着雌激素浓度增加,各组CXCR4表达率也随之增加,差异具有显著性意义(P＜0.05).反转录-聚合酶链反应法检测CXCR4的表达,亦得到相似结果.结论:雌激素对2型糖尿病患者内皮祖细胞的数量及功能均产生影响,可明显抑制内皮祖细胞凋亡及上调CXCR4的表达.提示雌激素可能在防止糖尿病周围血管病变上发挥一定作用.
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脱细胞角膜基质与骨髓间充质干细胞复合构建组织工程化活性人工角膜
目的:观察以脱细胞角膜基质作为支架材料、以骨髓间充质干细胞作为种子细胞复合构建组织工程化人工活性角膜的可行性.方法:实验于2004-09/2005-06在南昌大学江西医学院烧伤研究所完成.①取兔新鲜角膜,浸入1.25g/L胰蛋白酶和0.1 g/L乙二胺四乙酸溶液中作用24 h,然后浸入1%曲拉通X-100溶液中作用120 h,制备成脱细胞角膜基质,进行常规组织学苏木精-伊红染色观察.②采用密度梯度离心结合贴壁法分离纯化人骨髓间充质干细胞,用含10μg/L表皮生长因子的Dulbecco低必需培养基进行诱导培养.③将经诱导培养的骨髓间充质干细胞种植于脱细胞角膜基质上,复合构建组织工程化人工活性角膜,观察细胞与材料的黏附、细胞增殖情况.结果:①脱细胞角膜基质主要由胶原纤维组成,未见细胞成分残留.②经表皮生长因子诱导培养的人骨髓间充质干细胞体外增殖良好,24 h后贴壁细胞增多,7～10 d细胞多为梭形,呈有规则的集束辐射状排列;14～21 d左右细胞基本融合.③将人骨髓间充质干细胞种植于脱细胞角膜基质上,细胞铺展和增殖良好.结论:以骨髓间充质干细胞作为种子细胞复合脱细胞角膜基质支架材料可成功构建组织工程化人工活性角膜,有望成为一种修复角膜缺损的新技术方法.
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三磷酸胞苷二钠对局灶性脑缺血大鼠海马CA3区脑源性神经生长因子表达的影响
目的:观察三磷酸胞苷二钠(CTP)对缺血神经元修复、再生及结构重建的影响及其作用机制.方法:实验于2002-03/10在河北医科大学组胚教研室及河北医科大学第三医院中心实验室进行.选取SD大鼠60只,随机分为脑缺血自然恢复组、药物干预组和假手术对照组,每组20只.采用线栓法建立大脑中动脉脑缺血大鼠模型,药物干预组大鼠术后立即将三磷酸胞苷二钠(70 mg/kg体质量)经1 mL生理盐水溶解后给予腹腔注射,此后以相同剂量每日一次腹腔注射;自然恢复组及假手术组大鼠给予生理盐水1 mL每日一次腹腔注射,分别于术后7、14、21及30 d时各取5只大鼠处死,应用苏木精-伊红染色、免疫组化技术观察海马CA3区脑源性神经生长因子的表达,比较各组脑缺血后脑源性神经生长因子阳性细胞吸光度值.结果:实验选取的各组大鼠全部进入结果分析.①各组大鼠脑缺血后细胞形态观察结果:假手术组大鼠顶叶及海马区神经元排列整齐,形态完整,细胞数量较多,细胞核圆大且核仁明显.缺血组可见梗死灶,表现为正常结构消失,排列紊乱,细胞数量减少,胞核浓缩呈梭形或三角形,细胞质深染.②免疫组化染色及图像分析结果:光镜下观察,假手术组海马CA3区脑源性神经生长因子免疫组化染色阳性细胞神经元的胞浆内充满弥漫性的棕黄色颗粒,但其表达数量较少、染色较浅,自然恢复组脑源性神经生长因子表达与假手术组相比逐渐增多,第21天时达到高峰,并且免疫反应产物染色较深,部分神经元可见长的轴突,三磷酸胞苷二钠干预组脑源性神经生长因子阳性表达同自然恢复组相比均明显增加.③脑缺血后各组脑源性神经生长因子阳性细胞吸光度值的比较:与假手术组相比,自然恢复组脑源性神经生长因子吸光度值明显升高且差异有显著性(P＜0.01),与自然恢复组相比,三磷酸胞苷二钠干预组各时间点吸光度值均升高,而且7 d和14 d时同自然恢复组比较差异有显著性(P＜0.01).结论:脑缺血损伤可诱导海马CA3区脑源性神经生长因子表达增多.三磷酸胞苷二钠可上凋脑缺血后脑源性神经生长因子的表达,具有促进缺血神经元的修复、再生及结构重建的作用.
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钛合金表面纳米化对成骨细胞黏附的影响
目的:观察钛合金表面纳米化对成骨细胞黏附的影响.方法:实验于2004-06/2005-06在上海市第六人民医院实验室完成.对SD大鼠成骨细胞进行原代培养.成骨细胞的鉴定:①倒置相差显微镜下观察细胞形态.②碱性磷酸酶染色(偶氮偶联法).③成骨结节四环素染色:荧光显微镜观察,矿化结节呈金黄色.将成骨细胞分别与表面光滑的钛合金、表面粗糙的钛合金和表面纳米化的钛合金共同培养,一定时间后用细胞计数和扫描电镜观察等技术进行比较.结果:①材料表面特征:光滑钛合金表面除少量滑痕外无任何起伏.而粗糙钛合金表面有较大的不规则起伏,形成微米级的孔隙.纳米钛合金表面可见形成多孔纳米结构,在微米级的大孔内还有纳米级的小孔.②细胞培养和鉴定:倒置相差显微镜观察可见接种的骨组织块贴壁一两天后骨块边缘可见少量呈短梭形、三角形的细胞游离出.随培养时间延长,骨块边缘细胞增多,并向瓶壁周围移行.约2周后,细胞培养瓶底可形成一单层细胞,呈集簇状生长.未传代的细胞生长至三四周后细胞呈复层状生长,在其中心部细胞密集并可发生钙化,形成肉眼可见的散在白色点状物.③吖啶橙染色、计数及分析:随时间的延长3种材料上黏附的细胞均明显增加(P＜0.01).在1,2,4 h 3个同一时间段,黏附的成骨细胞数纳米＞粗糙＞光滑(P＜0.01),且SNK检验两两比较差异显著.由此可见,成骨细胞在表面纳米化钛合金表面达到早期黏附.④电镜观察:成骨细胞与材料共培养1 h后3种钛合金表面的成骨细胞数量纳米＞粗糙＞光滑.纳米表面的细胞大多已经伸展开来,并有较多突起,而在光滑和粗糙表面的细胞还呈球形,没有伸展开来.同时可以发现在粗糙和纳米钛合金表面的成骨细胞更倾向于黏附在材料的颗粒界面.结论:纳米化钛合金能明显促进成骨细胞的早期黏附.表面纳米化技术不仅保持材料的生物力学性能,而且使其具有纳米生物学的优点.
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次声波对成骨样细胞生物学特性的影响
目的:观察100dB条件下不同频率次声波对小鼠成骨样细胞增殖和分泌功能等生物学特性的影响.方法:实验于2003-03/06在解放军第四军医大学放射生物学教研室完成.复苏培养后的细胞随机分为空白对照组、4 Hz 100dB组、12 Hz100dB组、20 Hz 100dB组.将冻存的细胞株复苏,选择对数生长期的细胞,以1×107L-1细胞浓度接种在48孔培养板中,共接种4板并确定细胞贴壁.次日起每天上午8时将各组细胞放入次声仓内,4 Hz 100dB组、12 Hz 100dB组、20Hz 100dB组分别给予相应频率和声压级参数的次声作用,空白对照组在次声仓内无次声输出,30 min/d,共5 d.5 d后进行细胞增殖计数,观察次声波作用后小鼠成骨样细胞碱性磷酸酶活性和骨钙素表达的变化.结果:①不同参数的次声波对小鼠成骨样细胞增殖的影响:小鼠成骨样细胞的形态为不规则的多角形,受次声波作用后形态无明显改变.次声波作用第5天,4 Hz 100dB组、12 Hz 100dB组,20 Hz 100dB组小鼠成骨样细胞密度均明显高于空白对照组[(52.25±8.52),(50.33±7.99),(49.82±7.05),(39.92±7.38)107L-1,P均＜0.05].②次声波作用后小鼠成骨样细胞骨钙素的表达情况:次声波作用5d后,4 Hz 100dB组、12 Hz100dB组、20 Hz 100dB组小鼠成骨样细胞骨钙素浓度均明显高于空白对照组[(1.401 2±0.531 9),(0.877 5±0.258 9),(2.257 5±0.830 7),(0.592 5±0.172 5)μg/L;P=0.001,0.023,0.0005].③次声波作用后小鼠成骨样细胞碱性磷酸酶活性的变化:次声波作用5 d后,各组的小鼠成骨样细胞碱性磷酸酶表达均较低,4 Hz 100dB组、12 Hz 100dB组、20 Hz 100dB组与空白对照组的吸光度值基本相似(0.016±0.008,0.013±0.005,0.014±0.005,0.013±0.005,P=0.92,1.0,0.95).结论:4,12 Hz 100dB次声波作用可明显促进细胞增殖,20 Hz 100dB次声波作用具有显著分泌骨钙素的作用.提示100dB次声波不同频率下可以促进成骨样细胞的体外增殖和分泌功能.
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应用4,6-联脒-2-苯基吲哚大体染色法快速观察生物支架材料体外内皮化程度
目的:建立一种新的形态学方法,以简便快捷地观察生物支架材料体外内皮化的程度.方法:实验于2005-07/2006-02在复旦大学上海医学院分子生物学实验室完成.①新鲜的猪心瓣膜经过十二烷基磺酸钠和脱氧胆酸处理,获得去细胞生物支架.②采用消化法获得脐静脉内皮细胞.③将脐静脉内皮细胞(2×105/cm2)种植于支架上,静态培养10 d.用0.5 mg/L的4,6-联脒-2-苯基吲哚溶液对再内皮化支架进行直接的大体染色及染色后冰冻切片,同时用苏木精-伊红染色,免疫荧光染色和扫描电镜对支架的内皮化情况进行平行观察.结果:①猪心瓣膜的细胞成分完全脱去,胞外基质保存完好.②原代分离的脐静脉内皮细胞,培养5 d后融合成扁平单层,梭形或多角形,具有典型的铺路石样形态;CD31免疫荧光染色细胞表面呈现黄绿色荧光.③脐静脉内皮细胞种植10 d后,支架经4,6-联脒-2-苯基吲哚大体染色显示内皮化程度达90%以上,观察结果与电镜观察相同;冰冻切片观察显示支架表面有一融合的内皮细胞单层,与免疫荧光染色及常规苏木精-伊红染色结果相吻合.结论:4,6-联脒-2-苯基吲哚大体染色法可直接观察生物支架再内皮化程度,简便、准确直观,是体外构建组织的一种有效的形态学检测方法.
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1型糖尿病大鼠血管内皮细胞损伤后血生化学指标变化及锌原卟啉、正铁血红素的干预效应
目的:观察1型糖尿病血管内皮细胞损伤后内源性一氧化碳、血清总抗氧化能力、丙二醛、游离脂肪酸水平变化,以及锌原卟啉、正铁血红素对这种变化的干预结果.方法:实验于2004-10/2005-06在河北省人民医院老年医学省重点实验室完成.①选用健康雄性SD大鼠89只,8周龄,体质量240～260g.②取17只为对照组:腹腔仅注射柠檬酸缓冲液,4d后隔日腹腔注射生理盐水.将其余72只造成1型糖尿病模型:大鼠按50 mg/kg一次性腹腔注射链脲佐菌素(溶于pH 4.5的柠檬酸缓冲液中),4d后,有60只大鼠空腹血糖＞16 mmol/L为1型糖尿病模型复制成功.将其随机分为3组:1型糖尿病组(n=36):造模4 d后隔日腹腔注射生理盐水,饲养4,8和12周后处死12,14,10只;正铁血红素+1型糖尿病组(n=12):造模4 d后隔日给1型糖尿病大鼠腹腔注射正铁血红素30 μmol/kg,连续4周后处死;锌原卟啉+1型糖尿病组(n=12):造模4 d后隔日给1型糖尿病大鼠腹腔注射锌原卟啉10 μmoL/kg,连续4周后处死.③处死前采用C¨on 855血气分析仪检测动脉血中碳氧血红蛋白水平,以其反映一氧化碳水平.采用比色法检测血清总抗氧化能力,丙二醛和游离脂肪酸水平.扫描电镜观察股动脉内皮超微结构.④多组均数比较采用单因素方差分析,组间比较采用LSD法.结果:由于造模失败脱失12只,终进入结果分析77只.①动脉血碳氧血红蛋白水平:1型糖尿病大鼠4周明显低于对照组(P＜0.01),正铁血红素+1糖尿病组干预4周后明显高于1型糖尿病组干预4周后(P＜0.05),干预8,12周后低于对照组,但差异不明显.②血清总抗氧化能力水平:1型糖尿病大鼠呈时间依赖性降低,均明显低于对照组(P＜0.01),锌原卟啉+1型糖尿病组干预4周后明显低于1型糖尿病组干预4周后(P＜0.05).③血清丙二醛水平:1型糖尿病大鼠呈时间依赖性升高,其中干预8,12周后明显高于对照组(P＜0.01),锌原卟啉+1型糖尿病组干预4周后明显高于1型糖尿病组干预4周后(P＜0,05).④血清游离脂肪酸水平:锌原卟啉+1型糖尿病组干预4周后明显高于1型糖尿病组干预4周后(P＜0.05),1型糖尿病组干预12周后明显高于干预4周后(P＜0.05).⑤股动脉内皮超微形态学观察结果:对照组内皮细胞形态结构正常.1型糖尿病组内皮细胞出现损伤,干预8,12周后可见内皮细胞更严重损伤;应用正铁血红素后1型糖尿病大鼠内皮细胞形态接近对照组;锌原卟啉+1型糖尿病组大鼠内皮细胞形态异常.结论:随病程进展1型糖尿病大鼠内皮细胞抗氧化能力逐渐降低,脂代谢紊乱更加严重,内源性一氧化碳水平下降,并逐渐接近正常.锌原卟啉可加重血管内皮细胞结构损伤,应用正铁血红素可减轻血管内皮细胞结构损伤.
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组合性细胞因子与钙离子载体诱导急性髓系白血病细胞向树突状细胞分化中的作用
目的:探讨钙离子载体能否诱导急性髓系白血病细胞分化为树突状细胞及其抗肿瘤免疫.方法:选择2004-01/09解放军广州军区广州总医院血液科住院的初诊或复发的急性髓系白血病患者7例.分离急性髓系白血病患者的急性髓系白血病细胞,在体外给予钙离子载体100μg/L培养3～5 d(钙离子载体组),或1 000 U/mL重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、1 000 U/mL白细胞介素4和500U/mL肿瘤坏死因子α培养7～10 d(组合细胞因子组).通过细胞形态的观察及细胞免疫表型的检测鉴定树突状细胞,用同种异体混合淋巴细胞实验及细胞毒实验检测树突状细胞的功能.结果:①形态学观察和免疫表型变化:钙离子载体组及组合细胞因子组诱导急性髓系白血病细胞均可获得具有典型树突状细胞形态及免疫表型的成熟树突状细胞,但钙离子载体组诱导的树突状细胞表面CD80,CD86,CD83,CD40,CD54等分子的表达较组合细胞因子组明显增高.②混合淋巴细胞反应和胞毒性T淋巴细胞活性:钙离子载体组所诱导的急性髓系白血病细胞刺激同种异体混合淋巴细胞反应的能力及激发细胞毒性T淋巴细胞的活力比组合细胞因子组强.结论:钙离子载体能高效诱导急性髓系白血病细胞分化成树突状细胞,比组合细胞因子诱导分化的树突状细胞功能更强.
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脑源性神经营养因子对缺氧神经元的保护作用及其细胞内信号传递
目的:观察体外培养大鼠胚脑皮质神经元对缺氧耐受的时间窗,探讨外源性脑源性神经营养因子对缺氧神经元保护作用的时效-量效关系,及该保护作用可能的细胞内信号传递途径.方法:实验于2004-02/2005-02在四川大学华西医院移植工程及移植免疫实验室完成.体外培养孕17～19 d SD大鼠皮质神经元,随机数字法分为基线对照组、单纯缺氧组及缺氧+脑源性神经营养因子组,7 d后作缺氧培养,采用四氮唑盐比色法检测0～10 h段各时间点单纯缺氧组和缺氧+脑源性神经营养因子组(分别在缺氧前24 h及缺氧前即刻加入25～100μg/L脑源性神经营养因子)存活率的差别,并用Western blotting检测两组神经元在Akt/磷酸化Akt及CREB/磷酸化CREB表达的差别.结果:①脑源性神经营养因子对缺氧神经元的保护作用是相对的,该保护作用具有时效-量效关系,缺氧前24 h加入大剂量脑源性神经营养因子组(100μg/L)优于缺氧即刻加入小剂量(25μg/L)组,缺氧损伤到一定程度后(＞10 h)脑源性神经营养因子的保护作用将明显减弱[缺氧前24h加入100μg/L脑源性神经营养因子在1,2,4,8,10 h细胞活性分别为基线对照组的(133.85±3.72)%,(109.83±5.43)%,(86.15±0.68)%,(53.78±1.71)%,(33.41±1.64)%,而缺氧前即刻加入25 μg/L脑源性神经营养因子组在以上时点细胞活性分别为基线对照组的(81.55±1.07)%,(92.10±4.89)%,(78.75±1.87)%,(43.58±2.42)%,(33.13±0.94)%,单纯缺氧组的细胞活性分别为基线对照组的(82.12±3.15)%,(81.79±2.61)%,(64.5±4.56)%,(45.9±1.74)%,(35.45±1.25)%].②加入脑源性神经营养因子可使磷酸化Akt表达增加,磷酸化CREB表达提前并维持较长时间.结论:脑源性神经营养因子可减轻缺氧对神经元的损害,而Akt表达上调可能是脑源性神经营养因子发挥其对缺氧神经元保护作用的重要途径之一.
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核因子κB及其抑制蛋白ⅠκBα在成年大鼠坐骨神经许旺细胞的分布
目的:观察核因子κB及其抑制蛋白ⅠκBα在成年大鼠坐骨神经许旺细胞的表达,并分析二者之间的关系及意义.方法:实验于2005-01/06在重庆工学院生物工程学院及第三军医大学大坪医院野战外科研究所完成.随机取成年雄性SD大鼠6只,体质量200～250 g.1%戊巴比妥钠(20～40 mg/kg)腹腔麻醉后打开胸腔,用4%多聚甲醛溶液经左心室灌注后,取左侧坐骨神经,采用p65和p50(由p65和p50两个亚基组成的异源二聚体在核因子κB组成中发挥主要功能)及抑制蛋白ⅠκBα的多克隆抗体进行免疫组织化学染色,检测核因子κB及其抑制蛋白ⅠκBα在正常成年大鼠坐骨神经许旺细胞的表达及分布.结果:①p65和p50在坐骨神经许旺细胞胞浆中表达均很弱,胞核中则不表达.②ⅠκBα则在胞浆中有较强的表达,胞核中不表达.结论:核因子κB及其抑制蛋白ⅠκBα在正常成年大鼠坐骨神许旺细胞经均有一定程度的表达,在胞浆中前者表达较弱,后者较强,二者在胞核中均不表达.
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分米波防治屈肌腱粘连的生物力学特征
目的:通过生物力学检测方法分析,观察分米波对肌腱损伤术后粘连和肌腱愈合的影响.方法:实验于2000-10/2001-05在河北医科大学第三医院完成.选用4月龄健康雄性白色Leghorn鸡28只,体质量(1.53±0.068)kg,数字表法随机分为分米波治疗组、对照组,每组14只.选用Leghorn鸡双足第Ⅲ、Ⅳ趾为肌腱损伤模型趾,将趾深屈肌腱切断、修复,术后1 d～3周分米波治疗组足爪局部用分米波治疗,对照组不行分米波治疗.每组动物分别于术后3,6周随机处死7只,进行生物力学检测.观察两组Leghorn鸡不同时间点肌腱滑动距离、康复顺应性、肌腱抗张力强度.肌腱滑动距离M1,反映肌腱的粘连程度,M2为肌腱康复后滑动距离;康复顺应性:由(M2-M1)/(康复活动次数×康复拉力)计算得出,本实验用M2-M1的数值代表康复顺应性.结果:实验动物Leghorn鸡28只全部进入结果分析.①Leghorn鸡肌腱滑动距离康复顺应性测定结果:术后3,6周分米波治疗组肌腱滑动距离、康复顺应性显著均高于对照组[(5.37±1.06),(4.43±1.03)mm;(1.04±0.65),(0.63±0.31)mm;(6.76±1.52),(5.33±1.27)mm;(1.58±0.46),(1.47±0.26)mm;t=2.697～0.765,P＜0.05].②Leghorn鸡肌腱抗张力强度测定结果:术后3,6周分米波治疗组抗张力强度显著大于对照组[(26.93±4.80),(21.29±4.88)N;(47.12±7.76),(38.96±7.52)N;t=3.086,2.826,P＜0.01].结论:分米波治疗可有效地促进肌腱愈合,减少肌腱粘连,为肌腱损伤修复术后的早期康复训练提供了必要的条件,可以作为防治肌腱粘连的辅助措施.
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下颌角整形术中去咬肌和不去咬肌两种术式对下颌运动功能的影响
目的:观察下颌角整形术中去咬肌和不去咬肌两种术式对下颌运动功能的影响.方法:选择2004-03/08南方医科大学附属珠江医院整形科门诊收治下颌角肥大手术治疗患者24例,手术均经口内入路行下颌角磨削截骨术,其中去除部分咬肌12例,不去咬肌12例.①大开口度的测定:测量上下中切牙切缘之间的距离,再加上正中咬颌时前牙的覆盖,测量3次取其平均值.②大前伸度的测定:测量上下中切牙切缘之间的水平距离,再加上正中咬颌时前牙的覆盖,测量3次取其平均值.测量时间分别为术前、术后1,2周,1,2,3,4,5,6个月.结果:纳入患者24例,均进入结果分析.去咬肌组术后1,2周,1,2,3个月患者大开口度和大前伸度均较术前比较明显降低[以术后3个月为例,手术前后大开口度分别为(43.4±5.0),(38.3±3.4)mm,手术前后大前伸度分别为(8.5±0.7),(7.1±0.4)mm,P＜0.01],至术后4个月已达到术前正常值范围;不去咬肌组术后1,2周,1,2个月患者大开口度和大前伸度均较术前比较明显降低[以术后2个月为例,手术前后大开口度分别为(40.4±4.0),(35.3±3.7)mm,手术前后大前伸度分别为(9.0±0.6),(6.8±0.5)mm,P＜0.01],至术后3个月已达到术前正常值范围;去咬肌组较不去咬肌组患者术后大开口度和大前伸度恢复至术前正常值范围的时间长.结论:下颌角整形术对患者口腔颌面系统的功能无明显长期不良影响;去咬肌和不去咬肌的患者术后下颌运动功能恢复时间明显不一样.
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鞍马全旋练习池对运动损伤期训练与恢复的作用
目的:体操的体能训练与运动康复问题已引起广大教练和科技人员的高度重视,针对鞍马项目辅助器械的开发和鞍马辅助器械如何促进体操运动损伤恢复所进行的研究,通过鞍马全旋练习池的应用来加快体操运动员损伤的恢复,同时对竞技体育如何为全民健身服务作以探讨.方法:①鞍马全旋练习池设计原理:鞍马全旋练习池是通过水流、水温的物理作用和药物的渗透作用来加快运动员闭合性损伤的恢复,对体操运动员在损伤期保持体能训练有显著的促进作用.②材料:池体用透明玻璃钢制作;鞍马用硬塑料制成麻面式,规格同于标准鞍马;方向和速度可调式电动机;涡轮防护网.③操作方法:将池底的涡轮按运动员鞍马全旋的习惯方向转起,速度与运动员全旋速度等同,运动员在马上进行全旋、移位、打滚等练习.操作教练可以通过改变水流速度和运动员下肢的负重,来增加训练难度.结果:鞍马全旋练习池可用做:①创新技术或动作:运动员可以借助水的浮力,克服人体质量去体会技术和动作,而且不需要保护与帮助.②运动创伤的恢复:运动员损伤后,鞍马全旋练习池能够综合保持体能、功能训练和医疗恢复3个方面需要.③尝试继续提升鞍马全旋时人体的重心:人体在水中因水的浮力,很容易增大上肢与躯干的夹角.④初学鞍马练习者的辅助练习器.⑤可延长练习时间:在鞍马全旋练习池中极大的延长了练习时间,提高了成功率,且可以连续做数套动作.⑥娱乐性功能:作为体育娱乐消费项目,让没有经过专业训练的人,体会专业运动员动作,可以实现让竞技体育真正为全民健身服务.结论:鞍马全旋练习池设想的提出,对运动员损伤期的训练与恢复,具有较强的实用性;同时鞍马全旋练习池的娱乐性功能具有广泛的推广价值.
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胶原酶溶解椎间盘髓核的体外实验
目的:通过胶原酶对椎间盘髓核的体外溶解实验,进一步验证胶原酶溶盘术的作用并确认胶原酶的用量.方法:实验于2005-03/10在深圳市第五人民医院中心实验室完成,实验采用无菌操作的方法,对临床收集的北京大学深圳医院和深圳市第五人民医院的10例腰椎间盘突出患者手术取出的髓核组织(均为自愿捐献),使用临床治疗用胶原酶,以胶原酶浓度为2.5,5,10,15 mkat/L分为4组,在37℃的条件下,对髓核组织进行体外溶解试验,分别在培养3,6,9,15,30 d收集上清液,采用碱水解法检测溶解液中羟脯氨酸含量.结果:①在相同时间条件下,胶原酶浓度为2.5 mkat/L组分解髓核组织产生羟脯氨酸的量与胶原酶浓度为5 mkat/L组、胶原酶浓度为10 mkat/L组、胶原酶浓度为15 mkat/L组间存在差异(培养3 d:5.53,11.47,13.17,10.09μg/g;培养6 d:6.93,13.48,13.68,10.09μg/g;培养9 d:8.0,15.29,15.44,11.48μg/g;培养15 d:9.56,19.33,17.12,12.77μg/g;培养30 d:12.08,24.29,28.28,22.59μg/g,P＜0.05),而5 mkat/L组、胶原酶浓度为10 mkat/L组分解髓核组织产生羟脯氨酸的量与胶原酶浓度为15 mkat/L组之间没有差异(P＞0.05).②当胶原酶浓度＞5 mkat/L时,其分解胶原纤维产生羟脯氨酸的量并没有随着其浓度的增加而增加.结论:羟脯氨酸的变化较好的反映胶原酶对髓核的溶解作用,胶原酶对椎间盘突出髓核的溶解过程是一个渐进缓慢的过程,在一定的范围外(＞5 mkat/L)的胶原酶作用下,其产生羟脯氨酸的量没有随胶原酶浓度的增加而增加.
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骨损伤刺激对骨髓间充质干细胞增殖的影响
目的:观察骨损伤性刺激对骨髓间充质干细胞的影响,为体内诱导骨髓间充质干细胞增殖提供方法.方法:实验于2004-07/2005-03在南华大学附属第一医院临床研究所完成.选取健康SD大鼠18只,每组9只,随机分成两组,一组为观察组,进行一侧闭合性股骨横断性骨折损伤模型处理,另一组为对照组不作骨折损伤处理,两组大鼠同等条件下饲养2周,然后取出双侧股骨进行骨髓间充质干细胞提取,流式细胞仪检测含CD44-FITC阳性而CD45-RPE阴性的细胞的构成比(骨髓间充质干细胞具有表现为CD44阳性而及CD45阴性的特点,因此把通过流式细胞仪检测到的CD44-FITC阳性同时CD45-RPE阴性的细胞认定为骨髓间充质干细胞,由此测得的该细胞数占总检测细胞数的比为骨髓间充质干细胞构成比),计算出两组骨髓间充质干细胞构成比均数.结果:实验大鼠18只均进入结果分析.①观察组处理侧骨髓间充质干细胞构成比均数高于对照组处理侧(29.19±5.06,13.05±9.08,P＜0.01).②观察组未处理侧股骨骨髓间充质干细胞构成比均数高于对照组未处理侧(22.90±5.44,14.12±8.98,P＜0.01).③观察组处理侧股骨骨髓间充质干细胞构成比均数低于未处理侧(29.19±5.06,22.90±5.44,P＜0.05).结论:骨损伤后骨髓间充质干细胞出现增殖,为骨折的愈合提供物质基础,提示骨损伤性刺激可作为活体内诱导骨髓间充质干细胞增殖的一种方法.
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嗅鞘细胞移植治疗肌萎缩侧索硬化症中期安全性评价
目的:在证明嗅鞘细胞移植治疗肌萎缩侧索硬化症的近期安全性的基础上,进一步评价其中期安全性.,方法:本项研究为嗅鞘细胞移植治疗肌萎缩侧索硬化症系列研究的一部分.①随机选择2004-12/2005-05北京西山医院神经疾病研究治疗中心采用嗅鞘细胞移植治疗肌萎缩侧索硬化症患者13例,均经过世界神经病联合会El Escorial诊断标准确诊,病情呈进行性恶化趋势.②所有患者均接受胚胎嗅鞘细胞移植治疗,即取胚胎嗅球,消化成单个嗅鞘细胞后,培养两三周,然后在患者双侧大脑放射冠处各注射50μL嗅鞘细胞悬液,细胞数共约2×106个.③术后采用MRI颅脑扫描进行影像学检查,定期随访,仔细比较注射部位及其周围脑结构的形态学变化,分析嗅鞘细胞移植物的生物安全性.结果:按意向处理分析,嗅鞘细胞移植治疗肌萎缩侧索硬化症患者13例,随访5.1～11.8个月,平均7.5个月,全部进入结果分析.随访期间,无发热、头痛、头晕、恶心及呕吐等神经系统并发症.术前术后MRI扫描对比,颅内移植部位及其周围未发现新生肿瘤、出血、水肿、囊肿形成、神经结构破坏以及感染(脓肿)等病理性改变.结论:本研究首次证明在7个月随访期内,采用嗅鞘细胞移植手术治疗肌萎缩侧索硬化症是安全的.
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人白血病细胞株重组激活基因表达及T细胞受体基因重排的检测
背景:淋巴细胞特异性重组激活基因编码的重组激活基因1与重组激活基因2蛋白是参与V(D)J重排机制的重要的重组酶.除参与V(D)J重排以外,近年的研究结果表明重组激活基因介导的转位作用可能与染色体易位及淋巴性恶性肿瘤的发生有关,但迄今尚未有明确定论.目的:检测重组激活基因、DNA修复因子Ku70/Ku80和末端脱氧核苷转移酶mRNA表达以及T细胞受体基因重排在人白血病和淋巴瘤细胞株的发生情况.设计:重复测量实验.单位:南方医科大学生物技术学院分子免疫研究所.材料:T淋巴白血病细胞株Jurkat和6T-CEM购自上海细胞生物研究所;T淋巴白血病细胞株Molt-4,皮肤T细胞淋巴瘤细胞株HuT 102,Burkitt's淋巴瘤细胞株Raji和Daudi以及原髓细胞白血病细胞株HL-60和慢性髓原白血病细胞株K562均由本实验室保存.细胞用含有体积分数0.1胎牛血清的RPMI 1640培养基于37℃,体积分数0.05 CO2条件下培养.方法:实验于2005-10/2006-01在南方医科大学生物技术学院分子免疫研究所完成.采用反转录聚合酶链反应检测重组激活基因1,重组激活基因2,非同源末端连接装置途径中的DNA修复因子Ku70/Ku80,以及末端脱氧核苷转移酶mRNA表达;采用巢式、半巢式聚合酶链反应、连接介导的聚合酶链反应等方法检测T细胞受体重排删除DNA环和T细胞受体β链重组信号序列两端的断裂点.了解参与V(D)J重排过程的基因表达和T细胞受体基因重排中间体的产生情况.主要观察指标:重组激活基因、DNA修复因子Ku70/Ku80和末端脱氧核苷转移酶mRNA表达以及T细胞受体基因重排在人白血病和淋巴瘤细胞株的发生情况.结果:反转录聚合酶链反应检测结果显示:重组激活基因1 mRNA在4种T细胞株中均被检测到,在两种B细胞株和两种髓性白血病细胞株中未检测到;重组激活基因2和末端脱氧核苷转移酶mRNA表达仅在Jurkat,Molt-4和6T-CEM 3种T细胞株中检测到,但在6T-CEM表达较弱;除HL-60细胞未检测到Ku80表达外,所有细胞株均检测到Ku70和Ku80表达.对4种T细胞株T细胞受体重排中间体检测结果表明:仅在Jurkat细胞中检测到Dβ2-Jβ2 sjTRECs与Dβ2 5'端和3'RSS断点,表明Jurkat细胞发生T细胞受体基因重排.同时发现Jurkat TCRDβ2-Jβ2重排删除环结合区具有明显的多样性特征.结论:重组激活基因可能与T细胞白血病具有更为密切的关系.Jurkat细胞有可能成为研究重组激活基因与T细胞淋巴性肿瘤的一个潜在的细胞模型.
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自体骨髓细胞移植对老年猕猴肝脏功能与体液免疫及血细胞比例的干预
目的:分析自体骨髓细胞肝门静脉植入后对老年灵长类动物肝脏功能、体液免疫及血液细胞亚群数量变化的影响.方法:实验于2004-04/12在昆明总医院医学实验科完成.选取18～20岁老年恒河猴8只,分离骨髓有核细胞,将3×109个自体骨髓单个核细胞经肝门静脉植入体内.于骨髓细胞移植前和移植后1,2,3,4,5,6个月分别采集外周血5 mL,吸取上清液采用自动生化分析仪观察外周血肝功相关蛋白含量、胆红素含量及肝酶活性的变化;以上各时间点另采集外周血2 mL,应用SF-300全自动血球分析仪测定外周血白细胞总数、淋巴细胞、粒细胞、单核细胞、血小板及红细胞的数量和比例.结果:实验选用8只恒河猴,全部进入结果分析.①骨髓细胞移植后外周血肝功相关蛋白含量及肝酶活性的变化:与骨髓细胞移植前比较,血清总蛋白、清蛋白及球蛋白含量在移植后6个月内均明显升高(P＜0.05);谷丙转氨酶、血清谷草转氨酶活性在移植后1,2,3个月内明显升高(P＜0.05),随后逐渐下降,至6个月时接近移植前水平(P＞0.05).②骨髓细胞移植后血清胆红素浓度的变化:与骨髓细胞移植前比较,至移植后6个月血清总胆红素浓度明显降低(P＜0.05),血清间接胆红素浓度与移植前基本相似(P＞0.05);血清直接胆红素浓度在细胞移植后6个月内一直低于移植前水平(P＜0.05).③骨髓细胞移植后血清免疫球蛋白浓度及外周血细胞亚群比例的变化:血清IgG,IgA,IgM,C3,C4浓度、白细胞总数、血小板数量和淋巴细胞、单核细胞、粒细胞比例在移植后6个月内均显著高于细胞移植前(P＜0.05);红细胞数量未见明显变化.结论:老年猕猴自体骨髓细胞肝门静脉移植能够改善肝脏的蛋白合成和代谢功能,具有增强细胞与体液免疫力的作用.
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非诱导同种异体骨髓基质细胞心肌移植后细胞增殖分化的结局
背景:关于骨髓基质细胞心肌成形的研究,目前都集中在模拟自体细胞移植方面.而同种异体骨髓基质细胞心肌移植的研究,国内报道较少.目的:观察大鼠同种异体骨髓基质细胞移植到心肌梗死区后能否存活,并进一步增殖、分化,以及对宿主心脏的影响.设计:随机对照动物实验.单位:华中科技大学同济医学院附属协和医院心血管内科实验室.材料:1月龄Wistar大鼠10只,雌雄不拘,体质量100～120 g,用于取材培养骨髓基质细胞.3月龄雌性Wistar大鼠80只,体质量200～250 g,用于制造动物模型.方法:实验于2004-06/12在华中科技大学同济医学院附属协和医院心血管内科实验室完成.①80只大鼠结扎冠状动脉左前降支制作急性心肌梗死模型,45只大鼠制作模型成功.②4周后,取传两代非经诱导的体外培养的同种异体大鼠骨髓基质细胞,注射到大鼠心肌梗死区,为移植组(25只).同时设置注射培养基的对照组(20只).③移植4周后检测受体心脏的血流动力学指标,然后取标本,检测移植细胞存活、分化和组织的血管新生状况.主要观察指标:①两组大鼠血流动力学检测结果比较.②移植细胞的结局.③两组大鼠血管新生的改变.结果:细胞移植组13只,对照组11只大鼠进入结果分析.①移植组大鼠心脏血流动力学指标较对照组明显改善[左心室收缩压:(88.61±5.99),(76.93±4.75)mm Hg,左心室舒张末压:(7.72±1.36),(12.77±2.76)mm Hg,P均＜0.05;左心室收缩压大变化速率:(2 365.26±266.31),(2 025.04±230.25)(mm Hg/s),左心室舒张压大变化速率:(2313.26±159.30),(2 140.12±191.03)mm Hg/s].②同种异体骨髓基质细胞移植入心肌梗死区后能够度过急性炎症期而且不引起明显移植排斥反应;位于梗死区的移植细胞主要分化为成纤维细胞,部分位于心肌梗死区周围的细胞分化为血管内皮细胞,并促进了血管新生.③移植组心肌梗死区及其周围新生血管数目较对照组明显增加(P＜0.01).结论:同种异体骨髓基质细胞移植后未能在梗死区形成心肌样细胞,但所形成的血管内皮细胞产生了促进心肌梗死后血管新生、改善心功能的作用.
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大鼠白色脂肪组织来源血管内皮生长因子受体阳性细胞向内皮细胞的诱导分化
目的:观察大鼠白色脂肪组织作为内皮祖细胞来源的可能性.方法:实验于2004-12/2005-04在上海组织工程重点实验室完成.取3周龄Wistar大鼠腹股沟白色脂肪组织,消化法得到的细胞接种在培养皿内,用含体积分数为0.1的胎牛血清的DMEM培养基培养,传至第2代,应用免疫磁珠分选仪分选血管内皮生长因子受体阳性细胞.获得的细胞分诱导组(DMEM,体积分数为0.1的胎牛血清,血管内皮生长因子10μg/L,碱性成纤维细胞生长因子2μg/L)和非诱导组(DMEM,体积分数为0.1的胎牛血清)进行培养.流式细胞仪检测分选前后细胞纯度;噻唑蓝比色法检测诱导组与非诱导组细胞的生长曲线;相差倒置显微镜观察细胞形态;免疫细胞荧光检测细胞von Willebrand因子和血小板-内皮细胞间黏附分子-1的表达;荧光显微镜观察细胞摄取DiI-acLDL的功能;诱导组细胞接种于甲基纤维素半固体培养基进行三维培养,观察形成血管样结构的能力.结果:①细胞纯度:流式细胞仪检测显示未分选的第2代细胞血管内皮生长因子受体阳性率为(8.65±1.47)%,刚分选的血管内皮生长因子受体细胞阳性率(94.06±6.86)%,两者比较差异显著.分选前后的第2代细胞血小板-内皮细胞间黏附分子1阳性率分别为(1.26±0.21)%和(0.57±0.06)%,两者比较差异无显著性.②细胞生长曲线测定:诱导组细胞在诱导培养基中生长良好,第3天进入对数生长期,第6天到平台期.非诱导组细胞生长较慢,第5天进入对数生长期,第8天到平台期.第5天后各时间点差异均显著(P＜0.05).③细胞形态观察:培养12 d后,非诱导组细胞为梭形,而诱导组细胞呈"铺路石"样排列.④细胞免疫荧光检测:诱导培养12 d后诱导组细胞yon Willebrand因子和血小板-内皮细胞间黏附分子1为阳性,非诱导组细胞皆为阴性.⑤内皮细胞功能检测:诱导后12 d后的低密度脂蛋白摄取实验,诱导组细胞内出现红色荧光,非诱导组为阴性.⑥三维培养:诱导组细胞接种在甲基纤维素的半固体培养基内3 d后形成"树枝样"分叉结构,未诱导组细胞未形成此类结构.结论:大鼠脂肪组织来源的血管内皮生长因子受体阳性细胞能够诱导分化为成熟内皮细胞.
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人胚嗅球成鞘细胞的体外培养
目的:评估人胚嗅球成鞘细胞的分离与培养方法.方法:试验于2005-03/2005-08在昆明总医院中心实验室完成.选取自愿捐献自然流产3～5个月的胚胎,分离原代嗅球成鞘细胞,利用延迟差速贴壁法结合阿糖胞苷抑制法对细胞进行纯化,采用免疫组织化学方法鉴定细胞并计算其P75阳性率.结果:①人胚嗅球成鞘细胞的形态学观察:原代培养5 d的人胚嗅球成鞘细胞胞体呈长梭形,多极状,立体感强,折光性好.8 d后,胞体变大,突起变长,并逐渐相互交织成网.14 d后细胞主要表现为双极、三极形态.②人胚嗅球成鞘细胞免疫细胞化学染色及纯度鉴定:贴壁第2天,第7天的细胞染色,P75阳性达到95%以上.第14天细胞染色阳性率降至90%.25 d则仅为50%.结论:应用延迟差速贴壁法与阿糖胞苷化人胚嗅鞘细胞的方法,分离培养人胚嗅球成鞘细胞是一种较为稳定可靠的方法.
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海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠微囊化PC12细胞脑内移植改善帕金森病模型鼠的旋转行为
背景:细胞组织的微囊化移植是近年来帕金森病治疗的研究热点之一,目前发展较成熟、应用较多的是海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠微胶囊,但其易于囊周纤维化、易破碎等缺点,使其临床应用受到了限制.应用国内研制的新型微胶囊材料海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠微囊将PC12细胞微囊化后移植入帕金森病模型鼠纹状体内,观察其作用.目的:观察海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠微囊化PC12细胞脑内移植治疗,改善帕金森病模型大鼠旋转行为的作用.设计:随机对照动物实验.单位:吉林大学第二医院和中国科学院大连化学物理研究所.材料:成年雄性Wistar大鼠40只,体质量(220±10)g;海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠微囊;PC12细胞.方法:实验于2002-05/12在吉林大学第二医院动物实验室和中国科学院大连化学物理研究所完成.①应用国产新型材料壳聚糖制成的海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠微囊化PC12细胞.②将成功建立的23只帕金森病大鼠模型随机分为3组,微囊化PC12细胞组10只、裸PC12细胞组7只、空微胶囊组6只.分别将海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠微囊化PC12细胞、裸PC12细胞、空微胶囊移植入帕金森病模型鼠损伤侧纹状体内.③以阿朴吗啡检测移植前后大鼠旋转行为的差异.观察黑质及纹状体内微包囊的形态并检测微胶囊内细胞的活性.主要观察指标:①移植前后大鼠的旋转行为.②黑质和纹状体的病理形态.③回收的微包囊的完整性及囊内PC12细胞的活性.结果:①微囊化PC12细胞移植组在移植4周时旋转行为显著低于移植前和空微囊移植组[(6.9±2.8),(11.7±5.5),(10.5±1.6)r/min,P＜0.05],症状改善至少持续3个月;裸PC12细胞移植组大鼠的旋转行为与移植前相比也有改善[(5.6±1.1),(9.5±1.5)r/min,P＜0.05],但仅持续了2个月,且部分大鼠颅内有致死性肿瘤形成.空微囊移植组移植前后大鼠的旋转行为无明显差异.②回收微胶囊内的PC12细胞再培养生长良好,并且具有生物活性.结论:微囊化PC12细胞脑内移植能够改善阿朴吗啡诱发的帕金森病模型鼠的旋转症状,海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠新型微胶囊具有免疫隔离和抑制肿瘤形成的作用,有着广泛的临床应用前景.
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降血压肽对人脐静脉内皮细胞增殖及内皮素表达的影响
背景:降血压肽是一类能够降低人体血压的多肽,可通过抑制人体血管紧张素Ⅱ的生成而达到降低血压的作用.目的:在细胞分子水平探讨降血压肽对人脐静脉内皮细胞生长及内皮素表达的影响,为进一步将降血压肽开发为降压保健食品提供实验依据.设计:重复测量设计.单位:华南理工大学生命科学与工程学院,深圳职业技术学院应用生物技术系.材料:实验于2004-09/2005-03在深圳职业技术学院应用生物技术研究所完成.降血压肽由深圳职业技术学院应用生物技术研究所制备,在一定条件下抑制血管紧张素转移酶活性一半时所需要的抑制剂浓度为15 μmol/L.传至4代的人脐静脉内皮细胞用于实验,随机分为7组:空白对照组、降血压肽150 mg/L组、降血压肽300 mg/L组、降血压肽600 mg/L组、卡托普利阳性对照组、去甲肾上腺素阴性对照组、降血压肽+去甲肾上腺素组.方法:①脐静脉内皮细胞按一般细胞培养方法进行,培养液为M199+体积分数为0.15的小牛血清+青霉素10 000 U/mL+链霉素100 mg/L.细胞长满致融合状态后,按1:2比例传代,传至第4代的细胞用于实验.②空白对照组含体积分数为0.15小牛血清的M199;降血压肽150,300,600 mg/L组在此基础上加入降血压肽至终浓度分别为150,300,600 mg/L;卡托普利阳性对照组在此基础上加入卡托普利至终浓度为10-5mol/L;去甲肾上腺素阴性对照组在此基础上加入去甲肾上腺素终浓度为100 μg/L;降血压肽+去甲肾上腺素组在此基础上加入降血压肽至终浓度300 mg/L,去甲肾上腺素至终浓度100μg/L.③采用细胞计数法测定各组细胞生长状况,放免法测定不同培养时间各组细胞培养液中内皮素含量,反转录聚合酶链式反应法测定内皮素mRNA的表达,免疫组化测定细胞内皮素蛋白的表达.主要观察指标:①降血压肽对内皮细胞增殖、分泌内皮素的影响.②降血压肽对内皮细胞内皮素mRNA、内皮素蛋白表达的影响.结果:①降血压肽对内皮细胞增殖、分泌内皮素影响:随着培养时间的延长,与空白对照组比较,卡托普利阳性对照组及降血压肽各剂量组均有抑制内皮细胞生长、降低培养液中内皮素含量的作用(P＜0.01或0.05);去甲肾上腺素可促进内皮细胞的生长和分泌内皮素,但加入降血压肽后细胞密度和内皮素含量均接近空白对照组(P＞0.05).②降血压肽对内皮细胞内皮素mRNA、内皮素蛋白表达的影响:与空白对照组比较,阳性对照卡托普利组及降血压肽各剂量组均可下调内皮素mRNA和内皮素蛋白的表达(P＜0.01或0.05);去甲肾上腺素可上调内皮素mRNA和内皮素蛋白的表达,加入降血压肽后各基因表达接近空白对照组(P＞0.05).结论:不同剂量的降血压肽对内皮细胞均有抑制生长作用,可降低细胞释放内皮素的含量,下调内皮素基因的表达,且能够有效对抗去甲肾上腺素的促脐静脉内皮细胞生长及分泌作用.
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神经组织细胞特异性蛋白在大鼠羊膜上皮细胞中的表达
背景:有证据表明羊膜上皮细胞能够表达神经系统细胞的几乎全部特异性抗原,且可以分泌多种神经营养因子及递质.若羊膜上皮细胞能够代替神经细胞,其神经营养作用必将为治疗神经推行性病变带来广阔前景.目的:检测神经组织细胞特异性抗原在大鼠羊膜上皮细胞中是否表达?设计:重复测量设计.单位:吉林大学第二临床医学院,吉林大学基础医学院组织与胚胎学教研室.材料:实验于2004-10/2005-10在吉林大学基础医学院组织与胚胎学教研室完成.选取清洁级孕12～14 d的Wistar大鼠1只,将分离出的羊膜上皮细胞用于实验.小鼠抗大鼠神经元特异性抗原微管相关蛋白、星形胶质细胞特异性抗原胶质原纤维酸性蛋白、乙酰胆碱转移酶单克隆抗体、兔抗大鼠神经元特异性烯醇化酶和NT-3多克隆抗体(武汉博士德公司);大鼠抗大鼠Musashi抗体(日本庆应义塾大学岗野荣之教授惠赠).方法:取孕12～14d的Wistar大鼠胎盘,剥离羊膜获得上皮细胞,在37℃、体积分数为0.05的CO2环境下,胰蛋白酶消化5 min,加入DMEM/F12培养液,以5×109L-1的浓度接种于培养瓶中.培养3 d后,细胞以1×108L-1的浓度接种于预先涂有多聚赖氨酸的直径35 mm平皿中,用质量浓度为40g/L的多聚甲醛固定20 min.采用免疫细胞化学染色方法对神经元特异性抗原微管相关蛋白、神经元特异性烯醇化酶、星形胶质细胞特异性抗原胶质原纤维酸性蛋白、乙酰胆碱转移酶在羊膜上皮细胞中的表达情况进行检测.主要观察指标:①大鼠羊膜上皮细胞不同培养时间的形态观察.②神经组织细胞特异性抗原在大鼠羊膜上皮细胞中的表达情况.结果:①大鼠羊膜上皮细胞不同培养时间的形态观察:羊膜上皮细胞培养24 h后,细胞扁平呈成纤维细胞样.3～5 d后,胞体饱满,核大而圆,核仁清晰,突起发达,并互相连成网状.②神经组织细胞特异性抗原在大鼠羊膜上皮细胞中的表达情况:培养4 d后免疫细胞化学染色结果可见,羊膜上皮细胞表达Nestin、神经元特异性烯醇化酶、乙酰胆碱转移酶以及Musashi、神经元特异性抗原微管相关蛋白、星形胶质细胞特异性抗原胶质原纤维酸性蛋白.结论:羊膜上皮细胞与神经组织细胞具有一定的同源性,可望作为治疗神经系统疾病新的细胞来源.
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大鼠肌源性干细胞的培养与鉴定
背景:肌源性干细胞是一种成体多能干细胞,已成为基因治疗和细胞介导的组织工程领域内的研究热点,临床应用自体肌源性干细胞注射治疗压力性尿失禁具有广泛前景.目的:探讨大鼠肌源性干细胞体外原代培养的方法,为临床应用自体肌源性干细胞注射治疗压力性尿失禁提供实验依据.设计:重复观察测量.单位:武汉大学人民医院生殖中心与泌尿外科.材料:实验于2003-12/2004-05在武汉大学人民医院泌尿外科实验室完成.选取4～6周龄雌性SD大鼠20只,Ⅺ型胶原酶、胰酶、多聚赖氨酸(Sigma公司),dispase酶(Gibco公司),鸡胚提取液(自制).方法:①将大鼠以质量浓度为10g/L的戊巴比妥钠30g/kg腹腔麻醉后,无菌条件下取腓肠肌,置入冷DMEM培养基中,D-Hank's液洗涤组织块,除去筋膜、肌腱、神经和血管,剪成1.0～3.0 mm3小块,移入离心管.向组织中加入0.2%Ⅺ型胶原酶及0.1%的胰酶,采用胶原酶分离大鼠骨骼肌细胞.②应用差速贴壁法大鼠骨骼肌细胞进行纯化.细胞筛网过滤后接种至多聚赖氨酸包被的培养瓶中,37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中孵育1 h,未贴壁细胞移入新的培养瓶中,加入新的培养基37℃培养1 h后,未贴壁细胞再次转瓶换液,37℃培养过夜,如此反复,每次间隔24 h转瓶换液,培养第5～6天贴壁的细胞即肌源性干细胞.③细胞生长到70%融合后,胰蛋白酶消化,以1:2的比例进行传代.传代细胞消化后接种于放有盖玻片的6孔培养板中,加入生长培养基,24 h后制备细胞爬片,采用免疫组织化学方法鉴定所培养细胞上特异性结蛋白抗原和干细胞抗原-1的表达.主要观察指标:肌源性干细胞的形态及其鉴定结果.结果:①肌源性干细胞的形态观察:从骨骼肌组织中分离出来的肌源性干细胞呈球形,折光性强.培养12 h后开始贴壁仍为圆形,48 h后贴壁完全并开始增生,细胞逐渐延展成梭形或纺锤形,有两极,体积小.随培养时间的延长,细胞相互融合形成成熟的多核肌管.②肌源性干细胞的鉴定结果:细胞特异性结蛋白抗原和干细胞抗原-1染色呈阳性,荧光显微镜可见细胞浆发出红色荧光,阳性率达90%.结论:肌原性干细胞属于成体干细胞,具有取材方便、免疫原性低、移植后存活时间长等优点.高纯度的肌原性干细胞可通过体外原代培养获取,免疫组化技术可鉴定其肌源性和干细胞特性,在组织工程和基因治疗中具有广泛的应用前景.
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恒磁场对人脐血间充质干细胞增殖及细胞周期的影响
目的:观察不同强度恒磁场辐射对人脐血间充质干细胞增殖水平及细胞周期的影响.方法:实验于2005-08/2005-10在中南大学湘雅医学院组织胚胎学教研室完成.①用密度梯度离心法分离人脐血间充质干细胞.②经贴壁筛选法筛选,对生长良好的第3代人脐血间充质干细胞进行恒磁场辐射(强度分别为0.05,0.1,0.5和1.0 mT),连续刺激5 d,8 h/d.③用四甲基偶氮唑盐法、流式细胞仪法测定细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡情况.结果:①0.05 mT组细胞增殖显著高于对照组(0.198±0.011,0.162±0.007,P＜0.05);细胞周期静止期/DNA合成前期比例显著降低(66.3±0.1,75.8±0.3,P＜0.05);DNA合成期和DNA合成后期/分裂期比例显著增加(14 9±0.3比9.1±0.1,18.8±0.2比15.1±0.1,P＜0.05).②0.1 mT组细胞增殖和细胞周期与对照组相比无明显差异.③0.5 mT组和1.0 mT组细胞增殖均显著低于对照组,细胞周期静止期/DNA合成前期比例显著增加,DNA合成期和DNA合成后期/分裂期比例显著降低(P＜0.05).④各组均未发现DNA倍体异常细胞.结论:恒磁场对人脐血间充质干细胞增殖的影响与磁感应强度有关,0.05 mT的磁场促进间充质干细胞的增殖,0.1 mT的磁场对间充质干细胞无明显影响,0.5 mT和1.0 mT的磁场抑制间充质干细胞的增殖.
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神经干细胞移植治疗脑缺血的实验模型
目的:建立一个方便、有效的动物实验模型以研究神经干细胞移植治疗脑缺血的可行性.方法:实验于2004-09/2005-10在第四军医大学全军神经外科研究所完成.健康家猫12只,随机分为缺血再灌注组(10只)和假手术组(2只),参照四血管阻塞法制作猫全脑缺血模型.先用显微手术的方法分离家猫双侧椎动脉并电凝,永久性闭塞双侧椎动脉.24 h后再分离双侧颈总动脉,用动脉夹阻断血流.用含表皮生长因子的无血清培养基原代分离培养小鼠神经干细胞.将原代培养的小鼠神经干细胞移植到全脑缺血再灌注损伤模型的一侧大脑皮层中,假手术组猫大脑皮层注射同量的磷酸盐缓冲溶液;用免疫荧光技术检测移植1个月后的小鼠神经干细胞.结果:实验家猫12只,进入结果分析9只.①缺血再灌注组10只家猫经缺血再灌注损伤后死亡2只,1只夹闭血管后始终未出现静息脑电波,模型制作成功7只,成功率70%.假手术组家猫全部存活.缺血再灌注损伤后的家猫均出现不同程度的肢体瘫痪及平衡失调表现.饲养1周后,肢体瘫痪及平衡失调表现均逐渐有所改善.②原代培养细胞在无血清培养基中生长2～3 d后,大部分细胞死亡,只有少数以单细胞形式悬浮生长.部分细胞分裂形成几个到几十个细胞的细胞团.到7～10 d时可生长成有数十个到数百个细胞的细胞团,也呈悬浮生长.这些悬浮生长的细胞在含血清培养基中能够贴壁生长并部份分化成神经微丝抗原阳性的神经元及胶质纤维酸性蛋白抗原阳性的神经胶质细胞.③细胞移植后,家猫症状有所改善,但移植侧与对侧肢体瘫痪及平衡失调表现改善无明显差别.④免疫荧光方法检测小鼠神经干细胞移植到猫前脑后1个月仍有大量存活,部份细胞分化为神经元及神经胶质细胞,部份细胞向猫脑组织中迁移.迁移深度0.1～0.2 mm.呈弥散性分布.沿针道侧壁贴附的细胞呈圆形,迁移到脑组织深部的细胞大多呈梭形.海马及对侧脑皮层等远隔部位未检测到阳性细胞存在.不同个体间未发现明显差异.⑤缺血再灌注组脑皮层及海马CA1区苏木精-伊红染色示典型的迟发性神经元坏死.结论:小鼠神经干细胞在猫全脑缺血模型中能够存活、迁移并分化;成功建立一个神经干细胞移植治疗脑缺血的实验模型.
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人胎肾间充质样干细胞分离鉴定及其向脂肪和成骨细胞的分化
目的:分离纯化人胎肾中的间充质样干细胞,在化学因子作用下诱导其定向分化,并对其生物学特性进行初步鉴定.方法:实验于2005-10/2006-01在暨南大学医学院血液病研究所完成.①利用二步离心法、密度梯度离心法及细胞差速贴壁生长特性分离纯化人胎肾间充质样干细胞.细胞来源为自然流产胎儿,供者知情同意.②流式细胞仪检测其细胞周期和表面标志.③添加常规诱导液诱导其向脂肪分化[以脂肪诱导分化液(DMEM/F12+体积分数为0.1的胎牛血清+1 μmol/L地塞米松+5 u/mL胰岛素+200μmol/L消炎痛)进行培养]、成骨细胞分化(完全培养基中加入0.1 μmol/L地塞米松,10 mmol/Lβ-磷酸甘油,50μmol/L维生素C进行培养)并加以鉴定.结果:从人胎肾中成功分离纯化得到间充质样干细胞:①P6代细胞有79.1%的细胞处于静止期/DNA合成前期.②表达CD29,CD44,CD105和CD166,不表达造血细胞标志CD15,CD34,CD45.③不表达与移植物抗宿主病相关的HLA-DR,CD80,CD86,CD40,CD40L.④在向成骨分化的诱导液中培养后,间充质样干细胞发生形态变化,碱性磷酸酶染色阳性,出现钙结节;在脂肪诱导分化液内培养后,细胞形态发生变化,油红O染色阳性.结论:人胎肾中含有间充质样干细胞,人胎肾间充质样干细胞具有多向分化潜能,且免疫原性弱,可以作为组织工程和细胞治疗种子细胞的来源之一,但目前存在较难分离纯化,细胞产量不大的不足.
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改良载体提高大鼠成肌细胞移植效率
目的:观察含1g/L透明质酸钠的F12培养基能否提高成肌细胞移植效率和促进组织修复.方法:实验于2003-9/2004-10在四川大学华西医院修复重建实验室完成.①选取5月龄SD大鼠84只,建立胫前肌的深度冻伤的动物模型.②术后第10天,再次手术暴露冻伤肌组织.随机分为4组:取42只,左侧胫前肌注射以含1g/L透明质酸钠的F12培养基为载体的成肌细胞为左侧成肌细胞组;右侧胫前肌注射以F12培养基为载体的成肌细胞为右侧成肌细胞组;另42只,左侧注射含1g/L透明质酸钠的F12培养基溶液为培养液组;右侧不予注射为空白组.③各组分别于术后第2,5,9天,2,4,8,12周取材观察肌质量变化及组织学改变;于术后第2,5,9天进行磷酸肌酸激酶及同工酶测试.结果:84只大鼠均进入结果分析.①各组胫前肌肌质量变化:术后第2天和第5天,空白组肌质量轻(P＜0.05),其余组间差异无显著性(P＞0.05).术后第9天及第2,4,8,12周,左、右侧成肌细胞组肌质量明显高于培养液组和空白组(P＜0.05),而左、右侧成肌细胞组之间、培养液组和空白组之间差异无显著性(P＞0.05).②组织学观察:两组移植细胞均分化形成肌纤维,参与组织修复.透明质酸钠还促进早期小血管的再生.③磷酸肌酸激酶及磷酸肌酸激酶同工酶含量:运用两种载体的成肌细胞移植,冻伤组织中的磷酸肌酸激酶及同工酶活性明显增高(P＜0.05),显示移植细胞在冻伤局部增殖、分化参与受损组织的修复,以含透明质酸钠溶液为载体的移植组成肌细胞参与修复的总体活性较高.结论:成肌细胞移植对冻伤的肌肉组织有明显的修复作用,以透明质酸钠的溶液为载体可以提高成肌细胞移植效率.
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犬骨髓间质干细胞体外诱导及非诱导培养后向心肌细胞的分化
目的:骨髓间质干细胞体外诱导和非诱导培养向心肌细胞分化的结果的对比.方法:实验于2003-03/2004-12在阜外心血管病医院中心实验室完成.①分离犬骨髓间质干细胞.②于体外培养,应用不同浓度(0,6,8,10,12,14,20 μmol/L)的5-氮胞苷定向诱导并连续传代培养4周,未诱导的细胞培养8周.③进行细胞形态学、细胞免疫组织化学、透射电镜鉴定.结果:①骨髓间质干细胞于5-氮胞苷诱导培养2周时,α-肌动蛋白、TroponinⅠ染色阴性;4周时,α-肌动蛋白染色阳性,Troponin Ⅰ阴性;电镜下可见肌丝结构,其中8 mmol/L 5-氮胞苷诱导的间质干细胞肌丝结构排列较规则.②骨髓间质干细胞非诱导培养8周时,α-肌动蛋白染色阳性,TroponinⅠ阴性,电镜下亦可见肌丝结构形成;而培养4周时全部为阴性.结论:骨髓间质干细胞经5-氮胞苷诱导培养4周及未诱导连续培养8周均可定向转化为具有肌丝结构的肌样细胞,而非心肌样细胞.
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经静脉移植间充质干细胞在脊髓损伤鼠体内的迁移
目的:观察67Ga-Oxine标记间充质干细胞的可行性,检测经静脉移植的间充质干细胞在脊髓损伤鼠体内的迁移和分布.方法:实验于2004-01/2005-01在北京大学干细胞研究中心完成.①从人脐带血分离培养间充质干细胞,体外进行67Ga-Oxine和Hoechst33342标记.②SD大鼠40只随机分为两组,实验组(脊髓损伤大鼠20只)和对照组(正常大鼠20只)均经尾静脉注射相同标记细胞悬液.③分别于1 d和1周后取材,新鲜组织(脊髓、肺、肝、脾、肾、骨髓、静脉血)称湿重后伽玛计数仪检测其放射性,计算肺、肝、脾、肾、骨髓分别与静脉血单位质量放射性计数的比值,两组比较分析;实验组损伤脊髓和对照组相同部位脊髓分别与其临近正常脊髓放射性计数的比值之间比较.相应组织做冷冻切片(包括骨髓涂片),荧光显微镜观察Hoechst33342标记细胞在各组织内的分布.结果:40只SD大鼠全部进入结果分析.①体外间充质干细胞的67Ga-Oxine标记率为82.5%,放射活性为15.26 MBq/106细胞,标记48 h后细胞存活率＞95%.②移植1 d和1周后肺、肝、脾、肾、骨髓与静脉血单位质量放射性计数的比值,实验组与对照组对比差异均无显著性(P＞0.05).实验组损伤脊髓和对照组相同部位脊髓分别与其临近正常脊髓放射性计数的比值之间比较,1 d后差异无显著性(P＞0.05),1周后实验组明显高于对照组(1.441±0.038,1.003±0.022,P＜0.01).③相应组织连续冷冻切片荧光显微镜观察显示移植初期Hoechst33342标记细胞主要集中于肺部,而后在肝、脾、骨髓逐渐增加可持续到1周后.移植1 d后脊髓未见明显标记细胞,1周后实验组损伤脊髓部位标记细胞明显增加并相对聚集于灰质.结论:间充质干细胞可在体外应用67Ga-Oxine成功标记,为核素显像示踪移植间充质干细胞的相关研究提供了依据.经静脉移植的间充质干细胞可以迁移到损伤脊髓,为应用间充质干细胞移植治疗脊髓损伤提供了一种可能的无创性移植方法.
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脐血间充质干细胞体外定向诱导向心肌样细胞的转化
目的:观察脐血间充质干细胞经5-氮杂胞苷诱导在体外定向分化为心肌样细胞的形态学及分子生物学特征.方法:选取2003-05/2005-04在郧阳医学院附属十堰市太和医院妇产科患者12例,脐血来源者家属及本人知情同意.取脐静脉血50 mL,分离并培养骨髓间充质干细胞,用5-氮杂胞苷定向诱导向心肌样细胞分化.每日采用相差显微镜、透射电镜观察心肌样细胞形态学变化及超微结构特征,采用RT-PCR检测心房利钠肽、受磷蛋白、β-肌球蛋白重链表达.结果:①形态学变化:5-氮杂胞苷诱导后,约1周出现短棒状或珠状结构,2周排列具有方向性,3周有肌管样结构形成.②超微结构:诱导四五周细胞内含大量线粒体,可见心房颗粒、肌丝形成.③RT-PCR检测:经5-氮杂胞苷诱导四五周骨髓间充质干细胞有心房利钠肽、受磷蛋白、β-肌球蛋白重链表达.且心房利钠肽出现3条阳性带.结论:经5-氮杂胞苷诱导脐血间充质干细胞体外可分化为心肌样细胞,是细胞移植的优良供体.
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RNA干扰技术沉默黏附斑激酶诱导心脏成纤维细胞失巢凋亡
目的:利用短发夹RNA干扰载体介导的RNA干扰技术沉默成年大鼠心脏成纤维细胞中黏附斑激酶,观察细胞增殖和凋亡的变化.方法:实验于2004-12/2005-12在解放军第三军医大学新桥医院中心实验室完成.实验选用10～12周龄清洁级的雄性Wistar大鼠24只,以转染靶向黏附斑激酶的重组RNA干扰质粒的心脏成纤维细胞为干预组,选择未转染细胞和转染空质粒、非特异siRNA的细胞为不同对照组,共4组,各6只.消化法培养大鼠心脏成纤维细胞,设计、构建和鉴定黏附斑激酶RNA干扰载体,western blot法测量黏附斑激酶的沉默效率,四唑盐比色法检测细胞增殖,DNA缺口末端标记技术检测细胞凋亡,流式细胞仪测定B细胞淋巴瘤2和bax的变化.结果:Wistar大鼠24只,全部进入结果分析.①酶切鉴定和测序鉴定表明黏附斑激酶RNA干扰载体构建成功,转染细胞后,Westernblot结果表明第二个重组黏附斑激酶RNA干扰载体的RNA沉默效率高,为72.1%,其余分别为66.2%和55.3%.②Pavu6+27-黏附斑激酶2转染组A490值明显低于未转染细胞和转染空质粒、非特异siRNA组(0.179±0.017,0.30±0.002,0.296±0.006,0.281±0.007;t=17.802,16.436,14.993,P＜0.01);凋亡率较其余各组则明显升高[(22.28±2.13)%,(4.72±1.67)%,(6.36±0.92)%,(8.19±1.33)%;t=-19.05,-17.31,-15.16,P＜0.01].③Pavu6+27-黏附斑激酶2转染组bax上升明显,与正常对照组和空质粒转染组比较,差异十分显著(2.15±058,1.01±0.04,1.12±0.04;t=-4.79,-4.318,P＜0.01);与阴性对照组比较,差异显著(1.19±0.31,t=-3.59,P＜0.05).④Pavu6+27-黏附斑激酶2转染组B细胞淋巴瘤-2表达较正常对照组、空质粒转染组、阴性对照组显著上升(1.62±0.15,1.04±0.03,1.09±0.01,1.23±0.04;t=-9.39,-8.701,-6.338,P＜0.05).结论:通过RNA干扰技术沉默心脏成纤维细胞中黏附斑激酶基因的表达,可诱导心脏成纤维细胞凋亡,抑制或降低心脏成纤维细胞中黏附斑激酶表达可能是防治心肌纤维化的一种手段.
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人骨髓间充质干细胞全细胞膜上钙离子通道的电生理学特性
目的:观察人骨髓间充质干细胞膜上钙离子通道的激活、失活峰值与离子通道选择性等电生理学特性,为研究干细胞在分化过程中离子通道变化奠定基础.方法:选择泸州医学院附属医院耳鼻咽喉科2004-03/2005-04获得正常发育的人捐献的骨髓标本10例.采用梯度离心法和单层贴附培养法分离,纯化,获取人骨髓间充质干细胞,选取传代第1～2代生长活性良好的人骨髓间充质干细胞进行全细胞膜片钳的记录与分析.实验采用PC-ⅡB型膜片钳放大器(华中理工大学研制),由计算机发出指令经数字量数据/模拟量数据转换经放大器输出到细胞,细胞信号由放大器放大再经模/数转换后记录到计算机,保存在数字硬盘上供分析调读,记录与分析软件为IBBClamp,采样间隔100μs.通过设定不同的实验程序,记录通道电流的幅度,激活和失活电流的峰值与时程,离子通道的选择性,Ⅰ-Ⅴ曲线.结果:①纳入10例骨髓标本,8例成功分离、培养出骨髓间充质干细胞,2例培养出现细菌污染.②原代培养的骨髓间充质干细胞形态较均一,主要为梭形,其生长特点为:24～48 h内贴壁,3～9 d进入对数生长期,9～12 d进入生长平台期.③在8例成功培养细胞中,有7例骨髓间充质干细胞可成功记录到离子通道电流,并均可记录到对Nicardipine阻断剂敏感的钙离子通道电流,该钙离子通道电流表现特点为:在阻断骨髓间充质干细胞膜上钠、钾电流后,当钳制为-90 mV,膜上钙离子电流可被连续记录,从-110到-10 mV持续钳制用10 mV阶跃去极化,在-60 mV获得钙离子通道的反转电流.结论:人骨髓间充质干细胞膜上用全细胞电压膜片钳可记录到钙离子通道电流,其电生理学特性符合非兴奋细胞膜上的钙离子通道特点.
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神经干细胞和脑源性神经营养因子联用对老年痴呆鼠学习记忆能力和基底前脑小白蛋白的影响
目的:观察神经干细胞和脑源性神经营养因子联合应用对老年痴呆大鼠学习记忆能力及其基底前脑小白蛋白神经元的作用.方法:实验于2003-12/2005-10在广州医学院解剖教研室神经生物学实验室完成.取健康雄性SD大鼠40只,随机分为4组:正常对照组、损伤组、移植组和联合组,每组10只.①利用无血清培养技术获得新生SD鼠的海马神经干细胞.②除正常组外,其他3组切断SD大鼠左侧穹隆海马伞建立老年痴呆大鼠模型;移植组和联合组,基底前脑注射神经干细胞;联合组同时侧脑室注射脑源性神经营养因子.③4周后行Y迷宫测试大鼠学习、记忆能力(学习次数分值高表示差,记忆能力分值低表示差),免疫组织化学结合图象分析技术观察各组大鼠基底前脑小白蛋白阳性神经元数目受影响的情况.结果:①损伤组大鼠比正常对照组大鼠学习、记忆能力明显下降(98.2±5.6比59.8±4.1,3.5±0.5比8.4±0.4,P＜0.01).②移植组学习、记忆能力均有改善(74.1±5.4,6.7±0.5,P＜0.05),但与正常组比较差异有显著性意义(P＜0.05).③联合组学习记忆能力(56.7±0.9,8.3±0.3)与正常组比较无显著性差异(P＞0.05).④大鼠的学习记忆能力与基底前脑小白蛋白阳性细胞数呈正相关.结论:神经干细胞和脑源性神经营养因子联用较单独使用神经干细胞或脑源性神经营养因子更好地改善老年痴呆大鼠的学习记忆能力.
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基于CD细胞神经网络的肝脏B超图像数据挖掘
目的:运用CD细胞神经网络对肝病患者的肝脏B超图片进行探测,以便更好地在图像中挖掘有用信息,协助临床诊断.方法:实验于2004-07/2005-11在北京西苑医院和北京科技大学完成,实验前期进行图像采集,选取北京西苑医院收治的5例肝病患者的肝脏B超图片用于实验,后期进行数学分析.设计细胞神经网络模板参数的鲁棒性定理,该定理提供了一组参数不等式以确定满足该功能的参数变化区间.利用细胞神经网络方法对肝脏B超图像进行轮廓探测,由此得到肝脏B超图像里面所有轮廓信息,把处理结果数据化,利用十次多项式来进行拟合与数据挖掘,后通过多项式的系数来确定肝脏的病变情况.结果:按意向处理分析,实验选取5例肝病患者的肝脏B超图片,均进入结果统计.5例肝病患者的佳逼近系数经治疗后明显趋于健康者的佳逼近系数.这些数据的变化似乎能表明肝受损的程度,系数a10越大,似乎反映肝损伤越严重;系数a9较小似乎反映肝损伤程度越轻.结论:通过细胞神经网络处理B超图像产生的数据,初步分析似乎提示患者的肝损伤与十次多项式系数之间的某种关系,从而断定肝脏的病变情况,为医生的临床诊断提供参考.
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管状骨髓腔内骨整合式纯钛种植体与骨组织界面的整合状态
目的:自行设计管状骨髓腔内骨整合式纯钛螺旋状种植体组件,通过动物实验,观察种植体-骨组织界面的骨整合情况,为临床指缺损患者种植体式手指赝复体修复提供材料及依据.方法:实验于2005-08/12在第四军医大学西京医院整形外科实验室完成.采用国产纯钛制做螺旋形柱状种植体,根据成人正常掌骨和近节指骨及其髓腔的解剖学特点及临床应用的可行性,借鉴Bmnemark螺旋型种植体,自行开发研制纯钛种植体.选择新西兰大白兔10只,在麻醉显效后,胫骨髓腔内种植纯钛螺旋状种植体10枚,分别于术后2,4,8,12,16周各处死2只动物取材,X线摄片观察骨结合形成情况.结果:所有实验动物均进入结果分析,种植体无脱落.制备出掌指骨髓腔内骨整合式纯钛螺旋型种植体组件及配件.①X线观察结果:术后2周时,种植体与骨组织间可见到较明显透光间隙,种植体-骨界面未见骨小梁及新骨形成,术后4～6周,种植体与骨组织间透光间隙减小,可见种植体周围骨密度增高,种植体螺纹间新骨形成明显,术后8周,种植体与骨组织间已无明显透光间隙,均被高密度区替代,种植体周围骨密度增高,种植体螺纹间新骨形成明显,形成更完善的骨界面,界面骨成熟,术后12周与8周相比,变化不大.②大体及光镜观察结果:术后2周时,种植体与骨组织间为软组织界面,未见新骨生成;术后4～6周,种植体周围大量新生骨样组织形成;种植体周围及螺纹间新骨形成明显,形成骨性界面;术后12周与8周相比,骨性界面进一步形成.结论:该掌指骨髓腔内骨整合式纯钛螺旋状种植体组件,术后8周可以与周围骨组织形成完全骨结合.
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磷酸钙骨水泥强化椎弓根螺钉固定的生物力学特性
背景:聚甲基丙烯酸甲酯能改善椎弓根螺钉和周围骨质间界面的情况、显著提高螺钉固定强度,但它在术中和术后伴有聚合热损伤效应、毒性和不可吸收等缺点.磷酸钙骨水泥具有生物相容性和生物安全性好、可降解、不产生聚合热等优点,是一种较理想的聚甲基丙烯酸甲酯替代材料.目的:从生物力学方面评价磷酸钙骨水泥对椎弓根螺钉固定的强化作用.设计:随机对照,重复观察测量.单位:南京医科大学第二附属医院骨科.材料:实验于2002-08/2003-02在华中科技大学同济医学院完成.①由同济医科大学解剖教研室提供两具新鲜男性尸体椎骨,一具52岁,一具50岁.各取10个椎骨(T8-12,L1-5)分别构成52岁组和50岁组.摄X线片排除先天性畸形、骨折和肿瘤等病变.两组椎骨均为Ⅰ级骨质疏松,符合实验要求.②磷酸钙骨水泥固相主要成分是磷酸四钙和磷酸三钙超细粉末,液相主要成分是枸橼酸盐溶液,使用时按1 g固相:1 mL液相的比例进行配制,初步凝固时间15 min,终凝固时间12 h,大压缩强度介于45～57 MPa.③椎弓根螺钉自制,螺钉直径5 mm,螺纹段长34 mm,螺距2mm,螺纹深0.8 mm.方法:①磷酸钙骨水泥终凝固时强化椎弓根螺钉固定的生物力学测试:取50岁组椎骨作为测试对象.对照侧:钉道直接置入椎弓根螺钉;强化侧:填入磷酸钙骨水泥再置入椎弓根螺钉.置钉后的椎骨在37℃恒温箱里放置12 h,然后测定椎弓根螺钉的大轴向拔出力.②磷酸钙骨水泥初步凝固时强化椎弓根螺钉固定的生物力学测试:取52岁组椎骨作为测试对象.用同样方法在椎弓根对照侧直接置入椎弓根螺钉,强化侧填入骨水泥后再置入椎弓根螺钉,37℃恒温箱里放置15 min,测定椎弓根螺钉初步凝固时的大轴向拔出力.③磷酸钙骨水泥强化松动椎弓根螺钉固定的生物力学测试:取测试后的50岁组椎骨,用磷酸钙骨水泥重新固定12 h后拔松的椎弓根螺钉,测定其两侧的大轴向拔出力.主要观察指标:①磷酸钙骨水泥终凝固时强化椎弓根螺钉固定的生物力学测试结果.②磷酸钙骨水泥初步凝固时强化椎弓根螺钉固定的生物力学测试结果.③磷酸钙骨水泥强化松动椎弓根螺钉固定的生物力学测试结果.结果:①50岁组对照侧和强化侧的椎弓根螺钉大轴向拔出力中位数分别为620 N和1 136 N,强化侧较对照侧增加83%(P＜0.01).强化骨-螺钉界面的抗剪切应力中位数从1.16 N/mm2增加到2.13 N/mm2.②52岁组对照侧和强化侧的椎弓根螺钉大轴向拔出力中位数分别为554.5 N和859.5 N,强化侧较对照侧增加55%(P＜0.01).强化骨-螺钉界面的抗剪切应力中位数从1.039 N/mm2增加到1.61 N/mm2.③50岁组椎骨对照侧和强化侧重新固定12 h后大轴向拔出力中位数分别为517 N和876 N,和同侧松动后轴向拔出力中位数比较,分别增加了63.6%和54.2%(P均＜0.01).结论:磷酸钙骨水泥初步凝固和终凝固时能强化椎弓根螺钉的固定,并且椎弓根螺钉松动后使用磷酸骨水泥能使螺钉重新获得固定.椎体强化侧的椎弓根螺钉均从骨-螺界面剥离开来,不伴周边骨质和椎弓根的严重损害,有利于螺钉松动、拔出后的二次置入.
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小波变换和小波熵在睡眠脑电信号变化特性研究中的应用价值
目的:利用小波熵对各期睡眠脑电复杂度进行动态时变特性及统计特性的分析比较.方法:实验于2005-08/2005-09在江苏大学电气信息工程学院生物工程系实验室完成.睡眠脑电数据取自MIT-BIH数据库,8名被试者每人取一导整夜脑电信号,无睡眠方面疾病.采用其睡眠数据进行复杂度分析实验研究,小波包去噪信号进行多尺度分解后,利用小波熵求其各睡眠期和4个有用频率带δ、θ、α、β的小波熵值.结果:6种不同状态下脑电的小波熵之间有着明显的区别,其中清醒期小波熵均值大;在非快速眼动睡眠期的4个分期里S1期小波熵均值大、S4期小波熵均值小,随着睡眠的深入呈现出逐渐减少的趋势;快速眼动睡眠期小波熵均值介于清醒期和非快速眼动睡眠期之间.在脑电波4个基本节律带(δ、θ、α、β)下,共同的特点是在β节律下小波熵均值小,在θ节律下小波熵均值大;分别在δ、α、β频率带下清醒期小波熵大,在S1、S2、S3、S4期随着睡眠的深入有逐渐减少的趋势,快速眼动睡眠期介于清醒期和非快速眼动睡眠期之间;在S1、S2、S3、S4期小波熵均值在4个节律带的波动幅度要明显大于清醒期和快速眼动睡眠期.在睡眠各期及各频率带下小波熵方差值变化趋势与均值类似并更明显.结论:小波熵作为一种复杂性测度方法在睡眠各期脑电的应用结果中显示随着睡眠的深入,小波熵逐渐减少,这与理论上是符合的,所以小波熵可以作为不同生理状态下脑电的变化特性的检测指标,既能区分长时间段脑电复杂度之间的差异,又能反应微状态下的变化特性.
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国产缓降解聚酰胺可吸收螺钉在关节部位新鲜骨端骨折中的应用
目的:观察缓降解聚酰胺可吸收螺钉在关节部位新鲜骨折内固定中的临床应用效果.方法:选择2001-03/2005-12中山大学附属第二医院骨科病区住院的各种关节部位新鲜骨折患者46例,男36例,女10例;年龄16～63岁.其中肱骨内髁骨折7例,肱骨外髁骨折6例,肱骨大结节骨折5例,桡骨远端骨折7例,股骨外髁撕裂骨折3例,胫骨内、外侧平台撕裂骨折5例,内踝骨折5例,外踝骨折4例,后踝骨折4例.骨折后1～6 d,平均3 d.①所采用的缓降解聚酰胺可吸收螺钉(深圳昌华生物医学工程有限公司提供),为全螺纹或半螺纹拉力螺钉,直径为2.7 mm、3.5 mm和4.5 mm,长度20～70mm.②手术方法同传统AO内固定术.术后结合早期肢体功能康复与锻炼.③治疗效果以末次随访患者肢体局部功能恢复情况评估,分为优、良、差.疼痛采用目测类比评分法(VAS)评定,0分为无痛,10分为剧痛.结果:除1例失访外,45例获随访,随访期3～21个月,其中随访3个月1例,6个月5例,9个月11例,12个月13例,15个月8例,18个月5例,21个月2例,平均随访12月.依据末次随访结果评估治疗效果.①患者肢体局部功能恢复情况:优42例,骨折均达解剖复位,关节功能基本正常,活动时目测类比评分为0分,伤口一期愈合;良3例,骨折功能复位,关节功能基本正常,仅有轻度功能障碍,运动过多时有轻度疼痛(目测类比评分为一二分).②不良事件及副反应:术后病例复查无螺钉变形、断裂而引发骨折再移位或骨折不愈合情况,也无感染、积液和特异性炎症反应现象.结论:国产缓降解聚酰胺可吸收螺钉治疗新鲜关节部位骨端骨折患者术后肢体功能恢复状态较好,且无明显不良反应.
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眼球摘除术后定制个性化义眼
目的:为眼球摘除Ⅰ期植入义眼座的患者定制个性化义眼,观察其临床效果.方法:选取2002-04/2005-10行眼球摘除手术Ⅰ期植入义眼座的65例患者(65眼),患眼结膜囊内置入眼模,2周后参照健眼特征定制个性化义眼.测量患者配戴个性化义眼后双侧睑裂高度、眼球突出度、义眼水平及垂直方向活动度.就个性化义眼的颜色、外形、活动性、固位性及舒适性5个主要指标按满意、基本满意、不满意3级分别向患者征询意见.结果:按意向处理分析,实验纳入行眼球摘除手术Ⅰ期植入义眼座的65例患者,共65眼,全部进入结果分析.①个性化义眼大体形态观察:个性化义眼的质量为1.7～2.4 g,平均(2.1±0.3)g.中央厚度为4.0～5.1 mm,平均(4.5±0.4)mm.②患者配戴个性化义眼后外观各项指标评价:患者双侧睑裂高度、眼球突出度无显著性差异(t=2.147,2.308,P＞0.05);义眼水平方向活动度20°～35°,平均(28.2±5.4)°;垂直方向活动度15°～25°,平均(20.3±4.1)°.③患者配戴定制义眼后各项指标满意度调查结果:患者对个性化义眼外形、颜色、活动性、固位性、舒适性评价总满意率(满意和基本满意)分别为90.8%,86.2%,76.7%,96.9%,87.7%.④患者配戴个性化义眼引起的并发症情况:出现眼胀不适感7例(10.8%),巨乳头性结膜炎4例(6.2%).结论:对于眼球摘除义眼座植入术后的患者,根据患眼结膜囊形态取模,并参照健眼特征定制个性化义眼,可获得较好的仿真效果,具有临床应用与推广价值.
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极低频磁场诱导人肝癌细胞的凋亡
背景:磁场能在体内或体外影响肿瘤细胞的生长与分裂,但目前尚无定论磁场能否在体外诱导人肝癌细胞的凋亡.目的:观察极低频磁场诱导人肝癌细胞SK-HEP-1凋亡的效果.设计:开放性实验.单位:上海交通大学生物技术研究所.材料:实验于2004-09/2005-01在上海交通大学生物技术研究所完成.人肝癌细胞SK-HEP-1购于上海中科院细胞库.方法:SK-HEP-1细胞以2.0×104L-1接种,生长于含有体积分数为0.1的热灭活新生牛血清和2 mmol/L L-谷氨酰胺的DMEM培养基中,50 Hz,20 mT磁场对人肝癌细胞SK-HEP-1连续作用8 d;对照组细胞则在另一个培养箱中培养,除无磁场干预外,与磁场处理组细胞的生长条件完全一致.在细胞培养的第8天以DNA梯度电泳、Hoechst 33258染色和AO/EB双染色检测凋亡情况.主要观察指标:①有无DNA断裂后形成的梯度.②有无异常的细胞核.③凋亡细胞的比例.结果:①DNA梯度电泳检测细胞核间DNA裂解情况:SK-HEP-1细胞在极低频磁场处理8 d后产生DNA片段条带,对照组中(无磁场处理)则未观察到此特征性DNA条带.②Hoechst 33258荧光染色细胞凋亡分析:Hoechst 33258染色被用来研究细胞中核的变化,在极低频磁场处理过的细胞中,存在许多包含有细胞核片段的凋亡小体,但在对照组中则几乎没有.同时,磁场处理的细胞观察到有细胞质皱缩现象,在某些细胞中,甚至细胞膜都不完整.③AO/EB双染细胞凋亡分析:极低频磁场处理后活细胞的比例(9.2%)与对照组(91.8%)相比极为低下,且伴有很高的细胞凋亡率(72.3%),对照组细胞凋亡率为4.2%,凋亡细胞中的大多数属于凋亡早期.磁场处理后坏死细胞的比例(18.5%)也比对照组(4%)要高.AO/EB双染结果显示AO/EB双染后细胞的不同形态,其中对照组的细胞呈亮绿色的完整圆球状,而磁场处理后的细胞则呈现出不规则的细胞形态且有凝集的细胞核.结论:50 Hz,20 mT极低频磁场能在体外诱导人肝癌细胞SK-HEP-1发生凋亡.
