中国组织工程研究杂志
Chinese Journal of Tissue Engineering Research 중국조직공정구여림상강복
- 主管单位： 中华人民共和国卫生部
- 主办单位： 中国康复医学会,《中国组织工程研究与临床康复》杂志社
- 影响因子： 1.38
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 2095-4344
- 国内刊号： 21-1581/R
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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昆明白小鼠胎鼠成纤维细胞不同接种密度对人胚胎干细胞的影响
目的:以昆明白小鼠胎鼠成纤维细胞作为饲养细胞,观察其不同接种密度对人胚胎干细胞的克隆生长情况及分化率的影响.方法:实验于2003-07/2005-03华中科技大学同济医学院附属同济医院完成.首先进行小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养.选取2～5代的小鼠胚胎成纤维细胞,待其至对数生长期倒掉或吸掉培养基,加入含10 mg/L丝裂霉素C的细胞全培养液5 mL,置37℃,体积分数0.05的CO2饱和湿度温箱中培养二三小时,在6孔板中加入0.1%明胶包被,放置30 min以上,倒掉或吸掉含丝裂霉素C的培养基,磷酸盐缓冲液(-)清洗5遍,尽量除去丝裂霉素C,加入2 mL 0.05%的胰蛋白酶消化细胞,镜下观察,当细胞间出现裂隙,细胞变圆时(约2～4 min),立即加入等量的全培养液终止消化,并用吸管反复吹打,使之成为单细胞悬液,在细胞计数板中央放置专用的盖玻片,用玻璃虹吸管吸取细胞,让虹吸管在盖玻片上或下侧的计数板凹槽处流出悬液,至盖玻片下被液体充满为止.用细胞计数板计算活细胞数,并分别按3×108、5×108、1×109 L-1密度接种,机械法平均分人胚胎干细胞克隆,5个克隆/孔接种于不同密度的小鼠胚胎成纤维细胞上.观察克隆的生长情况及分化率,分化率=(完全分化克隆数+部分分化克隆数)/(完全分化克隆数+部分分化克隆数+未分化的克隆数).结果:胚胎干细胞克隆在3×108 L-1密度的小鼠胚胎成纤维细胞上生长极易分化,贴壁48 h后无生长,72～96 h分化率(98.0±2.0)%;接种于5×108 L-1的小鼠胚胎成纤维细胞上后,胚胎干细胞生长与分化共存,贴壁后48 h部分克隆生长,下次传代前分化率分化效率为(30.0±5.0)%;在1×109 L-1小鼠胚胎成纤维细胞上,胚胎干细胞克隆贴壁后48 h即开始生长,分化率为(1.0±0.2)%.3组之间分化率差异有显著性意义(P＜0.05).结论:以昆明白小鼠胎鼠成纤维细胞作为饲养细胞,1×109 L-1可以起到促进胚胎干细胞的增殖,并抑制其分化的作用.
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人胎肺间充质干细胞分离培养条件及向心肌细胞诱导分化的可能关联
目的:观察分离培养得到人胎肺间充质干细胞的条件,并分析诱导其转分化为心肌细胞的可能性及其相关因素.方法:实验于2003-01/2005-12在西北农林科技大学陕西省干细胞工程技术研究中心完成.取10周龄人工流产胎儿肺组织,0.25%胰蛋白酶消化,经培养得到人胎肺间充质干细胞.观察细胞形态及增殖,测细胞生长曲线.将人胎肺间充质干细胞以1.8×104/孔接种于明胶预处理的24孔板中.加Dulbecco修正Eagle's基础培养液培养24 h后弃去培养液,磷酸盐缓冲液(-)洗两三次.每14孔为1组,分别加入Dulbecco修正Eagle's基础培养液和先进的Dulbecco修正Eagle's(分别添加2%、5%、8%和10%新生牛血清)5种不同的培养液,其后方法同上,每天选任意两孔计数,求平均值.用流式细胞仪对所分离第8代细胞进行以下细胞表面标志检测:CD45、CD11a、CD14、CD90、CD34、CD71、CD25、CD105、CD117、CD166和CD44.人胎肺间充质干细胞向心肌细胞诱导分化:将第12代人胎肺间充质干细胞以500个/孔接种于明胶预处理的24孔板中.每6孔为1组,分别在Dulbecco修正Eagle's基础培养液中添加0、5、10、20μmol/L 5-氮胞苷,每组中每2孔为一诱导时间段,分别诱导培养24,48,72 h后换成Dulbecco修正Eagle's基础培养液,以后每3 d换液1次.观察细胞在各组中变化情况,诱导12 d后固定进行糖元染色和α平滑肌肌动蛋白免疫组化染色.结果:成功分离了人胎肺间充质干细胞,细胞已扩增至26代,流式细胞仪检测CD25、CD105、CD166和CD44表达阳性;CD71(39.1%)和CD117(29.8%)弱阳性.Dulbecco修正Eagle's培养液比先进的Dulbecco修正Eagle's培养液更适合于这类细胞生长.经10 μmol/L 5-氮胞苷诱导48 h后,糖元染色、心肌α平滑肌肌动蛋白免疫组化染色阳性细胞率达60%以上.结论:①人胎肺间充质干细胞在Dulbecco修正Eagle's基础培养液中能够大量扩增.②并表达CD25,CD105,CD166和CD44等细胞表面标志.③10 μmol/L 5-氮胞苷诱导48 h对该细胞向心肌细胞分化有明显促进作用.
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高压氧对脑源性神经干细胞分化的影响
目的:探讨高压氧对缺血缺氧脑源性神经干细胞模型向神经元细胞分化的影响.方法:实验于2006-01/05在中南大学湘雅医院神经病学实验室完成.YLC 0.5/1A型动物实验高压氧舱(湖北武汉).①实验选取清洁级SD新生鼠10只,无菌条件下分离脑组织,克隆传代培养脑源性神经干细胞.将第3代细胞制成单细胞悬液,分装在不同的25 mL培养瓶中,分为正常对照组、模型对照组、高浓度氧组、高气压组、高压氧组,1瓶/组.②除正常对照组外,其余各组均复制神经干细胞缺血缺氧模型.当培养的神经干细胞达80%融合时换为新鲜的完全培养基,次日将培养基弃去,换用新鲜的无血清DMEM/F12培养基,并将细胞置于体积分数为0.93的N2、0.05的CO2、0.02的O2培养箱中37 ℃培养,3 h后用于相关指标检测.③从每组取1 mL细胞悬液移入96孔酶标板,在酶联免疫检测仪490 nm波长处测定各孔吸光度值,检测神经干细胞活力.④将各组神经干细胞悬液接种于盖玻片上涂有多聚赖氨酸的培养皿中,Nestin免疫荧光染色后加入去除生长因子的血清DMEM/F12培养基,各组在不同条件下继续培养:高气压组培养皿置于高压氧动物舱内,采用压缩空气给予0.2MPa压力1 h(加、减压时间各15 min,稳压30 min),1次/d,连续7 d;高压氧组在高气压组基础上,稳压时舱内氧浓度保持在80%以上;高浓度氧组不加压,只保持舱内氧浓度在80%以上;正常对照组和模型对照组在加入去除生长因子的血清DMEM/F12(含体积分数为0.2的胎牛血清)中培养7 d进行诱导分化.各组神经干细胞进行特异免疫荧光染色,观察细胞分化情况.⑤采用显微镜在200倍视野下进行细胞计数,每组观察10张盖玻片,每张盖玻片观察6个不重复视野,计算各组神经干细胞分化为神经元及胶质细胞的百分率.结果:①造模后神经干细胞活力的观察:与正常对照组比较,模型对照组、高浓度氧组、高气压组、高压氧组神经干细胞复制缺血缺氧模型后吸光度值均明显下降(t=-4.357,P＜0.05),表明神经干细胞经缺血缺氧后数目减少,生长活力下降.②脑源性神经干细胞诱导分化情况:诱导分化3 d后,各组微管相关蛋白2免疫细胞化学染色可见神经元样细胞,胶质原纤维酸性蛋白免疫细胞化学染色可见星形胶质样细胞,半乳糖脑苷脂免疫细胞化学染色可见少突胶质样细胞.③各组神经干细胞分化结果比较:高压氧组神经元及胶质细胞分化率较正常对照组基本相似(t=0.324,P＞0.05),但神经元分化率明显高于模型对照组、高浓度氧组、高气压组(t=2.667～5.424,P＜0.05),胶质细胞分化率低于此3组(t=-5.424～-2.667,P＜0.05).结论:高压氧处理能够上调脑源性神经干细胞向神经元分化的比例.
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Wnt-1在大鼠脑缺血再灌注海马组织内源性神经干细胞早期增殖分化中的作用
目的:检测wnt-1在大鼠脑缺血再灌注海马组织神经干细胞早期增殖分化中的表达及其变化,探讨影响神经干细胞早期增殖分化的分子调控机制.方法:实验于2005-08/2006-08在沈阳医学院完成.选择健康雄性Wistar大鼠30只,随机分为正常组,缺血再灌注3,7,14,21 d组,每组6只.缺血再灌注各组采用颈动脉负压分流法制作大鼠脑缺血再灌注模型.正常组不作任何手术处理.用免疫组织化学SP法及显微图像分析检测海马神经干细胞中BrdU,Wnt-1的表达.结果:30只大鼠均进入结果分析.①缺血再灌注各组大鼠海马均可见BrdU阳性细胞.阳性细胞呈棕黄色,形态多样,呈圆形、椭圆形或梭形.脑缺血再灌注第3天缺血海马神经元BrdU阳性细胞明显增多,BrdU阳性细胞百分率为(56.78±2.37)%,第7天达高峰,BrdU阳性细胞百分率为(69.99±6.01)%,第14,21天逐渐减少,分别为(49.35±5.57)%,(38.33±7.89)%.缺血再灌注各组与正常组[(4.89±5.60)%]比较,差异有显著性意义(P＜0.05).②缺血再灌注各组大鼠均有wnt-1表达,海马颗粒层细胞质呈棕黄色颗粒,不着色为阴性.脑缺血再灌注第3天Wnt-1反应产物有所增多,海马组织Wnt-1表达的平均灰度值为103.67±5.49.第7天表达强,平均灰度值为75.34±6.75,以后表达逐渐减少.缺血再灌注各组与正常组(132.47±2.96)比较,差异有显著性意义(P＜0.05).结论:Wnt-1时间依赖性表达与神经干细胞增殖分化进程相吻合,说明其在神经干细胞早期增殖分化中起重要调控作用.
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维生素C及E联合作用对体外大鼠胚胎中脑神经细胞分化和增殖的影响
目的:观察维生素C,维生素E和维生素C+维生素E联合后对胚胎中脑神经细胞生长发育的影响.方法:实验于2006-03/04在江苏大学医学院研究中心细胞培养室完成.采用16 d大鼠胚胎中脑神经细胞体外培养方法,观察不同剂量的维生素C(5,10,25,50 μmol/L),维生素E(10,25,50,100 μmol/L)和维生素C、维生素E联合作用(维生素C25 μmol/L+维生素E 50 μmol/L,维生素C 50 μmol/L+维生素E 100 μmol/L),培养10 d后收集细胞,并利用图像分析细胞形态的变化、蛋白质、丙二醛含量及超氧化物歧化酶活性指标.结果:①维生素C、维生素E和维生素C+维生素E联合能促进体外培养中脑神经细胞突起生长,集落数增多.②与正常对照组比较,维生素C 10,25 μmol/L组、维生素E 10,25,50 μmol/L组、维生素C 25 μmol/L+维生素E 50 μmol/L组神经细胞总蛋白相对含量明显增加.③与正常对照组比较,维生素C 10,25 μmol/L组、维生素E 25,50 μmol/L组、维生素C 25 μmol/L+维生素E 50 μmol/L组神经细胞超氧化物酶活性增加,丙二醛含量降低.④维生素C 50 μmol/L组、维生素E 100 μmol/L组和维生素C 50 μmol/L+维生素E 100 μmol/L组超氧化物酶活性低于正常对照组,丙二醛含量高于正常对照组.结论:维生素C、维生素E和维生素C+维生素E联合剂量在一定范围内能够明显提高中脑神经细胞的抗氧化能力,同时能促进胚胎中脑神经细胞分化和增殖作用.
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大鼠肝卵圆细胞增殖模型的重建及免疫组织化学定位
目的:拟改良常用的大鼠肝卵圆细胞增殖模型Solt-Farber建模方法,并对肝卵圆细胞的生物学特性和免疫组织化学定位进行分析.方法:实验于2004-09/2005-09在华中科技大学同济医学院完成.①分组:选用体质量180 g左右的雄性SD大鼠120只,随机分为5 mg/kg 2-乙酰氨基芴处理组,20 mg/kg 2-乙酰氨基芴处理组及空白对照组,每组40只.②造模及给药:对Solt-Farber造模方法进一步改进:5 mg/kg,20 mg/kg 2-乙酰氨基芴处理组分笼饲养1周后通过胃管灌喂2-乙酰氨基芴,1次/d,连续3 d,按20 mg/kg剂量给予,第4天行2/3肝切除(手术当日不灌喂2-乙酰氨基芴),第5天继续灌喂,剂量分别按5 mg/kg,20 mg/kg给予,术后连续灌喂7 d.空白对照组除给予生理盐水灌喂外,不予以其他任何处理.③分别于术后第2,5,8,11,14天处死大鼠.观察大鼠肝脏标本的大体变化,留取肝组织行苏木精-伊红染色,免疫组化染色观察肝卵圆细胞增殖情况和肝卵圆细胞定位.结果:①5 mg/kg,20 mg/kg 2-乙酰氨基芴处理组大鼠术后肝脏均表现为明显充血,肝脏边缘圆钝.从术后第5天起处死的大鼠肝脏表面可见针尖样细小颗粒,呈局灶性,偶见肝脏有小出血点.②5 mg/kg,20 mg/kg 2-乙酰氨基芴处理组大鼠肝组织内可见明显的卵圆细胞增殖.两组肝卵圆细胞增殖数量比较差异无显著性(P＞0.05).空白对照组大鼠肝组织内未见到肝卵圆细胞.③肝卵圆细胞形态学特征:细胞体积小于肝细胞,体积相当于肝细胞的1/4～1/3;细胞大小及体积不均一,差异较大;形态多为卵圆型,多排列成小腺管样结构或成簇或散在分布.④肝卵圆细胞OV6,CK19,AFP,C-kit,CD34染色呈阳性.结论:①采用术前短时间大剂量,术后长时间小剂量的实验设计方案可以使建立模型所需时间进一步缩短,动物的耐受性明显好转,增殖效果却同样理想,证明大鼠肝卵圆细胞增殖模型改进成功.②在肝卵圆细胞主要位于肝实质细胞和胆管上皮细胞相结合部或其附近.
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角质形成细胞的培养及其表皮生长因子受体表达
目的:在成功分离人皮肤角质形成细胞的基础上,观察表皮生长因子受体在人皮肤角质形成细胞中的表达情况.方法:实验于2006-3/10在北京大学深圳医院中心实验室进行.采用dispaseⅡ-trypsin两步消化法获取表皮基底层细胞,用小鼠皮肤成纤维母细胞滋养层和黄素腺嘌呤二核苷酸培养液进行培养.小鼠皮肤成纤维母细胞的预处理:向对数生长期的小鼠皮肤成纤维母细胞培养液中加入丝裂霉素C至终浓度为4 mg/L,37 ℃下培养4 h,弃去培养液,用D-Hank's液洗3次,加入浓度为0.25 g/L的胰蛋白酶消化,分离出细胞,离心(200 g,5 min),用黄素腺嘌呤二核苷酸培养液悬浮细胞,计数,以5.0×104 /cm2的密度种于培养皿内,37 ℃、体积分数0.05的CO2培养箱下培养.角质形成细胞的培养:将分离的角质形成细胞悬浮在黄素腺嘌呤二核苷酸培养液中,以2.0×104 /cm2的密度接种在前1天经丝裂霉素C处理的小鼠皮肤成纤维母细胞滋养层上,37℃、体积分数0.05的CO2培养箱下培养.24 h换液,以后每3 d换1次液.采用免疫细胞化学的方法检测表皮生长因子受体的表达,采用复合逆转录聚合酶链反应检测角质形成细胞中表皮生长因子受体mRNA的表达.结果:采用dispase Ⅱ消化法分离了真皮和表皮,获得较多的角质形成细胞,可以避免真皮成纤维细胞的污染.人皮肤角质形成细胞在黄素腺嘌呤二核苷酸培养液中培养5 d可见明显的集落,约10 d可长满单层.免疫细胞化学显示表皮生长因子受体在细胞表面有明显的表达,复合逆转录聚合酶链反应显示表皮生长因子受体mRNA有明显的表达.结论:用小鼠皮肤成纤维母细胞滋养层和黄素腺嘌呤二核苷酸培养液可以较好地培养原代人皮肤角质形成细胞,表皮生长因子受体在细胞表面有明显的表达,这些结果为与表皮生长因子受体相关的皮肤病(如银屑病)的研究奠定了基础.
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特定培养基条件下大鼠脂肪间充质干细胞体外定向软骨细胞的分化
目的:体外诱导大鼠脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化,并对分化细胞进行相应鉴定,观察脂肪间充质干细胞作为软骨组织工程种子细胞的可行性.方法:实验于2005-05/2006-05在湘雅医院中心实验室完成.①取大鼠腹股沟脂肪,消化分离脂肪间充质干细胞进行原代培养.②流式细胞仪检测第3代脂肪间充质干细胞表面CD29,CD34,CD44表达.③传3代细胞进行微团培养1 d,换用含体积分数为0.01的新生牛血清、10μg/L的转化生长因子β1、6.25 mg/L的胰岛素、6.25 mg/L的转铁蛋白、1×10-7 mol/L的地塞米松、50 mg/L的维生素C的高糖DMEM诱导液,为特定培养条件.④在诱导后4,7,14 d应用阿尔新兰染色、蕃红O/固绿染色和Ⅱ型胶原免疫细胞化学评价软骨形成情况.⑤反转录-聚合酶链反应在诱导后0和14 d检测脂肪间充质干细胞前Ⅱ型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖mRNA的表达.结果:①脂肪间充质干细胞的形态特征:原代脂肪间充质干细胞呈短梭形、梭形及多角形,3代后呈均一长梭形.②脂肪间充质干细胞的表面标志鉴定:脂肪间充质干细胞表达CD29,CD44,基本不表达CD34.③脂肪间充质干细胞诱导后的形态特征:脂肪间充质干细胞经诱导后,由长梭形转变为三角形、多角形或短梭形,逐渐聚集成结节.④脂肪间充质干细胞诱导后的细胞化学染色结果;诱导后脂肪间充质干细胞胞外基质阿尔新兰染色、蕃红O/固绿染色、和Ⅱ型胶原免疫细胞化学着色阳性.⑤反转录-聚合酶链反应检测结果:反转录-聚合酶链反应检测未诱导脂肪间充质干细胞不表达前Ⅱ型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖mRNA基因,而诱导后的脂肪间充质干细胞表达前Ⅱ型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖mRNA基因.结论:脂肪间充质干细胞在由转化生长因子1、胰岛素、转铁蛋白等组成的特定培养基条件诱导下可以定向软骨细胞分化.
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由重组腺相关病毒1/2载体携带的LacZ报告基因在脐血间质干细胞中的表达
目的:观察由重组腺相关病毒1/2载体携带的LacZ报告基因在体外培养的脐血间质干细胞中的表达情况.方法:实验于2005-10/2006-02在上海交通大学附属新华医院科研中心完成.①以孕龄近60 d的杂种妊娠犬的脐带血作为实验用脐血间质干细胞的标本来源.重组腺相关病毒1/2载体-lacZ基因(北京本原正阳基因技术有限公司).②无菌条件下采集妊娠犬脐带血,置于预装有肝素的离心管中,与Hanks液1∶1混合均匀,叠加于相对密度为1.077的淋巴细胞分离液上,梯度离心分离后进行培养和扩增.③取第4代脐血间质干细胞,经胰酶消化后吹打成单细胞悬液,以5×104/孔接种于24孔板内,随机数字表法分为转染组20孔、空白对照组4孔.转染组将重组腺相关病毒1/2载体-lacZ报告基因(1×1012v.g.mL-1)用不含血清的IMDM培养液作系列滴度稀释,分为5个滴度,即感染复数分别为每个细胞1×102,1×103,1×104,1×105,1×106v.g,各感染复数均设4孔;空白对照组未加入病毒,只加入相同体积的不含血清的IMDM培养液.④转染72 h后采用X-gal化学染色法进行检测,成功转染上LacZ基因的脐血间质干细胞其胞浆内会因合成半乳糖苷酶而呈阳性蓝染.每组样本随机选取5个视野,相差显微镜下计数半乳糖苷酶阳性细胞数,取均值即为LacZ基因细胞转染率.结果:①脐血间质干细胞生长情况及LacZ报告基因表达的检测:转染组病毒基因转染后未再见到明显的细胞增殖,转染72 h后大部分细胞表达LacZ基因并合成半乳糖苷酶,X-gal染色呈蓝色,长梭形;4～6周后细胞形态趋向老化,长梭形逐渐变为宽扁形;8周后细胞均被蓝染,颜色明显较转染72 h时深,细胞形态由长梭形变为不规则,明显老化.空白对照组细胞反应均为阴性.②LacZ报告基因细胞转染率测定结果:转染72 h后,感染复数为每个细胞1×102v.g时,仅有少数细胞蓝染呈阳性;感染复数为每个细胞1×103,1×104,1×105,1×106 v.g时,转染率分别为(43±5)%,(82±4)%,(95±4)%,(97±3)%.结论:体外培养的脐血间质干细胞能高效转染重组腺相关病毒1/2载体-lacZ报告基因,在一定感染复数范围内,细胞转染率随着感染复数的增加而升高.提示脐血间质干细胞是重组腺相关病毒1/2载体-lacZ报告基因转染的适宜靶细胞.
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稳定表达人降钙素基因大鼠成肌细胞株的建立
目的:建立稳定表达人降钙素(hCT)基因的细胞株(L6),观察人降钙素基因在大鼠成肌细胞中的表达和分泌情况.方法:实验于2004-06/2005-11在河南省肿瘤病理重点实验室完成.用已构建的5'端融合小鼠抗体轻链基因lgκ的信号肽序列的人降钙素基因分泌性真核表达载体pCDNA3.0-lgκ-hCT,采用脂质体介导方法将人降钙素基因导入大鼠成肌细胞;对照组用pCDNA3.0空质粒转染.经G418筛选后,用反转录-聚合酶链反应法和免疫细胞化学法检测人降钙素基因在大鼠成肌细胞中的表达,并用放免法检测细胞培养上清液降钙素的分泌.结果:①反转录-聚合酶链反应法检测人降钙素基因的表达:反转录-聚合酶链反应扩增后,重组质粒载体转染组成肌细胞总RNA中检测到人降钙素基因的表达,而空载体转染组和未转染成肌细胞均未检测出目的基因(210 bp);β-肌动蛋白为内对照约385 bp.②免疫细胞化学法测定降钙素的表达:pCDNA3.0-lgκ-hCT转染组成肌细胞浆被黄染,提示有人降钙素表达;而空载体组胞浆染色阴性,无人降钙素表达.③细胞培养上清液中降钙素的含量:pCDNA3.0-lgκ-hCT重组载体转染组(hCT)1～10代细胞培养上清液人降钙素浓度差异无显著性(P＞0.05),明显高于同代空载体转染组(pCDNA3.0)(P＜0.001).结论:稳定表达人降钙素基因的大鼠成肌细胞株成功建立,为进一步体内移植治疗骨质疏松症打下基础.
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低氧促进大鼠骨骼肌成肌细胞体外增殖及重金属钴的作用
目的:观察低氧促进大鼠骨骼肌成肌细胞增殖的作用,并分析CoCl2对成肌细胞增殖的影响.方法:实验于2005-05/2006-07在解放军军事医学科学院基础医学研究所神经肌肉发育研究室完成.①低氧CO2温箱(Forma Scientific,美国);CoCl2(北京化工厂).②选取4～5周龄Wistar雄性大鼠5只,脱颈处死无菌切取后腿肌群,剪除脂肪和筋膜,制备单细胞悬液.以连续贴壁法筛选大鼠骨骼肌成肌细胞,接种于96孔板进行单克隆培养.采用成肌细胞特异性标志抗原desmin免疫化学染色,鉴定成肌细胞标志蛋白--结蛋白的表达,弃去desmin阴性的细胞克隆,继续培养desmin阳性的细胞克隆,隔天换液1次,7 d进行酶消化传代,获得大量扩增的细胞,并可冻存复苏,用于实验.③以1×107 L-1接种于20个35 mm培养皿中,接种细胞3 h后,将培养皿随机数字表法分为5组:常氧对照组、轻度低氧组、中度低氧组、CoCl2组、轻度低氧+CoCl2组,4皿/组.常氧对照组置于体积分数为0.2的O2常规氧气环境中;轻、中度低氧组分别于低氧温箱中维持体积分数为0.1与0.03的O2低氧环境中;CoCl2组向培养皿中加入终浓度为15 μmol/L的CoCl2;轻度低氧+CoCl2组向细胞培养皿中加入终浓度为15 μmol/L的CoCl2后,放入体积分数为0.1的O2低氧温箱.低氧培养24,48,72 h时,各组取出培养皿进行细胞消化离心,倒置相差显微镜下观察细胞生长情况,血球计数板计数法进行细胞计数.④以1×108 L-1接种于8个60 mm培养皿中,接种细胞3 h后,将培养皿随机数字表法分为2组:常氧对照组、轻度低氧组,4皿/组.两组干预措施同细胞计数过程.低氧培养48 h时,两组取出培养皿进行细胞消化离心,流式细胞仪检测细胞周期.结果:①骨骼肌成肌细胞的单克隆培养结果:成肌细胞可在体外存活6个月,增殖旺盛期约为3个月,可传代15次以上.单克隆培养2周后,可以由单个细胞长满96孔板中的1个孔,并不断扩增,终可以得到细胞类型专一单克隆化的成肌细胞.②成肌细胞特异性标志抗原desmin鉴定结果:镜下不同视野desmin阳性率达100%,即培养的成肌细胞单克隆纯度达100%.③细胞计数结果:与常氧对照组比较,低氧培养24,48,72 h时轻、中度低氧组均可明显促进大鼠骨骼肌成肌细胞体外增殖,且轻度低氧组作用尤为明显(t=4.98,P＜0.001);CoCl2组无明显变化,但轻度低氧+CoCl2组细胞数量显著增加(t=4.62,P＜0.001).④细胞周期分布:与常氧对照组比较,低氧48 h时轻度低氧组处于S期的细胞明显增多[(26.67±0.89)%,(65.43±0.23)%,t=2.36,P＜0.01],且增殖指数亦显著上升(33.4%,67.1%,t=2.15,P＜0.01).结论:①轻中度低氧可以促进大鼠骨骼肌成肌细胞的增殖,为体外大量扩增细胞提供了新思路.②CoCl2对骨骼肌成肌细胞没有促增殖作用.
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不同多羟基化合物对小鼠胚胎干细胞低温贮存的影响
背景:胚胎干细胞的长期低温贮存成为胚胎干细胞研究和应用的重要环节.传统的低温贮存保护剂主要包含二亚基亚砜、甘油、动物血清等,对于许多细胞类型并不能有效保证细胞的存活率,甚至于损失了细胞的某些功能.目的:开发适用于小鼠胚胎干细胞的低温贮存试剂.设计:观察实验.单位:广州医学院从化学院生理教研室与科宇联合干细胞生物技术有限公司.材料:实验于2004-10/2005-09在科宇公司实验室完成.小鼠细胞系mES-1为军事医学科学院基础医学研究所细胞生物学研究室惠赠.方法:将mES-1维持培养收集的细胞低温贮存.实验以二亚基亚砜为主要的低温贮存保护剂.按低温保护液成分不同分4组:对照组低温保护液包含DMEM(高糖)、10%二亚基亚砜、10%胎牛血清、10 mg/mL抗坏血酸、0.18 mg/mL肌醇、0.44 mg/mL叶酸,甘露糖组在对照组的基础上?舷补充7.56 mg/mL甘露糖,海藻糖组补充34.23 mg/mL海藻糖,蔗糖组补充41.94 mg/mL蔗糖.观察不同多羟基化合物对小鼠胚胎干细胞低温贮存后存活率和多向分化能力的影响.主要观察指标:胚胎干细胞集落形成率和拟胚体形成率.结果:①冻存后各低温保存剂组的胚胎干细胞集落形成率均比冻存前有显著性降低[对照组:(24.0±8.8)%,甘露糖组:(42.0±10.1)%,海藻糖组:(84.0±8.2)%,蔗糖组:(70.0±14.2)%,冻存前:(95.0±4.7)%,P均＜0.05],其中海藻糖组的胚胎干细胞集落形成率明显高于其他低温保护剂组(P＜0.05).②海藻糖组的拟胚体形成率高于对照组和甘露糖组[(90.0±5.2)%,(80.0±6.9)%,(82.0±9.6)%,P均＜0.05].与蔗糖组相比,差异无显著性意义.结论:以海藻糖为核心低温保护剂成分可有效维持小鼠胚胎干细胞的自我更新能力和多向分化能力.
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不同细胞因子组合对体外培养人脐带血造血干细胞的扩增效果
目的:观察细胞因子对培养的人脐带血造血干细胞的扩增效果,寻求体外佳细胞因子组合.方法:实验于2002-06/2004-04在承德医学院基础研究所及承德医学院附属医院中心实验室完成.①以足月顺产健康新生儿的脐带血(由承德医学院附属医院妇产科提供,新生儿家属均签署实验知情同意书)作为实验标本.无菌条件下平均采血量30～60 mL,梯度离心分离脐带血单个核细胞.②细胞体外扩增DMEM培养体系(含体积分数0.2的胎牛血清)为0.25 μg/L干细胞因子,0 25 μg/L白细胞介素3,0.5 μg/L白细胞介索6,0.25 μg/L粒-巨噬细胞集落刺激因子,0.8 μg/L粒细胞集落刺激因子,0.05 μg/L血小板生成素,0.8μg/L FLt-3配基.此7种细胞因子及剂量按不同组合分为6组:干细胞因子+白细胞介素3+白细胞介素6组、干细胞因子+白细胞介素3+白细胞介素6+粒-巨噬细胞集落刺激因子组、干细胞因子+白细胞介素3+白细胞介素6+粒细胞集落刺激因子组、干细胞因子+白细胞介素3+白细胞介素6+粒-巨噬细胞集落刺激因子+粒细胞集落刺激因子组、干细胞因子+白细胞介素3+白细胞介素6+血小板生成素+FLt-3配基组、干细胞因子+血小板生成素+FLt-3配基组.各组单个核细胞终浓度为1×108个L-1.③培养第7,14,21天进行细胞形态学观察;培养第0,5,10,14,18,21天观察不同细胞因子组合对脐带血干细胞扩增的效果;应用流式细胞仪对培养前后细胞表面标志CD34+进行检测.结果:①脐带血干细胞形态学观察结果:体外培养第14天,细胞胞体小,胞浆量少,胞核体积大,多不规则,为早期造血干细胞.②细胞体外扩增培养情况:应用干细胞因子+白细胞介素3+白细胞介素6+血小板生成素+FLt-3配基这一细胞因子组合,脐带血干细胞可保持＞98%的细胞存活率;培养第7天出现典型早期造血干细胞,第21天细胞总数达到高峰(F=60.228,P＜0.01).③细胞表面标志CD34+的动态变化:干细胞因子+白细胞介素3+白细胞介素6+血小板生成素+FLt-3配基这一细胞因子组合为生长刺激剂,应用后体外培养的造血干细胞于第14天达高峰,与培养前比较差异有显著性意义(F=20.782,P均＜0.01),之后逐渐下降.结论:应用干细胞因子+白细胞介素3+白细胞介素6+血小板生成素+FLt-3配基细胞因子组合可长期维持脐带血干细胞的体外生长,且体外培养第14天是临床移植的佳时机.
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脐血间充质干细胞培养体系的建立
目的:寻找脐带血来源的间充质干细胞体外分离、纯化及培养的条件,以建立稳定的体外培养体系,满足实验和临床的需要.方法:实验于2005-06/2006-04在青岛大学医学院附属医院儿科研究所完成.脐带血36份,50～60 mL/份,取自青岛大学医学院附属医院产科健康产妇正常足月顺产或剖宫产分娩婴儿的脐带血,经产妇本人及家属同意.无菌条件下取正常足月剖宫产胎儿的脐带血,经肝素抗凝,用淋巴细胞分离液分离脐血单个核细胞.16份脐血每份分为3组,分别以间充质干细胞接种密度1×107L-1、1×109 L-1、1×1011 L-1接种于未包被6孔培养板内,加入5%胎牛血清的DMEM-LG培养.20份脐血每份分为3组,以1×1011L-1单个核细胞密度分别加入5%、10%和20%胎牛血清的DMEM-LG接种于胎牛血清包被的6孔培养板内培养.采用常规的间充质干细胞培养Friedenstein法进行脐血间充质干细胞的培养和扩增培养.观察不同脐血单个核细胞的接种密度、培养液胎牛血清浓度和胎牛血清包被培养皿对间充质干细胞培养的影响.结果:①胎牛血清未包被组以1×107L-1和1×109L-1接种组培养7 d后贴壁数量很少,贴壁的细胞未长满瓶底即死亡,无法传代.1×1011L-1组贴壁细胞较多,间充质样细胞与破骨样细胞并存.1×1011L-1组分5%、10%、20%3种血清浓度,贴壁细胞均较多,以间充质干细胞为主,胎牛血清浓度5%组间充质干细胞的纯度较10%及20%组高,破骨样细胞相对较少;胎牛血清包被组与未包被组相比,贴壁细胞少,培养的间充质干细胞纯度较高,破骨样细胞相对较少.②流式细胞仪检测脐血间充质干细胞的免疫表型,结果显示,脐血P3代间充质干细胞不表达或极弱表达CD34、CD45、CD106等造血细胞标志,稳定地高表达CD29、CD44、CD105等间充质细胞相关的表面抗原标记物.结论:将脐血单个核细胞以1×1011L-1高密度接种在5%低胎牛血清浓度的低糖DMEM培养基中、胎牛血清包被培养瓶等条件下,可以在体外成功的培养出较纯化的脐血间充质干细胞,其培养成功率和间充质干细胞纯度较高.
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松质骨源性人成骨细胞的分离培养和细胞密度效应
目的:通过对人松质骨成骨细胞的培养,寻找人成骨细胞培养佳途径中细胞密度的相关影响因素,以期掌握人成骨细胞扩增的规律.方法:实验于2005-03/12在江苏省血液病研究所(苏州大学附属第一医院血研所)血栓室完成.①以人工髋关节置换术中切下的股骨头和膝关节置换术中切下的股骨髁的松质骨作为成骨细胞来源,分离培养和鉴定.②以第1代成骨细胞分别按1:2;1:3;1:4的比例传代培养,观察成骨细胞的生长周期.③计数培养后的细胞数,观察细胞密度不同对细胞生长的影响.结果:①细胞的生长及形态特征:原代细胞种植40 h后,可见有少部分成骨细胞贴壁并伸出伪足,80 h后,可见较多的细胞贴壁,以梭形或多角形多见.7～12 d左右细胞形成单层,此时成骨细胞多为梭形,胞浆丰富,透明度高,有核及明显的核仁,细胞整体形态与成纤维细胞相似.传代培养后,细胞多为梭形或多角形,细胞核大,有多个突起,突起相互交叉.随着时间推移细胞逐渐连接成片.②成骨细胞的生长周期:人成骨细胞的生长周期约4 d.③人成骨细胞不同比例传代培养生长情况:1×106个细胞分别按1:2,1:3和1:4传代培养4 d后,收集细胞总数分别为:(2.025±0.063)×106,(1.688±0.052)×106,(1.352±0.059)×106,统计学比较细胞数差异有显著性(P＜0.001).结论:同等数量细胞在密度不同时用相同的时间培养获得细胞总数并不相同,细胞的生长速度与细胞的密度相关,人成骨细胞培养以1:2传代较好.以松质骨取材来源人成骨细胞培养方便和快捷,细胞扩增要达到佳速度必须掌握好细胞传代的密度.
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人脐带血间充质干细胞的体外培养及其影响因素
背景:多潜能间充质干细胞在特定的培养条件下可以分化为骨、脂肪、软骨、肌肉以及内皮细胞,是目前倍受关注的一类具有多向分化潜能的组织干细胞.目的:建立人脐带血来源的间充质干细胞体外培养、扩增的方法,并分析其影响因素.设计:随机对照实验.单位:无锡第三人民医院组织工程和细胞生物学研究室.材料:健康新生儿脐带血(来源于无锡第三人民医院妇产科临产室,均征得产妇及其家属同意)70例,每例40 mL;低糖基本必需培养基(Gibco),胎牛血清(Gibco),青链霉素(Gibco),胰蛋白酶(Gibco),FITC标记的小鼠抗人CD29、CD105、CD106(Ancell)单克隆荧光抗体和PE标记的小鼠抗人CD34、CD44、CD45、CD19、HLA-DR(Immunotech)单克隆荧光抗体,Ficoll分离液(Pharmacia).方法:实验于2005-02/2005-12在无锡第三人民医院组织工程和细胞生物学研究室完成.①脐血间充质细胞的分离培养:健康新生儿脐带血共70例肝素(25 u/mL)抗凝,分离单个核细胞,其中60例沉淀细胞用细胞培养液(低糖基本必需培养基+50 g/L胎牛血清+10 g/L青链霉素)重悬,另10例用高糖基本必需培养基重悬(其余培养条件相同).细胞长到80%融合时,以1.0×107个/L的密度接种于培养瓶中进行扩增培养.②胎牛血清包被对人脐血间充质干细胞贴壁率的影响:取生长状态良好、纯化后对数生长期的人脐血间充质干细胞,分为血清包被组和无血清包被组,分别观察其贴壁率.③间充质干细胞的形态学和生长曲线:在相差显微镜(OLYMPUS CK40)下观察细胞生长状况,数码成像系统(OLYMPUS DP50)摄像记录.④免疫表型:取扩增第5代的脐血间充质干细胞,用EPICS-ALTRA流式细胞仪进行检测.主要观察指标:①观察高糖组和低糖组细胞的生长状态.②观察不同时间点胎牛血清包被组与未包被组细胞的贴壁情况并分别计算贴壁率.结果:本实验总共培养和分析了70例脐血间充质干细胞样本.由于10例予含高糖的培养基培养的标本均未获得理想的间充质干细胞,故未进行统计学分析.①按照本实验所建立的培养体系,约20%的样本成功培养出脐血间充质干细胞.原代细胞在培养2周后可达到融合,一般其倍增时间为3～4 d,传代后7～8 d即可达到融合.②扩增至第5代的间充质干细胞结果显示,脐血间充质干细胞均一稳定地表达间充质干细胞相关的抗原标记:CD29,CD44,CD105,但不表达CD34,CD45,CD106,HLA-DR,这与源于骨髓的间充质干细胞的表面抗原标记相一致.③血清包被组间充质干细胞贴壁率显著高于无血清包被组(P＜0.01).结论:脐带血中的间充质干细胞可在体外培养、扩增,能够作为间充质干细胞的一种有效来源.高糖可能抑制人脐血间充质干细胞的生长和扩增.
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许旺细胞增殖和分化过程中的信号通路
目的:探讨许旺细胞增殖和分化过程中细胞内各种信号通路及其关联性.资料来源:应用计算机检索Medline 1994-01/2006-12和Embase 1994-01/2006-12期间的有关许旺细胞增殖和分化相关的信号通路的文献,检索词"Schwann cell;proliferation;differentiation;signal transduction",并限定文章语言种类为英文.资料选择:选取与许旺细胞增殖和分化相关的有关信号通路的文献,进行初审,删除与信号通路不相关的研究,然后查找余下的文献全文.质量评价主要考察资料的真实性,调查设计是否严密,实施过程是否严格,统计学处理是否合理.资料提炼:共检索54篇与许旺细胞增殖和分化相关的有关信号通路的文献研究,纳入30篇文章.14篇有关许旺细胞增殖,12篇许旺细胞分化,4篇是其他的相关信号通路.资料综合:许旺细胞的分化和基因表达是通过各种细胞外信号来调控的,多种信号通路相互联系.来自于受体酪氨酸激酶,丝裂原活化蛋白激酶,磷酯酰肌醇-3激酶通路的信号在许旺细胞增殖和分化过程中都有很重要的作用,它们之间的平衡决定了细胞后的功能.而细胞内膜受体G蛋白偶联的环磷腺苷浓度促进了细胞的各种功能,也参与调节了其他信号通路.结论:许旺细胞增殖和分化过程是多种信号通路相互联系完成的,阐明不同信号通路之间的关系以及它们的交互作用对于揭示许旺细胞的生物学功能有重要的意义.
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椎间盘组织工程学种子细胞的研究概况
目的:为逆转椎间盘细胞水平的病理改变,进而修复退变的椎间盘组织修复与恢复功能选择适宜的种子细胞提供科学依据.资料来源:应用计算机检索Medline 1999-01/2006-06有关椎间盘组织工程、种子细胞及软骨缺损修复方面的文献,检索词为:"disci intervertebrales,tissue engineering,seed cell,cartiage defect,cartiage repajn",并限定文章语言种类为英文.同时计算机检索万方数据库1999-01/2006-06期间的相关文章,检索词为"椎间盘,组织工程,种子细胞",并限定文章语言种类为中文.资料选择:对资料进行初审,选取有关椎间盘组织工程种子细胞实验或临床研究文献,筛除非随机对照实验、重复实验和综述、讲座、笔谈等非原著性文献,对剩余文献查找原文.资料提炼:共收集223篇相关文献,其中32篇符合纳入标准,排除191篇.符合纳入标准的32篇文献中,17篇涉及椎间盘自身细胞,3篇涉及经基因工程修饰的椎间盘纤维环、髓核细胞,12篇涉及间充质干细胞.资料综合:目前椎间盘自身细胞的单层培养或三维培养的技术较成熟,纤维环与髓核细胞是椎间盘组织工程中较为常用的种子细胞,经基因工程修饰后可分泌更多的细胞外基质,亦能较长时间维持细胞的生物学表型.间充质干细胞构建的组织工程骨早期修复骨缺损能力较强,能够对负重骨缺损进行有效的修复.结论:椎间盘组织工程中对种子细胞的研究已取得可喜的进展,其中尤以经基因工程修饰的椎间盘纤维环、髓核细胞好,其作为种子细胞的优势在于生长迅速,细胞外基质分泌增多,长时间维持细胞的生物学表型,但其安全性还需进一步研究.
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人胚胎干细胞研究现状及其应用前景
目的:综合分析人类胚胎干细胞的研究动态及意义.资料来源:应用计算机检索Medline 1995-01/2005-02有关胚胎干细胞研究进展及其伦理争议的文献,检索词"stem cell,embryo,medical treatment,cloning,ethics",限定文章语言种类为英文.同期检索中国期刊全文数据库2002-01/2005-12有关胚胎干细胞研究进展及其伦理争议的文献,检索词为"干细胞,胚胎,医疗,克隆,伦理",限定文章语言种类为中文.资料选择:对检索到的干细胞研究进展及应用的相关信息进行整理,选取针对性强的文章.同一领域的文献则选择近期发表或权威杂志的文章.资料提炼:共检索到56篇相关文献,其中26篇文章符合要求.排除30篇,为重复性文章.资料综合:胚胎干细胞的研究自上世纪80年代初期始,经历了由低等动物、灵长类动物至人类胚胎干细胞研究的过程.从干细胞生物学特性、培养条件到干细胞建系的成功;从科研服务于人类到由此引发的伦理之争;从人类干细胞研究给医疗领域带来的广泛应用前景到目前研究尚存在的困难,比较全面的反映了人类干细胞研究的现状和应用前景.结论:由于胚胎干细胞在揭示生命的奥秘、攻克各种疑难杂症等方面具有极为诱人的前景,尽管目前还有许多困难,还存在争议,如果能够正确引导,建立相应完善的监管机制,人胚胎干细胞研究领域的每个进步都将对人类自身发展做出重大贡献.
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钙离子和钙网织蛋白对心肌细胞的作用
目的:阐述钙离子与钙网织蛋白对心肌细胞的作用.资料来源:检索PubMed 1994-01/2005-12与钙离子和钙网织蛋白对心肌细胞作用的相关文章,检索词为"Ca2+,calreticulin,cardiomyocytes/cardiac myocyte,differentiation",并限定语言种类为英语.资料选择:对所检索到的文献进行初筛,选择与钙离子和钙网织蛋白对心肌细胞作用的相关文章,筛除明显不符合原文的文章和重复性研究.资料提炼:共收集相关文章200篇,纳入42篇,排除158篇.资料综合:通过对内质网和肌质网上细胞内Ca2+释放通道(RyR和IP3R)的分子结构以及crt基因结构的研究表明:通道分子和钙网织蛋白共同参与调控体内Ca2+稳态,从而在心脏发育分化过程中发挥重要作用.结论:在心脏中细胞内游离Ca2+是一种关键的第二信使,细胞内Ca2+稳态的改变会显著影响许多心脏功能包括收缩舒张和心脏发育.细胞内Ca2+稳态的维持主要依赖内质网.在内质网中,钙离子主要与钙网织蛋白结合.crt基因敲除可损伤心脏发育而导致胚胎死亡.
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抗-Jka致溶血性输血反应结果分析
患者,男,69岁,B型血,Rh(D)阳性.1999年因肺癌手术曾输过血,无不良反应.2005-12因化疗致纯红细胞再生障碍性贫血住新乡医学院第三附属医院,入院重度贫血貌,临床申请输血.5 d后又输同型压积红细胞悬液2 u,当晚出现抽搐、发热、胸闷、畏寒、出汗等症状,经查间接胆红素增高,尿蛋白1+,潜血2+,临床按溶血性输血反应进行处理,患者症状缓解.为查明原因,重新抽取新鲜标本和溶血反应前的标本一同送至新乡市中心血站.通过血型血清学检测来寻找输血反应原因.结果显示,直接抗球蛋白实验为阴性.溶血反应前的标本均未出现凝集和溶血现象,而抗人球蛋白实验检测到患者血清中有不规则抗体存在;溶血反应后的标本均检测到不规则抗体.患者血清中存在抗-Jka,效价为8.
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当归补血汤对骨髓抑制小鼠骨髓细胞增殖的影响
实验于2005-03/2006-03在成都中医药大学中西医结合基础实验室完成.选择6～8周龄BALB/C雄性小鼠40只,随机分为4组:bcl-2对照组,bcl-2实验组,cmy-c对照组和cmy-c实验组,每组10只.所有小鼠于实验第1天起,连续5 d腹腔注射5 g/L环磷酰胺溶液,剂量为6 mL/(kg·d).实验第11～20天,bcl-2实验组和cmy-c实验组每日当归补血汤煎液灌胃,剂量为6 mL/(kg·d),共计10 d.对照组等量生理盐水灌胃.实验第20天,所有小鼠全部处死,取小鼠一侧股骨骨髓细胞,bcl-2对照组,bcl-2实验组离心洗涤后涂片做bcl-2原位杂交免疫组化染色.cmy-c对照组,cmy-c实验组离心洗涤后涂片cmy-c原位杂交免疫组化染色.将每张切片5个视野摄入图像分析仪,分析各视野阳性细胞面积总和和积分吸光度总和.实验结果bcl-2实验组阳性细胞面积总和为(16.11±3.01)×102 μm2,积分吸光度总和为(19.9±2.42)×105,与bcl-2对照组比较,差异有显著性意义(P＜0.01).cmy-c实验组阳性细胞面积总和(7.86±0.49)×102 μm2,积分吸光度总和为(13.66±70.00)×105,与cmy-c对照组比较,差异有显著性意义(P＜0.01).证明当归补血汤能促进骨髓有核细胞抗凋亡作用基因bcl-2和促细胞增殖基因cmy-c mRNA表达显著增加,从而推断当归补血汤能够促进骨髓细胞增殖并抑制其凋亡.
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自体骨髓干细胞移植治疗下肢缺血性疾病:43例6个月后疗效评估
探讨自体骨髓干细胞移植在下肢缺血性疾病治疗中的应用并评价其疗效.回顾性总结分析解放军第四六三医院血液内分泌科2005-01/09住院的具有完整随访资料的下肢缺血性疾病患者43例,采用下肢自体骨髓干细胞移植术.随访时间为6个月.术后每个月定期电话随访症状变化情况,6个月后复查皮温、经皮氧分压、踝肱比,随访疼痛、冷感、跛行距离,观察溃疡、坏疽情况.结果43例患者全部随访.①患者的疼痛缓解率为67.4%(29例/43例),冷感缓解率76.7%(33例/43例),跛行好转率60.5%(26例/43例),溃疡好转率84%(16例/19例),坏疽截肢1例,脱落愈合2例,无变化3例,扩大3例.②患者下肢皮温上升[(28.6±1.2)℃至(30.5±2.4)℃],经皮氧分压上升[(3.4±0.64)kPa至(3.9±0.8 kPa)],踝肱比无明显变化(0.45±0.36至0.46±0.39).提示骨髓干细胞移植治疗下肢缺血性血管病有效,是一种简单的、有效的治疗下肢动脉缺血性疾病的方法.
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非亲缘异基因外周血干细胞移植重建白血病幼儿造血功能:1例报告
目的:分析非亲缘异基因外周血干细胞移植治疗幼儿急性非淋巴性白血病的可行性.方法:患儿,男,3岁,于2005-07-18为行造血干细胞移植入本院血液科骨髓移植病房,入院诊断为急性非淋巴细胞性白血病-M5b.经抗肿瘤药物治疗病情获得完全缓解.患儿首先接受清髓性预处理,然后接受同性别非亲缘异基因外周血造血干细胞移植.①移植预处理包括马利兰、阿糖胞苷和环磷酰胺.移植前依次用药为马利兰3.2 mg/(kg·d)×4 d,口服,于移植前6,7,8,9 d给药;阿糖胞苷3.2 g/(m2·d)×2 d,于移植前4,5 d给药;环磷酰胺54 mg/(kg·d),于移植前2,3 d给药.②急性移植物抗宿主病的预防用药包括环孢菌素A和氨甲蝶呤、抗胸腺细胞球蛋白及吗替麦考酚酯.供者接受粒细胞集落刺激因子动员4 d后采集外周血造血干细胞,供、受者间HLA全相合,患者血型A,供者血型B,主次要均不合.结果:①患儿移植后早期获得造血重建,中性粒细胞＞0.5×109 L-1和血小板＞50×109 L-1的天数分别是12 d和11 d.②移植后1个月经DNA短串联重复序列多态性分析证明为供者型完全植入,移植后3个月查骨髓象正常.③移植后3,6个月定期行淋巴细胞亚群检查表明除CD19+,CD4+细胞未恢复外,自然杀伤细胞在移植后3个月恢复正常,T淋巴细胞CD3+与CD8+、体液免疫球蛋白在移植后6个月中均获得重建.④整个移植过程顺利,未出现明显感染和重度急性移植物抗宿主病.移植后96 d时出现Ⅰ度皮肤移植物抗宿主病,经加用激素治疗,皮疹消失.移植术后已随访观察12个月,患儿正常生活.结论:如果患儿有HLA完全相合的供者,非亲缘异基因外周血干细胞移植治疗儿童高危白血病是一种有效和安全的方法,对国内独生子女家庭拓宽供者来源有重要的实用价值.
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嗅鞘细胞移植治疗肾上腺脑白质营养不良1例
患者,男,10岁,因动作迟缓、伴视物不清及走路不稳6个月为主诉于2005-10-16入北京市石景山区西山神经再生和功能重建研究所神经外科.MRI检查示双侧顶枕部脑室旁异常信号影,诊断为肾上腺脑白质营养不良,应用嗅鞘细胞移植术治疗.术后患者吞咽功能、言语功能、行走、反应能力等均有改善,头颅MRI示病灶范围明显缩小,表明嗅鞘细胞移植可以在一定程度上改善肾上腺脑白质不良患者的临床症状.
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体外连续传代培养人腮腺腺上皮细胞的观察
实验于2004-11/2005-03在天津市口腔医院中心实验室完成.取材于一成年人腮腺良性肿瘤切除后弃用的正常腮腺组织.首先制备鼠尾胶原,取成年大白鼠2只,无菌条件下抽取鼠尾肌腱筋膜,收集浸泡在500 mL 1 g/L的冰醋酸中,铺被时将胶原冰醋酸溶液浸润培养板和培养瓶底壁,与盛有氨水烧杯一同放置在一无菌器皿中,在37℃温箱中保存72 h.然后采用酶消化法从腮腺组织分离培养腺上皮细胞,以鼠尾胶原作培养底物,在1∶1DMEM/F12培养基中加入胰岛素、异丙基肾上腺素、氢化考的松等生长刺激因子,倒置显微镜下观察原代及传代细胞形态学特征.结果表明腮腺上皮细胞原代培养4 d时成极性排列,形成大小不等的腺腔与导管样结构.腮腺上皮细胞传代培养在50 d的培养周期中传代至F3代,F3代细胞液氮冻存后复苏成活.苏木精-伊红染色见细胞体积较大,胞质丰富核膜清晰,1～2个核仁,部分可见核分裂相,无异常核分裂相.
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嗅鞘细胞移植对脊髓损伤大鼠诱发电位的影响
目的:观察嗅鞘细胞移植对脊髓损伤大鼠感觉及运动诱发电位的影响,尝试用嗅鞘细胞移植修复脊髓损伤后受损的传导通路.方法:实验于2004-09/2006-07在西安交通大学口腔医学实验中心完成.①选取成年健康SD大鼠40只,取16只大鼠用于嗅鞘细胞的培养与纯化,剩余24只随机数字表法分为4组:假手术组、模型对照组、嗅鞘细胞移植组、DF12培养液组,6只/组.②模型对照组、嗅鞘细胞移植组、DF12培养液组采用脊髓横切法制作脊髓损伤模型,以T10为中心的后正中切口入路,切除T10全椎板及T9,T11的部分椎板,显露脊髓,以特制探针横预置3-0丝线于待损伤脊髓腹侧硬膜外,以剃须刀片于预置线头侧0.5 mm(T10水平)将脊髓横断.假手术组仅切开T10全椎板及T9,T11的部分椎板,对脊髓未作横断处理.③造模后,嗅鞘细胞移植组以距脊髓断端1 mm的平面与正中线交点为进针点,每一进针点按1.75 mm,1.25 mm,1.00 mm,0.50 mm 4个不同深度分别注射嗅鞘细胞培养液0.5 μL,注射速度0.1 μL/min,每注射位点留针5 min.DF12培养液组同法注射0.5 μL无血清的D/F12培养液.假手术组、模型对照组未作处理.④术后8周,各组大鼠麻醉后使用Dantec Keypoint型四导诱发电位肌电图仪测定感觉及运动诱发电位的潜伏期及波幅变化.结果:24只大鼠全部进入结果分析.①嗅鞘细胞移植术后大体观察:术后6周,嗅鞘细胞移植组双后肢拖步爬行、双侧膝踝关节处溃疡和压疮等失神经支配征象逐渐好转,股四头肌肌力明显恢复,拖步爬行现象改善;而模型对照组、DF12培养液组大鼠失神经支配征象无改善,假手术组未见异常.②术后8周感觉诱发电位检测结果:模型对照组、DF12培养液组均未引出感觉诱发电位波形.与假手术组比较,嗅鞘细胞移植组感觉诱发电位潜伏期明显延长[(2.640±0.294),(14.575±2.117)ms,P＜0.01],波幅显著降低[(3.797±0.140),(0.403±0.078)μV,P＜0.01].③模型对照组、DF12培养液组均未引出运动诱发电位波形.与假手术组比较,嗅鞘细胞移植组运动诱发电位潜伏期明显延长[(5.825±0.350),(10.750±1.184)ms,P＜0.01],波幅显著降低[(5.200±0.432),(0.10±0.001)μV,P＜0.01]. 结论:嗅鞘细胞移植治疗可以调节损伤脊髓的内在微环境,加强体感诱发电位和运动诱发电位的恢复表达,改善神经功能.
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许旺细胞移植促进大鼠脑胆碱能纤维损伤后的修复
目的:脑损伤大鼠于脑隔-海马通路植入许旺细胞,观察许旺细胞的存活状况和损伤区乙酰胆碱酯酶能纤维的再生,分析许旺细胞与中枢神经系统轴突再生的相关性.方法:实验于2002-05/2003-05在北京解放军总医院完成.①选取成年雄性Sprague-Dawley大鼠64只,随机数字表法分为许旺细胞移植组、模型对照组,32只/组.另取SD乳鼠30只作为许旺细胞的标本来源.②两组大鼠均建立脑隔-海马胆碱能纤维损伤模型.造模后许旺细胞移植组立即注射体外培养2～3代的许旺细胞悬液,注射部位为中线旁1.8 mm,前囟后1.8 mm和中线旁1.8 mm,前囟后2.0 mm两点,5μL/点.模型对照组仅注入RPMI 1640培养液.③两组分别于许旺细胞植入后1,2,4,6周各处死8只大鼠,取脑组织制备石蜡切片.免疫荧光组织化学染色检测移植后许旺细胞低亲和力神经生长因子受体的表达情况;乙酰胆碱酯酶纤维染色检测损伤区乙酰胆碱酯酶能神经纤维再生情况;移植后第4周,采用网格测试系统对距损伤区分别为0.5 mm,1.5 mm,2.5 mm层面(即海马的前、中、后部区域)乙酰胆碱酯酶纤维密度进行定量分析.结果:实验选取64只大鼠均进入结果分析.①移植后许旺细胞表达低亲和力神经生长因子受体的情况:许旺细胞移植组在移植后2周表达低亲和力神经生长因子受体,第4周达到高峰,6周时略有下降;而模型对照组未出现表达低亲和力神经生长因子受体的许旺细胞.②移植后脑损伤区乙酰胆碱酯酶能神经纤维再生情况:许旺细胞移植组于移植后第2周在损伤后的皮层下隔区内即可见再生的乙酰胆碱酯酶能神经纤维,主要分布在损伤后的皮层下隔区,呈束样向海马内延伸.模型对照组无明显乙酰胆碱酯酶纤维再生.③移植后第4周脑损伤区海马内不同层面乙酰胆碱酯酶纤维密度定量分析结果:许旺细胞移植组大鼠脑海马CA3区在0.5 mm,1.5 mm,2.5 mm各层面的乙酰胆碱酯酶纤维密度均明显高于模型对照组(t=8.012,P＜0.05).结论:植入脑隔-海马通路后的许旺细胞可在受体内存活并表达低亲和力神经生长因子受体,促进损伤后乙酰胆碱酯酶能神经纤维的再生.
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骨髓间质干细胞移植治疗大鼠急性心肌梗死的病理学观察
目的:观察急性心肌梗死大鼠行骨髓间质干细胞移植后受损心肌组织的病理形态学变化.方法:实验于2004-01/2005-06在上海胸科医院完成.选取健康成年雌性SD大鼠40只,随机数字表法分为骨髓间质干细胞注射组、模型对照组,20只/组.①两组大鼠均建立心肌梗死模型.造模0.5 h后,骨髓间质干细胞注射组于结扎点下方缺血区域组织注射Dill标记的骨髓间质干细胞3×106个,模型对照组心肌缺血区域注射100 μL生理盐水.②造模后4～6周处死两组大鼠,取出心脏,剪除双侧心房及右心室,沿左心室长轴由心尖到底部做3 mm厚切片,镜下观察心肌梗死区域病理组织学表现.③选择心肌梗死表现明显的蜡块切片,行酸性复红染色,用Leica Q Win多媒体彩色病理图文分析软件进行图像分析,自动测量出切片中心肌梗死组织占总面积的百分比.免疫组化检测梗死心肌血管内皮生长因子和FactorⅧ蛋白因子的表达情况.结果:40只大鼠均进入结果分析.①梗死心肌的病理形态学观察:光镜下两组均可见大小不等的心肌梗死灶,梗死心肌区域细胞肿胀坏死,严重缺血坏死区出现心肌溶解.但骨髓间质干细胞注射组上述改变明显弱于模型对照组,其心肌梗死中层可见条索状的梗死灶及纤维瘢痕灶,并且有残存的心肌呈岛状散在分布,纤维瘢痕区域心肌细胞、微血管和毛细血管数量均明显增加,侧支循环丰富.另外,骨髓间质干细胞移植组于造模初期4只大鼠心内膜面有灶性软骨生成,向心室腔突起.②梗死心肌面积百分率的检测:骨髓间质干细胞注射组梗死心肌面积百分率明显低于模型对照组[(3.69±0.48)%,(19.20±1.77)%,t=7.621～10.820,P=0.001].③梗死心肌血管内皮生长因子和FactorⅧ免疫组化检测:骨髓间质干细胞注射组血管内皮生长因子、FactorⅧ呈阳性表达,模型对照组未检测到血管内皮生长因子和FactorⅧ.结论:骨髓间质干细胞在大鼠心脏内可以转化为血管内皮细胞或分泌血管内皮生长因子,是治疗缺血性心血管疾病理想的细胞来源.心内膜面有灶性软骨生成可能是由于注射细胞时进针太深,警示注意骨髓间质干细胞移植的副反应.
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异基因造血干细胞移植后发生阻塞性肺病的临床特征
目的:分析异基因造血干细胞移植后阻塞性肺病的临床特点和发病因素.方法:厦门大学附属中山医院血液科于2002-12/2005-04对27例血液病患者进行了异基因造血干细胞移植.移植前均无肺部疾患史,胸部X射线检查肺功能均正常.随诊截止时间为2006-04-30.预处理均采用以马利兰+环磷酰胺为基础的方案,预防移植物抗宿主病采用骁悉、环孢素及短程甲氨喋呤方案,移植前给予更昔洛韦预防巨细胞病毒感染.阻塞性肺疾病诊断标准:有呼吸道症状(干咳、呼吸困难)但无严重感染证据,肺功能指标:1s用力呼气量小于预计值的80%及1 s用力呼气量/用力肺活量小于80%,胸部X线片显示可正常或过度通气,高分辨CT可表现为弥漫性肺泡实变,支气管、细支气管扩张.分析患有阻塞性肺病患者的造血功能重建情况、移植物抗宿主病发生情况、阻塞性肺病的发生情况、治疗及预后情况.结果:27例患者均进入结果分析.①根据临床诊断标准,7例患者患有阻塞性肺病,发生率为26%,中位发病时间为移植后300 d(110～390 d),均伴有慢性移植物抗宿主病.②主要表现为干嗽(57%),呼吸困难、双肺呼吸音弱(100%),胸片未见异常,胸部高分辨CT分别显示正常、下肺少量较淡的模糊小片状影及支气管扩张;肺功能均显示重度混合性通气功能障碍.③抗生素治疗无效,免疫抑制剂及激素治疗有效,但于减量或停药后症状可加重,3例死于呼吸衰竭,4例症状好转,但肺功能无改善.结论:阻塞性肺病是移植后严重并发症之一,部分为进行性发展,死亡率较高,定期的肺功能检查有助于早期诊断;其原因可能主要为非感染性因素所致.
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静脉注射骨髓间充质干细胞在缺血鼠脑中的分布与转化
目的:观察经静脉输入骨髓源性骨髓间充质干细胞在缺血鼠脑中的分布与转化情况.方法:实验于2003-07/2004-08在中国医科大学完成.①取两周龄Wistar胎鼠1只制备骨髓间充质干细胞,将传至2,3代的细胞于移植前3 d加入溴脱氧核苷尿嘧啶进行标记备用.②选取健康成年Wistar大鼠22只,随机数字表法分为缺血再灌注模型组12只、假手术组10只.缺血再灌注模型组大鼠建立大脑中动脉闭塞模型,假手术组手术步骤相同,但不阻塞大脑中动脉.术后大鼠提尾右前肢屈曲内收、向右侧转圈或向右侧倾倒为造模成功,缺血再灌注模型组12只大鼠均符合标准.③造模24 h后,取2,3代经BrdU标记的骨髓间充质干细胞,消化离心后分别取3×106个细胞(总量大约1 mL)静脉输入两组每只鼠尾.④造模后14 d,两组大鼠断头后以前囟为中心前后1 mm处取脑组织制作标本切片,苏木精-伊红染色.应用BrdU标记骨髓间充质干细胞,计数两组同一部位的10个冠状切片的所有BrdU反应阳性细胞.应用免疫荧光与免疫酶法双重染色,计数BrdU阳性细胞表达神经元特异性烯醇酶、神经胶质原纤维酸性蛋白的比例.结果:实验选取22只大鼠均进入结果分析.①神经元凋亡检测结果:缺血再灌注模型组大鼠缺血区脑组织均发现了暗红色神经元,神经细胞间隙增宽.假手术组均未检测到以上现象.②骨髓间充质干细胞BrdU免疫组化染色结果:骨髓间充质干细胞的胞核为圆形或椭圆形,暗棕色,胞浆少且形态不规则,BrdU标记出现在大脑中动脉闭塞范围的供体细胞胞核中.大多数BrdU标记的骨髓间充质干细胞定位于缺血中心和边缘区,平均阳性细胞数为(15 002.75±4 972.64);少量分布在对侧半球皮层,平均阳性细胞数为(999.58±655.41).假手术组脑组织内未发现BrdU阳性细胞.③骨髓间充质干细胞双重免疫组化染色结果:缺血区BrdU阳性细胞表达神经元特异性烯醇酶和神经胶质原纤维酸性蛋白的比例分别是(4.53±1.80)%,(3.66±0.87)%.缺血区对侧的BrdU阳性细胞均未发现表达神经细胞标志.结论:骨髓间充质干细胞经静脉输注途径可以进入缺血后脑组织,存活且大多定位于缺血半球缺血区,表达神经细胞表型的蛋白标志.
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许旺细胞移植治疗晚期脊髓损伤的手术方法
目的:观察采用许旺细胞脊髓腔内移植手术治疗晚期脊髓损伤患者,其神经恢复的疗效.方法:选择2001-03/2006-03在解放军昆明总医院脊髓损伤治疗科的完全截瘫患者47例.根据患者症状、体征、CT、核磁共振、美国脊髓损伤学会评分明确诊断.男38例,女9例,平均31.4岁,均签知情同意书.致伤原因中车祸26例,高处坠落13例,刀伤1例,重物砸伤7例.脊髓损伤部位为颈段15例,T1-6段12例,T7-12段20例.伤后至许旺细胞伤后平均移植时间26.8月.47例患者伤后在院外均接受过不同种类的神经营养或生长因子治疗及正规的康复治疗,其中37例在院外已行脊柱内固定及脊髓减压手术,疗效均不明显.47例除8例因内固定材料不宜行核磁共振检查外,其余均行核磁共振检查.取6个月左右流产胎儿脊神经背根用于许旺细胞培养,不影响许旺细胞移植.手术于全麻下行脊髓损伤节段后方入路,切开硬膜显露脊髓,显微镜下松解粘连,切除增厚的蛛网膜及疤痕组织,合并脊髓囊肿或空洞,于脊髓受损处,选择薄、呈透明的部位纵形切开空洞,彻底清除囊腔内液化、坏死组织,用神经剥离子轻柔搔刮囊壁,生理盐水反复冲洗囊腔,直至冲洗液清亮.将附有许旺细胞的薇乔3-0紫色可吸收线按囊腔的长度剪好,置于囊腔内,滴入许旺细胞溶液1 mL,再用附有许旺细胞的薇乔网覆盖,几丁糖封闭创面,敞开硬膜,放置明胶海绵放于硬脊膜外.置多侧孔引流管,逐层缝合切口.术后2周进行康复训练.许旺细胞移植后随访2～8周.采用美国脊髓损伤学会制定的评分标准,进行术前和术后评分对比.结果:47例患者均进入结果分析.许旺细胞移植后8周时,按美国脊髓损伤学会脊髓损伤神经功能分类国际标准评价,47例患者的脊髓功能均有部分恢复,与术前对比,差异有显著性意义[术前:运动功能:(41.30±16.48)分,轻触觉:(56.28±21.04)分,针刺觉:(58.47±23.12)分;术后:运动功能:(44.06±17.030分,轻触觉:(60.38±20.52)分,针刺觉:(65.30±23.73)分,P＜0.05).患者术后无发热、脊髓感染、功能损伤加重及死亡等并发症.术后复查磁共振检查脊髓无瘤样增生及空洞扩大.结论:本实验应用的手术方法移植许旺细胞治疗晚期脊髓损伤具有安全性,术后8周评估患者脊髓功能与术前比较有量化性提高,其恢复部分脊髓神经功能的作用尚需原期观察.
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红细胞裂解法分离及培养大鼠骨髓间充质干细胞
背景:骨髓间充质干细胞在骨髓中的含量非常少,而且与其他细胞特别是易与红细胞相混杂,因此在分离过程中需去除干扰,以获得尽可能多的高纯度的骨髓间充质干细胞.目的:采用红细胞裂解法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,同时进行生物学鉴定.设计:观察对比实验.单位:中国航天员科研训练中心航天细胞分子生物学实验室.材料:选用50只生后30 d的雄性SD大鼠,体质量100g,SPF级,购自北京实验动物中心(合格证:SCXK(京)2002-0003).DAB浓缩显色液(含过氧化氢,中杉公司),兔抗大鼠多克隆抗体(武汉博士德公司),FCS(PAA,Austria),LG-DMEM培养基(Sigma,USA).方法:实验于2004-09/2005-09在中国航天员科研训练中心航天细胞分子生物学实验室完成.将大鼠脱臼处死,暴露骨髓腔,收集细胞悬液,采用全骨髓培养法对骨髓间充质干细胞分离与原代培养.①红细胞裂解实验:取A、B、C、D 4管分别加入0.5 mL过滤并充分吹打均匀后的骨髓冲洗液,分别对应加入红细胞裂解液、氯化氨2 mL、磷酸盐缓冲生理盐水2 mL和体积分数为0.04的乙酸溶液0.5 mL,分别测量各组吸光度值及血红蛋白浓度,并观察细胞生长情况.②骨髓间充质干细胞生长曲线、倍增时间及表面标志分子表达情况的观察:根据公式:群体倍增时间(TD)=t[lg2/(lgNt-lgN0)](N0和Nt分别代表接种后和培养t小时的细胞数),计算出细胞的群体倍增时间并描绘并分析骨髓间充质干细胞第2、4、6代细胞的生长曲线;采用亚甲基兰染色测定骨髓间充质干细胞增殖情况;采用免疫细胞化学染色检测骨髓间充质干细胞表面标志分子表达情况.主要观察指标:①大鼠骨髓间充质干细胞分离和培养的观察结果.②不同处理方法对红细胞的裂解效果及其对骨髓间充质干细胞生长的影响.③第2、4、6代细胞的生长曲线及细胞倍增时间.④大鼠骨髓间充质干细胞表面标志分子表达情况.结果:①大鼠骨髓间充质干细胞的分离和培养结果:原代培养48 h后大部分细胞已贴壁,72 h时贴壁细胞已开始分裂增殖.7～8 d后可见有明显集落形成,之后集落迅速增多,不断扩大,互相融合,14～16 d时细胞克隆生长稠密.刚传代的细胞呈球形,很快沉降贴壁,少部分圆形细胞悬浮.贴壁细胞均匀分布,3～5 d增殖迅速.虽然传代后细胞形态未变,但增殖速度明显增快,约6 d长满培养瓶底.②不同处理方法对红细胞的裂解效果及其对骨髓间充质干细胞生长的影响:红细胞裂解液处理组,氯化氨处理组和4%乙酸处理组的血红蛋白浓度明显高于磷酸盐缓冲生理盐水处理组,差异有显著性(P＜0.01).③不同代骨髓间充质干细胞的生长曲线观察结果:第2,4,6代细胞生长曲线基本相同,经过一两天的潜伏适应期后进入对数生长期,第5天达顶点,以后进入平台期(在第5～7天).第6代骨髓间充质干细胞的潜伏期表现不明显骨髓间充质干细胞的群体倍增时间平均约为34 h.④不同代骨髓间充质干细胞的免疫表型鉴定:各代细胞CD44和CD106染色均呈阳性,表现为棕黄色颗粒沉淀,CD34染色呈阴性.结论:采用红细胞裂解液处理骨髓冲洗液后再行接种,能提高骨髓间充质干细胞的贴壁效率,同时不影响其贴壁后的生长,是一种可行的分离方法.细胞表面标记染色鉴定证明,本实验所分离细胞是骨髓间充质干细胞.
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转染癌基因的骨髓基质干细胞体外分化特征
目的:观察转染癌基因的骨髓基质干细胞在体外分化情况,为肝细胞癌的细胞源研究提供实验依据.方法:实验于2003-05/2004-06在南方医科大学药理教研室实验室完成.①两步法获取大鼠肝细胞,梯度离心法分离大鼠骨髓基质干细胞.②单基因转染是单独将c-myc或K-ras癌基因瞬时转染大鼠骨髓基质干细胞,6孔培养板中培养,24 h后荧光显微镜下观察骨髓基质干细胞转染结果.双基因转染步骤相同,只是将c-myc和K-ras癌基因同时转染大鼠骨髓基质干细胞.③c-myc癌基因转染组、K-ras癌基因转染组、双癌基因转染组常规培养,加入含体积分数为0.1胎牛血清的DMEM培养基,于37℃、体积分数为0.05的CO2孵箱培养,每24 h半量更换培养液.④c-myc癌基因转染+肝细胞组、K-ras癌基因转染+肝细胞组、双癌基因转染+肝细胞组将已转染癌基因的骨髓基质干细胞,置于叠加的培养板半透膜的上方(细胞密度均为1×105个/cm2),再将肝细胞置于半透膜的下方(每孔细胞密度为3×105/cm2)进行共培养,其余步骤同常规培养.⑤通过反转录聚合酶式反应和细胞免疫组化检测骨髓基质干细胞分化情况.结果:①癌基因转染24 h骨髓基质干细胞检测结果:单独转染c-myc或K-ras癌基因的细胞,其绿色荧光蛋白呈均匀一致分布;双基因转染的细胞,绿色荧光蛋白呈点片状分布.②各组骨髓基质干细胞向肿瘤细胞分化检测结果:c-myc癌基因转染组、K-ras癌基因转染组、双癌基因转染组的骨髓基质干细胞,均未向肿瘤细胞分化;c-myc癌基因转染+肝细胞组、K-ras癌基因转染+肝细胞组、双癌基因转染+肝细胞组的骨髓基质干细胞,均向肝细胞癌发展;空白对照组骨髓基质干细胞细胞均为阴性.此外,双癌基因转染+肝细胞组的骨髓基质干细胞分化增殖迅速,反转录聚合酶式反应和免疫组化检测发现,培养第7天出现甲胎蛋白表达,并迅速增加,而第7天出现的白蛋白和细胞角蛋白18表达迅速减弱,第14天消失.结论:转染癌基因的骨髓基质干细胞,在向肝细胞诱导的条件下,部分癌基因可以使干细胞分化为肝癌细胞;多癌基因转染时,更易于使干细胞分化为肝癌细胞.
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体外诱导骨髓间充质干细胞向肾小管上皮细胞的分化
目的:探讨体外诱导骨髓间充质干细胞向肾小管上皮细胞分化的可行性.方法:实验于2004-10/2005-12在苏州大学儿科研究所和苏州大学附属儿童医院骨科实验室完成.骨髓间充质干细胞特性实验:①将2只4周龄SD大鼠断颈处死,无菌条件下取股骨、胫骨,去除其干骺端,暴露骨髓腔,DMEM培养液冲洗,混匀后用密度为1.077 g/L淋巴细胞分离液分离.取单个核细胞层接种50 mL细胞培养瓶进行培养,3 d后首次换液,待10～14 d细胞生长到80%～90%融合时以胰蛋白酶-乙二胺四乙酸消化传代.②采用免疫荧光法测定骨髓间充质干细胞表面CD44与Vimentin的表达情况;应用二苯基四氮唑溴盐法检测细胞生长情况.损伤肾脏组织匀浆诱导骨髓间充质干细胞实验:①取1只成年SD大鼠麻醉后,表皮消毒,取腹部正中切口,寻及双侧肾蒂,用无损伤动脉夹夹闭双侧肾蒂,缺血60 min后松开动脉夹,再灌注60 min后,无菌取肾制备匀浆.②将肾脏匀浆置于插入式嵌合培养皿中对第3代骨髓间充质干细胞进行诱导,并加入含有5 μmol/L全反式维甲酸的低必须培养基.③诱导第0,3,5,7天,倒置显微镜下观察细胞大体形态变化;以上各时间点取活细胞制成活细胞悬液,经流式细胞仪测定第18型角蛋白的阳性表达率;取诱导分化第7天的细胞,电镜观察其超微结构变化;钙钴法碱性磷酸酶细胞化学染色,与未经损伤肾脏组织匀浆诱导的骨髓间充质干细胞进行比较.结果:①骨髓间充质干细胞的特性检测:免疫荧光法鉴定分离培养的第3代细胞表面CD44和Vimentin表达阳性.二苯基四氮唑溴盐法测得的细胞生长曲线呈倒"S"型.②损伤肾脏组织匀浆诱导后骨髓间充质干细胞情况:骨髓间充质干细胞经诱导后大体形态变圆,由梭形细胞逐渐转变为鹅卵石样细胞,细胞碱性磷酸酶染色呈强阳性.诱导第7天细胞出现微绒毛和紧密连接,经诱导后的骨髓间充质干细胞第18型角蛋白表达阳性率升至79.5%.结论:在缺血再灌注损伤大鼠肾脏匀浆及全反式维甲酸的联合诱导下,骨髓间充质干细胞可向肾小管上皮样细胞分化,具有成缮为种子细胞应用于急性肾脏损伤治疗的潜在价值.
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密度梯度离心结合贴壁法培养成年大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性
背景:研究骨髓间充质干细胞的培养方法,以获取大量高纯度的骨髓间充质干细胞,对应用组织工程技术重建眼部组织治疗眼部疾病具有重要意义.目的:应用密度梯度离心结合贴壁法进行成年大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养,观察其生长特性及大量繁殖的可能性.设计:完全随机分组设计/重复测量实验.单位:中山大学中山眼科中心病理科实验室.材料:选用6周龄SD大鼠4只,雌雄不限,清洁级2级,体质量约250 g/只,由中山大学动物中心提供,许可证号码SCSK(粤2004/0011).DMEM/F12培养基(美国GlBCo公司)、胎牛血清(杭州四季青生物工程公司)、胰蛋白酶、依地酸二钠、淋巴细胞分离液.纤维连接蛋白、CD44、CD34、CD31单克隆抗体,免疫组化二步法试剂盒(北京中杉生物技术公司).方法:实验于2005-09/2006-01在中山大学中山眼科中心病理科实验室完成.①取SD大鼠,断颈处死后于750 g/L酒精浸泡10 min.无菌条件下,分离并暴露骨髓腔,用注射器吸入应用液直接插入股骨腔,用含肝素的培养液将骨髓腔里的细胞冲洗出来作为细胞混悬液,密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,观察活体细胞生长情况.②将第2代细胞接种于预置在培养板内的无菌盖玻片上,当细胞基本融合时,取出作原位甲醇固定10 min,苏木精-伊红染色.原位丙酮固定10 min,按二步法作免疫组织化学纤维连接蛋白、CD44、CD34、CD31反应,3,3'-二氨基联苯胺显色,后将盖玻片反扣在载玻片上,封固、观察.③将细胞按4.25×107L-1的浓度接种于96孔板中,每孔200 μL,置培养箱中,分别于接种后1,2,3,4,5,6 d各于两排孔中加入20 μL/孔四甲基偶氮唑盐,继续培养4 h后吸去上清液,每孔加200 μL二甲基亚砜,振荡5 min后,于570 nm波长测吸光度值,绘制细胞生长曲线.主要观察指标:①大鼠骨髓间充质干细胞活体培养观察结果.②2代细胞免疫组织化学染色观察结果.③接种后1,2,3,4,5,6 d细胞生长曲线.结果:①刚接种入培养板的大鼠骨髓间充质干细胞于倒置显微镜下可见呈大小较一致的圆形,胞膜清晰,胞体透亮.第2天可见细胞已开始贴壁,3 d后多数细胞伸出伪足,变成多角形、星形或不规则形.4 d后细胞开始分裂繁殖,约12 d细胞便基本单层融合,呈漩涡状排列.②对分离后所获得的细胞进行免疫组化染色,细胞CD44、纤维连接蛋白均阳性,CD34、CD31均阴性.③大鼠骨髓干细胞传代后第2天细胞数量就开始大量增加,至第5天数量达到顶点,细胞融合,生长达到平台期.结论:采用密度梯度离心结合贴壁培养法可获得较高纯度的骨髓间充质干细胞,是实用、便捷和可行的方法.并且在体外培养条件下能大量增殖,为应用组织工程技术治疗眼部疾病提供种子细胞.
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骨髓间充质干细胞基因工程改造方法的比较
目的:对脂质体介导、反转录病毒载体介导、腺相关病毒载体介导这3种常用的基因转染方法进行比较,寻找一种适合于骨髓间充质干细胞的基因转移方法.方法:实验于2004-10/2005-06在首都医科大学北京神经科学研究所完成.①在脂质体介导下,将增强的绿色荧光蛋白基因导入骨髓间充质干细胞,然后通过G418抗性筛选,观察转染效率.②反转录病毒介导的基因转染,首先利用LipofectAMINETM 2000转染包装细胞系PT67,获得重组反转录病毒上清,然后用病毒上清直接感染骨髓间充质干细胞.转染后的细胞同样用G418筛选,得到阳性克隆后进行定点消化、扩增.③在腺相关病毒介导的基因转染过程中,首先通过磷酸钙沉淀法转染包装细胞系HEK293,得到重组AAV-LacZ病毒颗粒直接感染骨髓间充质干细胞,1周后进行β-gal染色,计算转染效率.结果:①脂质体介导的基因转染24 h后在荧光显微镜下观察,可见少量细胞呈现绿色荧光蛋白阳性,阳性率大约为5%.抗生素筛选3周后细胞全部死亡,经过多次试验均未得到阳性细胞克隆.②反转录病毒感染后,在荧光显微镜下观察可见少量骨髓间充质干细胞表达增强的绿色荧光蛋白.当加入G418筛选后,大量细胞死亡,1周后仅有极少数细胞存活.继续培养3～4周后,细胞形成克隆,定点消化细胞克隆,扩增后95%的细胞表达绿色荧光蛋白.③腺相关病毒上清感染骨髓基质细胞1周后,用β-gal染色估计骨髓间充质干细胞转染效率大约为75%.但传代后阳性细胞所占比例明显下降,大约2%.结论:骨髓间充质干细胞易于接受外援基因.3种基因转移方法相比:脂质体转染法转染效率低,不适合骨髓间充质干细胞;反转录病毒载体法感染效率高,适用于骨髓间充质干细胞;而腺相关病毒载体法感染效率较高,但该载体系统没有抗生素筛选,所以无法使阳性细胞得到纯化和扩增,其可能更适合于体内基因直接感染.
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骨髓间充质干细胞的分化潜能及临床应用价值
目的:观察人的骨髓间充质干细胞多分化潜能及在糖尿病治疗领域的价值.方法:实验于2005-07/2006-07在青岛大学医学院附属医院内分泌科完成.骨髓来源于非造血系统疾病的16岁儿童胸骨骨髓血(查体以排除造血系统疾病,结果显示为健康体质),经得家属同意.Percoll淋巴细胞分层液分离骨髓间充质干细胞,取第3代细胞,等密度接种于培养瓶中,经CD44抗体、CD45抗体、CD34抗体鉴定.取其第4代细胞,诱导其向脂肪细胞及神经细胞分化,利用碱性成纤维细胞生长因子预处理先获得巢蛋白阳性细胞,分别用两种方法诱导其向胰岛祖细胞的转化:化学物质诱导和共培养法诱导,免疫荧光检测胰岛祖细胞标志-胰十二指肠同源异型盒基因(蛋白的表达,电化学发光法检测其是否表达胰岛素).胶原酶消化法获取胰腺间充质干细胞,鉴定,用添加碱性成纤维细胞生长因子的无血清低糖DMEM使其增殖.将胰腺间充质干细胞接种于底层已接种骨髓间充质干细胞的6孔板共培养,共培养法诱导骨髓间充质干细胞向胰岛祖细胞的初步转化.结果:成脂诱导及成神经诱导可获得油红O染色阳性细胞以及巢蛋白阳性细胞.化学法向胰岛祖细胞诱导后可检测到PDX-1免疫反应阳性细胞.共培养法诱导也可获得PDX-1免疫反应阳性细胞.新生儿胰腺具有巢蛋白、CK-19阳性的胰腺间充质干细胞,体外高糖诱导可形成胰岛样细胞团.结论:骨髓间充质干细胞在体外具有诱导分化为脂肪细胞、神经元样细胞及胰岛祖细胞的潜能.新生儿胰腺间充质干细胞向胰岛细胞分化过程中所分泌的一些物质对骨髓间充质干细胞向胰岛祖细胞的转化具有促进作用.
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雌二醇对大鼠骨髓基质细胞过氧化物酶增殖活化受体γ2基因表达的影响
背景:雌二醇能否改变骨髓基质细胞分化过程中过氧化物酶增殖活化受体γ2-mRNA的表达进而影响其向成骨细胞分化有待研究.目的:观察骨髓基质细胞在向成骨细胞分化的介质中,17B-雌二醇对其过氧化物酶增殖活化受体γ2mRNA及蛋白表达的影响.设计:对比观察实验.单位:成都军区总医院中心实验室,德阳市人民医院检验科,成都百奥生物技术有限公司.材料:选用1只雌性SD大鼠,3月龄,清洁级,体质量(200±20)g,由成都中医药大学实验动物研究中心提供(动物许可证号码11).DMEM培养液购自Hyclone,1,25一双羟维生素D3、地塞米松和雌二醇购自Sigma公司,引物用Jellyfish软件设计,由大连宝生物技术有限公司合成.RT-PCR试剂盒和RNA提取试剂盒均由大连宝生物提供.兔抗山羊多抗(北京中山生物技术有限公司),山羊抗鼠PPARγ2抗体和Western Blotting增强化学发光试剂均购自Santa Cruz公司.方法:实验于2001-04/2002-07在成都军区总医院中心实验室和成都百奥生物技术有限公司完成.①无菌条件下分离大鼠骨髓基质细胞,1,25一双羟维生素D3和地塞米松诱导大鼠骨髓基质细胞向成骨细胞分化,观察细胞生长情况.②用0,0.1,10和1 000 nmol/L不同浓度雌二醇对细胞分化过程进行干预3 d.培养细胞用Tris-Triton X-100缓冲液加超声粉碎裂解细胞,在Beckman CX-7生化分析仪上测定碱性磷酸酶的活性,观察不同浓度雌二醇条件下细胞产生碱性磷酸酶的情况.③100 g/L中性甲醛固定培养于24孔板的骨髓基质细胞,Weigert苏木素染液染色10 min,自来水冲洗,5 g/L盐酸乙醇分化,Van Gieson染色,体积分数为0.95乙醇分化脱水,二甲苯透明,显微镜下观察并照相,观察细胞胶原合成情况.④应用半定量RT-PCR及Northern blot、Western blot技术,观察不同浓度雌二醇对骨髓基质细胞分化过程中PPAR-γ2 mRNA及蛋白表达的影响.主要观察指标:①骨髓基质细胞生长情况、细胞胶原合成情况.②不同浓度雌二醇条件下细胞产生碱性磷酸酶的情况.③不同浓度雌二醇对骨髓基质细胞分化过程中PPAR-γ2 mRNA及蛋白表达的影响.结果:①骨髓基质细胞接种后4 h开始贴壁,24～72 h可见贴壁细胞明显增大且分裂增殖,细胞呈三角形,多角形或梭形.3 d后首次换液,贴壁细胞体积增大,呈集落生长,10 d左右融合成遍.多次传代的骨髓基质细胞呈有序的成纤维细胞样分布.②随着雌二醇浓度的增加,胞浆染色越淡,由鲜红、淡红到黄色.胞浆呈红色说明有胶原合成,红色越深,表明胶原越多.③不同浓度雌二醇条件下细胞均能产生碱性磷酸酶,其活性随雌二醇浓度增加而降低,雌二醇浓度从0 nmol/L增加到1 000 nmol/L时,碱性磷酸酶从(710.1±41.7)nkat/g降至(60.0±11.7)nkat/g(t=29.0,P＜0.01).④雌二醇浓度为0.1,10和1 000 nmol/L时,PPAR-γ2 mRNA的表达量均明显高于雌二醇0 mol/L组(t=6.1,7.2,11.5,P＜0.01),Northern blot结果显示雌二醇浓度为0.1,10和1 000 nmol/L时PPAR-γ2 mRNA表达量分别为(4.0±0.4)%,(1.7±0.2)%,(2.8±0.2)%,明显高于雌二醇0 mol/L组[(1.5±0.1)%,t=5.4,105.0,14.2,P＜0.01].⑤Western Blot检测结果显示雌二醇能明显增加骨髓基质细胞PPAR-γ2蛋白的表达.雌二醇浓度为0.1,10和1 000 nmol/L时,PPAR-γ2蛋白的表达量分别为(2.2±0.2)%,(2.6±0.2)%,(4.1±0.2)%,明显高于雌二醇0 mol/L组[(1.2±0.10)%,t=6.6,8.5,13.2,P＜0.01].结论:雌二醇能明显抑制体外培养的骨髓基质细胞碱性磷酸酶的表达,同时促进骨髓基质细胞内过氧化物酶增殖活化受体γ2mRNA和蛋白的表达.
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人骨形成蛋白2和血管内皮细胞生长因子165在人骨髓间充质干细胞中的共表达
背景:骨形成蛋白与骨、软骨、肌腱、韧带等多种组织的形成有关,血管内皮细胞生长因子通过提高血管的通透性和促进内皮细胞迁移可促进血管生成.目的:构建人骨形成蛋白2和人血管内皮细胞生长因子165的真核共表达载体,并观察其在骨髓间充质干细胞中的表达.设计:观察对比实验.单位:泸州医学院附属医院整形外科和中国医学科学院中国协和医科大学整形外科医院.材料:骨髓间充质干细胞来源于健康成人献髓志愿者.pIRES-EGFP-hVEGF165含人血管内皮细胞生长因子165全长cDNA序列,由中国医学科学院整形外科医院成挺博士提供.含人全长骨形成蛋白2cDNA序列的克隆载体pSP65-hBMP2,由军事医学科学院基础医学研究所郭希民博士提供.真核表达载体pIRESneo(Clontech公司)Pyrobest DNA Polymerase、限制性内切酶、DNA连接酶和质粒提取试剂盒、DNA片段分离及纯化试剂盒(大连宝生物公司),LipofectamineTM脂质体转染试剂盒、DMEM培养基、胰蛋白酶、TRIzol RNA提取试剂盒(Gibco BRL),Omniscript RT试剂盒(Qiagen),Taqplus-DNA聚合酶(Promega),PMSF、leupeptin、aprotinin、chymostatin(Sigma),蛋白酶抑制剂、PVDF膜(Amersham-Pharmacia Biotech),兔抗人BMP2和VEGF单克隆抗体(Santa Cruz公司),羊抗兔IgG-过氧化物酶(博士德公司),G418(美国Ameresco公司).方法:实验于2005-06/2006-04在泸州医学院附属医院和中国医学科学院中国协和医科大学整形外科医院完成.利用重组DNA和基因克隆技术将人骨形成蛋白2和人血管内皮细胞生长因子165cDNA定向克隆到载体pIRESneo的多克隆位点构建重组质粒,经Xho Ⅰ/Bgl Ⅱ双酶切和基因测序鉴定后,在阳离子脂质体介导下转染骨髓间充质干细胞,根据观察结果的需要,将转染的细胞分为IRES-hBMP2-VEGF165组,pIRES-hBMP2组,pIRES-VEGF165组,空质粒对照组,分别给予pIRES-hBMP2-VEGF165,pIRES-hBMP2,pIRES-VEGF165 及pIRES-neo转染,取同样数量的未转染的细胞作为空白对照组.通过RT-PCR及Western blot检测细胞骨形成蛋白2和血管内皮细胞生长因子165mRNA表达和蛋白的分泌.主要观察指标:①重组质粒双酶切和基因测序分析.②RT-PCR观察质粒转染后的骨髓间充质干细胞的人骨形成蛋白2 mRNA和人血管内皮细胞生长因子mRNA表达.③Western Blot检测质粒转染后的骨髓间充质干细胞的骨形成蛋白2和人血管内皮细胞生长因子蛋白分泌情况.结果:①重组质粒双酶切和基因测序分析结果:用EcoRI和Bgl Ⅱ将三个阳性质粒和pIRES-BMP2进行双酶切鉴定与基因测序分析重组质粒的hBMP-2和hVEGF165与报道结果一致,证明重组质粒pIRES-hBMP2-hVEGF165构建成功.②RT-PCR检测结果:转染pIRES-hBMP2-hVEGF165的细胞高表达BMP2 mRNA和VEGFmRNA,而未转染的细胞和只转染空质粒的细胞则阴性或只有痕量表达.③Westem Blot检测结果:转染pIRES-hBMP2-hVEGF165和pIRES-BMP2的细胞大量分泌人BMP2至上清,而转染pIRES-VEGF165或空质粒的细胞与未转染的细胞仅有极少量的BMP2分泌;转染pIRES-hBMP2-hVEGF165和pIRES-hVEGF165的细胞大量分泌血管内皮细胞生长因子至上清,而转染pIRES-hBMP2或空质粒的细胞与未转染的细胞仅有极少量的血管内皮细胞生长因子分泌.结论:重组质粒pIRES-hBMP2-hVEGF165真核共表达载体在人骨髓间充质干细胞细胞中有良好的表达.
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培养基对兔骨髓间充质干细胞扩增与分化的影响
目的:考察α-MEM,DMEM-HG,DMEM-LG 3种培养基对兔骨髓间充质干细胞体外贴壁、增殖与分化的影响.方法:实验于2005-04/2005-12在华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室完成.①兔骨髓间充质干细胞的获取:从1个月龄新西兰大白兔股骨中用全骨髓分离法分离得到兔骨髓间充质干细胞,体外培养,将第4代兔骨髓间充质干细胞分别在α-MEM,DMEM-HG,DMEM-LG三种培养基中以1×107 L-1的密度培养于24孔板中,观察细胞形态,测生长曲线和贴壁率.②为消除贴壁差异,在α-MEM培养基中待接种的细胞贴附后,分别更换DMEM-HG或α-MEM培养基进行培养;在DMEM-HG培养基中贴附的细胞以同样方法处理,比较其生长速率和细胞密度.③以100个细胞/孔的密度将细胞接种于3种培养基的6孔板中,测克隆形成率.④细胞以0.5×107 L-1的密度接种于24孔板,分别在3种培养基中扩增至50%汇合后,改用成骨诱导培养液进行诱导培养,茜素红染色测其矿化能力.结果:①3种培养基中细胞在α-MEM中贴壁率高,达(41.7±1.4)%,第1天即进入对数生长期,平均比生长速率大,为0 57 d-1,平均倍增时间短,为2 d,培养期大扩增倍数为27.9倍,克隆形成率多,达(30.9±2.6)%.②消除贴壁差异后,细胞在不同培养基中生长无明显差别,两条生长曲线基本重合.③3种培养基中扩增的细胞经成骨诱导后,茜素红染色皆为阳性,其中DMEM-HG培养基中阳性明显.结论:α-MEM培养基适合于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增,引起细胞在不同培养基中生长差异的主要原因在于贴壁率的不同.
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兔骨髓间充质干细胞表面抗原检测及其变化特点
目的:应用流式细胞仪对兔骨髓间充质干细胞的表面抗原进行检测,观察骨髓间充质干细胞传代次数、克隆纯化与骨髓间充质干细胞表面抗原表达之间的关系.方法:实验于2004-01/2006-08在浙江省医学科学院生物工程所完成.取3月龄新西兰大白兔用于骨髓间充质干细胞的分离培养.兔骨髓间充质干细胞的克隆化:将铺满培养瓶底的原代骨髓间充质干细胞,用D-Hanks液小心的洗1次,加入0.25%胰蛋白酶消化约4 min,弃消化液,加LG-DMEM培养液收集细胞,1 000 r/min,离心10 min,然后用LG-DMEM培养液充分混匀沉淀细胞.细胞计数后以10倍递减稀释至细胞密度为103个/mL.取0.1 mL稀释后的细胞悬液加入10 mL培养液,使终细胞密度为10个/mL.将细胞悬液加入96孔培养板,每孔100 μL.置37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度条件下培养,每天观察克隆细胞的增殖生长状况.待克隆细胞生长至60%～80%融合时,逐步扩大培养,在液氮冻存保种的同时进行细胞连续传代.将体外普通法分离的骨髓间充质干细胞第5代、第7代、第13代、第16代、第21代、第22代及克隆纯化的骨髓间充质干细胞第3代、第5代、第15代、第26代均标记上CD14-FITC及CD44-PE,通过流式细胞仪检测其阴性率及阳性率.结果:①普通法分离的骨髓间充质干细胞各代的CD44表达呈阳性,且随着培养代次的增加,其表达的阳性率逐渐增强,到P16代以后又呈下降趋势;各代骨髓间充质干细胞表面抗原CD14出现了微弱阳性,但随着培养代次增加,其阳性率呈下降趋势.②克隆纯化的骨髓间充质干细胞其CD44呈现阳性,表达在80%以上,至P26代时CD44表达下降到70.49%;其CD14基本呈阴性.结论:兔骨髓间充质干细胞其CD44呈阳性表达,CD14呈阴性表达.随着传代代数增加CD14阴性符合率逐渐提高,CD44阳性表达率也提高.普通法分离的骨髓间充质干细胞较克隆纯化的骨髓间充质干细胞CD14阴性符合率差,前者的CD44阳性表达率也较后者低.
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β-巯基乙醇和神经生长因子定向诱导鼠骨髓基质细胞分化为神经细胞的验证
目的:验证β-巯基乙醇、神经生长因子对大鼠骨髓基质细胞体外定向诱导分化为神经细胞的可行性.方法:实验于2005-05/2006-02在锦州医学院外科实验室完成.①选取清洁级1月龄SD大鼠30只,全骨髓培养法从大鼠骨髓中分离培养骨髓基质细胞.②取第3代骨髓基质细胞,以含胎牛血清的DMEM培养液培养消化后,计数细胞量,描绘细胞增殖曲线.③取第3～5代骨髓基质细胞,接近70%～80%融合后,分为3组:β-巯基乙醇诱导组:加入含1 mmol/L β-巯基乙醇的无血清培养基预诱导24 h后,去除预诱导液,再加入含5 mmol/L β-巯基乙醇的无血清培养基诱导5 h;神经生长因子诱导组:加入碱性成纤维细胞生长因子20 μg/L进行预诱导24 h后,去除预诱导剂,磷酸盐缓冲液洗涤3次,再加入含神经生长因子50 μg/L无血清培养基诱导24 h;阴性对照组:仅加等量无血清培养基.观察各组诱导后细胞的形态学改变.④免疫组化法检测诱导后各组细胞的神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白和胶质纤维酸性蛋白的表达和分化率.结果:①骨髓基质细胞的生长曲线:培养第1～4天为潜伏期,此后细胞增殖加速并进入对数生长期,第9天达到高峰,以后细胞增值速度减慢,进人平台期.骨髓基质细胞倍增时间约为32 h.②骨髓基质细胞诱导分化后的形态学观察结果:β-巯基乙醇诱导组经β-巯基乙醇诱导1 h,细胞形态即发生改变,胞体收缩成球形或锥形,折光性增强,部分细胞周围有光晕,有较多长突起.5 h后,神经元样细胞明显增多,可形成神经网络状结构,但是死亡细胞逐渐增多;神经生长因子诱导组形态学变化出现较迟,在12 h才有明显的形态学改变,表现为胞体变大,有类似轴突和树突的细长突起.24 h表现更为明显,部分细胞间也可见网络状排列,细胞死亡现象不明显;阴性对照组无明显的形态学改变,仍为长梭形细胞.③神经元样细胞免疫组化测定结果:β-巯基乙醇诱导组、神经生长因子诱导组神经细胞特异性烯醇化酶、微管相关蛋白表达均为阳性,表现为胞体和突起被染成棕黄色,而胶质纤维酸性蛋白呈阴性;阴性对照组无阳性结果出现.β-巯基乙醇诱导组神经细胞特异性烯醇化酶、微管相关蛋白分化率分别为(71.2±3.8)%和(64.1±2.7)%,神经生长因子诱导组分别为(46.2±2.5)%和(42.9±1.9)%,两组间差异有显著性意义(P＜0.05,t=-5.205).结论:β-巯基乙醇、神经生长因子均可成功诱导大鼠骨髓基质细胞分化为神经元样细胞.
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不同分离方法与培养条件下大鼠骨髓间充质干细胞生长增殖情况比较
目的:应用贴壁分离法和密度梯度离心法以不同培养条件观察纯化过程中对获得的骨髓间充质干细胞的影响,试图寻找获得高质量、高活性的骨髓间充质干细胞的培养条件.方法:实验于2005-09/2006-01在解放军第四军医大学实验动物中心实验部进行.①SPF级雄性Wistar大鼠18只,贴壁分离培养取12只,根据血清和培养基的不同分为4组:进口血清+DMEM组、进口血清+F12-DMEM组、国产血清+DMEM组、国产血清+F12-DMEM组,3只/组.密度梯度离心培养实验取剩余6只,以分离液的不同分为Ficoll分离液组、Percoll分离液组,3只/组.②骨髓取材:各组大鼠断颈处死后,无菌取双下肢,剔除股骨、胫骨周围肌肉组织,剪去骨干的两端,暴露骨髓腔,穿刺两侧骨端取出骨髓.③贴壁分离法:进口血清+DMEM组、进口血清+F12-DMEM组、国产血清+DMEM组、国产血清+F12-DMEM组大鼠分别采用相应的血清和培养基冲洗骨髓,制备单细胞悬液,接种于培养瓶中,5 d后首次更换培养液,弃去未贴壁细胞,此后每3～4 d换液1次.④密度梯度离心法:Ficoll分离液组选用的Ficoll分离液密度为1.077;Percoll分离液组将Percoll分离液与0.1 mol/L磷酸盐缓冲液按9∶1比例混匀,密度为1.073.将两组大鼠骨髓置入离心管,离心弃上清,轻轻叠加到相同体积的各自对应分离液上,再次离心收集界面层白色混浊液,采用F12-DMEM培养液重悬细胞,按1×109 L-1的密度接种于培养瓶中,培养条件与贴壁分离法相同.⑤指标检测:倒置显微镜下,每天观察贴壁分离、密度梯度离心不同培养条件下细胞的生长情况和活体形态特征.进行锥虫蓝排斥试验,蓝染细胞为死亡细胞,在3 min内用计数板分别计数活细胞和死细胞,未被蓝染细胞所占细胞总数的百分比即为初步得到细胞活性的数据.两种分离方法均取生长良好的第3代细胞,以时间为横坐标,细胞数为纵坐标,绘制生长曲线.结果:18只大鼠均进入结果分析.①细胞形态观察结果:贴壁分离法:采用进口血清培养的两组细胞形态学上都表现为长梭形,细胞活性较高,且给予F12-DMEM培养基的细胞增殖较快,集落融合较早,传代所需时间短;采用国产血清培养的两组细胞中,给予F12-DMEM培养基可以获得梭形细胞,而给予DMEM培养基后则多为类圆形骨髓样细胞,仅见极少梭形细胞.密度梯度离心法:Ficoll分离液组和Percoll分离液组均可培养出梭形骨髓间充质干细胞,细胞活性均高,但集落融合、传代所需的时间均较贴壁分离法长.②细胞活性检测结果:贴壁分离法:进口血清+DMEM组、进口血清+F12-DMEM组、国产血清+DMEM组、国产血清+F12-DMEM组的活细胞率分别为98.3%,98.7%,97.1%,97.7%,组间比较差异无显著性意义(χ2=0.054～0.620,P均＞0.05).密度梯度离心法:Ficoll分离液组活细胞率与Percoll分离液组相似(96.9%,97.1%,t=1.066,P＞0.05).③第3代细胞生长曲线测定结果:不同培养条件下各组第3代细胞生长曲线基本相似,在培养1 d时,细胞量稍有减少;4 d后细胞数均迅速增长;8 d进入平台期,细胞增殖减慢.结论:采用全骨髓贴壁分离法和密度梯度离心法,只要选择合适的培养条件均可获得骨髓间充质干细胞,但选用进口胎牛血清、F12-DMEM培养基效果较好.
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大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及其生物学特性观察
目的:分离和培养大鼠骨髓间充质干细胞并观察其生物学特性.方法:实验于2004-05/2006-04在武装警察部队医学院细胞生物学实验室进行.在无菌条件下分离大鼠胫骨、股骨,用预冷磷酸盐缓冲液冲出骨髓,经Percoll梯度分离方法获得骨髓单个核细胞,接种含体积分数为0.10胎牛血清的IMDM培养基中.对单个核细胞行贴壁培养后,通过倒置光显微镜和透射电子显微镜进行细胞形态学观察,流式细胞术进行细胞周期分析,细胞计数法测定细胞生长曲线,免疫细胞化学染色显示c-kit表达.结果:①倒置光显微镜下观察采用Percoll(1.073 g/mL)分离的骨髓间充质干细胞大小较为均匀,基本上呈梭形或星形的上皮样细胞,传代培养后的细胞体积增大,成纤维样细胞逐渐增多.②透射电子显微镜下观察骨髓间充质干细胞的核质比例较大,核仁大而明显,细胞表面有微绒毛,胞浆内可见核糖体和线粒体,其他细胞器较少,表现出未分化细胞的特征.③细胞生长曲线测定表明接种后第4天细胞进入指数增生期,至第7天进入平台期.④流式细胞术证明G2+S期细胞为11.8%.⑤体积较大的多角形细胞为c-kit阳性,体积较小的成纤维样细胞为阴性细胞,阳性颗粒主要分布在细胞膜和细胞质,细胞核未见表达,阳性细胞比率为55.3%.结论:成功地建立了一种分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的方法,获得的细胞生长稳定,增殖活跃,可作为组织工程的种子细胞.
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成体毛囊中干细胞与其他皮肤干细胞不一样
威斯康星州医学院的科学家Maya Sieber-Blum与Yao Fei Hu和Zhi-Jian Zhang博士近发现,真皮神经嵴细胞和其他的皮肤干细胞并不一样.位于毛囊凸起部位的真皮神经嵴细胞同时具有胚胎干细胞和成体干细胞的特性.与胚胎干细胞一样,它们具有高度的可塑性,可被高纯度分离,经过培养得到增生;同时这些细胞又具有成体干细胞非侵入性特点.
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重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子乳酸链球菌表达载体的构建
目的:构建重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子乳酸链球菌表达载体,为进一步研究人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子在乳链菌的表达及其治疗价值奠定基础.方法:实验于2005-04/2006-03在南方医科大学南方医院消化病研究所完成.①载体pNCSF的构建:将质粒集落刺激因子及含有P59启动子、USP45蛋白信号肽的pNBC1000质粒分别加入BamH Ⅰ和Pst Ⅰ进行双酶切,并用Apa Ⅰ、Sac Ⅰ进行双酶切鉴定,重组质粒命名为pNCSF.②SDGFP的TA克隆及载体pNCSFGFP的构建:将经过优化适合在乳链菌表达的人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因克隆于含有P59启动子、USP45蛋白信号肽的pNBC1000载体,得到重组质粒pNCSF;同时设计上下游引物经PCR扩增增强荧光表达蛋白(EGFP),TA克隆后经测序验证,再连接于p NCSF获得重组质粒pNCSFGFP.③载体pTRCSF、pTRCSFGFP的建立:将获得的pNCSF和pNCSFGFP进一步克隆于穿梭载体pTR1001c,以获得人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子乳链菌表达载体pTRCSF及pTRCSFGFP.结果:①载体pNCSF构建结果:酶切鉴定产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳后,发现有(含启动子P59、信号肽USP45、人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)720 bp的目的片段.②SDGFP的TA克隆及载体pNCSFEGFP的构建结果:SDGFP阳性克隆产物经EcoR Ⅰ酶切鉴定得到775 bp目的片段.pNCSFEGFP酶切鉴定产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳后,发现有(含启动子P59、信号肽USP45、人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、SDGFP)1 495 bp的目的片段.③穿梭质粒pTRCSF、pTRCSFGFP酶切鉴定结果:经Xba Ⅰ、SacⅠ进行双酶切鉴定,分别得到约717 bp、1 492 bp大小目的片段.结论:获得了人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子乳链菌表达载体pTRCSF及pTRCSFGFP,并经酶切鉴定和测序证实.
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FLT3基因突变与骨髓增生异常综合征的预后
目的:FLT3跨膜区内部串联重复突变是与白血病发生相关的FLT3基因中常见的突变类型.本实验旨在探讨FLT3跨膜区内部串联重复突变与骨髓增生异常综合征预后的关系及其临床意义.方法:实验于中国刑警学院法医教研室、沈阳医学院生物化学及分子生物学教研室完成.选择1998-03/2005-10于中国医科大学及沈阳医学院附属医院血液科门诊或住院治疗的患者58例作为实验组,经免疫学、细胞遗传学和分子生物学检查确诊均为骨髓增生异常综合征患者.男37例,女21例,平均年龄19岁,均自愿参加.形态学分型中58例骨髓增生异常综合征患者中难治性贫血13例、难治性贫血伴环状铁粒幼细胞增多4例、难治性贫血伴原始细胞增多20例、转变中的难治性贫血伴原始细胞增多12例、慢性粒-单核细胞性白血病9例.对照组为同期就诊非白血病患者及健康供者10例.①DNA提取:患者骨髓或健康志愿者外周血标本采用淋巴细胞分离液分离单核细胞,传统酚/氯仿/异丙醇法提取DNA.②PCR引物设计:针对FLT3基因内部重复串联结构主要发生在11号外显子,在11号外显子近端和远端分别设计引物11F和11R,扩增产物为133 bp.同时设计对照组β-actin引物actin F和actin R,扩增产物为305 bp.③PCR扩增及电泳PCR:反应体系包括上、下游引物各0.2 μmol/L,dNTPs 0.25 mmol/L,Taq DNA聚合酶2.5 U,模板DNA 200 ng.反应条件为94℃变性3 min后进行35个循环,后72℃延伸10 min.取扩增产物,经2%琼脂糖凝胶电泳观察结果.④测序及Blast分析.结果:骨髓增生异常综合征患者58例和对照组10例全部进入结果分析.①58例骨髓增生异常综合征患者中19例FLT3表达阳性,阳性率为32.78%.19例FLT3基因检测阳性患者,有5例出现FLT3跨膜区内部串联重复突变,阳性率为2.74%,其中慢性粒-单核细胞性白血病2例、难治性贫血伴原始细胞过多过度型3例.②测序及Blast比对分析显示,外显子11区均有跨膜区内部串联重复突变,各例的复制区域不同,长短不等(19～39 bp).③临床资料显示,5例伴有FLT3跨膜区内部串联重复突变的髓增生异常综合征患者中有4例在短时期内(1～5个月)转化为急性髓系白血病. 结论:髓增生异常综合征患者存在有跨膜区内部串联重复突变.该突变可以作为骨髓增生异常综合征白血病化的重要标志.
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创伤失血后微循环多形核白细胞在毛细血管内皮附壁状态的性别差异
目的:在体实时观察创伤失血性休克复苏后微循环多形核白细胞在毛细血管后微静脉内皮的附壁是否存在性别差异,并测定多形核白细胞黏附因子CD11b的表达.方法:实验于2005-08/2006-03在解放军总医院基础所微循环室完成.①实验动物为发情前期的雌性和成年雄性SD大鼠30只,分为雄性,雌性和假手术3组,每组10只,其中假手术组雌雄各5只.②麻醉后通过放血的方法将平均动脉压降至(35±5)mm Hg,并维持60 min,然后在60 min内用4倍于大失血量的乳酸林格氏液进行复苏.假手术组不进行休克及液体复苏.③复苏后2 h和6 h在腹部正中作4 cm切口,取出回盲部附近的肠系膜,显微镜下观察多形核白细胞在肠系膜毛细血管后小静脉内的附壁情况并录像.通过股动脉抽取外周血分离多形核自细胞,用流式细胞仪测定黏附分子CD11b的表达.复苏后6 h将动物处死,测定肺组织髓过氧化物酶活性.结果:30只大鼠均进入结果分析.①活体微循环观测:复苏后2 h,雄性组大鼠毛细血管后小静脉内多形核白细胞数量明显增多,形成附壁.复苏后6 h,雄性组毛细血管后小静脉内血流出现时快时慢甚至逆流的现象,说明雄性大鼠创伤失血性休克后微循环出现紊乱.②多形核白细胞附壁的分析:复苏后2 h,雌性组和假手术组的多形核白细胞附壁数低于雄性组[(1.8±0.3),(0.4±0.2),(4.2±0.9)个,P＜0.05].但6 h后各组之间差异不明显.③多形核白细胞黏附分子CD11b表达的测定:复苏后2 h和6 h,多形核白细胞黏附分子CD11b的表达雄性组明显高于雌性组和假手术组(P＜0.01),雌性组和假手术组间差异不明显.④肺组织髓过氧化物酶活性测定:休克复苏后6 h,雄性及雌性肺组织髓过氧化物酶活性都与各自的假手术组相比有显著的升高(P＜0.05),但雌性组升高低于雄性组(P＜0.05).结论:创伤失血性休克后雌性大鼠多形核白细胞黏附分子CD11b的表达和多形核白细胞在毛细血管后微静脉内皮的附壁数量与雄性相比明显降低,多形核白细胞在肺组织中的浸润明显减少.
