中国组织工程研究杂志
Chinese Journal of Tissue Engineering Research 중국조직공정구여림상강복
- 主管单位： 中华人民共和国卫生部
- 主办单位： 中国康复医学会,《中国组织工程研究与临床康复》杂志社
- 影响因子： 1.38
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 2095-4344
- 国内刊号： 21-1581/R
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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牙髓干细胞在组织工程研究中的进展和应用前景
背景:牙髓干细胞作为特殊的干细胞来源,具有高度增殖和自我更新能力,能在特定条件诱导下分化成多种组织细胞,为组织工程领域的发展寻觅了一条新的途径.目的:对牙髓干细胞的生物学特征、来源、分离方法及其在组织工程学中的应用和研究等方面作一综述.方法:由第一作者以"dental pulp stem cell,differentiation,regenerative medicine,tissue engineering"为英文关键词,以"牙髓干细胞,分化,再生医学,组织工程"为中文关键词,检索2005至2017年期间收录在PubMed,Medline,中国知网,万方等数据库中与牙髓干细胞和组织工程医学相关的文献,排除与文章研究目的无关及重复性的文献,纳入符合标准的66篇文献进行综述.结果与结论:随着组织工程医学和再生医学应用的不断发展,牙髓干细胞和组织工程支架的有效结合得以实现,目前研究的重点不仅仅关注于牙髓干细胞的成牙、成骨特性,其在神经修复、血管构建、角膜重建、软骨形成等方面也得到广泛应用.
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骨髓间充质干细胞联合脱细胞真皮基质修复尿道损伤
背景:近年来,组织工程学的发展为尿道损伤修复提供了更多的选择.目的:探讨骨髓间充质干细胞联合脱细胞真皮基质修复尿道损伤的效果.方法:取第3代新西兰大白兔骨髓间充质干细胞,接种于脱细胞真皮基质材料表面,构建组织工程尿道.将36只新西兰大白兔随机分3组,每组12只.实验组于尿道损伤处植入骨髓间充质干细胞-脱细胞真皮基质复合物,对照组于尿道损伤处植入单纯脱细胞真皮基质材料,正常组既无损伤也不做任何处理.术后4,8,12周,尿道修复组织进行苏木精-伊红染色,术后12周,进行免疫组织化学染色和尿动力学检查.结果与结论:①术后4周,实验组尿道缺损区可见有少许薄层上皮再生,连续性较好;对照组修复段尿道新生黏膜尚不连续.术后8-12周,实验组修复段尿道上皮层逐渐变厚,与正常尿道上皮连续性良好,黏膜逐渐增厚,尿道黏膜光滑连续;对照组修复段尿道新生黏膜连续性较好,再生上皮层次较少;②术后12周,免疫组化可见实验组修复尿道标本uroplakin Ⅲa,CK AE1/AE3,α-SMA表达阳性;③实验组手术前后的大尿道压比较差异无显著性意义;对照组术后大尿道压高于术前,差异有显著性意义(P <0.05);④结果表明,骨髓间充质干细胞联合脱细胞真皮基质修复尿道损伤的效果优于单纯脱细胞真皮基质材料.
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脂联素与鼠脂肪干细胞移植治疗大鼠肾病综合征
背景:脂联素可以调节机体内的糖和脂代谢,保护机体组织器官,故将其与干细胞移植联合用于治疗肾病综合征.目的:探讨脂联素联合脂肪干细胞治疗大鼠肾病综合征的影响.方法:①体外复苏培养大鼠脂肪干细胞,移植前行CM-Dil 标记;②将80只SD大鼠随机分为4组:对照组、肾病综合征模型组、脂肪干细胞移植组和脂联素联合脂肪干细胞移植组,各20只.后3组采用单次尾静脉阿霉素注射(6 mg/kg)构建大鼠肾病综合征的模型,分别经尾静脉注射生理盐水,2×106L-1脂肪干细胞悬液和2×106L-1脂肪干细胞悬液+1 μg/kg脂联素,1次/d,连续3 d.结果与结论:①造模28 d后,与对照组相比,其余3组大鼠的24 h尿蛋白、血胆固醇和尿素氮水平较高,血白蛋白水平较低;与肾病综合征模型组相比,脂肪干细胞移植组大鼠24 h尿蛋白、血胆固醇和尿素氮水平降低,血白蛋白水平升高;与脂肪干细胞移植组相比,脂联素联合脂肪干细胞移植组24 h尿蛋白、血胆固醇和尿素氮水平降低,血白蛋白水平升高;②造模28 d后,肾病综合征模型组大鼠肾组织的病理损伤为明显,脂肪干细胞移植组大鼠肾组织的病理损伤明显减轻,脂联素联合脂肪干细胞移植组大鼠肾组织的病理损伤明显改善,炎性细胞及水肿均减轻;③肾组织中 CM-Dil 阳性细胞:脂联素联合脂肪干细胞移植组多,脂肪干细胞移植组次之,对照组和肾病综合征模型组未见;④结果提示脂肪干细胞移植对肾病综合征有一定治疗作用,且脂联素可以增强其治疗效果,改善肾功能指标,有效抑制肾组织的病理损伤.
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脂肪干细胞与羟基磷灰石/β-磷酸三钙复合体修复兔椎体缺损
背景:骨缺损的修复不仅是临床上的难题,也一直是骨科领域的热点.虽然自体骨移植是骨修复技术的"金标准",但由于自体骨来源有限,易出现取骨区感染、疼痛等症状,而且同种异体骨有免疫排斥、愈合缓慢、感染等特点,因此研发新型骨缺埙修复材料迫在眉睫.目的:评价兔脂肪干细胞与羟基磷灰石/β-磷酸三钙骨组织工程复合体修复兔椎体缺损的效果.方法:取3月龄新西兰大白兔38只,其中2只用于体外培养脂肪干细胞,将第3代经成骨诱导分化的兔脂肪干细胞接种于羟基磷灰石/β-磷酸三钙支架上进行体外培养2周.36只新西兰大白兔随机分为3组(n=12),均在L4/5椎体前缘制备一直径约5 mm、深约3 mm椎体缺损,A组、B组分别植入兔脂肪干细胞/羟基磷灰石/β-磷酸三钙复合体、羟基磷灰石/β-磷酸三钙支架,C组不植入材料.术后4,8,12周行脊柱正侧位DR照射,进行Lane-Sandhu X射线评分,术后12周处死取标本,行大体观察、组织病理学观察椎体缺损修复情况.结果与结论:①大体观察发现A组椎体缺损区基本被新生骨组织取代,修复效果明显优于B组及C组;②术后12周时,A组椎体缺损区材料基本吸收,B组椎体缺损材料部分吸收,可见骨痂形成,C组椎体缺损区边界尚清晰,可见片状钙化影.经Lane-Sandhu X射线评分后统计学分析,A组椎体缺损修复情况明显优于B组及C组(P < 0.05);③组织病理学观察发现A组材料吸收明显,B组部分材料残留,仅见到部分纤维性骨痂及少许类骨样组织形成,C 组可见大量纤维组织及少许骨痂形成;④以上结果表明,脂肪干细胞与羟基磷灰石/β-磷酸三钙构建的骨组织工程复合体具有较好的修复椎体缺损的能力.
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大鼠骨髓来源内皮祖细胞体外增殖和凋亡及阿托伐他汀的干预
背景:研究发现,阿托伐他汀具有心血管保护作用,能显著改善内皮功能,促进内皮祖细胞的动员、迁移和分化.现阶段在细胞体外培养水平上进行阿托伐他汀药物浓度筛选所进行的研究较少.目的:探讨不同浓度阿托伐他汀对大鼠骨髓来源内皮祖细胞体外生长特性的影响.方法:取 SD 大鼠长骨骨髓,用密度梯度离心法结合差异贴壁法提取单核细胞,用选择性培养液诱导培养内皮祖细胞,采用免疫荧光染色法鉴定细胞表面标志物.将内皮祖细胞分为对照组和4个不同浓度阿托伐他汀组(0.01,0.1,1,10 μmol/L)进行培养,光镜下观察和MTT法检测细胞生长增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡率,硝酸还原酶法化学比色法检测培养液中一氧化氮和内皮型一氧化氮合酶水平.结果与结论:①对照组和阿托伐他汀组的细胞数量均表现为增长趋势,1 μmol/L阿托伐他汀组增长明显, 10 μmol/L阿托伐他汀组在7 d后出现下降趋势;②1 μmol/L阿托伐他汀组凋亡率低于其他各组,10 μmol/L阿托伐他汀组凋亡率高于其他各组;③0.01,0.1,1.0 μmol/L阿托伐他汀组一氧化氮和内皮型一氧化氮合酶水平明显高于空白对照组(P < 0.01),10 μmol/L阿托伐他汀组一氧化氮和内皮型一氧化氮合酶水平明显低于其他各组(P < 0.01);④结果表明,阿托伐他汀可通过增加内皮型一氧化氮合酶和一氧化氮的生成,促进内皮祖细胞增殖并减少凋亡,其中1 μmol/L浓度的阿托伐他汀适合内皮祖细胞培养.
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富血小板血浆联合柚皮甙体外诱导人骨髓间充质干细胞的成骨分化
背景:已有研究表明富血小板血浆、骨碎补活性成分柚皮甙均可促进间充质干细胞增殖及向成骨分化,二者联合应用的效果尚不明确.目的:观察富血小板血浆联合柚皮甙对人骨髓间充质干细胞体外成骨分化的影响.方法:将第 3 代成人骨髓间充质干细胞分为4组:①空白对照组:α-MEM培养液培养,不加入药物;②富血小板血浆组:加入含富血小板血浆的α-MEM培养液培养;③柚皮甙组:加入含柚皮甙的α-MEM培养液培养;④联合组:加入含富血小板血浆及柚皮甙的α-MEM培养液培养.其中富血小板血浆和柚皮甙含量分别为12.5%、50 μg/L.MTT法检测骨髓间充质干细胞的增殖情况,碱性磷酸酶染色、Ⅰ型胶原免疫组化染色、茜素红染色分析骨髓间充质干细胞成骨分化情况,RT-PCR 检测骨髓间充质干细胞成骨分化过程中相关因子的基因表达.结果与结论:①富血小板血浆、柚皮甙、富血小板血浆+柚皮甙均能促进人骨髓间充质干细胞增殖,其中富血小板血浆+柚皮甙促细胞增殖作用显著;②碱性磷酸酶染色、Ⅰ型胶原免疫组化染色、茜素红染色均显示富血小板血浆组、柚皮甙组、联合组呈阳性反应,其中联合组阳性反应更明显,空白对照组呈阴性或弱阳性反应;③第7,14天时,富血小板血浆组、柚皮甙组、联合组碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原的表达量明显高于空白对照组(P < 0.05),第14天时,联合组碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原的表达量明显高于富血小板血浆组、柚皮甙组(P <0.05);④结果表明,富血小板血浆联合柚皮甙对骨髓间充质干细胞体外增殖有促进作用,并能诱导向成骨细胞分化,两者具有相互协同作用.
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骨髓间充质干细胞在Matrigel凝胶支架上的生长与变化
背景:研究表明,Matrigel 作为一种细胞外基质复合物加入到细胞培养体系中,对细胞的增殖、分化、胶原分泌具有促进作用.目的:建立Matrigel复合骨髓间充质干细胞的三维培养模型,观察Matrigel三维培养条件下骨髓间充质干细胞的形态、增殖及存活情况.方法:全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,进行成骨、成脂诱导鉴定;CCK-8测定第3代骨髓间充质干细胞的生长曲线;选取生长状态良好的第2代骨髓间充质干细胞,与Matrigel混合形成细胞凝胶复合物,采用相差显微镜和苏木精-伊红染色观察骨髓间充质干细胞的形态及增殖情况,Live/Dead染色评价细胞活性.结果与结论:①全骨髓贴壁法分离培养的比格犬骨髓间充质干细胞具备向成骨、成脂细胞分化的能力;②骨髓间充质干细胞的生长曲线呈 S 形,符合正常细胞的生长特性;③相差显微镜下可见骨髓间充质干细胞在Matrigel中逐渐伸长相互交联,呈三维网状生长,增殖状态良好,随着时间延长(7 d后),基质胶逐渐变软塌陷, 14 d时仍可见少部分细胞网状交联生长;苏木精-伊红染色可见第4天时细胞胞质较大,第7天时细胞细长、相互交联;④三维培养第1,4,7天,骨髓间充质干细胞在Matrigel中活性百分比分别为92.57%,95.54%,97.37%,呈逐渐升高趋势;⑤结果表明,骨髓间充质干细胞在Matrigel中的增殖能力较强,活性较高.
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明胶纤维支架促进人牙髓干细胞的成纤维分化
背景:牙髓炎、牙髓坏死使得牙齿丧失活力,牙质变脆易折裂,并且失去牙髓免疫防御反应,如何实现牙髓组织再生成为口腔领域研究热点.支架材料的理化性质、生物相容性等对于干细胞的增殖和分化起关键作用.目的:探讨明胶纤维支架是否能够促进牙髓干细胞向成纤维细胞分化.方法:通过静电纺丝法合成不同浓度的明胶纤维支架,利用扫描电镜观察支架的表面形貌,拉伸实验检测明胶纤维支架的物理学性质.将人牙髓干细胞接种于支架材料表面,利用 MTT 和 RT-PCR 方法检测明胶纤维支架对人牙髓干细胞增殖和成纤维分化能力的影响.结果与结论:①7.5%的明胶纤维支架纤维直径为(2.02±0.36) μm,交联后纤维直径增大,为(3.15±0.52) μm;15%的明胶支架纤维出现粘结,交联后粘结情况更加显著,纤维结构丧失,呈现平面结构;②两种明胶纤维支架均能促进人牙髓干细胞的黏附和生长,第7天时,7.5%明胶纤维支架上的细胞数量明显高于15%明胶纤维支架(P < 0.05);③7.5%明胶纤维支架组Collagen Ⅰ、α-SMA、Periostin和Fibronectin的表达水平高于15%明胶纤维支架组(P < 0.05);④结果表明,7.5%明胶支架的多孔纤维结构更利于细胞的增殖和向成纤维细胞分化.
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骨髓间充质干细胞对衰老大鼠学习能力的影响
背景:目前国内外研究表明骨髓间充质干细胞可作为理想的种子细胞用于修复衰老和病变引起的组织器官损伤.目的:探讨骨髓间充质干细胞对衰老大鼠脑组织氧化水平及脑源性神经营养因子表达的影响,解析其修复衰老大鼠学习记忆能力的机制.方法:选用清洁级SD大鼠30只,分为对照组、模型组和细胞治疗组,每组10只,雌雄各半.采用D-半乳糖皮下连续注射3个月方式构建大鼠衰老模型,造模成功后,细胞治疗组大鼠尾静脉注射骨髓间充质干细胞,每周输入1次,共输入8次.末次移植后采用Morris水迷宫法检测各组大鼠学习记忆能力,采用黄嘌呤氧化法检测脑组织中超氧化物歧化酶活性,硫代巴比妥酸法检测脑组织中丙二醛水平,采用Fe3+还原法检测脑组织总抗氧化能力,采用Real-Time PCR和免疫印记法检测衰老大鼠脑组织脑源性神经营养因子mRNA和蛋白表达.结果与结论:①与模型组相比,细胞治疗组大鼠脑组织超氧化物歧化酶、总抗氧化能力、脑源性神经营养因子mRNA和蛋白水平升高(P < 0.05),丙二醛水平降低(P < 0.05);②与模型组比较,细胞治疗组大鼠穿越平台时间减少,穿越平台次数增多,差异有显著性意义(P < 0.05);③结果表明,骨髓间充质干细胞改善衰老大鼠学习记忆能力可能是通过提高抗氧化能力,调节脑源性神经营养因子表达来实现的.
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长链非编码RNA-H19对缺血缺氧条件下骨髓间充质干细胞生存和血管再生能力的影响
背景:课题组前期研究发现骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)移植后其在局部梗死组织中的生存力低下,形成新生血管的密度较低,在一定程度上影响了其治疗的效率.长链非编码RNA-H19(lncRNA-H19)被证实与骨髓间充质干细胞分化及血管形成密切相关.目的:体外观察 lncRNA-H19对骨髓间充质干细胞在缺血缺氧条件下生存和血管再生能力的影响,并探讨其可能机制.方法:体外培养的骨髓间充质干细胞分为5组:MSCs+H19组、MSCs+H19对照组(MSCs+H19 NC组), MSCs+si-H19组、MSCs+si-H19对照组(MSCs+si-H19 NC组)和MSCs组.其中MSCs+H19组和MSCs+H19 NC组分别予以转染lncRNA-H19及lncRNA-H19 scramble RNA阴性对照,MSCs+si-H19组和MSCs+si-H19 NC组分别转染lncRNA-H19 siRNA及lncRNA-H19 siRNA scramble阴性对照,体外缺血缺氧条件(无血清,体积分数为1% O2)下培养24 h,MTS法检测细胞增殖情况,TUNEL法检测细胞凋亡情况.取细胞培养基上清液分别刺激人脐静脉内皮细胞,观察血管形成情况.Western blot检测各组血管内皮生长因子A表达.结果与结论:①与MSCs组及MSCs+H19 NC组相比,MSCs+H19组增殖能力显著增强,凋亡显著减少,血管管腔样结构明显增多(P < 0.01);②与MSCs组及MSCs+si-H19 NC组相比,MSCs+si-H19组增殖能力显著减弱,凋亡显著增加,血管管腔样结构明显减少(P < 0.01);③与MSCs组及MSCs+H19 NC组相比, MSCs+H19组血管内皮生长因子A表达显著增高;④与MSCs组及MSCs+si-H19 NC组相比,MSCs+si-H19组血管内皮生长因子 A 表达显著减少;⑤结果表明,lncRNA-H19促进骨髓间充质干细胞在体外缺血缺氧环境下的生存并增强其血管形成能力,此作用可能与其上调血管内皮生长因子A表达相关.
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补肾活血汤水提物调控Cbfal/RUNX2基因沉默骨髓间充质干细胞SP7/Osterix及碱性磷酸酶的表达
背景:补肾活血汤可以促进骨髓间充质干细胞成骨分化,探究分子机制利于推向临床.目的:探讨补肾活血汤水提物对Cbfal/RUNX2基因沉默的骨髓间充质干细胞Osterix、碱性磷酸酶表达的影响.方法:骨髓贴壁筛选法分离和培养大鼠骨髓间充质干细胞,Cbfal/RUNX2基因沉默慢病毒转染骨髓间充质干细胞.取第3代骨髓间充质干细胞(空白对照组)、慢病毒沉默骨髓间充质干细胞(沉默组)和阴性病毒载体预处理骨髓间充质干细胞(阴性对照组),以及上述3组骨髓间充质干细胞加入100 mg/L补肾活血汤水提物干预3 d后,检测RUNX2、Osterix蛋白和mRNA表达以及碱性磷酸酶活性.结果与结论:①Cbfal/RUNX2基因沉默慢病毒转染效率达约90%;②与空白对照组和阴性对照组比较,沉默组骨髓间充质干细胞RUNX2和Osterix的蛋白及mRNA表达均下降,碱性磷酸酶活性也明显下降,差异有显著性意义(P < 0.01);③补肾活血汤水提物干预后,沉默组骨髓间充质干细胞RUNX2、Osterix的表达和碱性磷酸酶活性明显增加,差异有显著性意义(P < 0.01);④结果表明,补肾活血汤水提物可以促进骨髓间充质干细胞的RUNX2、Osterix表达,亦增加了碱性磷酸酶活性,从而促进骨髓间充质干细胞成骨分化.
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miRNA-520a-3p调控MAP3K2表达对肺癌干细胞凋亡的影响
背景:有研究证实,miRNA-520a-3p在肺癌干细胞中有一定调节作用,但具体功能和作用机制尚不明确.目的:探索miRNA-520a-3p对肺癌干细胞凋亡的影响,并对其作用机制进行初步研究.方法:采用免疫磁珠法从肺腺癌细胞株A549中分离出CD133+肺癌干细胞.实时荧光定量PCR检测miRNA-520a-3p在CD133+肺癌干细胞中的表达.采用脂质体转染法增加CD133+肺癌干细胞中miRNA-520a-3p表达水平,流式细胞术检测过表达miRNA-520a-3p对CD133+肺癌干细胞凋亡的影响.双荧光素酶报告基因实验检测 miRNA-520a-3p 对 MAP3K2基因的调控作用.Western Blotting 检测过表达 miRNA-520a-3p 对CD133+肺癌干细胞中MAP3K2,Bcl-2和Caspase-3 蛋白表达的影响.结果与结论:①在CD133+肺癌干细胞中,miRNA-520a-3p表达水平显著低于CD133-肺癌细胞(P < 0.05);②过表达miRNA-520a-3p后,显著增加了CD133+肺癌干细胞凋亡百分比(P < 0.05);③抑制miRNA-520a-3p表达能够显著增强含有 MAP3K2基因3'-非翻译区(3'-UTR)报告质粒的荧光素酶活性(P < 0.05),增加miRNA-520a-3p表达能够显著降低含有MAP3K2基因3'-UTR报告质粒的荧光素酶活性(P < 0.05);④过表达miRNA-520a-3p后,CD133+肺癌干细胞中MAP3K2,Bcl-2蛋白表达降低(P均 < 0.05),而Caspase-3蛋白表达增加(P < 0.05);⑤结果表明,在CD133+肺癌干细胞中,miRNA-520a-3p呈低表达状态.miRNA-520a-3p可能通过调控MAP3K2基因表达,诱导CD133+肺癌干细胞凋亡.
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结直肠癌干细胞增殖及侵袭中ABCG2基因的效应
背景:ABCG2转运蛋白能介导多重耐药,高表达 ABCG2蛋白能提高干细胞对于化疗药物的耐受性,但是ABCG2基因对结直肠癌干细胞增殖、侵袭机制尚未证实.目的:探讨ABCG2基因在结直肠癌干细胞增殖、侵袭中的作用.方法:常规培养结直肠癌细胞系HCT116,将其随机分为4份:其中2份采用免疫磁珠法分离CD133阳性细胞(结直肠癌干细胞),分别用ABCG2-siRNA和ABCG2过表达质粒转染,构建结直肠癌干细胞ABCG2蛋白低表达与过表达模型,设为ABCG2蛋白低表达和过表达组;另2份HCT116细胞分别设为细胞正常组、空质粒转染后对照组.用 MTT、Transwell 法测定不同模型下结直肠癌干细胞的增殖、侵袭变化;利用酶联免疫吸附实验及PCR法测定两种不同细胞模型下基质金属蛋白酶与mRNA表达水平.结果与结论:①流式细胞仪检测显示CD133阳性细胞在结直肠癌细胞系HCT116中占2.4%,经免疫磁珠分选纯化后其比例升至94.51%,证实分离培养的细胞为结直肠癌干细胞;②转染前4组细胞MTT值比较无差异(P > 0.05);ABCG2蛋白低表达细胞模型转染后MTT值低于过表达组(P < 0.05);③Transwell结果表明:ABCG2蛋白低表达组细胞迁移能力受到明显的抑制;而ABCG2过表达组穿过基底膜数目相对较多,细胞的迁移及侵袭能力明显增强(P < 0.05);④酶联免疫吸附实验显示ABCG2蛋白低表达组基质金属蛋白酶水平低于过表达组(P < 0.05);PCR测试mRNA结果与酶联免疫吸附实验相似;⑤提示:下调ABCG2蛋白表达能抑制结直肠癌干细胞增殖、侵袭,ABCG2基因通过调控基质金属蛋白酶水平影响结直肠癌干细胞活性.
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人脂肪干细胞及其外泌体的分离与鉴定
背景:间充质干细胞如今在科研领域被广泛地研究和应用,许多研究认为其发挥作用的机制很大程度上依赖于其旁分泌的外泌体.目的:分离纯化人脂肪干细胞来源的外泌体,并鉴定其生物学特性.方法:采用胶原酶消化法获得人脂肪干细胞,进行细胞表面分子标志和成骨、成脂分化能力鉴定.运用超滤法从人脂肪干细胞条件培养基中提取外泌体,应用扫描电子显微镜、粒度仪观察所获外泌体的形态和大小,采用抗体芯片检测外泌体所含蛋白质表达.结果与结论:①人脂肪干细胞呈梭形、漩涡状生长,细胞表面表达CD73、CD44、CD90、CD105分子,具备成脂、成骨等多向分化潜能,可证实为人脂肪干细胞;②大多数外泌体直径均在30-150 nm范围内;扫描电镜显示外泌体呈均一大小的圆杯形态;③抗体芯片显示外泌体含 FLOT1、ICAM、ALIX、CD81、CD63、ANXA5、TSG101等多种特殊蛋白;④以上结果表明实验成功分离得到人脂肪干细胞外泌体.
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人脐带间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的免疫原性变化
背景:人脐带间充质干细胞具有低免疫原性,而人脐带间充质干细胞诱导分化的胰岛素分泌细胞是否保持低免疫原性尚不清楚.目的:探讨人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞诱导分化后在体外的免疫原性变化及移植到宿主后微环境对免疫原性的影响.方法:①采用经典改良方案诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞,流式细胞术检测胰岛素分泌细胞免疫表型及细胞毒性实验中胰岛素分泌细胞的凋亡率;②CCK-8检测单向混合淋巴细胞实验中外周血单个核细胞的增殖能力;③小鼠腹腔及左肾包膜移植胰岛素分泌细胞后,流式细胞术及免疫组织化学检测移植部位的免疫细胞浸润情况.结果与结论:①人脐带间充质干细胞分化的胰岛素分泌细胞高表达 HLA-ABC,低表达 HLA-DR,CD40和CD80;②细胞毒性实验中胰岛素分泌细胞的凋亡率随预致敏脾细胞的增多而升高;③单向混合淋巴细胞实验中效靶比为10:1,50:1时胰岛素分泌细胞能抑制外周血单个核细胞增殖;④腹腔及左肾包膜移植胰岛素分泌细胞后移植部位淋巴细胞增多;⑤结果表明,人脐带间充质干细胞诱导分化的胰岛素分泌细胞在体外保持低免疫原性,但移植到体内后由于微环境的变化而具有一定免疫原性.
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鼠神经生长因子体外诱导脐血间充质干细胞向类神经元分化
背景:脐血间充质干细胞是从胎儿脐血中分离出的一种成体干细胞,具有分化为类神经元的潜能,可用于多种神经系统疾病的治疗.如何有效诱导脐血间充质干细胞向类神经元分化一直是干细胞领域的研究热点,具有很高的科学研究价值.目的:探讨鼠神经生长因子在体外条件下对脐血间充质干细胞向类神经元诱导分化的作用.方法:复苏人脐血间充质干细胞,体外扩增培养并观察细胞形态特征,绘制细胞生长曲线.取第5代脐血间充质干细胞,分别加入质量浓度为50,100,150,200 μg/L的鼠神经生长因子培养液作为诱导组,另设不加任何诱导剂的空白对照组,每日倒置显微镜下观察细胞形态变化并拍照记录,诱导7 d后采用免疫细胞化学法检测神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)的表达,使用Image-Pro Plus 6.0软件计算NSE、GFAP阳性表达率.结果与结论:①脐血间充质干细胞复苏后活性达90%以上,形态为大小不一的长梭形、纺锤形,其生长曲线呈"S"型,第3-6天为细胞对数生长期;②经鼠神经生长因子诱导后细胞形态出现典型类神经元样改变,而对照组细胞形态无明显变化;③免疫细胞化学法显示鼠神经生长因子诱导后细胞NSE、GFAP均呈阳性表达,其中100 μg/L鼠神经生长因子诱导组的NSE、GFAP阳性表达率高,相比其他鼠神经生长因子诱导组差异有显著性意义(P < 0.05),而对照组无NSE、GFAP阳性细胞;④结果表明,鼠神经生长因子在体外能够诱导脐血间充质干细胞分化为类神经元,100 μg/L为较合适的诱导质量浓度.
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无血清和有血清培养人脐带间充质干细胞的对比
背景:研究表明有血清培养体系存在若干风险和问题,比如免疫排斥、批次差异、病毒风险等,另外随着外泌体的发现和应用,无血清培养体系变得越来越重要.目的:系统比较人脐带间充质干细胞无血清培养体系与传统有血清培养体系的异同,为人脐带间充质干细胞的临床转化奠定基础和提供实验数据.方法:无菌条件下采集健康剖腹产足月儿脐带,组织块贴壁法培养人脐带间充质干细胞,从第1代开始有血清培养组用体积分数为10%胎牛血清培养,血清替代物组用体积分数为15%血清替代物培养.倒置显微镜观察其形态变化,流式细胞仪检测其表面标记物,CCK-8检测其增殖能力,诱导分化实验检测其多向分化潜能, Western Blot检测干性标志物oct4、nanog、sox2的蛋白水平.结果与结论:①倒置显微镜下观察可见血清替代物组人脐带间充质干细胞呈现较均一的漩涡状生长,胎牛血清组人脐带间充质干细胞随着细胞代数的增加逐渐出现细胞分化或者老化现象;②两种培养法培养的人脐带间充质干细胞均表达CD73,CD90和CD105,低表达CD34和CD45,二者无明显差异;③增殖能力上胎牛血清组优于血清替代物组;④两种培养法培养的人脐带间充质干细胞均具有成脂、成骨、成软骨诱导分化能力,二者无明显差异;⑤血清替代物组与胎牛血清组oct4、nanog的表达水平无显著差异,血清替代物组sox2表达水平高于胎牛血清组(P < 0.05);⑥血清替代物培养的人脐带间充质干细胞符合间充质干细胞国际标准,血清替代物能够替代胎牛血清成为培养人脐带间充质干细胞的优选方法.
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Wnt/β-catenin信号通路与脐带间充质干细胞向肝样细胞的分化
背景:脐带间充质干细胞可在体内外诱导分化为肝样细胞,然而确切机制目前尚不清楚,研究表明Wnt/β-catenin信号通路与之密切相关.目的:探讨Wnt/β-catenin信号通路对脐带间充质干细胞肝向分化的影响及其机制.方法:采用组织块贴壁法分离培养人脐带间充质干细胞,将培养至第4-6代脐带间充质干细胞分成4组,分别为对照组,常规诱导肝向分化组,激活剂Wnt3a组(在常规诱导肝向分化基础上加入20 μg/L Wnt/β-catenin信号通路激活剂Wnt3a),抑制剂Dkk-1组(在常规诱导肝向分化基础上加入20 μg/L Wnt/β-catenin信号通路抑制剂Dkk-1).分别在诱导第7,14,21,28天收集细胞,采用荧光定量PCR和Western blot检测肝细胞分化相关基因的mRNA和蛋白表达.运用PAS染色、LDL摄取实验、ICG吸收实验在诱导第28天时进行肝样细胞功能检测.结果与结论:①与对照组相比,常规诱导组、激活剂Wnt3a组、抑制剂Dkk-1组中除了CK-19 mRNA及蛋白表达均下调外(P < 0.01),AFP、ALB、HNF4α mRNA和AFP、HNF4α蛋白表达均显著上调(P < 0.05);②与常规诱导组相比,激活剂Wnt3a组AFP、ALB、HNF4α mRNA及AFP、HNF4α蛋白表达均显著下调(P < 0.05);③与常规诱导组、激活剂Wnt3a组相比,抑制剂Dkk-1组AFP、ALB、HNF4α mRNA及AFP、HNF4α蛋白表达显著增高(P < 0.05);④抑制剂Dkk-1组PAS染色、LDL摄取实验、ICG吸收实验中检测到的阳性细胞多,常规诱导组其次,阳性细胞少的是激活剂Wnt3a组;⑤以上结果表明,Wnt/β-catenin信号通路受抑制时可促进脐带间充质干细胞肝向分化,反之,则抑制脐带间充质干细胞肝向分化.
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单唾液酸四己糖神经节苷脂佳质量浓度诱导人脐带间充质干细胞向神经元样细胞的分化
背景:国内外研究证实单唾液酸四己糖神经节苷脂在体外能够诱导人脐带间充质干细胞分化为神经元样细胞,但探索其合适的诱导剂量等相关研究甚少.目的:探索单唾液酸四己糖神经节苷脂在体外诱导人脐带间充质干细胞分化为神经元样细胞的佳质量浓度.方法:采用胶原酶消化法获取人脐带间充质干细胞,扩增后,取第3代细胞,随机分为5组,当细胞融合至70%-80%时,分别加入质量浓度为50,100,150,200 mg/L单唾液酸四己糖神经节苷脂的诱导液,空白对照组只加入等量L-DMEM培养基.倒置显微镜下观察细胞形态变化.诱导第6小时用免疫细胞化学染色方法检测GFAP、NF-H、MAP-2的表达.结果与结论:从脐带组织中分离出来的人脐带间充质干细胞可以稳定传代,并表达间充质干细胞表面标志,单唾液酸四己糖神经节苷脂可以诱导人脐带间充质干细胞向神经元样细胞分化,并表达成熟神经细胞标志物MAP-2、NF-H,佳诱导质量浓度为150 mg/L.
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靶向抑制Molt-4 T细胞增殖的Smo-siRNA:筛选和评价
背景:研究表明,T淋巴细胞白血病的发生发展与Hedgehog通路的异常有关.Smo基因是该信号通路中的关键基因,控制着Hedgehog信号向细胞膜内的传递.目的:筛选一种可以高效抑制Molt-4细胞株增殖和诱导凋亡的小干扰RNA(Smo-siRNA).方法:①根据siRNA设计原理,设计并化学合成Smo-siRNA 1,2,3以及无关干扰序列的阴性对照siRNA;②利用NuclefectorTM核转染仪将以上Smo-siRNA分别转入人T淋巴细胞白血病细胞株(Molt-4细胞),分别在转染24,48,72 h 采用 qRT-PCR 检测 Smo mRNA 相对表达水平,CCK-8法检测细胞生长抑制率, Hoechst33258 染色观察细胞凋亡形态,流式细胞仪(AnnexinV/PI法)检测细胞凋亡率.结果与结论:①利用NuclefectorTM核转染仪成功将Smo-siRNA转入Molt-4细胞,Smo-siRNA 1沉默效果佳,有效降低Molt-4细胞Smo mRNA表达水平(P < 0.05),并且以48 h作用效果明显;②转染后24 h, Smo-siRNA可明显抑制Molt-4细胞生长(P < 0.05);③Hoechst染色证实Molt-4细胞符合凋亡的细胞形态学变化;④与对照组比较,Smo-siRNA1组细胞的凋亡率明显增加(P < 0.05);⑤结果表明,小干扰RNA下调Molt-4细胞Smo基因表达可明显抑制Molt-4细胞增殖,并促进凋亡,提示Smo-siRNA具有作为T细胞白血病靶向基因治疗或者协同治疗的潜能.
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全反式维甲酸处理下HL-60细胞在E-选择素上的滚动黏附
背景:全反式维甲酸能诱导早幼粒细胞向成熟粒细胞分化,是治疗急性早幼粒细胞白血病的理想手段.然而全反式维甲酸治疗过程中出现的分化综合征对其治疗效果有一定影响,该并发症与细胞形态改变、黏附分子表达及功能差异密切相关,特别是整合素和选择素家族.目的:研究不同流体剪切力下,全反式维甲酸处理的HL-60细胞在E-选择素上的滚动黏附,揭示蕴含其中的药物影响效应和力学调控机制.方法:利用平行平板流动腔,驱动经或未经全反式维甲酸处理的HL-60细胞在铺有E-选择素的基质上滚动,记录滚动过程,提取平均滚动速度和平均停留时间等参数.其中,HL-60细胞采用1×10-6 mol/L的全反式维甲酸处理48,72,96 h,剪切力取值为0.02,0.04,0.06 Pa,底板铺展E-选择素的质量浓度为40 μg/L.结果与结论:①随剪切力的升高,经和未经全反式维甲酸处理的 HL-60细胞在 E-选择素上的滚动速度曲线呈现出先减小后增大的两阶段趋势.相应地,平均停留时间和停留时间比率表现出先增加后减小的趋势,由此推断,HL-60细胞在E-选择素上的流动增强型滚动现象是由逆锁键所调控的;②同一剪切力下HL-60细胞的滚动速度随着加药时间的增加呈现出下降趋势.相反地,HL-60细胞的停留比率、平均停留时间时间呈现上升趋势.这进一步说明细胞的停留时间是细胞滚动速度的主要调控因素.
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Y-27632促进人胚胎干细胞向类神经元细胞的分化
背景:Y-27632是Rho相关卷曲螺旋形成的蛋白激酶抑制剂,已被证实具有调节干细胞的自我更新、促进克隆形成和存活的作用.另外,其对神经细胞生长和发育也具有调节和保护作用.而如何提高胚胎干细胞向类神经元细胞分化是神经损伤修复和神经再生领域热点问题.目的:探讨Y-27632对人胚胎干细胞向类神经元细胞分化效率的作用.方法:取16代人胚胎干细胞复苏后,进行形态观察和染色鉴定,采用悬浮培养法制备类胚体,培养8 d后,进行分组贴壁培养:对照组细胞为常规Sato培养基诱导分化;Y-27632组分别在Sato培养基加入5,10, 20,40 μmol/L Y-27632.培养10 d后进行染色鉴定;10-18 d后,进行免疫荧光染色检测胚胎干细胞分化效率和类神经元细胞突起生长情况.结果与结论:①人胚胎干细胞共表达Oct4和SSEA-3干细胞特异蛋白;②悬浮分化培养8 d后,进一步贴壁培养10 d,可观察到具有神经形态,且表达Tuj-1的类神经元细胞;③经不同浓度的Y-27632诱导后,免疫荧光染色发现贴壁细胞数和Tuj-1阳性细胞数显著增加,提示胚胎干细胞向类神经元细胞分化速率加快,且在浓度为10 μmol/L时为明显;④分化培养18 d后,免疫荧光染色显示,与对照组相比,10 μmol/L Y-27632组的Tuj-1阳性细胞数及突起数和突起长度显著增加;⑤结果说明,Y-27632不仅能够促进人胚胎干细胞向类神经元细胞分化,同时促进类神经元细胞突起的生长.
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人参皂苷Rg3对体外培养小鼠神经干细胞分化的影响
背景:神经干细胞来源非常有限,而且在自然分化过程中绝大多数分化为神经胶质细胞,分化为神经元的比例相对较少,因此采取有效措施诱导其向合适的子细胞方向分化是非常重要的科研课题.以往研究证明人参皂苷类成分,如Rb1和Rg1,对神经干细胞的定向分化有一定影响,但Rg3是否对神经干细胞的分化起作用鲜有报道.目的:研究人参皂苷Rg3对小鼠神经干细胞分化为神经元和星形胶质细胞的影响.方法:分离孕14 d的C57BL/6小鼠的胎鼠大脑皮质神经干细胞并传代培养,用神经干细胞特异性免疫抗体Nestin和Sox2检测神经干细胞纯度.用分化培养基联合人参皂苷Rg3(空白对照、50 nmol/L和250 nmol/L)诱导神经干细胞分化3 d,然后用神经元特异性免疫抗体Tuj1和星形胶质细胞特异性免疫抗体GFAP检测神经干细胞分化为神经元和星形胶质细胞的情况,计算Tuj1+/DAPI和GFAP+/DAPI的比例;通过实时荧光定量PCR技术检测各组细胞Tuj1和GFAP mRNA的表达水平.结果与结论:①经细胞免疫荧光实验检测传代培养的小鼠胎鼠细胞几乎全为 Nestin 和 Sox2双阳性细胞,表明成功分离培养出纯度较高的神经干细胞,可以用于后期实验;②诱导分化3 d 后,与空白对照组和250 nmol/L人参皂苷Rg3组相比,50 nmol/L人参皂苷Rg3组对神经干细胞分化为神经元具有明显促进作用(P < 0.01),而空白对照组和250 nmol/L人参皂苷Rg3组之间差异无显著性意义(P > 0.05);③诱导分化3 d后,与空白对照组相比,50 nmol/L人参皂苷Rg3组和250 nmol/L人参皂苷Rg3组对神经干细胞分化为星形胶质细胞具有促进作用(P < 0.05),而50 nmol/L人参皂苷Rg3组和250 nmol/L人参皂苷Rg3组之间差异不明显(P > 0.05);④real time PCR结果总体与细胞免疫荧光结果相似;⑤结果表明,人参皂苷Rg3在50 nmol/L浓度时能明显促进神经干细胞向神经元和星形胶质细胞方向分化;但在250 nmol/L浓度时主要促进其向星形胶质细胞方向分化,对神经元分化没有显著影响.
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超顺磁性氧化铁标记对诱导多功能干细胞体外分化的影响
背景:超顺磁性氧化铁标记技术是一种经典的干细胞活体无创示踪手段,目前已广泛应用于干细胞移植相关的基础与临床研究中.诱导多功能干细胞是目前有潜力用于细胞移植治疗的种子细胞之一,超顺磁性氧化铁标记技术是否也能够用于诱导多功能干细胞的无创示踪,关键看该材料标记后是否严重影响细胞的分化,目前这方面的研究鲜有报道.目的:探究超顺磁性氧化铁标记对诱导多功能干细胞体外分化的影响.方法:分离、培养大鼠皮肤成纤维细胞,用高效重组载体和病毒包装含有目的基因(Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc)的质粒共转染293T细胞,进行病毒包装和生产.使用包装有目的基因的慢病毒载体感染大鼠皮肤成纤维细胞,得到诱导多功能干细胞.实验分2组:实验组诱导多功能干细胞采用超顺磁性氧化铁体外标记后行神经诱导分化,对照组诱导多功能干细胞(未用超顺磁性氧化铁体外标记)直接行神经诱导分化.对磁标记诱导多功能干细胞进行普鲁士蓝染色和透射电镜观察.免疫组化检测诱导分化后神经元特异性烯醇化酶的表达,流式细胞仪检测分化为神经元样细胞及胶质样细胞的比例.结果与结论:①超顺磁性氧化铁粒子标记后普鲁士染色和透射电镜观察可见细胞胞浆内含致密铁颗粒;②诱导多功能干细胞进行神经诱导分化后神经元特异性烯醇化酶呈阳性表达;③实验组诱导多功能干细胞分化为神经元样细胞及胶质样细胞的比例与对照组相比差异无显著性意义(P > 0.05);④结果表明,超顺磁性氧化铁粒子标记对诱导多功能干细胞向神经元样细胞分化无明显影响,合理应用这种新型细胞标记术将促进对再生医学种子细胞的研究.
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大鼠腰椎终板软骨干细胞的分离及分化
背景:细胞克隆筛选系统ClonePix能快速有效的挑选出经低熔点琼脂糖悬浮培养获得的细胞克隆团,能够解决生物治疗所需种子细胞数量不足的问题.目的:分离和鉴定大鼠腰椎终板软骨干细胞.方法:取4周龄SD大鼠10只,解剖显微镜下获得其腰椎终板软骨,采用胰酶与Ⅱ型胶原酶消化获得原代软骨细胞,将原代软骨细胞在低熔点琼脂糖培养基中悬浮培养,细胞克隆筛选系统ClonePix挑取细胞克隆团进行体外扩增,扩增后观察其细胞形态,然后进行成骨、成脂肪及成软骨方向诱导,并检测单克隆形成能力.结果与结论:①利用低熔点琼脂糖悬浮培养法能够获得大鼠腰椎终板软骨细胞克隆团,细胞克隆团经体外扩增培养后形态呈梭形;②诱导后经茜素红、油红O及番红染色证明具有成骨、成脂肪及成软骨分化能力;③将细胞克隆团的单个细胞接种于10 cm培养皿,经过12 d的体外扩增培养,肉眼可观察到细胞集落.随着细胞接种密度的增大,细胞集落形成数目减少,以100个细胞密度接种时,集落形成能力强,可以形成数目大于20个的细胞集落;④结果表明,经低熔点琼脂糖悬浮培养法获得的细胞克隆团具有多向分化能力和高增殖能力.
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雌激素介导下Wnt/β-catenin信号通路调控人牙周膜干细胞的成骨分化
背景:已有实验发现,雌激素能促进人牙周膜干细胞骨向分化,但雌激素调控人牙周膜干细胞成骨分化的具体机制目前尚未明确.目的:探讨雌激素通过Wnt/β-catenin信号通路对人牙周膜干细胞骨向分化的调控作用.方法:采用消化组织块法联合有限稀释克隆法分离培养并纯化得到人牙周膜干细胞,取第3代人牙周膜干细胞随机分为3组:单纯成骨诱导液组(对照组);含1×10-7 mol/L雌激素成骨诱导液组(雌激素组);含100 μg/L Wnt3a成骨诱导液组(Wnt3a组).各组在成骨诱导1,3,5,7 d时检测碱性磷酸酶活性,成骨诱导7 d时采用Western blot检测Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白β-catenin、GSK-3β、P-GSK-3β、CyclinD1以及成骨相关蛋白Runx-2、OCN的表达水平.结果与结论:①各组碱性磷酸酶活性随时间推移均呈上升趋势.雌激素组和 Wnt3a 组在诱导1,3,5,7 d各时间点碱性磷酸酶表达水平均高于对照组(P < 0.05);而雌激素组和Wnt3a组表达水平差异无显著性意义(P > 0.05);②雌激素组和Wnt3a组β-catenin、P-GSK-3β、CyclinD1的表达水平高于对照组(P < 0.05),而GSK-3β表达水平低于对照组(P < 0.05),同时雌激素组和Wnt3a组的成骨中晚期标志物Runx2、OCN表达水平均高于对照组(P < 0.05).雌激素组和Wnt3a组间Wnt/β-catenin信号通路相关因子和成骨中晚期相关蛋白的表达差异无显著性意义(P > 0.05);③结果表明,雌激素可促进人牙周膜干细胞的成骨分化,这种促进作用的实现可能与雌激素微环境下活化人牙周膜干细胞中的Wnt/β-catenin信号通路有关.
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不同共培养模式下间充质干细胞对造血干细胞增殖的作用
背景:虽然进行了大量相关研究,但目前仍缺乏切实可行的体外扩增造血干细胞的方法.间充质干细胞能分泌多种促进造血干细胞增殖并抑制其分化的细胞因子,在维持造血微环境及调控造血干细胞功能中发挥着重要的作用.目的:探讨不同共培养模式下骨髓间充质干细胞在体外对造血干细胞增殖的影响.方法:采用全骨髓贴壁法体外培养 C57BL/6小鼠间充质干细胞至 P3代,采用 miniMACS 磁珠分选仪分选GFP小鼠(C57系)骨髓CD117+细胞(造血干细胞),采用不同共培养模式将2种细胞进行共培养:对照组为造血干细胞单独培养组;实验组为 Transwell 共培养组(上室接种造血干细胞、下室接种间充质干细胞);2D 接触共培养组(24孔板共同接种造血干细胞与间充质干细胞).分别于共培养1,3,5,7 d于倒置相差显微镜、荧光显微镜下观察造血干细胞的形态,并检测造血干细胞的活性细胞数.结果与结论:共培养1-7 d,各组造血干细胞数量均随着培养时间的增加而增加(P < 0.05).各组细胞自3 d开始进入对数生长期,5 d时部分造血干细胞开始出现形态变化.比较第7天造血干细胞活性细胞数,可知与间充质干细胞共培养的实验组及2D接触共培养组均明显高于对照组(P < 0.05):而2D接触共培养组造血干细胞数明显高于非接触培养的实验组(P < 0.05).结果提示:间充质干细胞在体外能够有效促进造血干细胞增殖,接触共培养条件下其促进作用更明显.
