DAPI标记骨髓间充质干细胞在胶质瘤模型大鼠脑内的迁徙和定位

背景:骨髓间充质干细胞作为载体细胞行脑内移植治疗胶质瘤,如何证实其为好的药物载体?目的:将DAPI标记的大鼠骨髓间充质干细胞移植入模型鼠脑内,观察骨髓间充质干细胞在肿瘤内的迁徙与定位.方法: 体外培养骨髓间充质干细胞.利用立体定向仪将培养好的C6细胞注入大鼠脑内,建立大鼠脑内胶质瘤模型.将DAPI标记于培养好的骨髓间充质干细胞上,利用微量注射器注入模型鼠脑内;移植后第3,7天处死大鼠,利用共聚焦显微镜观察骨髓间充质干细胞在肿瘤内的分布及与肿瘤细胞的关系.结果与结论:实验成功建立了大鼠脑内胶质瘤模型.以DAPI标记的骨髓间充质干细胞.在模型鼠脑内主动聚集于肿瘤血管周围,并能与肿瘤细胞发生融合.结果证实骨髓间充质干细胞可以作为肿瘤基因治疗的良好载体.

稳定表达绿色荧光的大鼠胚胎来源肝干细胞

背景:胎肝来源肝干细胞作为细胞移植的供体来源具有优势,但有鉴于干细胞特质,其培养困难,传代后易分化生长;且现有干细胞示踪定位技术欠成熟,这些均是制约肝干细胞移植的重要因素.目的:观察原代肝干细胞电转pEGFP-Cl质粒是否能获得稳定表达绿色荧光的肝干细胞.方法:联合机械分离和胶原酶消化法体外分离孕13.5 d SD大鼠胚胎来源肝细胞,应用特异培养基培养分离细胞,随后通过半量换液法纯化出肝干细胞,采用细胞免疫荧光法对贴壁细胞进行鉴定,并用pEGFP-Cl质粒电转染原代肝干细胞后持续表达绿色荧光作示踪定位标志.结果与结论:原代培养的胎肝干细胞24 h后可见细胞半贴壁,形态基本相同, 呈圆形或卵圆形;第2天观察细胞为大小几乎一致的圆形;培养第3天出现一些由3,5 个形态一致的细胞集落, 细胞直径6～10 μm;细胞集落不断增大,至第5天集落中细胞数量增至10个左右,集落由大小不等的致密圆形细胞组成,界限清楚;第8天后细胞呈上皮样铺展;第12天时,细胞变大呈煎蛋样摊开,形态不规则,细胞浆内可见颗粒,生长变得缓慢;传代后细胞扩增速度无明显变化,至第3代仍保持较均一的上皮细胞状;通过细胞免疫荧光法检测出培养第5天的贴壁细胞表达干细胞标志物CD34和胆管细胞标志物CK19;经筛选pEGFP-Cl质粒电转染后的原代肝干细胞能稳定表达绿色荧光.实验成功构建转染了绿色荧光蛋白的肝干细胞.

经5-氮胞苷诱导骨髓间充质干细胞心肌移植对心功能的影响

背景:骨髓间充质干细胞具有多分化潜能,但其在体外经5-氮胞苷诱导后移植于急性心肌梗死大鼠中,能否改善近期及远期的心功能,目前尚不明确.目的:观察兔骨髓间充质干细胞移植入急性心肌梗死组织后对心功能的影响.方法:分离培养兔骨髓间充质干细胞,5-氮胞苷诱导4周后,体外DAPI标记.新西兰兔随机均分3组,假手术组:打开胸腔1 h后缝合胸腔;骨髓间充质干细胞组:于冠状动脉结扎建立急性心肌梗死模型后1 h在梗死周边区用微量注射器分4点注射诱导后的自体骨髓间充质干细胞;急性心肌梗死组:造模后于相同部位注射等量生理盐水.移植后3 d,4周超声心动图检测各组大鼠左室舒张末期容积,左室收缩末期容积及射血分数变化.结果与结论:荧光显微镜观察发现,骨髓间充质干细胞组移植后3 d,4周心脏标本中均发现有DAPI标记的阳性细胞,呈散在分布于瘢痕周边区并沿心肌纤维排列方向走行.移植后3 d,骨髓间充质干细胞组与急性心肌梗死组相比,左室舒张末期容积、左室收缩末期容积及射血分数无明显差异,心功能没有明显的改善;移植4周后,骨髓间充质干细胞组与急性心肌梗死组相比,射血分数明显提高,左室舒张末期容积、左室收缩末期容积明显降低.

不同方法移植骨髓间充质干细胞在体内重要器官的分布及分化

背景:大量实验显示心肌损伤后,趋化或直接心肌内注射的骨髓干细胞可以在体内分化为心肌细胞、血管内皮细胞或血管平滑肌细胞.目的:观察不同方法移植的骨髓间充质干细胞体内重要器官的分布、生长和分化情况.方法:选用3月龄日本大耳白兔39只,均制作急性心肌梗死动物模型并随机分为4组,3个组为实验组分别以心肌内直接注射、经冠脉注射、经静脉注射3种不同移植经BrdU标记的自体骨髓间充质干细胞.对照组分为3个亚组,分别经冠脉、静脉和心肌内直接注射等量的生理盐水.4周后处死动物,取心、肺、肝、肾制作组织切片并观察BrdU阳性细胞和BrdU及α-横文肌肌动蛋白双阳性细胞.结果与结论:①骨髓间充质干细胞移植各实验组在梗死区及其周边均可见到BrdU阳性细胞和BrdU及α-横文肌肌动蛋白双阳性细胞.BrdU阳性细胞间及与宿主心肌细胞间有细胞突起相连,并可见明显的横纹和肌小节.②各实验组新生毛细血管密度较对照组都有增加(P < 0.05),其效果顺序由好到差依次为冠脉注射组、心肌注射组和静脉注射组.③经冠脉和静脉移植组非目的器官肺、肝、肾的标本切片内均发现BrdU阳性细胞表达,且静脉移植组肺内BrdU阳性细胞数多于肝、肾,但均未见有分化趋势和恶性细胞表达.结果提示骨髓间充质干细胞经3种方法移植均能使心肌梗死区及其周边区心肌细胞和毛细血管再生,除心肌注射组外非目的器官都有BrdU阳性细胞表达,但仍以目的器官表达为主.

养心通脉有效部位方与急性心肌梗死大鼠骨髓间充质干细胞的动员及定向归巢

背景:急性梗死心肌修复过程中,寻找可有效提高外周血骨髓间充质干细胞的数量、并动员其定向归巢于损伤心肌的骨髓间充质干细胞动员剂尤为关键.目的:探讨养心通脉有效部位方对急性心肌梗死大鼠骨髓间充质干细胞动员入血及定向归巢于梗死心肌的影响.方法:养心通脉有效部位方主要成分包括人参皂苷、丹参酮ⅡA、总生物碱、人参多糖等,由中南大学药学院依课题组稳定的制作工艺制作提供.SD大鼠70只,取8只大鼠作为正常对照组,剩余62只大鼠建立急性心肌梗死模型.取造模成功的32只大鼠,随机分为养心通脉有效部位方组、复方丹参注射液组、重组人粒细胞集落刺激因子组、模型对照组,各组均于造模3 h后给与对应药物,连续5 d.流式细胞仪检测外周血CD34+细胞数,免疫组化染色检测梗死心肌边缘区CD34+细胞数.结果与结论:与模型对照组比较,重组人粒细胞集落刺激因子组、养心通脉有效部位方组外周血CD34+细胞数均明显增加(P < 0.01);心肌梗死边缘区胞浆CD34+细胞数均显著增加(P < 0.01).与重组人粒细胞集落刺激因子组比较,养心通脉有效部位方组心肌梗死边缘区胞浆CD34+细胞数显著增加(P < 0.01).养心通脉有效部位方能促进骨髓干细胞动员入血,并定向归巢于梗死心肌,其作用与重组人粒细胞集落刺激因子大体相当,在归巢CD34+细胞方面甚至强于重组人粒细胞集落刺激因子,是一种良好的骨髓间充质干细胞动员剂.

骨髓间充质干细胞移植修复大鼠慢性胰腺损伤

背景:慢性胰腺炎是以胰腺慢性炎症损伤及纤维化为主要病理特征的慢性进展性疾病,骨髓间充质干细胞可能在其治疗中具有潜在价值,但目前这一领域的研究尚不多见.目的:观察骨髓间充质干细胞对慢性胰腺炎大鼠胰腺损伤的修复作用并探讨其治疗机制.方法:体外培养、扩增大鼠骨髓间充质干细胞并对其进行鉴定;采用胆胰管逆行注射油酸法制备Wistar大鼠慢性胰腺炎模型,随机数字表法分为假手术组、模型组、间充质干细胞治疗组.间充质干细胞治疗组造模后20 d经尾静脉注射间充质干细胞生理盐水细胞悬液1 mL(含细胞3×106),第40天和第60天各重复1次;模型组经尾静脉注射等体积生理盐水;假手术组不进行十二指肠穿刺及胆胰管逆行注射,其余操作同模型组.3组动物均于治疗结束后取胰腺组织行病理组织学检查;并检测胰腺组织内结缔组织生长因子、转化生长因子β、Ⅰ、Ⅲ型胶原水平及髓过氧化物酶活性.结果与结论:经间充质干细胞治疗的慢性胰腺炎大鼠胰腺病变程度及纤维化程度显著减轻;胰腺组织内结缔组织生长因子、转化生长因子β、Ⅰ、Ⅲ型胶原水平及髓过氧化物酶活性显著降低(P < 0.01).提示骨髓间充质干细胞对慢性胰腺炎大鼠胰腺损伤有显著的修复作用,其机制可能和抑制结缔组织生长因子、转化生长因子β产生、抑制炎症反应、减少胶原增生有关.

经静脉途径移植骨髓间充质干细胞在慢性心肌梗死大鼠体内的分布

背景:目前的研究中,大多针对急性心肌梗死进行细胞移植研究,而对于慢性心肌梗死后经静脉移植干细胞的研究尚少见,尤其是在移植后多个时间点动态监测移植的干细胞在体内分布及存活情况尚无报道.目的:观察经静脉途径移植骨髓间充质干细胞后在慢性心肌梗死模型大鼠体内的分布情况.方法:从雄性SD大鼠获取培养骨髓间充质干细胞,将18只雌性SD大鼠制备成心肌梗死3周后随机均分为2组,实验组:用胰岛素针抽取加入PBS的含有5×106骨髓间充质干细胞的混悬液300 μL,并将其缓慢注入股静脉;对照组:注入同等体积的PBS.另选9只雌性SD大鼠仅开胸,不结扎冠状动脉,作为假手术组,并将含有5×106骨髓间充质干细胞的混悬液300 μL通过股静脉注入体内.骨髓间充质干细胞移植24 h,2周及1个月后,各组大鼠体内的细胞分布情况应用实时荧光定量PCR技术进行检测.结果与结论:实验组与假手术组大鼠在细胞移植后1 d,肺组织、肝脏、脾脏中细胞分布差异无显著性意义(P > 0.05),而实验组心脏中细胞分布明显多于假手术组(P < 0.01);移植后2周,两组肺组织中细胞数目均急剧减少(P < 0.05),肝脏、脾脏、心脏中细胞分布差异无显著性意义(P > 0.05);移植4周后两组相比,肺组织、肝脏、脾脏中细胞分布差异亦无显著性意义(P > 0.05),而假手术组心脏中未检测到细胞.移植4周后,各组织中细胞分布均明显减少.在对照组中,各时间点均未检测到SRY基因.提示慢性心肌梗死经静脉移植骨髓间充质干细胞后,早期大量细胞滞留于肺组织,且细胞数目随时间延长锐减.此外,心脏,脾脏,肝脏中仍可有少量细胞分布.

三种方法原代培养人牙周膜细胞

背景:牙周膜细胞培养是牙周细胞生物学研究的基础.牙周膜细胞原代培养因其成功率较低,一直是制约牙周细胞生物学研究的瓶颈之一.如何寻找一种简单有效的培养方法,提高原代培养成功率一直是近年来牙周细胞生物学的研究热点之一.目的:比较组织块法、酶消化法、酶消化结合组织块法对人牙周膜细胞的培养效果,探索一种更有效的人牙周膜细胞的体外培养方法.方法:取58例正常恒牙牙周膜组织,随机分为3组,分别采用组织块法、酶消化法、酶消化结合组织块法进行原代培养,再进行传代培养、倒置显微镜下观察细胞生长情况以及细胞形态;免疫组织化学鉴定波形蛋白与角蛋白;取第4代细胞,绘制生长曲线.结果与结论:酶消化结合组织块法培养成功率(35%)明显高于其他两种方法(11%和21%).3种方法获得的细胞均符合正常人牙周膜细胞形态学特征和生物学特征,生长良好.第4代细胞生长曲线均为近似的"S"形,有明显的滞留期、对数生长期和平台期.提示实验建立的酶消化结合组织块法较为简单并具有较高的成功率,是一种培养牙周膜细胞的可行办法.

人脐血单个核细胞移植前后患者脑脊液中细胞生长因子的变化

背景:移植的神经干细胞可以通过分泌或调节某种或几种神经营养因子来促进损伤后神经功能的修复.目的:检测人脐血单个核细胞治疗患者脑脊液中神经生长因子、血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子的水平.方法:选择山东省交通医院行人脐血单个核细胞治疗的神经系统疾病患者28例,于腰穿蛛网膜下腔途径行脐血单个核细胞治疗1次/周,共治疗3次,每次治疗前留取脑脊液2 mL.采用酶联免疫吸附法(ELlSA)检测人脐血单个核细胞治疗患者脑脊液中神经生长因子、血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子水平的变化,并观察移植后不良反应.结果与结论:经单因素方差分析及组间q检验,第2次治疗1周后,神经生长因子水平明显高于治疗前及第1次治疗后1周(P < 0.05);第2次治疗1周后,血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子水平均高于治疗前及第1次治疗后1周,但差异无显著性意义(P > 0.05).脐血单个核细胞移植后出现低热12例,头痛4例,腰痛3例,乏力4例,恶心、呕吐2例,均为一过性症状,数日内自行缓解.结果显示,人脐血单个核细胞治疗患者脑脊液中神经生长因子水平有明显增高,血管内皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子的含量变化不明显.

同种异体大鼠骨髓间充质干细胞移植在肠缺血-再灌注损伤肠道中的定植及其分化效应

背景:小肠对缺血缺氧极为敏感,其发生缺血-再灌注时可出现严重的组织损伤,骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能,可通过多种途径参与受损组织的修复.目的:观察同种异体大鼠骨髓间充质干细胞移植后在肠缺血-再灌注损伤中肠道的定植情况和治疗效果.方法:Wistar雌性大鼠分为3组,假手术组剖开腹腔后即予以缝合;其余大鼠建立肠缺血-再灌注模型,对照组肠道缺血-再灌注后仅输入生理盐水;治疗组鼠尾静脉注射Wistar雄性大鼠骨髓间充质干细胞.治疗后分别于12,24 h,3,7,14,28 d分批取空肠组织,制作冰冻切片在荧光显微镜观察供体细胞在受体肠道的分布,空肠组织匀浆后行RT-PCR检测雄性大鼠的性别决定基因,并检测肠组中丙二醛和超氧化物歧化酶含量.结果与结论:冰冻切片在荧光显微镜下观察,未见供体细胞在受体肠绒毛表面定植.雌性大鼠肠组织中性别决定基因的RT-PCR检测结果为:3 d阳性率为50%,7 d阳性率66.6%,14 d阳性率33.3%,28 d阳性率为16.6%.骨髓间充质干细胞治疗组第12,24小时,3,7天的空肠组织中的丙二醛水平低于对照组、超氧化物歧化酶含量高于对照组.结果提示,同种异体大鼠骨髓间充质干细胞可在受体肠缺血-再灌注损伤的肠道内定植,并可加速肠道损伤的恢复,其发挥疗效并非直接分化,而是主要是通旁分泌的形式促进机体内源性修复.

慢肌卫星细胞移植修复骨骼肌的钝挫损伤

背景:肌卫星细胞在骨骼肌的损伤、修复和维持中起着重要作用,骨骼肌的肌湿质量、肌横切面积及肌动蛋白的含量可为损伤肌肉的恢复提供指标.目的:观察骨骼肌慢肌卫星细胞移植对肌肉损伤的修复作用.方法:体外培养分离Sprague-Dawley大鼠慢肌卫星细胞,分别取慢肌卫星细胞悬液和生理盐水(对照组)注入钝挫伤动物模型的损伤部位,观察骨骼肌损伤的修复情况.结果与结论:移植后实验组比对照组恢复效果好.①卫星细胞移植后5,10,15 d,实验组肌肉组织内荧光标记的肌卫星细胞逐渐减少,形成肌管并终融合成肌纤维参与损伤修复.②移植后5,10,15 d大鼠肌电图的纤颤电位和正尖波均逐渐减少,且损伤侧的肌电强度和波宽依次增大,逐渐接近正常侧,而对照组肌电强度与波宽则增加缓慢.③随着损伤修复的进程,肌湿质量恢复率均逐渐降低.④随着恢复的进程,实验组灰度值大于对照组数值.提示骨骼肌慢肌卫星细胞移植到钝挫损伤的肌肉内可明显加快损伤肌肉的恢复.

脐血间充质干细胞移植后帕金森病大鼠纹状体内多巴胺含量的变化

背景:目前干细胞移植对帕金森病动物模型的研究多集中在骨髓间充质干细胞和胚胎干细胞方面,关于脐血间充质干细胞移植对帕金森病动物模型的研究相对较少,且未见测量脐血间充质干细胞移植前后多巴胺含量变化的报道.目的:观察脐血干细胞移植对帕金森病大鼠纹状体内多巴胺含量的影响.方法:帕金森病模型大鼠随机分成实验组和对照组.将第3代脐血间充质干细胞用Hoechst33258标记后植入实验组大鼠纹状体内,对照组注射磷酸盐缓冲溶液.移植后2,4,8周用免疫荧光双标法检测间充质干细胞的存活、迁移以及胶质纤维酸性蛋白、神经元特异性烯醇化酶、酪氨酸羟化酶和突触素的表达.移植后8周利用高效液相色谱-电化学检测仪检测纹状体多巴胺含量.结果与结论:脐血间充质干细胞移植后可在大鼠脑内存活,随时间延长迁移范围扩大,分布于纹状体、胼胝体和皮质;胶质纤维酸性蛋白、神经元特异性烯醇化酶、酪氨酸羟化酶都有表达,突触素无表达.多巴胺水平与对照组相比有明显提高 (P < 0.05).

小鼠饲养层细胞制备与小鼠胚胎干细胞SF1-G的培养

背景:小鼠胚胎干细胞系SF1-G是由雌性C57BL/6 小鼠与雄性M. spretus 小鼠交配后,取桑葚胚期胚胎在STO饲养层细胞上分离培养获得,STO细胞较昂贵,而由小鼠胚胎成纤维细胞制备的饲养层细胞不仅取材容易,而且形成胚胎干胞的克隆率、维持胚胎干细胞正常核型的能力均比STO细胞要好一些,因此,建立一种适宜SF1-G细胞扩增的培养体系,保持其未分化状态生长是充分利用胚胎干细胞资源的前提.目的:建立有效的小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及胚胎干细胞饲养层细胞制备体系;以建立有效的小鼠胚胎干细胞(SF1-G细胞)扩增培养体系.方法:从孕12.5～14.5 d的ICR小鼠分离培养原代小鼠胚胎成纤维细胞;取 3～5 代的小鼠胚胎成纤维细胞,以丝裂霉素C抑制其增殖能力制备饲养层细胞;在饲养层细胞上增殖培养SF1-G细胞;染色体G显带分析法检测SF1-G细胞核型,SF1-G细胞碱性磷酸酶染色和RT-PCR检测Oct4、Nanog基因表达.结果与结论:从孕鼠胚胎有效分离到小鼠胚胎成纤维细胞,以3～5代细胞制备的饲养层细胞能够支持胚胎干细胞SF1-G呈边界清晰的克隆样生长.染色体核型检测 SF1-G保持正常核型,碱性磷酸酶、表面标志物检测均呈阳性.实验建立了有效的小鼠胚胎成纤维细胞分离培养体系,并制备供胚胎干细胞进行增殖培养饲养层细胞体系,能够在实验室对 SF1-G细胞保持正常未分化状态培养.

造血干细胞动员和采集对正常供者的影响

背景:粒细胞集落刺激因子动员是当前健康志愿供者采用的主要方法.据国内外文献报告:在粒细胞集落刺激因子动员中已发生少数严重不良反应,这引起了国人对中国非血缘健康供者安全的忧虑.粒细胞集落刺激因子作为动员剂对健康志愿供者有何影响?是否安全?目的:观察粒细胞集落刺激因子对正常供者的影响.方法:选择2003-01/2008-12在海口市人民医院接受粒细胞集落刺激因子5～10 μg/(kg·d)动员剂进行外周血造血干细胞捐赠者16例,观察动员及采集过程的不良反应,检测动员前后血常规CD3、CD19、CD3+4、CD3+8细胞比值在动员前后变化,并随访所有供者.结果与结论:10例供者在重组人粒细胞集落刺激因子动员过程中无任何不适,有3例出现低热,头痛、肌肉及骨骼疼痛、腰痛等,3例供者出现发热,其严重程度均在Ⅰ级,但无需终止动员.白细胞经重组人粒细胞集落刺激因子动员后数量较动员前升高,停止动员后3 d全部供者的白细胞恢复至动员前水平.血红蛋白、血小板、CD3、CD19、CD3+4、CD3+8细胞比值在动员前、动员后72,96 h无明显变化.提示健康供者可耐受粒细胞集落刺激因子5～10 μg/(kg·d),动员和采集过程;且对T细胞亚群无影响.

ICR小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及饲养层制备

背景:小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层能有效促进胚胎干细胞及诱导多能性干细胞增殖并维持其未分化特性和多潜能性,且效果优于无饲养层单独添加一些细胞因子,而且可以为上述两种细胞提供类似的胚胎发育环境.目的:建立稳定高效的ICR小鼠胚胎成纤维细胞饲养层培养体系,用于培养人胚胎干细胞及诱导多能性干细胞.方法:使用胰蛋白酶消化法分离ICR小鼠胚胎成纤维细胞,观察不同的胰蛋白酶水平及消化时间对获取小鼠胚胎成纤维细胞的量及其增殖活性的影响;利用不同质量浓度丝裂霉素C处理小鼠胚胎成纤维细胞1,1.5,2,2.5,3,3.5 h制备饲养层细胞,MTT法检测其增殖活性,探索其制备饲养层的佳条件.结果与结论:分离ICR小鼠胚胎原代成纤维细胞佳胰蛋白酶浓度为0.05%,消化时间为12～15 min,丝裂酶素佳作用质量浓度和时间为10 mg/L作用2.5 h,成纤维细胞饲养层可以维持8～12 d.0.05%胰蛋白酶消化15～20 min效果优于0.15%,0.25%胰蛋白酶消化;10 mg/L丝裂霉素C处理胚胎成纤维细胞2.5 h能有效抑制其增殖,表明该条件下的饲养层细胞能很好的支持胚胎干细胞及诱导多能性干细胞生长.

他克莫司促进神经干细胞移植大鼠脊髓损伤的再生与修复

背景:研究证实,他克莫司不仅抑制T细胞的增殖、活化,还能抑制小胶质细胞、巨噬细胞等炎症细胞在损伤局部聚集、活化及相关炎症因子的释放,减轻继发性炎症反应对原发损伤周围正常组织的破坏,从而对损伤局部的神经组织起保护作用.目的:观察他克莫司对神经干细胞移植大鼠脊髓损伤后再生修复的影响.方法:分离培养孕13d SD大鼠神经干细胞.显微镜下动脉瘤夹夹闭SD大鼠T8脊髓,建立压迫型脊髓损伤动物模型.损伤后7 d随机数字表分为3组:对照组,于损伤中心定向注射生理盐水;细胞移植组,于损伤中心定向注射神经干细胞;他克莫司组,于损伤中心定向注射神经干细胞同时给予免疫抑制剂他克莫司1 mg/(kg·d)腹腔注射连续7 d.1,2,4,8周后,通过BDA顺行示踪、苏木精-伊红与免疫组化染色及电镜检测,观察移植后脊髓组织再生和神经元的变化.结果与结论:对照组在损伤中心端远侧无神经纤维通过.细胞移植组与他克莫司组在治疗1周后有部分神经纤维通过,8周均有部分BDA阳性标记的皮质脊髓束再生通过脊髓损伤部位,特别是他克莫司组可延续至距损伤中心1.7 cm .苏木精-伊红染色显示,细胞移植组与他克莫司组2周时坏死灶开始缩小,泡沫细胞减少.电镜结果显示,他克莫司组1周时即出现较正常的微丝和微管结构,8周时星形细胞、许旺细胞、髓鞘典型多见,神经轴突的终末有较多的兴奋性递质和不典型的轴树连接,出现较多的结构正常的髓鞘.说明损伤大鼠移植神经干细胞后联合应用他克莫司后可减轻早期的急性炎症反应,保证神经细胞的存活,具有神经保护和神经营养作用,可加快神经功能的恢复.

骨髓间充质干细胞对大鼠胰腺损伤的修复

背景:胰腺缺血性损伤是临床常见但又难以解决的实际问题,常规的预防和治疗方法收效甚微.骨髓间充质干细胞是近年来兴起的治疗损伤公认有效的手段,因此,有必要寻找利用干细胞治疗缺血性胰腺损伤的方法.目的:观察骨髓间充质干细胞对胰腺缺血损伤的修复作用.方法:采用贴壁培养和组织块培养相结合的方法得到高纯度的骨髓间充质干细胞,在含体积分数为20%胎牛血清的L-DMEM培养液中扩增培养,传3代后用增强型绿色荧光蛋白重组腺病毒标记细胞,注入胰腺缺血性损伤动物模型胰腺局部,观察动物存活率,冰冻切片共聚焦显微镜观察标记细胞位置.结果与结论:实验分离获得了高纯度贴壁生长的骨髓间充质干细胞.注入细胞的动物模型存活率明显高于对照组;共聚焦显微镜观察显示,注入细胞24 h后,细胞可到达受损部位,并聚集在微循环系统中,以后逐渐大量进入受损部位,在循环系统及导管系统中有较高表达.提示采用骨髓间充质干细胞局部注入,可明显增加模型动物的存活率,有利于损伤的胰腺修复.

大鼠骨髓间充质干细胞体外增殖与多向分化的能力

背景:生理条件下机体内多数骨髓间充质干细胞增殖并不明显,然而在一定刺激下可表现出旺盛的有丝分裂活动,具有很强的增殖倍增能力,且体外实验表明其具有多向分化潜能.目的:进一步验证体外分离培养的大鼠骨髓间充质干细胞生长增殖与多向分化潜能.方法:全骨髓法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,贴壁筛选法进行纯化,倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长特征,MTT法绘制细胞生长曲线,免疫组化法对细胞表面干细胞标志CD44进行鉴定.取传至第4代细胞,分别用成骨、成软骨、成脂肪和成神经诱导剂予以培养,通过碱性磷酸酶染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色、油红O染色、NeuN抗体免疫组化染色进行分化能力鉴定.结果与结论:分离培养的细胞呈长梭形或多边形,细胞生长曲线呈S形,群体倍增时间约为31 h,免疫细胞化学染色后CD44呈阳性表达,CD34呈阴性.第4代骨髓间充质干细胞成骨诱导2周后出现钙盐沉积,成软骨诱导培养2周后Ⅱ型胶原检测呈阳性,成脂肪诱导培养2周后在细胞的胞浆内充满大量红色脂肪滴,成神经诱导6 h后细胞出现突起,类似神经元的轴突和树突纤维,NeuN免疫组化染色呈阳性.表明体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞生长增殖能力旺盛,可向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经元样细胞方向分化.

人类心肌匀浆上清液对骨髓间充质干细胞诱导分化及相关基因时序表达的影响

背景:大量有关动物的体内外研究表明,骨髓间充质干细胞在心肌微环境或模拟心肌微环境的作用下可分化为心肌细胞.然而,类似的人类研究报道较少,同时相关的分化机制也不甚清楚.目的:探讨人类心肌匀浆上清液对骨髓间充质干细胞诱导分化的影响及相关基因的时序表达.方法:体外分离培养人类骨髓间充质干细胞,传至第4代加入自体心肌匀浆上清液诱导骨髓间充质干细胞,持续作用2周.相差显微镜下观察骨髓间充质干细胞形态变化,免疫荧光方法鉴定心肌特征性肌动蛋白α和肌钙蛋白的表达,应用半定量RT-PCR技术分析Nkx-2.5、GATA-4、MEF-2C、α-MHC、肌钙蛋白等相关基因在分化过程中的动态时序表达.结果与结论:经心肌匀浆上清液诱导后,骨髓间充质干细胞体积变大,立体感增强,形态近似棒状.诱导2周时肌动蛋白α及肌钙蛋白阳性细胞比例分别为25.53%和23.48%.Nkx-2.5、GATA-4、MEF-2C基因在诱导后3 d表达开始增强, 其中GATA-4、MEF-2C诱导后5 d达高峰,以后维持在较高水平,Nkx-2.5则随诱导时间逐渐增强;α-MHC、肌钙蛋白基因诱导前无表达,于诱导第3天出现表达,以后维持在高水平.结果提示,心肌匀浆上清液对骨髓间充质干细胞具有定向诱导作用,在此过程中,伴随着Nkx-2.5、GATA-4、MEF-2C、α-MHC和肌钙蛋白基因的时序表达变化.

第4代大鼠脂肪间充质干细胞的免疫表型鉴定

背景:有文献证实以酶消化法可获得在脂肪组织间充质干细胞,传至第10代时细胞生长仍良好,但表面标志物表达下降. 目的:分离培养大鼠脂肪组织间充质干细胞,传代至第4代,检测免疫表型. 方法:从6只SD大鼠腹股沟脂肪垫中分离培养脂肪组织间充质干细胞,以贴壁细胞扩增传代至第4代.相差显微镜下观察脂肪组织间充质干细胞的形态,并用流式细胞术鉴定脂肪组织间充质干细胞的表面标志物CD11b,CD29,CD45,CD49d,CD90 和 CD106的表达率.结果与结论:大鼠脂肪组织间充质干细胞呈现类似成纤维细胞样形态学特征,免疫表型分析显示CD29和CD90 呈阳性,而CD11b、CD45、CD49d和CD106呈阴性反应.结果提示通过这种酶消化法获得的SD大鼠的脂肪组织间充质干细胞,免疫表型分析显示符合间充质干细胞的特征.

脂质体介导人骨形态发生蛋白2基因转染对兔脂肪干细胞生长增殖的影响

背景:脂质体对细胞具有毒副作用,而外源性基因的胞内导入亦在细胞的代谢方面有所影响,因此脂质体介导人骨形态发生蛋白2基因转染脂肪干细胞对其在生长、增殖方面有无显著影响值得探讨.目的:观察脂质体介导的人骨形态发生蛋白2基因转染对兔脂肪干细胞生长、增殖的影响.方法:从兔脂肪组织中提取脂肪干细胞,体外培养传代,取第4代细胞分别转染人骨形态发生蛋白2基因和增强型绿色荧光蛋白基因,倒置显微镜下连续观察转染后的细胞形态变化及生长情况.荧光显微镜下计数转染后48 h可发绿色荧光细胞的个数估算瞬时转染效率,MTT法绘制染后细胞的生长曲线,并计算群体倍增时间.结果与结论:转染后48 h,细胞体积变大,胞浆丰富,部分呈圆形或椭圆形改变.荧光显微镜下计数瞬时转染率为(18.0±0.42)%.MTT法绘制细胞生长曲线发现:转染后细胞较未转染的细胞生长速率略慢,但转染与未转染组细胞的生长曲线大致一样,均呈"S"形,且两者的总体趋势变化不大.转染后人骨形态发生蛋白2组的细胞群体倍增时间为55.51 h,EGFP组群体倍增时间约为53.58 h,未转染组的群体倍增时间46.10 h,差异无显著意义(P > 0.05).提示脂质体可以介导人骨形态发生蛋白2基因和绿色荧光蛋白基因转染兔脂肪干细胞,并对细胞的生长、增殖无明显影响.

人白细胞介素12腺病毒载体构建及在人骨髓间充质干细胞中的表达

背景:研究表明,白细胞介素12是一种强有力的抗肿瘤细胞因子,骨髓间充质干细胞易于外源基因的导入和表达,且具有较弱的免疫抗原性和免疫调节功能,因此,利用携带白细胞介素12基因的间充质干细胞对于肿瘤的治疗具有极大的发展前景.目的:构建人白细胞介素12 5型腺病毒载体(Ad hIL-12),感染人骨髓间充质干细胞,检测白细胞介素12的表达.方法:提取成熟的树突状细胞的总RNA,用RT-PCR方法获得hIL-12 p35和p40基因cDNA,p35和p40 cDNA通过脑心肌炎病毒内部核酸进入位点连接,构建pDC515 hIL-12 p35/IRES/p40腺病毒穿梭质粒.采用Ad MaxTM腺病毒载体体系,pDC515 hIL-12 p35/IRES/p40穿梭质粒与pBHGfrt△E1,3FLP骨架质粒共转染至293细胞,通过重组酶位点特异性重组获得Ad hIL-12.Ad hIL-12感染人骨髓间充质干细胞后经γ射线照射使细胞失去增殖能力,用hIL-12p70 ELISA试剂盒检测细胞上清中白细胞介素12的水平.结果与结论:经测序证实,RT-PCR所获得的hIL-12 p35和p40基因cDNA序列与GenBank NM_000882(762 bp)和NM_002187(987 bp)提供的序列完全一致.用Ad MaxTM腺病毒载体体系可高效、快捷地获得所要包装的腺病毒载体,通过IRES连接hIL-12的两个亚基p40和p35可有效地表达IL-12p70蛋白;Ad hIL-12腺病毒载体感染人骨髓间充质干细胞后可持续高水平分泌白细胞介素12,在以人骨髓间充质干细胞为载体细胞的基因治疗中有潜在的应用前景.

转化生长因子β1/胰岛素样生长因子1与髓核细胞诱导脂肪间充质干细胞向髓核样软骨细胞分化的比较

背景:以往研究脂肪间充质干细胞培养方式多为单层培养,诱导方式主要集中于细胞因子的方法,而椎间盘体内微环境,除细胞因子对细胞影响外,在其三维环境中细胞间的相互作用还值得进一步研究.目的:在体外分别通过髓核细胞和转化生长因子β1/胰岛素样生长因子1两种条件诱导,观察脂肪间充质干细胞向髓核细胞分化的差异.方法:分别单层培养兔的脂肪间充质干细胞与髓核细胞细胞,脂肪间充质干细胞培养至3代经鉴定后,按5×106个细胞制成微球,置于Transwell培养板中培养,分别通过髓核细胞微球及转化生长因子β1/胰岛素样生长因子1诱导;于诱导前、诱导7,14 d,观察细胞形态变化,并通过RT-PCR对Ⅱ型胶原、蛋白多糖水平进行测定.结果与结论:在体外诱导7,14 d,两组脂肪间充质干细胞微团体积、形态无明显区别.RT-PCR检测结果显示7 d两组与髓核诱导组均有Ⅱ型胶原及蛋白多糖mRNA表达,但转化生长因子β1/胰岛素样生长因子1组表达更强;诱导14 d髓核诱导组Ⅱ型胶原及蛋白多糖mRNA表达明显增高,优于转化生长因子β1/胰岛素样生长因子1组.结果表明,在体外髓核细胞和转化生长因子β1/胰岛素样生长因子1对脂肪间充质干细胞进行诱导均有促进其向髓核细胞分化作用,而转化生长因子β1、胰岛素样生长因子1为正常髓核细胞分泌重要因子,说明髓核细胞对脂肪间充质干细胞的诱导之间除细胞因子作用外,尚存在相互促进增殖分化作用.

小胶质细胞对体外培养神经干细胞向胆碱能神经元分化的影响

背景:神经干细胞的定向分化与小胶质细胞的浓度有关,浓度倍数过小可能达不到应有效应,太大则会产生细胞毒性.目的:观察不同比例的小胶质细胞对体外培养的神经干细胞向胆碱能神经元方向分化的影响.方法:取新生24,48 h内Wistar大鼠用于神经干细胞与小胶质细胞的原代培养,免疫组化进行鉴定.神经干细胞与小胶质细胞共同接种于6孔板,接种密度分别为10∶1,4∶1,1∶1,1∶4,1∶10,每种密度设6孔,以单纯神经干细胞作为对照,共培养3,7,14 d,观察细胞的生长情况.结果与结论:原代培养的神经干细胞聚集成球状,悬浮生长,Nestin染色阳性,胞核不着色.小胶质细胞贴壁生长,折光性强,大部分细胞有短的突起呈分支状,小胶质细胞特异性标记抗体CD11b/c染色结果显示细胞纯度在80%以上.与单纯神经干细胞对照组相比,神经干细胞与小胶质细胞以10∶1,4∶1,1∶1,1∶4,1∶10接种密度共培养组ChAT阳性细胞数均明显升高.共培养组神经干细胞与小胶质细胞比例为4∶1时升高幅度显著高于其他接种密度 (P < 0.05),且在培养第7天时生长达到高峰.结果提示小胶质细胞可以促进神经干细胞向胆碱能神经元方向分化,神经干细胞与小胶质细胞4∶1比例共培养第7天时效果佳.

Wnt3a促进大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化

背景:Wnt信号通路是细胞增殖分化的关键调控环节,但与骨髓间充质干细胞神经分化的联系并不十分明确.目的:寻找促进骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的Wnt信号分子.方法:首先体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞并传代,行形态学观察,并以流式细胞学方法检测细胞表型CD44,CD9,CD34和CD45.采用碱性成纤维细胞生长因子分别联合Wnt3a或Wnt5a的方案诱导分化,应用免疫组化和反转录-聚合酶链反应方法比较Wnt3a和Wnt5a对骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的影响.结果与结论:骨髓间充质干细胞为长梭形,CD9,CD44高表达,CD34,CD45低表达.Wnt3a诱导组的巢蛋白和神经元特异烯醇化酶呈阳性,而胶质纤维酸性蛋白无明显表达,诱导后细胞的活力良好.Wnt5a诱导组巢蛋白呈弱阳性表达,而神经元特异烯醇化酶及胶质纤维酸性蛋白阴性.反转录-聚合酶链反应结果显示,Wnt3a诱导组巢蛋白在诱导前后均有表达,神经元特异烯醇化酶在诱导后5 d可见明显的扩增条带,10 d后更加明显.胶质纤维酸性蛋白在诱导10 d后出现较弱的扩增条带.Wnt5a组、对照组骨髓间充质干细胞在诱导后10 d巢蛋白有微弱表达,神经元特异烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白几乎无表达.提示Wnt3a分子能够促进体外培养的骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化.

辛伐他汀对大鼠骨髓基质干细胞Wnt信号通路相关因子表达的影响

背景:辛伐他汀作为降脂类药物,具有一定的潜在促骨形成作用,并因此成为骨代谢领域的研究热点,但在体内试验中对其促进成骨的作用尚存争议.目的:观察辛伐他汀体内给药对大鼠骨量和骨髓基质干细胞增殖﹑分化的影响,及其在此过程中Wnt信号通路相关因子mRNA表达水平的变化.方法: 6周龄雌性SD大鼠36只随机分成2组:对照组每天蒸馏水灌胃;实验组辛伐他汀灌胃20 mg/(kg·d).分别于给药后3,6,9周处死两组大鼠各6只,取左侧股骨行骨密度测定;取右侧股骨和胫骨骨髓细胞向成骨方向诱导培养,于细胞培养第16天检测碱性磷酸酶比活性、碱性磷酸酶染色;细胞培养第21天提取总RNA,采用Real-time RT-PCR检测LRP-5、Axin2、β-catenin的mRNA的表达.结果与结论:辛伐他汀体内给药干扰3,6,9周后大鼠骨密度均无显著变化,体外培养骨髓基质干细胞所有检测基因mRNA水平、成骨分化能力与对照组相比差异均无显著性意义.辛伐他汀体内给药3,6,9周对大鼠骨量及骨髓基质干细胞的分化及LRP-5、Axin2、β-catenin mRNA表达无显著作用.

骨髓间充质干细胞向多巴胺能神经元的诱导分化

背景:近年来研究发现,神经营养因子在骨髓间充质干细胞的分化中发挥重要作用.目前脑组织中具有再生能力的神经干细胞在体外是否具有直接诱导骨髓间充质干细胞分化为多巴胺能神经元的作用还未见报道.目的:观察大鼠间充质干细胞在胶质细胞源性神经营养因子与神经干细胞共培养两种诱导条件下体外分化成多巴胺能神经元的能力.方法:分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,取第3代细胞分2组培养,一组细胞应用胶质细胞源性神经营养因子单独诱导,另一组细胞与已培养成球的神经干细胞共培养进行诱导,共培养之前行Brdu标记.诱导3 d后以免疫组织化学法检测各组贴壁细胞神经元特异性标志物神经原纤维和多巴胺能神经元特异性标志物酪氨酸羟化酶的表达,观察间充质干细胞的分化情况.结果与结论:胶质细胞源性神经营养因子单独诱导组间充质干细胞在诱导24 h后胞体回缩呈锥形,突起延长且数量增多,有神经元样形态,且细胞间相互连接成网络状,3 d后部分细胞表达神经原纤维,其中少部分同时表达酪氨酸羟化酶.与神经干细胞共培养组神经干细胞球很快解离,迅速贴壁,共培养的贴壁细胞大量增殖且多呈神经元样,胞体细长多突起,相互间连接成网,多数贴壁细胞分别单独表达神经原纤维和酪氨酸羟化酶,少数细胞可见Brdu/神经原纤维,Brdu/胶质纤维酸性蛋白,Brdu/酪氨酸羟化酶双标阳性.提示间充质干细胞在胶质细胞源性神经营养因子、神经干细胞存在的情况下可定向转化为神经元,并有向多巴胺能神经元分化的可能.在该实验条件下胶质细胞源性神经营养因子效果好于神经干细胞.

胰岛干细胞的研究与进展:诱导产生功能性β细胞的路还有多远?

背景:胰岛素替代治疗是目前常用于治疗糖尿病的方法,然而这种治疗方法有很多缺陷.胰岛移植作为治疗糖尿病的一种有效方法已经得到公认.胰岛供体的缺乏和移植排斥反应的存在限制了胰岛移植的临床应用.胰岛干细胞可以有效解决这个难题.目的:文章对胰岛β干细胞的来源、诱导分化效率,目前存在的问题和应用前景进行综述.方法:应用计算机检索Pubmed 数据库1990-01/2009-12有关于糖尿病干细胞研究的相关文献,检索关键词:diabetes, stem cell, treatment, islets.通过阅读标题和文摘进行初筛,排除重复性研究、Meta分析类文献,保留23篇文献进行分析总结.结果与结论:由干细胞诱导分化得到的胰腺β细胞可以发挥调节血糖的作用.目前用于诱导分化为胰腺β细胞的干细胞来源包括胚胎干细胞、胰腺干细胞、骨髓间充质干细胞等.在不同的干细胞诱导分化为胰腺β细胞的研究中,分为体内和体外两种诱导分化方法,而体外诱导法多数采用分步诱导的方式,也有部分实验利用基因技术的方法进行诱导.目前胰岛干细胞的研究仍处于初步阶段,如何诱导产生大量的功能性β细胞仍是一个巨大挑战.

Notch信号转导通路在神经修复与再生中的激活效应

背景:近年来发现神经干细胞可以通过对等分裂方式分化为功能神经细胞,从而使损伤的神经细胞功能得到恢复,而Notch信号转导通路对神经细胞发育成一系列的神经元和胶质细胞具有允许和决定作用.目的:文章主要对Notch的结构、调节机制、影响因素及对神经细胞的作用与影响进行了综合分析.方法:应用计算机检索CNKI和PubMed数据库中有关信号途径与神将干细胞分化发育和脊髓损伤有关的文章,检索关键词"Notch,神经细胞,神经修复,神经再生"或"signal transduction, NSC, SCI, Notch".初检得到430篇文献,终纳入有代表性的31篇文章进行综述.结果与结论:文章主要讨论了Notch在神经修复与再生中的重要地位,它可以选择性激活体外的多能神经干细胞和体内胚胎前脑的放射状神经胶质,而且,在神经胶质发生过程中激活是星形神经胶质发育所必需的,并对其他功能细胞的发育、生长及凋亡起着重要的调控作用.

创伤性颅脑损伤后的成年神经细胞再生

中以"Traumatic brain injury; Neurogenesis; Hippocampus; Subventricular zone; Cerebral cortex"为检索词进行检索.选择的神经解剖部位为神经发生区域海马和脑室下区以及非神经发生区域大脑皮质,文章内容与创伤和成年神经细胞再生相关,同一领域文献则选择近期发表或发表在权威杂志文章.初检得到213篇文献,根据纳入标准选择31篇文章进行综述.结果与结论:成年个体神经系统存在神经细胞再生,适度的创伤能够刺激海马和脑室下区的神经细胞再生,神经细胞再生有助于海马神经功能的修复,一些促进神经细胞再生的外界因素能够改善神经功能.大脑皮质中可能存在处于静息状态的神经前体细胞,在一定条件下,它们可能会再次进入细胞周期从而诱发神经细胞再生,可能对于脑损伤修复有潜在意义.

干细胞移植治疗心脏疾病的研究与应用

背景:心脏疾病发展到终末期,由于受到种种限制,现有的治疗手段不能从根本上治愈心脏疾病.干细胞是各种成熟细胞的起源细胞,具有自我更新和分化的潜能,其有较强的再生能力,替代,修复或加强受损的组织或器官的生物学功能,理论上使心血管疾病终得到治愈成为可能,尽管存在争议,但大量研究资料表明干细胞移植治疗是安全有效的.目的:综述干细胞移植治疗心脏疾病的相关研究进展.方法:第一作者应用计算机检索1999-01/2006-10 PubMed数据库(网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed)相关文章,检索词为"stem cells,transplant,heart disease",并限定文章语言种类为English.同时计算机检索1999-01/2006-10中国期刊全文数据库(网址http://www.wanfangdata.com.cn)相关文章,检索词为"干细胞,移植,心脏疾病",并限定文章语言种类为中文.共检索到文献60篇.结果与结论:各种类型的心脏疾病发展到终末期,由于受到心肌细胞结构和功能的不可逆损害,健康的心肌细胞有限的代偿不能满足机体需求,各种姑息保守治疗手段不能解决根本问题,难以达到令人满意的程度.而心脏供体源有限、免疫排斥反应、费用的昂贵及手术的高风险使心脏移植治疗受到很大的限制.给临床治疗提出了严峻的挑战.寻找一种更有效的治疗手段、开辟新的治疗途径成为必然.随着组织、细胞工程研究的不断深入,细胞重建和功能恢复的干细胞移植疗法成为有应用前景的研究热点.

花季如你,美丽如我