中国组织工程研究杂志
Chinese Journal of Tissue Engineering Research 중국조직공정구여림상강복
- 主管单位： 中华人民共和国卫生部
- 主办单位： 中国康复医学会,《中国组织工程研究与临床康复》杂志社
- 影响因子： 1.38
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 2095-4344
- 国内刊号： 21-1581/R
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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成人移植双份脐血植入状态的定量监测
背景:脐血因所含的有核细胞数量有限,主要应用于儿童患者,近年来,人们尝试将两份脐血混合输入,用于成人血液系统疾病的治疗.目的:定量监测双份异基因脐血用于成人白血病患者移植后两份脐血的植入状态、嵌合体类型、相对数量的动态变化及演变规律.设计:以脐血干细胞移植的供受者为观察对象,供受者移植前及受者移植后不同时间段的系列血样提取DNA作为检测标本,短串联重复序列遗传位点为观察指标.单位:深圳市血液中心输血医学研究所免疫遗传重点实验室.对象:纳入2005-06在北京大学深圳医院住院治疗的急性髓细胞白血病患者,男性,43岁,体质量75 kg.首次化疗完全缓解后6个月移植两份人类白细胞抗原(HLA)各一个位点不合的非血缘脐血,脐血1有核细胞数为2.5×107 kg-1;脐血2有核细胞数为1.53×107 kg-1.脐血来源于广州脐血库.患者对治疗方案知情同意.方法:采用荧光标记复合扩增短串联重复位点嵌合体定量检测技术,对急性髓细胞白血病成人患者移植两份(脐血1有核细胞数为2.5×107 kg-1,脐血2有核细胞数为1.53×107 kg-1)HLA各一个位点不相合的异基因脐血前后的序列血样进行了9个短串联重复序列位点的检测,利用供、受者之间的差异位点定性判断脐血是否植入以及嵌合体类型;而后根据377XL DNA测序仪上荧光扫描后两供者差异基因检出峰的峰面积计算脐血植入后患者体内两份脐血的相对数量,定量分析供体细胞植入程度及演变规律.并与采用HLA差异基因对植入状态的分析结果进行对比.主要观察指标:在成人移植双份脐血后,观察患者及两供者9个位点的短串联重复序列基因在患者体内的转变过程,对植入状态进行定量及定性的描述.结果:移植后15 d两份脐血植入状态为完全双份供者嵌合体,患者体内脐血1的相对细胞数量占51.3%,脐血2占48.7%;30 d时脐血1上升为70.0%,脐血2下降为30.0%.52 d时只检测到脐血1的基因,植入状态转为完全单份供者嵌合体,有核细胞数少的一份脐血被排斥,有核细胞数多的一份长期植入.结论:荧光标记复合扩增短串联重复序列嵌合体定量检测可精确地描述两份脐血的植入程度及变化过程,为临床脐血的应用及供者的选择提供了一个准确、可靠的实验依据,证明双份HLA各一个位点不合的脐血同时用于成人的移植是可行的.
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流式细胞分选术和Rho123在分离MHCC97肿瘤干细胞中的应用
目的:肝癌组织中可能存在具有表型和功能特殊的肝癌细胞,分离和鉴定这群细胞是否具有干细胞特征对阐明肝癌发病机制、揭示肝癌复发和转移具有重要的意义.寻求分离MHCC97肿瘤干细胞的有效方法,探讨角蛋白(CK-19)在不同肝癌细胞亚群中的表达差异.方法:实验于2006-11/2007-05在解放军第四军医大学免疫实验室和肝胆外科实验室完成.细胞来源:MHCC97肝癌细胞(人高转移肝癌细胞系)由上海复旦大学中山医院肝癌研究所提供.实验方法:MHCC97细胞常规消化,HBSS洗涤,制备成单细胞悬液,细胞密度为1×109 L-1.每份取1×106个细胞,参考Rho123对线粒体膜电位测定的0.1 mg/L质量浓度,分别做0.1 mg/L和0.05 mg/L两个质量浓度细胞梯度染色,对照组加入维拉帕米(终浓度50 mmol/L),以未加Rho123作为阴性对照.实验评估:采用免疫细胞化学方法观察细胞角蛋白19在0.05 mg/L Rho123细胞及0.1 mg/L Rho123两组中的表达和含量.结果:单纯加入Rho123组有一低荧光拖尾,而维拉帕米拮抗组无此区域,即0.05 mg/L Rho123细胞占总数的2.1%,其余为0.1 mg/L Rho123组细胞.两组细胞内均有细胞角蛋白19阳性表达,阳性反应为显示位于细胞质的棕黄色颗粒,两组比较有统计学差异(P＜0.05)结论:细胞角蛋白19在肝癌细胞亚群中表达有差异,强阳性多数分布在0.05 mg/L Rho123组中,Rho123结合流式细胞分选术可以有效地分选出癌细胞中的肿瘤干细胞.
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人角膜缘干细胞体外传代及建系
背景:通过体外培养人角膜缘干细胞并进行传代、建系研究可为角膜缘干细胞移植的基础与临床研究提供足够的细胞储备.目的:探讨一种体外培养人角膜缘干细胞传代、建系的方法.设计:随机对照观察.单位:赣南医学院.材料:实验于2003-06/2004-04在赣南医学院科研中心与中山大学医学院眼科医院国家重点实验室完成.新鲜人角膜缘组织块分别取自2名健康人角膜组织供体,均经过供体者知情同意.RPMI-1640(Sigma R8755,含L-谷氨酰胺),200 g/L胎牛血清(Gibco 16140-071).DMEM培养基、硫酸软骨素、人表皮生长因子购自美国Sigma公司,HEPES、DMSO购自美国Gibco公司,100%甘油购自上海运佳黄浦制药有限公司,戊二醛购自德国E.Merk公司,乙醇、盐酸、丙酮、甲醛等购自北京化学试剂公司,0.25%胰蛋白酶液购自上海新华制药厂,上述试剂均为分析纯级.方法:人角膜缘深部色素区组织块经消化后,分别在含有RPMI-1640、200 g/L胎牛血清的培养瓶与以羊膜细胞外基质为培养载体的培养皿中进行体外培养.光镜及扫描电镜观察原代及传代培养细胞的生长情况;采用台盼蓝排斥实验计算冻存细胞逐代冻存处理后的复苏率.主要观察指标:①人角膜缘干细胞体外原代及传代培养观察结果.②细胞冻存复苏率.结果:①原代培养结果:经PRMI-1640培养基中培养1 d后,倒置相差显微镜下可见培养瓶中细胞多已贴壁,均匀稀疏排列成单层并贴于培养瓶底部.②传代培养结果:传第2代时添加人表皮生长因子后,细胞分散成单层,贴壁生长旺盛.所有细胞传至第30代后形态的变异性增加明显,细胞体积明显增大,形态呈圆形或不规则圆形,密集成群.在培养液中传33代后,细胞仍然保持旺盛的分化、增殖能力,并且更适宜在羊膜细胞外基质上生长.③细胞冻存复苏率:冻存细胞的复苏率为82.2%.结论:将人角膜缘干细胞经体外培养33代并逐代冻存后初步建立了人角膜缘干细胞系,人角膜缘干细胞更适合在含有羊膜细胞外基质为底物的培养基中生长.
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散打大负荷专项训练运动对红细胞参数变化的影响
目的:有关持续一段时期大强度、或大运动量、递增负荷强度运动的实验较多,而对运动强度大、时间较短的激烈对抗性运动项目的运动研究较少.实验观察了散打大负荷专项训练对不同运动水平运动员红细胞参数变化的影响,并分析其可能的机制.方法:实验于2003-08-25/2003-08-26在上海体育学院武术散打馆完成.选取上海体育学院男子散打队运动员共16名,实验组为一级和武英级运动员8名,对照组为二级运动员8名,运动员对均对实验内容均知情同意.所有运动员在实验前及实验过程中身体健康,无心血管、肝肾及血液系统疾病史,实验前48 h内受试者均未进行过剧烈运动.采用全自动血细胞分析仪测定实验组和对照组在一次散打大负荷专项训练前后红细胞参数的动态变化.结果:16名受试者均进入结果分析.一次散打大负荷专项训练可导致两组红细胞计数、红细胞压积即刻值均明显低于基础值(P＜0.05),平均红细胞血红蛋白含量、平均红细胞血红蛋白浓度即刻值均明显高于基础值(P＜0.05),运动后12 h均恢复到基础水平,但实验组血红蛋白明显高于对照组(P＜0.05).结论:一次散打大负荷专项训练可导致运动员单位体积红细胞数量因大量红细胞破裂溶血而减少,恢复12 h后,破裂的红细胞数量与补充的新红细胞数量基本上达到一个新的动态平衡,与运动员运动水平高低无关.
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人血小板源性生长因子A基因发夹结构小干扰RNA真核表达载体的构建及鉴定
目的:血小板源性生长因子对诱发视网膜色素上皮细胞移行、终导致增生性玻璃体视网膜病变起到了重要作用.构建人血小板源性生长因子A具有发夹结构小干扰RNA(shRNA)表达质粒,以观察其对人血小板源性生长因子A基因表达的沉默效果.方法:实验于2007-04/2007-07在吉林大学第一临床医院传染科研究室完成.根据血小板源性生长因子A基因mRNA序列,设计有小发夹结构的3条寡核苷酸序列,克隆到空载体pGPU6/GFP/Neo中,构建重组质粒,同时设计构建分别针对人GAPDH干扰质粒作为阳性对照,不针对任何特异基因的质粒作为阴性对照.通过酶切鉴定和测序验证阳性克隆.结果:经重组质粒筛选,重组质粒测序鉴定与设计的shRNA转录模板序列相同,均证实重组质粒构建成功.结论:利用RNA干扰技术路线可成功构建靶向人血小板源性生长因子A的发夹结构小干扰RNA表达载体.
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曲古菌素A对小鼠树突状细胞表面配对免疫球蛋白样受体B表达及细胞功能的影响
目的:观察曲古菌素A对树突状细胞表面配对免疫球蛋白样受体B表达及其对细胞功能的影响,验证曲古菌素A的免疫调节作用,为器官移植耐受及自身免疫性疾病治疗开辟新的方向.方法:实验于2005-01/2006-01于华中科技大学同济医学院附属协和医院血液科实验室完成.①以曲古菌素A(100 mg/L)诱导小鼠树突状细胞系DC2.4细胞为实验组,正常DC2.4细胞为对照组.②体外化学合成特异性配对免疫球蛋白样受体B小RNA干扰片段转染DC2.4细胞,应用半定量反转录-聚合酶链反应及流式细胞仪检测配对免疫球蛋白样受体B的表达.③以DC2.4细胞为刺激细胞,以异基因BALB/C淋巴细胞为效应细胞,3H-TdR标记法检测曲古菌素A对混合淋巴细胞反应的影响.④酶联免疫吸附法检测各组混合淋巴细胞反应上清中干扰素γ的表达水平.结果:①反转录-聚合酶链反应结果显示,曲古菌素A诱导72 h后DC2.4细胞配对免疫球蛋白样受体B mRNA表达水平显著升高(P＜0.01);流式细胞仪检测配对免疫球蛋白样受体B的表达阳性率由(28.65±8.12)%升至(58.78±4.70)%(P＜0.01).②DC2.4细胞可刺激异基因淋巴细胞的增殖.曲古菌素A诱导后异基因混合淋巴细胞反应明显受抑,特异干扰配对免疫球蛋白样受体B表达则使异基因混合淋巴细胞反应增强.③与正常组相比,酶联免疫吸附法检测曲古菌素A诱导组异基因混合淋巴细胞反应上清干扰素γ水平明显降低,配对免疫球蛋白样受体B干扰组明显增高(P＜0.01).结论:曲古菌素A上调小鼠树突状细胞配对免疫球蛋白样受体B的表达可能是树突状细胞获得耐受的分子机制之一.曲古菌素A具有免疫调节作用,可用于自身免疫性疾病或器官移植免疫耐受的诱导治疗.
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慢性粒细胞性白血病干细胞抗伊马替尼机制的初步分析
目的:了解伊马替尼对慢性粒细胞性白血病患者体内BCR/ABL融合基因阳性的原始及定向白血病干/祖细胞分化及增殖的影响,从而更深入阐明部分慢性粒细胞性白血病患者在经历一段血液学甚至是细胞遗传学水平上的完全缓解后复发及对伊马替尼耐药的机制.方法:实验于2006-09/2007-06在河南省血液病研究所完成.①对象:选取10例慢性粒细胞白血病患者,患者对治疗及实验知情同意.实验经医学伦理委员会批准.实验过程中应用的伊马替尼为Novartis公司产品,批号B-1701-0001-000005;氟波酯为淅川制药公司产品,批号030321495.②实验方法:抽取慢性粒细胞性白血病患者骨髓10 mL,分离得到具有血液血管干细胞特性、BCR/ABL融合基因阳性的Flk1+CD31-CD34-细胞.以诱导造血集落的前48 h,96 h,120 h内培养体系中含5μmol/L伊马替尼分别作为伊马替尼1,2,3组,设立空白对照,均体外培养18 d,检测伊马替尼对造血集落培养基中的未分化及处于分化阶段的BCR/ABL融合基因阳性Flk1+CD31-CD34-细胞的增殖抑制作用.采用流式细胞术将BCR/ABL融合基因阳性Flk1+CD31-CD34-细胞分为3个亚群,即G0期、G1期及S/G2+M期,分别评估氟波酯、伊马替尼、氟波酯联合伊马替尼对3个亚群细胞的体外增殖及凋亡的影响.结果:①伊马替尼对处于分化阶段BCR/ABL融合基因阳性Flk1+CD31-CD34-细胞增殖及向血管内皮细胞分化的影响:与空白对照组比较,伊马替尼1组每1000个BCR/ABL融合基因阳性Flk1+CD31-CD34-细胞产生的粒-单系祖细胞集落数、红系爆式集落数无明显变化(P＞0.05),伊马替尼2,3组两种造血集落数均显著降低(P＜0.05).在内皮诱导体系中与空白对照组比较,伊马替尼3组CD31+/vWF+细胞出现率明显降低(P＜0.05),且分化形成血管样结构的时间延迟.②伊马替尼诱导BCR/ABL融合基因阳性Flk1+CD31-CD34-细胞及其分化细胞凋亡的比较:5 μmol/L伊马替尼作用48 h后,BCR/ABL融合基因阳性Flk1+CD31-CD34-细胞凋亡数量明显低于其分化的造血、血管内皮细胞(P＜0.05).③氟波酯联合伊马替尼对白血病干细胞体外分化及凋亡的影响:氟波酯联合伊马替尼能显著诱导处于G0期的BCR/ABL融合基因阳性Flk1+CD31-CD34-细胞分化为造血细胞,同时也能显著诱导其凋亡.单独应用氟波酯或伊马替尼均对处于G0期的BCR/ABL融合基因阳性Flk1+CD31-CD34-细胞凋亡无明显影响,进入G1期及S/G2+M期后有一定的促凋亡作用.结论:①临床所观察到的慢性粒细胞性白血病患者在运用伊马替尼一段时间后出现正常的造血恢复现象,可能仅仅是因为伊马替尼清除了定向恶性白血病祖细胞的增殖.②氟波酯联合伊马替尼可有效诱导原始白血病干细胞的分化及凋亡.
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外周血CD4+CD28+T淋巴细胞数量与阿托伐他汀对急性冠脉综合征患者干预的相关性
目的:急性冠脉综合征患者T淋巴细胞活化增殖以及细胞因子分泌增加.实验拟进一步验证阿托伐他汀干预急性冠脉综合征患者炎症细胞因子和CD4+CD28+T淋巴细胞的变化.方法:选择2006-03/2006-07在南方医科大学附属珠江医院心内科住院患者30例.患者对治疗均知情同意,并经医院伦理委员会批准.急性冠脉综合征组20例(急性心肌梗死10例,不稳定心绞痛10例),稳定性心绞痛组10例作为对照.所有患者在随访的6个月中,除按照入院前冠心病治疗常规服用阿司匹林、玻立维、硝酸酯类等药物外,加用阿托伐他汀20 mg,1次/d,持续服用到随访日期.采用ELISA检测各组患者治疗前后外周血清以及培养的外周血单个核细胞上清中肿瘤坏死因子α和干扰素-γ的水平,采用流式细胞仪检测患者治疗前后CD4+CD28+T淋巴细胞的数量.结果:30例患者均进入结果分析.阿托伐他汀治疗前后对比,急性冠脉综合征组外周血清以及培养的单个核细胞上清中肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ的水平均明显下降(P均＜0.001),而稳定性心绞痛组无明显变化(P＞0.05),急性冠脉综合征组外周血CD4+CD28+T淋巴细胞数量明显减少(P＜0.001),稳定性心绞痛组无明显变化.结论:急性冠脉综合征患者促炎症细胞因子以及外周血CD4+CD28+T淋巴细胞的数量接受阿托伐他汀干预可下调.
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mSOD1转基因阳性家族性肌萎缩侧索硬化症模型大鼠的生物学特征
目的:家族性肌萎缩侧索硬化症转基因大鼠模型的鉴定及生物学特性的检测.方法:实验于2006-06/12在北京市虹天济神经科学研究院完成.从国外购来mSOD1转基因的肌萎缩侧索硬化症大鼠模型及其野生型进行繁殖扩增;PCR筛选mSOD1基因阳性鼠作为实验观察对象;观察其行为学变化、绘制生长曲线;记录神经传导速度及肌电情况;苏木精-伊红染色法观察股二头肌标本病理学变化;尼氏染色法进行中枢神经系统的神经元计数.实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.结果:繁殖并扩增了肌萎缩侧索硬化症模型的种群;PCR法成功筛选出了mSOD1基因的阳性鼠,mSOD1阳性鼠在生长过程中逐渐出现四肢运动障碍、体质量急剧降低且很快死亡;发病鼠神经传导速度减慢、肌电显示出自发的纤颤电位;肌纤维发生萎缩;中枢神经系统的神经元丢失明显且有部分神经元发生空泡样变.结论:mSOD1转基因阳性的肌萎缩侧索硬化症模型大鼠可表现出与人类疾病的相似症状,生物学各项指标变化明显,是理想的肌萎缩侧索硬化症研究模型.
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急性心肌梗死后外周血单个核细胞表面CD147与基质金属蛋白酶-9 mRNA表达的相关性
目的:基质金属蛋白酶在急性心肌梗死后的心室重构中起着重要作用,但其调节机制目前尚未明确.实验拟通过动物模型的建立及体外细胞培养,观察急性心肌梗死后单个核细胞表面CD147与心肌成纤维细胞基质金属蛋白酶-9 mRNA表达的关系.方法:实验于2006-08/2007-06在河北省人民医院临床实验中心完成.实验材料:SD大鼠及SD仔鼠(出生1～3 d)购自河北医科大学试验动物中心.实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.实验方法:①将30只大鼠随机分为急性心肌梗死组(n=15)和假手术组(n=15),假手术组只过线不结扎.流式细胞分析法检测大鼠术后24 h外周血单个核细胞表面CD147表达.②选择SD仔鼠制备心肌成纤维细胞.将单个核细胞与心肌成纤维细胞以细胞数0.5:1,1:1,2:1混合培养24 h后,半定量反转录-聚合酶联反应法检测基质金属蛋白酶-9 mRNA表达.当单核细胞与心肌成纤维细胞2:1混合时,加入CD147单克隆抗体1,2,4 μL/L,培养24 h后检测基质金属蛋白酶-9 mRNA表达.结果:①急性心肌梗死后外周血单个核细胞表面CD147表达明显增加.②单个核细胞与心肌成纤维细胞混合培养,随着单个核细胞比例的增加,心肌成纤维细胞基质金属蛋白酶-9mRNA表达增加.③在单个核细胞与心肌成纤维细胞2:1混合培养体系中,随着加入CD147单克隆抗体浓度的增加,基质金属蛋白酶-9mRNA生成减少.结论:急性心肌梗死后单个核细胞表面CD147表达明显增加,对心肌成纤维细胞基质金属蛋白酶-9生成起上游调节作用.
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人胚胎干细胞分化为心肌细胞的体外实验
背景:体外诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞国内外已做了大量研究.然而,在国内对胚胎干细胞分化为心肌细胞的研究只限于小鼠胚胎干细胞,还未见有将人胚胎干细胞诱导为心肌细胞的报道.目的:将人胚胎干细胞系H14诱导分化为心肌细胞.设计:体外人胚胎干细胞培养细胞,采用悬浮法让其形成拟胚体,在不同的分化时期观察出现有节律性收缩的拟胚体的比率以及心肌特异性基因的表达.单位:香港中文大学公共卫生学院何鸿燊防治传染病研究中心分子生物学实验室.材料:实验所用人胚胎干细胞株H14来源于美国威斯康星大学WiCell研究所并授权使用.方法:于2006-08/12在香港中文大学公共卫生学院何鸿燊防治传染病研究中心分子生物学实验室完成.采用悬浮法培养人胚胎干细胞株H14,让其形成拟胚体.4 d后,将拟胚体培养在包被有明胶的6孔培养板内(5～10个胚胎体/孔),让其自发分化为跳动的拟胚体,显微镜下观察有节律性收缩的拟胚体;然后采用反转录聚合酶链反应方法检测心肌特异性基因的表达.主要观察指标:不同的分化时期有节律性收缩的拟胚体的比率以及心肌特异性基因的表达.结果:拟胚体形成8 d后,大约有2%的拟胎体出现有节律性的收缩,随着时间的延长,产生收缩的拟胚体越多,到第16天,大约有10%的拟胚体出现节律性跳动,跳动频率为70～100次/min.反转录聚合酶链反应结果显示,有节律性收缩的拟胚体表达心肌特异性的转录因子GATA-4和Nkx2.5,心肌特异性基因IsI-1和α-MHC.结论:国内首次成功使人胚胎干细胞诱导分化为心肌细胞.
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hVEGF165基因转染后骨髓间充质干细胞蛋白分泌功能及成骨活性的检测
目的:血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在血管再生和骨组织再生过程中起着重要的调节作用.观察hVEGF165基因转染的骨髓间充质干细胞分泌VEGF的功能及转染后细胞的成骨活性.方法:实验于2004-07/2005-12在江苏省血液研究所国家重点实验室完成.①体外分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞,传代培养后以1 μg PcDNA3.1-hVEGF165:3μL阳离子脂质体Lipofectamine的比例转染,通过免疫组织化学SP方法检测转染后细胞中外源性VEGF的表达.②体外分离、培养大鼠肾微血管内皮细胞,分别加入hVEGF165基因转染48 h及1周后细胞上清、空载体转染及未转染组细胞上清,MTT法观察细胞增殖情况,以了解转染后细胞培养上清中VEGF的生物学活性.③测定在正常条件培养和成骨条件培养下,转染后细胞上清中碱性磷酸酶、骨钙素的水平.结果:①hVEGF165基因转染的骨髓间充质干细胞能成功分泌VEGF蛋白.②hVEGF165基因转染48 h组大鼠肾微血管内皮细胞A值高于空载体转染及未转染组(P＜0.05),但低于hVEGF165基因转染1周组.③成骨条件培养下,基因转染组细胞碱性磷酸酶和骨钙素的分泌量明显高于未转染组(P＜0.05);而在正常条件培养下,基因转染组细胞碱性磷酸酶和骨钙素的表达分泌量较低.结论:①采用基因转染技术可将hVEGF165基因转染到骨髓间充质干细胞中并可有效表达具有生物活性的VEGF,且这种生物学活性呈剂量依赖性.②在成骨条件培养下,转染hVEGF165基因后骨髓间充质干细胞的成骨能力增强.
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绿色荧光蛋白标记对大鼠骨髓间充质干细胞生长的影响
目的:观察腺病毒pAdEasy系统携带绿色荧光蛋白对骨髓间充质干细胞的标记效率及标记对骨髓间充质干细胞生长的影响,为进一步追踪研究骨髓间充质干细胞奠定基础.方法:实验于2006-11/2007-03在四川大学华西组织胚胎学与神经生物学实验室完成.①实验材料:成年雄性SD大鼠,体质量100～120 g,由四川大学实验动物中心提供.实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:采用密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,传代扩增,应用免疫细胞化学方法对培养的骨髓间充质干细胞进行鉴定.将生长到约80%融合的第3代骨髓间充质干细胞随机分为绿色荧光蛋白标记组和对照组.绿色荧光蛋白标记组加入1:100稀释的腺病毒(pAdEasy-1-pAdTrack-CMV)上清液,对照组加入磷酸盐缓冲液.③实验评估:观察绿色荧光蛋白标记对骨髓间充质干细胞生长曲线的影响.结果:体外培养的原代骨髓间充质干细胞24 h内可见有少量贴壁细胞,8～10 d左右达到70%～80%汇合.免疫细胞化学检测第3代骨髓间充质干细胞显示,CD44和CD90表达阳性,而CD14和CD34表达阴性.生长曲线表明,绿色荧光蛋白标记对骨髓间充质干细胞增殖无明显影响.结论:腺病毒pAdEasy系统携带绿色荧光蛋白标记的骨髓间充质干细胞效率高,标记后对细胞的生长无明显影响.
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C6细胞中诱导体外培养大鼠神经干细胞迁移蛋白的初步分析
目的:许多体内实验表明神经干细胞具有向胶质瘤细胞迁移的特性,该特性使神经干细胞有可能成为基因治疗脑胶质瘤潜在的基因携带者.实验拟观察大鼠星形胶质瘤C6细胞诱导体外培养的大鼠神经干细胞的迁移作用,并初步分离C6细胞中诱导神经干细胞迁移的蛋白.方法:实验于2005-01/2006-05在南通大学江苏省神经再生重点实验室完成.实验材料:C6细胞用含10%小牛血清的DMEM/F12培养基进行培养,使用时细胞处于对数生长期.清洁级的新生1周内的SD大鼠由南通大学实验动物中心提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.实验方法:从新生5～7 d SD大鼠大脑皮质分离培养、纯化神经干细胞.从SD新生红皮鼠大脑皮质分离、培养、纯化星形胶质细胞.采用"Transwell Inserts"细胞培养室培养系统共培养36 h,比较C6细胞和大鼠星形胶质细胞对体外培养的大鼠神经干细胞的迁移作用;自然系统聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳分离C6细胞和星形胶质细胞差异蛋白,观察各蛋白凝胶条带对神经干细胞的迁移作用.结果:体外培养C6细胞能诱导神经干细胞迁移,迁移细胞数目与星形胶质细胞相比,差异有显著意义(P＜0.001).将C6细胞中差异蛋白条带与神经干细胞共培养,与对应的星形胶质细胞蛋白条带相比,可观察到与相对分子质量约67 000蛋白胶条共培养的神经细胞球在接近蛋白胶条的一侧细胞向胶条迁移生长.结论:C6细胞可以诱导体外培养的神经干细胞迁移,其总蛋白在自然系统聚丙烯酰胺凝胶电泳分离实验中获得的相对分子质量为67 000的蛋白组分具有诱导神经干细胞迁移的活性.
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5-氮胞苷诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化
目的:目前在5-氮胞苷诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化领域中,对用于诱导的细胞代次选择不一.实验选择第2,9代骨髓间充质干细胞,观察比较经5-氮胞苷体外诱导后其各自向心肌细胞分化过程中心肌特异性肌钙蛋白cTnT和早期分化基因的表达.方法:实验于2005-07/2007-07在天津中医药大学病理三级实验室完成.①实验方法:清洁级Wistar雄性大鼠,脱颈处死后取双侧股骨、胫骨,采用密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞进行原代培养.去掉原代细胞瓶内的培养液,D-Hank's液冲洗去除血清,胰蛋白酶+乙二胺四乙酸消化,制备单细胞悬液,按1:3传代.用10 μmol/L的5-氮胞苷分别诱导第2,9代骨髓间充质干细胞,诱导4周,并设立未加诱导剂的阴性对照.②实验评估:倒置相差显微镜下观察细胞的生长情况及形态变化;免疫组织细胞化学法检测心肌特异性肌钙蛋白cTnT的表达,胞浆出现棕黄色颗粒状物质为阳性;嵌合荧光法检测心肌早期基因NKx2.5、GATA-4、Desmin、α-actin的相对表达量.结果:①细胞形态学观察:5-氮胞苷诱导前细胞生长较快,诱导后死亡细胞较多且生长较慢.诱导后2,3,4周,第9代骨髓间充质干细胞无论在形态和细胞活力方面均优于第2代.②心肌特异性肌钙蛋白cTnT的表达:5-氮胞苷诱导4周后,第9代骨髓间充质干细胞心肌特异性肌钙蛋白cTnT阳性表达率明显高于第2代[(22.42±9.97),(11.22±5.62)%,P＜0.05],阴性对照无阳性表达.③心肌早期基因的表达:反转录-聚合酶链反应结果显示,5-氮胞苷诱导4周后,第9代骨髓间充质干细胞心肌早期基因NKx2.5、GATA-4、Desmin、α-actin的相对表达量均明显高于第2代(P＜0.05).结论:经5-氮胞苷诱导后,骨髓间充质干细胞表达心肌特异性肌钙蛋白cTnT及4种心肌早期基因,证实其能够向心肌细胞分化,且传至第9代时向心肌细胞分化的能力要强于第2代.
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脑源性神经生长因子促进成年大鼠脑海马神经干细胞定向分化的浓度选择
目的:探讨培养基中表皮生长因子与血清两者浓度一定的条件下,不同浓度的脑源性神经生长因子对成年大鼠脑海马神经干细胞向神经元分化的影响.方法:实验于2007-08在中国医科大学神经解剖研究室完成.①材料:清洁级雄性成年SD大鼠1只,由中国医科大学实验动物部提供,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.实验过程中应用的表皮生长因子、脑源性神经生长因子均由R&D公司提供.②实验方法:无菌条件下分离大鼠脑海马组织,剪碎后胰蛋白酶消化,过滤、离心、弃上清,加入含2%B27、20 μg/L表皮生长因子、20 μg/L碱性成纤维生长因子的DMEM/F12无血清条件培养基体外培养神经干细胞,传至第4代时利用有限稀释法进行单克隆培养,100倍镜下克隆球直径约为200μm时制备单细胞悬液,稀释后滴加于96孔板内,设立两组,全量新鲜培养基组加入刚配置未使用过的DMEM/F12无血清培养基100μL,半量条件培养基组加入上述曾用于神经干细胞培养且含有其代谢产物的1/2 DMEM/F12无血清培养基100μL.③实验评估:观察神经干细胞的单克隆培养增殖情况.对克隆球行巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶、胶质原纤维酸性蛋白免疫细胞化学染色.按培养基中脑源性神经生长因子终浓度的不同将所培养细胞设立0,50,100,150,200 μg/L组,各组均加入20μg/L表皮生长因子和体积分数为0.1的胎牛血清,1周后行神经元特异性烯醇化酶免疫细胞化学染色,检测神经干细胞向神经元分化情况.结果:①神经干细胞单克隆培养结果:单克隆培养开始时神经干细胞增殖缓慢,半量条件培养基组细胞增殖速度快于全量新鲜培养基组,随着细胞数的增多,两组细胞增殖速度也相应加快,分别在培养后第12天、第15天形成直径为200μm的克隆球.②神经干细胞免疫细胞化学染色结果:单克隆培养后克隆球表达巢蛋白,诱导分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质原纤维酸性蛋白均呈阳性表达.③各组神经干细胞分化为神经元的比例:与0 μg/L脑源性神经生长因子组比较,50,100 μg/L脑源性神经生长因子组的神经干细胞分化为神经元比例均明显增高(t=2.502～5.025,P＜0.05);而浓度为150,200 μg/L时均无明显变化(t=0.420～1.857,P＞0.05).结论:向含有B27、表皮生长因子、碱性成纤维生长因子的DMEM/F12条件培养基中加入20 μg/L表皮生长因子和体积分数为0.1胎牛血清的情况下,脑源性神经生长因子促使神经干细胞向神经元分化的较佳浓度为50 μg/L.
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不同代数永生化支气管上皮细胞中蛋白质的分布特征
目的:采用凝胶分离、高效液相色谱/质谱联用技术对不同代数的永生化支气管上皮细胞加以研究,说明不同代数导致的蛋白质分布变化.方法:实验在大连化学物理研究所生物技术部生物分子高效分离与表征实验室完成.实验所用的样品MP49和MP188来自中国医学科学院,由程书钧院士友情提供.M细胞是中国医学科学院自行建立的永生化支气管上皮细胞系的第49代和188代,利用该实验室配制的无血清培养基进行常规细胞培养,收集培养液.采用凝胶分离、高效液相色谱/质谱联用技术对分泌到培养液中的分泌蛋白质进行特征分析.结果:MP49的蛋白的相对分子质量分布较广,几乎在10 000～100 000范围内都有蛋白质分布;MP188的蛋白主要集中在高分子量范围和低分子量范围内(Mr＞600 00,＜100 00).MP49酶解产物中疏水性肽明显多于MP188.结论:在支气管上皮的恶性演变过程中寻找可能的癌症早期诊断蛋白质标记物,从亲水性较强的高分子量或低分子量蛋白质入手可能会得到更好的结果.
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骨髓瘤细胞抑制骨髓间充质干细胞向成骨细胞的转化
目的:多发性骨髓瘤患者的长期生存率没有得到提高,因此进一步明确多发性骨髓瘤的发病机制并寻找理想的治疗方法是当前研究的重要课题.实验观察多发性骨髓瘤细胞对骨髓间充质干细胞成骨分化的潜能及对其表达核因子κB受体激活剂配体/骨保护蛋白的影响.方法:选择2006-07/2007-06在苏州大学附属第二医院住院的7例多发性骨髓瘤患者,患者经骨髓细胞学检查、血液生化测定及免疫球蛋白定量分析等符合多发性骨髓瘤诊断标准.正常成人骨髓由苏州大学附属第二医院血液科研究生捐献.患者对实验知情同意,并经医院伦理委员会批准.实验方法:常规分离培养两种来源骨髓间充质干细胞,采用直接免疫荧光标记及流式细胞术分析其表面标志.观察两种来源骨髓间充质干细胞在成骨诱导培养条件下向成骨细胞分化的潜能,并在诱导培养的第1天和3周时分别加入RPMI 8266或XG7多发性骨髓瘤细胞株,于培养28 d后行Von-Kossa及TRAP染色;多发性骨髓瘤细胞与正常骨髓间充质干细胞共培养24 h后,应用RT-PCR法检测核因子κB受体激活剂配体/骨保护蛋白的表达.结果:①两种骨髓间充质干细胞形态无明显区别,表型特征相似,均可在成骨诱导培养后向成骨细胞分化.②Von-Kossa染色后提示来源于多发性骨髓瘤患者的骨髓间充质干细胞成骨分化潜能较差,矿化基质沉积较正常来源骨髓间充质干细胞少.两种骨髓间充质干细胞共培养第28天行Von-Kossa染色后,可见矿化基质沉积较不加入多发性骨髓瘤细胞株组明显减少(P＜0.001),TRAP染色未发现破骨样细胞的存在.③RT-PCR结果显示,正常骨髓间充质干细胞不表达核因子κB受体激活剂配体,但表达骨保护蛋白,与骨髓瘤细胞共培养后,8226或XG7细胞可明显上调骨髓间充质干细胞表达核因子κB受体激活剂配体,相反骨保护蛋白表达明显受抑.结论:多发性骨髓瘤细胞抑制骨髓间充质干细胞的成骨分化及上调骨髓间充质干细胞表达核因子κB受体激活剂配体,抑制骨保护蛋白的表达可能是多发性骨髓瘤患者骨病发病的主要原因.
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抑瘤素表达产物诱导大鼠肝干细胞WB-F344体外分化
目的:抑瘤素是一种肝细胞促分化因子,能够诱导胚胎肝细胞分化为具有各种代谢功能的成熟肝脏.构建以抑瘤素为主的肝干细胞体外诱导微环境,观察其诱导大鼠肝脏来源的干细胞WB-F344体外分化.方法:实验于2002-10/2004-07在解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所完成.①实验材料:表达抑瘤素的CHO-OSM-EGFP细胞株由李晓利等构建.WB-F344细胞由姚鹏博士惠赠.②实验方法:将终浓度为20%稳定表达抑瘤素的中国仓鼠卵巢细胞上清中加入浓度为1 U/mL胰岛素、1×10-7mol/L地塞米松,与WB-F344细胞共培养.空白对照组中未加入诱导分化成分CHO-OSM-EGFP细胞上清、胰岛素、地塞米松.③实验评估:采用流式细胞术分析细胞周期和细胞凋亡,光学显微镜观察细胞形态,RT-PCR分析白蛋白及甲胎蛋白基因表达.结果:①诱导后的WB-F344细胞较空白对照组G2/M+S期细胞所占比例明显减低,增殖指数下降约2.8倍,G0/G1细胞所占比例明显增加.②实验组WB-F344细胞形态发生明显改变,由初的多角形变为长梭性,细胞伸出小管状伪足,核质比例下调,形态趋于成熟大鼠肝脏实质细胞.③RT-PCR结果显示,诱导后WB-F344细胞表达白蛋白,不表达甲胎蛋白.诱导前WB-F344细胞表达甲胎蛋白,不表达白蛋白.结论:在以抑瘤素为主的诱导微环境中,WB-F344细胞表现出生长抑制,形态及功能趋于成熟的大鼠肝细胞
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骨髓间充质干细胞移植入脑缺血大鼠侧脑室后的迁移及分化:免疫荧光标记
目的:骨髓间充质干细胞可以分化成神经细胞替代受损组织,并可分泌生长因子和营养因子来促进其体内细胞的存活和分化.实验将体外扩增和Hoechst33342标记的骨髓间充质干细胞移植入缺血性大鼠侧脑室内,观察干细胞在大鼠脑内的生存、迁移、分化情况及对神经功能恢复的影响.方法:实验于2004-12/2007-06在南京大学医学院附属鼓楼医院科研部完成.①取体质量120～160 g的SD大鼠用于制备移植细胞;另取80只体质量250～300 g的SD大鼠用于制作大脑中动脉闭塞模型.实验方法符合动物伦理学要求.②应用直接贴壁法分离纯化及扩增大鼠骨髓间充质干细胞,荧光染料Hoechst33342标记.③将造模成功的75只大脑中动脉闭塞大鼠按随机数字表法分为3组:模型对照组15只;磷酸缓冲液组30只;骨髓间充质干细胞移植组30只,将骨髓间充质干细胞立体定向移植到大鼠缺血侧脑室中.④术后1,3,6,12,24 d测定大鼠神经功能损害评分,荧光显微镜下观察Hoechst33342标记的骨髓间充质干细胞在脑内的生存和迁移情况,采用免疫荧光法检测胶质原纤维酸性蛋白和微管相关蛋白2的表达.结果:①细胞移植后6 d,12 d骨髓间充质干细胞移植组大鼠的神经功能评分均显著低于磷酸缓冲液组(P＜0.05).②移植的骨髓间充质干细胞可在大鼠脑组织中存活,并向缺血区域迁移.③移植第24天Hoechst33342/微管相关蛋白2、Hoechst33342/胶质原纤维酸性蛋白双阳性细胞占Hoechst33342阳性细胞的百分率为(10.45±1.35)%,(8.73±1.38)%.结论:骨髓间充质干细胞可以在动脉闭塞局灶性脑缺血模型大鼠脑中存活,并向缺血区域附近迁移,在一定条件下可分化为神经元和星形胶质细胞,同时能促进局灶性脑缺血大鼠的神经功能恢复.
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不同浓度重组人骨形成蛋白2和碱性成纤维生长因子对犬骨髓基质细胞的生物学作用
目的:骨形成过程由骨形成蛋白诱导开始,并受到多种生长因子的综合调控.为建立良好的细胞培养体系和配制含有多种生长因子的活性材料,现察不同浓度的重组人骨形成蛋白2和碱性成纤维细胞生长因子对犬骨髓基质细胞增殖、成骨分化的影响.方法:实验于2007-05/07在上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔生物工程实验室完成.①实验材料:1岁beagle犬3只.重组骨形成蛋白2,碱性成纤维细胞生长因子(Peprotech).②实验方法:犬肌注麻醉后,穿刺抽取2 mL骨髓,离心制备骨髓基质细胞,进行原代培养.待细胞80%汇合时,胰酶+乙二胺四乙酸消化传代.③实验评估:取传至第3代的细胞,接种后分别加入重组骨形成蛋白2和碱性成纤维细胞生长因子,各自分为0,25,50,100,200 μg/L组.于第1,2,3,4,5,6天倒置显微镜下动态观察细胞形态;MTT比色法测定细胞增殖水平;碱性磷酸酶活性定量检测细胞成骨分化情况;于第6天行Von Kossa及碱性磷酸酶染色.结果:①细胞形态观察:第3代骨髓基质细胞诱导培养3 d后,多角形细胞增多,细胞逐渐向梭形或多边形转化,胞体膨大,存在大小形态不一的胞浆突起,胞核较大,位于细胞体一侧,偶见2个核仁;约6 d细胞融合,仍以长梭形或线形为主,集落生长趋势明显.②细胞增殖测定:与空白对照组比较,100,200μg/L重组骨形成蛋白2能显著促进骨髓基质细胞生长,且浓度为100μg/L时随作用时间的延长细胞生长速度增加尤为明显(P＜0.01);50μg/L碱性成纤维细胞生长因子能显著促进骨髓基质细胞生长(P＜0.05).③细胞成骨分化测定:与空白对照组比较,25 μg/L重组骨形成蛋白2能显著促进犬骨髓基质细胞分化,且随作用时间的延长细胞分化尤为明显(P＜0.01).碱性成纤维细胞生长因子无显著促进犬骨髓基质细胞分化作用.④Von Kossa染色结果:各组均有明显钙结节形成.⑤碱性磷酸酶染色结果:各组胞质内均可见紫色颗粒,呈阳性表达.结论:100 μg/L重组人骨形成蛋白2与50 μg/L碱性成纤维细胞生长因子均能有效地促进犬骨髓基质细胞增殖,25μg/L重组人骨形成蛋白2可明显促进犬骨髓基质细胞成骨分化,为构建活性骨替代材料提供良好的实验平台.
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骨髓间充质干细胞移植改善心肌梗死患者心功能
学术背景:目前常用的心肌梗死治疗方法-介入治疗能改善心肌缺血,但坏死心肌不能自主修复.近年来干细胞移植成为治疗缺血性心脏病研究的热点,且间充质干细胞具有取材方便,免疫排斥性低,多向分化性,不涉及伦理道德问题等优点,更是倍受重视.目的:总结骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死的研究进展.检索策略:由该论文的研究人员应用计算机检索Pubmed数据库1990-01/2007-12关于骨髓间充质干细胞治疗心肌梗死的文献,检索词"Mesenchymal stem cells,transplantation,myocardial infarction",并限定文章语言种类为English.同时检索万方数据库2002-03/2007-03相关的文章,检索词为"骨髓间充质干细胞移植,心肌梗死",并限定文章语言种类为中文.然后对资料进行初审,纳入标准:①与骨髓间充质干细胞治疗心肌梗死密切相关.②同一领域选择近期发表或在权威杂志上发表的文章.排除标准:重复性研究.文献评价:文献的来源主要是骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死方面的随机对照试验.所选用的31篇文献中,7篇为综述,其余均为临床或基础实验研究.资料综合:①骨髓干细胞具有比既往预期更高的可塑性,在心肌梗死后能迁移到心肌损伤部位,在心脏环境中横向分化为心肌细胞和血管内皮细胞,参与坏死心肌组织的再生.②临床研究证实,骨髓干细胞移植可以改善心肌梗死患者的心功能.③关于骨髓间充质干细胞在软骨修复方面的研究虽已取得较大进展,但仍存在许多问题,如测定移植细胞的成活率并找到提高其成活率的方法;心肌梗死面积多大进行细胞移植会更有效;需发明一种能长期标记移植细胞的技术,明确被成功移植的细胞的状态;确定佳细胞移植的时间、数量,并进一步完善移植方法等.结论:有关骨髓间充质干细胞改善心肌梗死患者心功能、细胞移植方法等方面的研究取得很大的进展,但仍存在许多需要解决的问题.
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中医药在干细胞移植治疗心血管疾病中的作用
学术背景:在骨髓干细胞移植治疗心脏疾病的研究中,常用的移植方法是将干细胞直接注射到受损的心肌,可促进心肌组织修复的外周血干细胞数量的增加可通过中药骨髓干细胞动员剂实现.目的:总结中医药在干细胞移植治疗心血管疾病中作用的研究进展.检索策略:由该论文的研究人员应用计算机检索Pubmed数据库1995-01/2003-12的相关文献,检索词"stem cells,transplantation,traditional Chinese medicine,cardiovascular disease",并限定文章语言种类为English.同时检索万方数据库2003-01/2007-12的相关文章,检索词为"干细胞移植,中医药,心血管疾病".共检索到62篇文献,对资料进行初审,纳入标准:①与中医药在干细胞移植治疗心血管疾病中作用密切相关.②同一领域选择近期发表或在权威杂志上发表的文章.排除标准:重复性研究.文献评价:文献的来源主要是中医药对干细胞移植治疗心血管疾病干预作用的文章.所选用的26篇文献中,5篇为综述,其余均为基础实验研究.资料综合:中药在干细胞增殖及向心肌细胞分化的研究中有了突破性的进展,特别是中药的单味成分及复方制剂的提取物在动物实验中都有理想的结果及显著疗效.进行中药诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞的探索,将为应用中医药治疗心肌梗死提供新的理论依据.中药具有临床应用安全和长期有效的特点,能扩张冠状动脉,抗心肌缺血;能调节机体免疫,抗排斥反应;能促进细胞增殖,抗细胞凋亡;能增强基因调控,促进蛋白表达等.结论:中药干预的研究虽然起步较晚,目前也仅是体外实验研究阶段,不管是复方制剂,还是单味药提取的有效的药物成分,在体外培养都脱离了人体环境,实验结果有其局限性.骨髓干细胞与中药诱导分化将可能成为中医药走向现代化的一个标志,具有重大的实际意义.
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骨髓间充质干细胞移植治疗脑梗死:有望产生结构与功能的双重修复作用
学术背景:成年人脑海马齿状回和嗅球等部位发现神经干细胞后,彻底改变了传统发生生物学所认为的成熟神经元一旦受损就不能再生这一观念,但神经干细胞存在取材不便、受伦理学限制及免疫排斥等缺陷.通过骨髓间充质干细胞移植治疗脑梗死,有望从组织结构功能上对坏死神经元进行修复.目的:归纳总结近年来骨髓间充质干细胞移植治疗脑梗死方面的实验研究进展.检索策略:由该论文的研究人员应用计算机检索Pubmed数据库1998-01/2006-12的相关文献,检索词"mesenchymal stem cells,cerebral infarction,cerebral ischemia,transplant",并限定文章语言种类为English.同时计算机检索中国期刊全文数据库1998-01/2006-12的相关文献,检索词"骨髓间充质干细胞,脑梗死,脑缺血,移植",并限定文章语言种类为中文.共检索到88篇文献,对资料进行初审,纳入标准:文章所述内容应与骨髓间充质干细胞移植治疗脑梗死、脑缺血的研究相关.排除标准:重复性研究.文献评价:文献的来源主要是通过对骨髓间充质干细胞移植治疗脑梗死方面内容进行汇总分析.所选用的30篇文献中,1篇为综述,其余均为临床或基础实验研究.资料综合:①骨髓间充质干细胞具有高度自我更新和多向分化潜能,在体内外可以分化为多种细胞,近年来作为组织工程的种子细胞用于脑梗死的治疗.②骨髓间充质干细胞来源方便,体外培养扩增快速,可通过静脉、动脉、立体定位注射和腹腔注射等途径移植入脑梗死模型动物体内,并且能够迁移至受损脑组织.③骨髓间充质干细胞可能通过分泌神经营养因子,减少神经细胞凋亡,替代受损神经元,促进血管、轴突、髓鞘等再生,激活内源性神经干细胞的增殖分化等机制修复受损脑组织.④骨髓间充质干细胞可作为基因载体,通过导入外源性基因,与基因治疗相结合治疗脑梗死效果更好.结论:骨髓间充质干细胞作为种子细胞在治疗模型动物脑梗死方面已经取得一定效果,其详细机制仍有待进一步深入研究,而且在应用于临床前仍有许多理论和技术问题需要解决.
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骨髓细胞治疗细胞死亡相关性心脏病的证据与进展
学术背景:应用自体骨髓细胞治疗细胞死亡相关性心脏病后可显著改善心功能水平.然而,近年的研究并没有发现骨髓细胞任何成分分化成心肌细胞的临床证据,心功能改善与心肌细胞再生的直接联系并不明确.目的:总结骨髓细胞治疗细胞死亡相关性心脏病的研究进展.检索策略:由该论文的研究人员应用计算机检索PubMed数据库1977-04-01/2007-04-01的相关文献,检索词"bone marrow cells,heart failure,Cardiac function".同时计算机检索CNKI中国期刊全文数据库2004-01/2007-04期间的相关文章.共检索到66篇文献,对资料进行初审,纳入标准:①与骨髓细胞治疗心肌细胞丧失和心功能不全密切相关.②同一领域选择近期发表或在权威杂志上发表的文章.排除标准:重复性研究或meta类文章.文献评价:文献的来源主要是骨髓细胞治疗心肌梗死和心力衰竭的有关随机对照实验.所选用的30篇文献中,3篇为综述,其余均为临床或动物实验研究.资料综合:①随着急性心肌梗死抢救的成功率的提高和老龄人口的到来,以细胞丧失为特点的心力衰竭的发生率不断升高,但心力衰竭治疗尚无本质性的突破.②骨髓细胞的局部移植可以有效改善急性心肌梗死和心力衰竭的近期心脏功能.③先前的动物实验研究表明,心肌梗死后心功能的改善可能源于骨髓干细胞分化或融合成有功能的心肌细胞.但近来的实验及临床研究一直未能发现这方面的有力证据.④新的研究发现,心脏修复通过骨髓先驱细胞介导的旁分泌血管生成通路,这个发现可能为揭开骨髓细胞治疗细胞死亡相关性心脏病的机制开辟了新的道路.⑤尽管骨髓干细胞治疗心肌细胞丧失的确切机制尚不完全清楚,但多数动物及临床研究证明有效而且安全,进一步的深入研究是有价值的.结论:骨髓细胞治疗细胞死亡相关性心脏病总体上安全、有效,但机制不清,而骨髓细胞介导的旁分泌血管生成通路的证实无疑为未来的研究打开了一扇窗口,同时,进一步的临床大规模临床实验研究也势在必行.
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干细胞移植治疗缺血性心脏病的进展及其作用机制
学术背景:心肌梗死后,尽管现有的内外科治疗手段可以改善冠状动脉供血、挽救缺血心肌,但对已坏死的心肌或无功能心肌尚无良好治疗措施.细胞作为构成心脏结构、执行心脏功能的物质基础,尽管存在争议,但大量研究资料表明干细胞移植治疗是安全有效的.目的:文章试图就目前成体干细胞在缺血性心脏病治疗的临床研究进展做一综述,客观评价成体干细胞治疗缺血性心脏病的安全性、有效性,阐述成体干细胞改善心功能的可能机制,介绍当今临床研究方向.检索策略:由该论文的研究人员应用计算机检索Pubmed数据库1996/2007成体干细胞与缺血性心脏病方面的文献,检索词"adult stem cells,ischemial heart disease,cardiomyocytes",并限定文章语言种类为English.同时计算机检索中国期刊全文数据库1996/2007的相关文献,检索词"成年干细胞,心肌细胞,缺血性心脏病",并限定文章语言种类为中文.共检索到1 303篇文献,对资料进行初审,纳入标准:①文章所述内容应与缺血性心脏病干细胞移植密切相关.②同一领域选择近期发表或在权威杂志上发表的文章.排除标准:①重复性研究.②Meta分析.文献评价:文献的来源主要是通过对干细胞移植治疗缺血性心脏病现状及其作用机制进行汇总分析.1 303篇文献中,动物实验和在体、离体、细胞学实验626篇,综述、述评、讲座类文献345篇,临床研究45篇,选用其中的46篇作为本文参考文献.资料综合:①干细胞为一群具有自我更新、多向分化潜能的原始细胞,分为胚胎干细胞和成体干细胞.虽然研究表明胚胎干细胞较成体干细胞具有更强的增殖和分化潜能,但由于其涉及伦理道德、来源困难等原因,限制了它的使用.②就目前已完成的包括不同类型的成体细胞(如骨髓单个核细胞、内皮祖细胞、CD133+细胞、骨髓间充质干细胞、成肌细胞等)移植治疗缺血性心脏病的早期临床试验来看,尽管存在样本小、缺乏随机对照等不足,但均显示一个公认的事实,即无论采用何种方法移植成体干细胞治疗缺血性心脏病均是安全有效的.这对于正在进行的较大规模的临床研究是十分重要的,为其提供了更充分的临床资料.③多数研究认为干细胞改善心功能的作用机制包括直接与间接效应,如移植细胞横向分化为再生心肌与血管、移植细胞的旁分泌作用促进血管再生、抑制心肌细胞凋亡及心室重构等.近来研究认为外源前体移植心肌可以刺激机体内源心肌存留的干细胞增殖,从而改善心功能.结论:尽管目前成体干细胞改善心功能的确切机制仍不清楚,但多数早期临床研究表明成体干细胞移植治疗缺血性心脏病是安全有效的.当前的研究方向是需要随机、双盲、安慰剂对照的多中心临床试验.
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骨髓干细胞动员治疗脑缺血损伤
学术背景:近来的研究表明,来源于骨髓的干细胞具有横向分化潜能和成神经分化特性,对脑缺血损伤后神经功能恢复和神经细胞的修复具有保护作用.目的:通过回顾近年来骨髓干细胞动员对脑缺血损伤保护作用的文献,对骨髓干细胞的特性及动员过程、途经、可能的作用机制、影响因素进行阐述,以期完善骨髓干细胞动员防治脑缺血损伤的基础与临床研究.检索策略:应用计算机检索Medline1997-01/2007-01与骨髓干细胞动员和脑缺血相关的文章,检索词"bone marrow stem cells,cerebral ischemia"并限定语言种类为English,同时计算机检索CNKI数据库1997-01/2007-01相关文章,并限定文章语言种类为中文,检索词为"骨髓干细胞,脑缺血".就检索到的300余篇文献进行筛选,选择以骨髓干细胞动员和脑缺血损伤的基础研究为主要内容的文献63篇,其中研究内容相似的,以近5年且发表在较权威杂志者优先.文献评价:将入选的30篇文献进行分类,11篇研究骨髓干细胞的生物学特性,19篇与骨髓干细胞动员治疗脑缺血损伤的过程、途经、可能的作用机制、影响因素相关.资料综合:来源于骨髓的干细胞具有很强的"可塑性",自我更新和高度增殖能力,其可能通过修复和替代脑缺血损伤后的神经细胞,促进或直接参与缺血区新生血管生成,分泌神经营养因子等,对脑缺血损伤后神经功能恢复发挥保护作用,其作用机制和作用方式目前尚不确切,有待于建立完整的动物模型技术平台,通过基础研究进行解决.结论:骨髓干细胞对脑缺血损伤具有修复作用,采用骨髓干细胞动员的干预策略,方法简便、安全有效、无创伤且可避免干细胞移植的免疫排斥反应,具有较好的发展潜力,有望成为治疗脑缺血性疾病的研究重点.
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脐血干细胞移植治疗脑卒中的研究现状
学术背景:目前传统的方法无法从根本上改善脑卒中后所造成的神经功能缺损,欲达到理想的恢复还赖于脑功能的重建.近年研究发现,脐血干细胞在特定诱导条件下可分化为神经细胞,修复受损的神经.目的:总结脐血干细胞移植治疗脑卒中的研究进展.检索策略:由第一作者应用计算机检索PubMed数据库与万方数据库1995/2007年期间相关文献,检索词为"cord blood stem cells,Stroke,脐血干细胞,脑卒中",并手工查阅相关书籍.对资料进行初审,选择脐血干细胞研究及采用脐血干细胞移植治疗脑卒中的研究,排除综述及重复文献.共检索到50篇相关文献.文献评价:选择其中的31篇,文献的来源主要是脐血干细胞研究及采用脐血干细胞移植治疗脑卒中的动物及基础实验研究.资料综合:脐血干细胞具有自我更新、增殖和多向分化潜能,在合适诱导下可分化为神经细胞.研究表明,脐血干细胞在体外诱导及体内移植能生成神经样细胞,能表达神经元表达神经元特异性标志物nestin、NF-M、NeuN、MAP2等.脐血干细胞治疗脑卒中在动物及实验研究基础上已取得了较大成就,但仍存在许多问题,细胞体外培养中分化增值的调控机制不十分清楚,临床研究报道甚少,诱导生成的神经细胞存活的时间、能否跟正常神经细胞一样发挥功能等,待进一步探讨.结论:用来源丰富、免疫排斥概率小的脐血干细胞治疗多发的脑卒中,具有明显的优越性,为脑血管疾病患者神经功能的恢复带来新的希望.
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鸡胚原始生殖细胞的建系方法及其影响因素
学术背景:胚胎原始生殖细胞经体外抑制分化培养可得到胚胎生殖细胞,是胚胎干细胞的又一来源.以其作为外源基因的载体用于制作嵌合体、基因敲除等具有很高的实用价值.目的:概括性论述鸡胚胎原始生殖细胞建系方法、影响因素及应用前景等问题.检索策略:由该论文的研究人员应用计算机检索Pubmed数据库1990-01/2006-04的相关文献,检索词"embryos,primordial germ cells,embryonic stem cells,embryonic germ cells,genital ridge,In vitro culture",并限定文章语言种类为English.同时计算机检索中国期刊全文数据库2000-04/2007-04的相关文献,检索词"胚胎,原始生殖细胞,胚胎干细胞,胚胎生殖细胞,生殖嵴,体外培养",并限定文章语言种类为中文.共检索到60篇文献,对资料进行初审,纳入标准:①与鸡胚胎原始生殖细胞的建系、影响因素及应用密切相关.②同一领域选择近期发表或在权威杂志上发表的文章.排除标准:重复性研究.文献评价:文献的来源主要是通过对鸡胚胎原始生殖细胞建系方法、影响因素及应用前景方面内容进行汇总分析.所选用的30篇文献中,7篇为综述,其余均为临床或基础研究.资料综合:①原始生殖细胞离体培养的关键是保证细胞具备无限增殖能力的同时维持其未分化状态.目前主要通过选择鸡胚原始生殖细胞的适宜分离时期和方法、合理设计培养基、采用饲养层细胞培养以及添加抑制分化的细胞因子等方法来解决.②鸡胚原始生殖细胞的生物学检测主要包括形态学鉴定、碱性磷酸酶活性检测、PAS染色检测、阶段特异性胚胎表面抗原1检测、核型分析、分化试验以及嵌合体试验等方法.③鸡胚原始生殖细胞的应用研究广泛,相比较桑椹胚和囊胚体外培养获取干细胞优势明显;为基础研究提供了原始的发育生物学模型;生产克隆动物,降低禽类的保种成本;生产药物蛋白,是生产治疗用重组蛋白极为理想的来源.结论:尽管目前有关鸡原始生殖细胞的培养与应用已取得一定进展,但在生产实践上如何设计出更适合于鸡原始生殖细胞生长的离体培养体系、如何更高效方便地获得鸡原始生殖细胞、如何提高利用原始生殖细胞制作嵌合体的成功率等问题还有待进一步深入研究.
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自体骨髓干细胞移植治疗失代偿期肝硬化
选择36例失代偿期肝硬化患者,年龄37～59岁,患者在无菌条件下,从髂后上棘抽取骨髓100～200 mL,在体外分离纯化骨髓干细胞后,局部麻醉下经股动脉插管经肝动脉将分离的骨髓干细胞移植于肝脏.自移植后12周,25例(69.4%)患者谷丙转氨酶逐渐降低,由平均(2788.56±357.90)nkat/L降至(1077.05±440.25)nkat/L;22例(61.1%)患者总胆红素逐渐下降,由平均(151.47±25.77)μmol/L降至(69.93±18.86)μmol/L;27例(75%)患者白蛋白逐渐升高,由平均(25.17±11.79)g/L升至(30.87±12.17)g/L.在干细胞移植后凝血酶原活动度逐渐上升,由术前平均(25.89±12.67)%上升至术后12周的(50.39±19.38)%,患者凝血机制明显改善.移植后大多数患者身体状况有明显的改善;移植后12周腹水减轻的19例(52.7%),食欲改善的28例(77.7%),体力好转20例(58.3%),腹胀减轻17例(47.2%),36例干细胞移植患者未出现严重并发症.
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深低温+100%甘油+RPMI 1640合成细胞培养液保存羊膜联合角膜缘干细胞移植在眼表重建中的应用
目的:评价深低温+100%甘油+RPMI 1640合成细胞培养液保存羊膜联合角膜缘干细胞移植在重建眼表结构中的治疗效果.方法:①实验对象:选取解放军南京军区福州总医院眼科中心2000～2006年收治的严重眼表烧伤患者29例34眼.实验经医学伦理委员会批准,剖腹产孕妇的胎盘由本院妇产科提供,孕妇均签署知情同意书.离体6 h以内的同种异体新鲜角膜由福建省红十字会提供.②实验方法:钝性分离羊膜与绒毛膜,将羊膜上皮面朝上平铺于去除胶面的眼科手术薄膜纸片上,剪成3 cm×4 cm大小,置于100%甘油+RPMI 1640合成细胞培养液各5 mL的无菌小瓶中,-80℃冷藏备用.在供体眼球角膜缘前1 mm处透明角膜上、角膜缘后2 mm处巩膜上作适当深度的环形划界,然后剖出带有浅层基质的角膜缘上皮移植片备用.严重眼表烧伤组织,将备好的羊膜植片上皮面朝上平铺于眼表面,依结膜缺损区大小修剪,缝合固定于近角膜缘的浅层巩膜上,使羊膜紧贴于角膜表面,然后将羊膜边缘与球结膜对位缝合.再将备好的角膜缘上皮移植片与植床角膜缘对位固定缝合.此外,4眼伴轻度眼睑闭合不全者同时行眼睑缘粘连性缝合.结果:严重眼表烧伤患者29例34眼中,除眼睑缘粘连性缝合的4眼外,余30眼(88.24%)术后7～14 d角膜水肿消退,14～21 d上皮修复角膜全表面,结膜表面光滑,无感染发生;术后3～6个月角膜新生血管明显减少,角膜透明度改善,视力提高3～5行;经过22.8个月随访,眼表面稳定.睑缘粘连性缝合的4眼(11.76%)发生羊膜植片急性排斥反应,羊膜融解,改行深板层角膜移植,2个月后观察眼表亦光滑,无睑球粘连发生.结论:深低温+100%甘油+RPMI 1640合成细胞培养液保存羊膜联合角膜缘干细胞移植手术,既发挥了羊膜的生物学特性,又提供了角膜缘活性细胞,能快速、稳定促进角膜更新机制的恢复,加速角膜表面重新上皮化,是治疗严重眼表烧伤有效、可行的手术方式.
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自体造血干细胞移植治疗急性淋巴细胞白血病43例:远期疗效分析
目的:异基因造血干细胞移植治疗急性淋巴细胞白血病的疗效已不容置疑,在不具备异基因造血干细胞移植条件下,评价白体造血干细胞移植治疗急性淋巴细胞白血病的疗效.方法:选取1989-05/2000-07解放军总医院血液科43例急性淋巴细胞白血病患者,所有患者均同意行自体造血干细胞移植.中位年龄24.5(11～48)岁.单次移植29例,其中移植前首次完全缓解期23例,二次缓解期5例,未缓解期1例.双次移植14例,其中首次移植和第二次移植前为二次缓解期各1例,其余移植前均为首次完全缓解期.预处理方案:包括含全身放疗(26例)、全淋巴放疗(14例)与不含全身放疗的高剂量化疗方案(3例).移植后治疗:化疗长春新碱+泼尼松/6-巯基嘌呤+甲氨蝶呤方案和白细胞介素2免疫维持治疗.结果:单次自体造血干细胞移植29例5年无病存活10例,其中移植前首次完全缓解期9例,二次缓解期1例.5年无病存活率34.5%.双次移植14例5年无病存活6例,5年无病存活率为42.9%.两次移植前均为首次完全缓解期.结论:在不具备异基因造血干细胞移植条件下,可采用自体造血干细胞移植治疗急性淋巴细胞白血病,双次自体造血干细胞移植疗效较好.
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长期接触射线辐射石油作业人员142名细胞微控测定分析
目的:染色体畸变是反映电离辐射损伤的敏感指标之一.分析观察长期接触射线的石油化工工作人员染色体畸变和细胞微核率变化.方法:①选择2000-10/2007-03延安地区的石油作业人员142人,男102人,女40人;年龄25～36岁;其中从事石油化工工作10年以下共86人,10年以上者56人.另选身体健康的企业人员114人做对照,年龄20～38岁.所有受检者对检测项目均知情同意.②检测方法:采用微量全血培养法做染色体培养,常规培养法做微核测定.③评估:进行染色体畸变分析和细胞微核率分析.结果:①石油化工工作人员组(＜10年和≥10年者)染色体型畸变明显高于对照组(1.07%,1.36%,0.14%,P＜0.01).＜10年和≥10年者间差异无显著性(P＞0.05).②石油化工工作人员组(＜10年和≥10年者)微核率明显高于对照组(1.782%,2.098%,0.022%,P＜0.01).＜10年和≥10年者差异不显著(P＞0.05).结论:放射组的微核率随染色体畸变率的增高而增加,两者间存在着密切的相关性.辐射对人体造成的危害不容忽视,应加强对石油工作人员的健康防护.
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外周血细胞间黏附因子1水平与Graves病的相关性
目的:Graves病被认为是一种淋巴细胞介导的自身免疫性疾病,细胞间黏附因子1在白细胞由血液至炎症部位的趋化及免疫介导细胞信号传导中起重要作用.探讨细胞间黏附因子1与Graves病的相关性.方法:①对象:为202例中国北方汉族人,其中2004-02/12青岛市中心医院内分泌科住院或门诊初诊未治疗Graves病患者139例,同期体检健康成人63人.②分组:按Graves病发病年龄分为早发Graves病组(发病年龄＜40岁)78例和晚发Graves病组(发病年龄≥40岁)61例;健康对照组63例.所有受试者对检测项目知情同意.正常对照组与Graves病组的年龄、性别构成比差异均无显著性.③方法及评估:运用酶联免疫吸附法技术,检测各组血清游离T3,游离T4,促甲状腺素,促甲状腺素受体抗体,甲状腺球蛋白抗体,甲状腺过氧化物酶抗体,细胞间黏附因子1水平变化.结果:①与正常对照组比较,Graves病组游离T3,游离T4,超敏促甲状腺素,促甲状腺素受体抗体,甲状腺过氧化物酶抗体,甲状腺球蛋白抗体差异均有显著性(P＜0.05).②早发Graves病组和晚发Graves病组的游离T3,游离T4,超敏促甲状腺素,促甲状腺素受体抗体,甲状腺过氧化物酶抗体,甲状腺球蛋白抗体差异均无显著性(P＞0.05).③Graves病组血清细胞间黏附因子1的水平高于正常对照组(P＜0.05);晚发Graves病组血清细胞间黏附因子1的水平高于早发Graves病组(P＜0.05).结论:Graves病患者外周血中细胞间黏附因子1水平增高;且晚发患者更明显.
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骨髓干细胞移植对心肌梗死大鼠血流动力学指标和心脏功能的影响
目的:心肌梗死所致的细胞缺失和瘢痕形成是心力衰竭乃至死亡的病理基础,目前药物治疗、介入治疗和外科手术均不能替代坏死心肌和彻底改善心脏功能.观察骨髓干细胞移植对心肌梗死大鼠血流动力学指标和心功能的影响.方法:实验于2005-03/2006-10在哈尔滨医科大学附属第一医院细胞移植中心完成.①实验动物:SD雄性大鼠60只作为细胞移植的受体,随机数字表法分成假手术组、心肌梗死组、细胞移植组,20只/组.另取SD雄性幼鼠10只作为骨髓干细胞的供体.实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.②实验方法:取幼鼠股骨骨髓,Percoll分离后收取细胞层,加入含体积分数为0.1的胎牛血清、100 IU/mL青霉素、100 g/mL链霉素的DMEM营养液,差速贴壁法分离骨髓干细胞,达80%～90%融合时采用胰酶+乙二胺四乙酸消化传代.向含有第3代骨髓干细胞的培养液中加入5-氮杂胞嘧啶核苷进行诱导,3周后行BrdU标记,离心后配制成1×1012 L-1的细胞悬液用于移植.心肌梗死组、细胞移植组大鼠建立心肌梗死模型,假手术组未结扎冠状动脉.细胞移植组吸取0.2 mL骨髓干细胞悬液注射到瘢痕组织中,心肌梗死组注入等量干细胞培养液基质,假手术组不予任何移植处理.③实验评估:术后4周,利用导管和心动超声技术检测各组大鼠左室舒张末期内压、左室收缩末期内压、左室压力大变化值、左室压力小变化值、等容时间常数和心率.结果:术后4周,与假手术组比较,心肌梗死组左室收缩末期内压、左室压力大变化值、左室压力小变化值均明显降低(P＜0.01),左室舒张末期内压、等容时间常数均明显增高(P＜0.01);与心肌梗死组比较,细胞移植组以上各项指标均明显好转(P＜0.01).结论:骨髓干细胞移植到瘢痕心肌组织中,能改善心肌梗死后大鼠的血流动力学参数和心脏功能.
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延边朝鲜族新生儿血红蛋白Gγ/(Gγ+Aγ)比值测定
目的:血红蛋白γ链包括Gγ和Aγ,基因图谱分析发现新生儿常有γ链基因的异常.实验测定延边朝鲜族新生儿血红蛋白Gγ/(Gγ+Aγ)比值,对于研究人类遗传变异和基因调节具有重要意义.方法:实验于2005-12/2007-04在延边大学医学部基础医学院生物化学与分子生物学教研室完成.①材料来源:97例朝鲜族新生儿脐带血由延边大学医院妇产科产室提供,产妇均签署知情同意书.②实验方法:新生儿脐带血取样后立即冷冻于液氮之中,EDTA-Na2抗凝,进行血红蛋白解链,每500μL脐带血与0.9%的NaCl溶液1 000μL相混合稀释,离心去上清,分离血红蛋白.用酸性聚丙烯酰胺以凝胶电泳法分离血红蛋白中的Gγ和Aγ肽链,电压200 V,电泳50 min,电泳方向为正极到负极.电泳后凝胶用丽春红2R染色,乙酸脱色致本底无色.用UVP扫描凝胶成像分析系统对凝胶板上的Gγ和Aγ肽链进行扫描定量,测定血红蛋白中Gγ/(Gγ+Aγ)比值.结果:朝鲜族新生儿脐带血中的血红蛋白Gγ/(Gγ+Aγ)比值分布情况:1例处于30%～48%低Gγ区,占总例数的1.03%,平均值27.60%;96例处于50%～79%中间区,占总例数的98.97%,平均值(68.40±2.90)%,明显低于相关文献报道的新疆维吾尔族、广西壮族、北京市汉族、西藏藏族新生儿Gγ/(Gγ+Aγ)的整体均值(75.4±2.50)%,差异有显著性意义(P＜0.05);未发现＞80%高Gγ区者.结论:延边朝鲜族新生儿血红蛋白Gγ/(Gγ+Aγ)比值多分布于50%～79%中间区,其平均值与其他民族比较相对较低.
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Ⅰ型变链素基因片段原核表达的构建
目的:获得编码变形链球菌CH43变链素Ⅰ前体肽基因片段,构建Ⅰ型变链素的原核表达载体,优化表达条件.方法:实验于2004-09/2005-06在解放军第四军医大学秦都口腔医院牙体牙髓病实验室地点完成.①实验材料:streptococcus Mutan CH43菌株由Dr.P.g.Caufield惠赠.E.coliTOP10 E.coli DH5α及表达载体pProEX由秦都口腔医院牙体牙髓病实验室保存.②实验过程:厌氧条件下培养变形链球菌CH43,通过碱裂解法得到其基因组DNA.利用聚合酶链反应技术从变形链球菌CH43基因库中扩增出编码变链素Ⅰ前体肽mutA基因片段相应大小的DNA片段,将片段与pMD18-T载体连接后测序以检测序列正确性.将测序正确的Ⅰ型变链素mutA按照BamHI和HindIII酶切位点克隆人原核表达载体pProEX-HTb,将连接产物转化入Ecoli DH5α,挑出阳性克隆,以A600从0.406～1.666七个不同浓度,异丙基β-D硫代半乳糖苷(终浓度设成1.0,1.4,1.8,2.0,2.5 mmol/L 5个梯度)诱导表达重组的带有6个组氨酸标签的融合蛋白,诱导时间分别3,6,18 h.③实验评估:观察mutA片段的扩增及序列测定结果;表达载体的构建结果;融合蛋白在大肠杆菌中的表达及表达条件的优化.结果:①聚合酶链反应获得的mutA序列与GenBank报道的一致(为147 bp).②Ⅰ型变链素的mutA基因片断被成功克隆入原核表达载体pProEX-HTb中,在A600达到1.000以上,异丙基β-D硫代半乳糖苷终浓度1.2 mmol/L,30℃诱导6 h,蛋白表达量较佳,稳定可重复.结论:成功克隆变形链球菌CH43变链素Ⅰ mutA基因片段,构建表达了Ⅰ型变链素的融合蛋白.
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反复贴块法培养大鼠主动脉平滑肌细胞
目的:原代培养鼠主动脉平滑肌细胞,传统贴块法往往由于血管片成功贴壁数少而导致失败或存在培养周期长的缺点.反复血管片贴壁法能够克服以上弊端,本实验拟进一步验证.方法:实验于2007-03/06在南昌大学第二附属医院江西省分子中心重点实验室完成.①实验方法:健康Wistar大鼠2只,断颈法处死,分离胸主动脉,清除结缔组织,纵向剖开血管去除内皮细胞,继续用力刮可见血管片分为两层,去掉外层,剩下即为所需的中膜组织,剪细置于无菌培养瓶底,组织块间距不超过0.5 cm,瓶底朝上,向培养瓶内加入5.0～6.0 mL含体积分数为0.15胎牛血清的培养液后,放在大平皿上使瓶口稍朝上,置于37℃孵箱,一次性培养瓶放置1 h(普通培养瓶2～3 h)后将其缓慢翻转平放,使组织块完全浸入培养液中.当一些组织块周围细胞生长相当密集以致失去特有的梭形形态时,即可按1:1或1:2进行传代.②实验评估:采用相差显微镜观察细胞的生长形态及生长规律.免疫化学法检测α-平滑肌肌动蛋白的表达.结果:①细胞生长形态:原代培养第3天,贴附良好的血管片周围细胞呈辐射状生长,形态多样.4～10 d细胞数量增多,细胞生长至融汇后相互平行排列成束或放射状,血管平滑肌细胞特征性"峰"、"谷"状生长特点尤为明显.细胞生长相当密集而传代.②α-平滑肌肌动蛋白免疫组织化学检测:胞浆内出现肌丝,纵向平行排列有密区,α-平滑肌肌动蛋白免疫化学染色呈阳性(棕色).结论:利用反复血管片贴壁法成功进行大鼠主动脉平滑肌细胞的原代培养,具有简便易行、细胞损失小、培养周期短等优点.
