中国组织工程研究杂志
Chinese Journal of Tissue Engineering Research 중국조직공정구여림상강복
- 主管单位： 中华人民共和国卫生部
- 主办单位： 中国康复医学会,《中国组织工程研究与临床康复》杂志社
- 影响因子： 1.38
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 2095-4344
- 国内刊号： 21-1581/R
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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人类外周血染色体G显带的改良方法
背景:染色体G显带常规方法操作繁琐、费时、效果较差,不利于临床染色体病的检查和教学科研等.目的:寻找提高染色体G显带效果的方法.设计:观察性实验.单位:新乡医学院.材料:实验于2001-01/2005-01在新乡医学院形态实验室完成.取新乡医学院第三附属医院妇产科2001-2004年门诊不孕不育和不良生育史患者外周血共376份.RPMl1640培养液(GIBCO公司),20%小牛血清,秋水仙素,0.075 mol/L KCl,甲醇,冰醋酸,胰蛋白酶(SIGMA公司),Giemsa染液.方法:改良的人类外周血染色体制备技术及G显带方法:操作步骤同常规方法,只是将部分影响因素做了调整,如秋水仙素作用时间调整到终止培养前2 h,加入1 mL固定液(甲醇:冰醋酸=2∶1)进行预固定,混匀后以1 500 r/min离心10 min.再离心后视细胞多少加新鲜固定液,制成细胞悬液,滴片.将上述玻片标本置500℃烤箱中一两小时,自然冷至37℃后,浸入胰蛋白酶液中消化3～5 min左右,立即移入Giemsa染液(用1份Giemsa原液加9份pH为6.8的磷酸缓冲液配制)中染色10 min,镜检计数,共观察3 000分裂相数,计算标本的400～600条分裂相的百分率和分散良好百分率.染色体分散良好指染色体分散后没有重叠,数目完整,随体和着丝点明显,着色鲜明,形状清晰,且各色染色体处于同一平面上.分裂相百分率=400～600分裂相细胞数/观察细胞数×100%.主要观察指标:标本的400～600条分裂相百分率和分散良好百分率.结果:常规方法400～600条分裂相占52%,分散良好率68%;改良方法400～600条分裂相占75%,分散良好率86%,两组比较差异有显著性意义(P＜0.05).结论:改良方法获得的染色体分裂相多,分散良好,长短适中,Giemsa染色显示带纹清晰.
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脐血CD34+细胞向肝细胞分化的体内外实验
目的:以脐血CD34+细胞为起始细胞,分别在人体外和肝受损的重度联合免疫缺陷小鼠体内诱导CD34+细胞向肝细胞转化.方法:实验于2004-09/2005-06在反应器工程国家重点实验室进行.取健康足月产妇的新鲜脐血,产妇知情同意.采用密度梯度离心法分离脐血单个核细胞.将单个核细胞悬浮于免疫磁珠法缓冲液中,获取CD34+细胞.将CD34+细胞在干细胞因子+白细胞介素3+白细胞介素6细胞因子组合中培养1周,然后在肿瘤抑制素+成纤维细胞因子1+成纤维细胞因子2+白血病抑制因子+肝细胞生长因子+表皮生长因子组合中诱导其向肝细胞分化.将2-乙酰氟氨以0.4 mg/只的剂量通过腹腔注射输入到重度联合免疫缺陷小鼠体内.7 d后再腹腔注射入0.4 mL/kg的CCl4,同时向实验组小鼠尾部静脉注射CD34+细胞,对照组小鼠则仅输注2-乙酰氨芴和CCl4.分别于4,6周后采用流式细胞术检测小鼠肝脏中的人源细胞,并用RT-PCR和免疫组化方法检测人源血清白蛋白基因和抗原的表达.结果:①CD34+细胞体外培养过程中,细胞总数扩增了近30倍,并且在培养21 d收获的细胞中可检测到人血清白蛋白基因和抗原的表达,CD34+在体外被诱导成肝样细胞.②采用流式细胞术检测重度联合免疫缺陷小鼠肝脏中的人源细胞,并用RT-PCR和免疫组化的方法检测人源血清白蛋白基因和抗原的表达,4周时发现小鼠肝脏中含有7.66%的人源细胞,但人源细胞不表达血清白蛋白基因和抗原.6周时重度联合免疫缺陷小鼠肝脏中的人源细胞的比例增加至31.10%,并且人源细胞开始表达血清白蛋白基因和抗原.结论:CD34+细胞无论在体外培养还是在肝脏受损的重度联合免疫缺陷小鼠体内均能成功转化为肝实质细胞.
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款冬花粗多糖体外诱导人白血病K562细胞的凋亡
目的:观察款冬花粗多糖对体外培养人白血病K562细胞有无凋亡诱导作用.方法:实验于2006-06-25/2006-09-08在河北北方学院实验中心细胞生物学实验室、分子生物学实验室、药物研究实验室完成.①款冬花粗多糖的提取:称取已干燥粉粹的款冬花417.0 g,加入1 000 mL体积分数0.85乙醇回流提取1 h,滤过,滤渣加入1 000 mL三蒸水回流提取2 h,过滤,滤渣再加入1 000 mL三蒸水回流提取2 h,合并2次滤液,减压浓缩至适量,四倍体积无水乙醇醇沉,静置过夜,过滤,沉淀依次用无水乙醇、丙酮、石油醚洗涤,即得款冬花粗多糖.苯酚-硫酸法测定款冬花粗多糖含量以生药计算为122.9 mg.制成102.5 g/L粗多糖溶液.②人白血病K562细胞的生长抑制实验:体外培养的K562细胞经10,30,50,70,90 mg/L的款冬花粗多糖作用48 h后,通过Hoeehst33258染色在荧光显微镜下进行形态学观察、采用琼脂糖凝胶电泳及流式细胞术检测细胞凋亡.结果:①经款冬花粗多糖作用后,荧光显微镜下发现体外培养的K562细胞中出现核固缩、凋亡小体.②经不同质量浓度款冬花粗多糖处理的K562细胞DNA电泳均出现相差约200bp的DNA梯子状条带.③流式细胞仪检测发现,经不同质量浓度款冬花粗多糖处理的K562细胞,有凋亡峰.结论:款冬花粗多糖可诱导体外培养人白血病细胞K562凋亡.
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不同分离方法对鼠胚胎成纤维细胞生长影响的比较
目的:采用组织块培养法、单细胞悬液法、滤网过滤改良法分离培养鼠胚胎成纤维细胞,比较不同分离方法对其生长形态、生长曲线及细胞周期的影响.方法:实验于2006-03/09在辽宁医学院解剖实验室完成.①选取清洁级昆明种七八周龄雄性小鼠10只,4周龄雌性小鼠20只,雄雌鼠按1∶2合笼,次日晨检查有阴栓者记为孕0.5 d,选择孕12.5～14.5 d雌鼠断颈处死,取出胎鼠,去除胚胎头部、内脏和四肢,将躯干部用无菌眼科剪剪成1 mm3以下的碎块,分别用以下方法进行分离培养.②组织块培养法:将剪碎的组织块吸置于离心管内,加入1 mL消化液(含2.5 g/L胰蛋白酶和0.4 g/L乙二胺四乙酸的磷酸盐缓冲液),吹吸30 s,加入等体积的完全培养基(含体积分数为0.1的胎牛血清)终止消化,弃上清液,留下鼠胚组织块沉淀物,按相互距离0.5 cm放入培养瓶内,培养箱静置2～4 h后,加入适量完全培养基,3 d换液一次.③单细胞悬液法:将剪碎的组织块加入1 mL消化液,吹打30 s,室温下静置3～5 min,吸取上层液体,再加入消化液,重复上述操作五六次,后弃组织块,将收集的上层液离心,1 000 r/min离心5 min,弃上清液,加入完全培养基5 mL,吹打均匀后吸至培养瓶内培养.培养条件、换液时间与组织块培养法相同.④滤网过滤改良法:将剪碎的组织块加入1 mL消化液,吹打30 s,37℃水溶箱中轻摇3～5 min,加入完全培养基1 mL终止消化,室温下静置1.0～2.0 min,用直径5 cm、孔径为150目滤网过滤后,将过滤液以1 000 r/min离心5 min;弃上清液,加入适量完全培养基,轻吹30～50下,吸至培养瓶内,37℃、体积分数为0.05的CO2孵箱中培养24 h,半量换液,以后3 d换液一次.⑤检测不同分离方法对鼠胚胎成纤维细胞生长形态、生长曲线及细胞周期的影响.结果:①鼠胚胎成纤维细胞生长形态观察:组织块培养法第2天可见少量成纤维细胞,细胞生长缓慢,需要七八天才能传代.单细胞悬液法第2天可见成纤维细胞生长,细胞量虽多,但死亡的细胞也较多,细胞活力减弱,四五天后传代.滤网过滤改良法第2天可见成纤维细胞呈长梭形,胞浆饱满,细胞生长迅速,三四天长满培养瓶,三四天传代.②细胞生长曲线检测:组织块培养法培养的细胞第4～8天进入对数生长期,单细胞悬液法培养的细胞第3～5天进入对数生长期,滤网过滤改良法培养的细胞第2～4天进入对数生长期.③细胞周期检测与增殖指数:培养第3天,滤网过滤改良法所得的鼠胚胎成纤维细胞增殖指数高,达到54.12%,单细胞悬液法、组织块培养法细胞增殖指数分别为53.52%和53.15%,3种方法差异无显著性意义(P＞0.05),表明其细胞周期基本相同.结论:滤网过滤改良法可以在较短时间内培养出优质高采的鼠胚胎成纤维细胞.
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深低温保存大鼠胚胎脊髓组织:以细胞核质比例评价细胞形态和存活率的变化
目的:胚胎细胞脊髓内移植是判定冻存细胞直接的证据.通过计算机图像处理系统判定细胞核质比例,以观察经深低温保存后大鼠胚胎脊髓细胞形态和存活率的变化.方法:实验于2004-12/2005-03在承德医学院临床技能实验室完成.剖腹取胎龄14 d Wistar大鼠的胎鼠,分离胚胎脊髓,剪成1 mm3的小块.将DMEM细胞培养液70 mL、大鼠灭活血清20 mL、DMSO 10 mL混合制成冻存液.取冻存管,加入冻存液10mL,并将剪好的胚胎脊髓组织10～20块放入其中,封口.放于冰箱中逐步降温保存,后置于液氮中保存.胚胎脊髓在液氮中保存15 d后,取出冻存管,放入37℃恒温水浴槽中快速复温,待完全融化后,以3 000 r/min离心3min,弃去上清液,再加入等量DMEM细胞培养液,静置3 min,冲洗,并植入正常大鼠脊髓内.以台盼蓝拒染率测定深低温保存前和深低温保存后胚胎脊髓组织细胞存活率,着色的为死亡细胞、不着色的为存活细胞.算出细胞存活率和核质比例.4周后应用免疫组化法检测受体大鼠移植段脊髓.结果:①经低温保存的胚胎脊髓细胞存活率低于未经低温保存组[(64.78±6.14)%,(50.07±7.58)%,P＜0.01];两组的存活细胞形态和核质比无明显改变.②移植后4周,有1只大鼠因感染死亡.镜下观察移植大鼠脊髓组织均可见移植物存活,存活移植物与受体脊髓组织融合良好,移植区边缘均有少量宿主神经细胞空泡变性,2只因移植物与受体之间存在裂隙,只有部分融合,无明显胶质瘢痕,1只移植区外偶见局限淋巴细胞浸润.③免疫组化检测显示,在移植区内可见少量的5羟色胺及神经丝阳性细胞和纤维,在损伤腔边缘部可见大量来自宿主的5-羟色胺阳性纤维进入移植区,移植区周边的纤维较中央部位纤维粗大.结论:经过深低温保存大鼠胚胎脊髓组织保持了原有的细胞形态,并能够在异体脊髓内存活,并与宿主融合良好,保持了原有的活性.
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人牙髓细胞体外培养及向成牙本质细胞的诱导分化
目的:观察体外培养的牙髓细胞向成牙本质细胞分化过程中碱性磷酸酶的表达和矿化结节形成能力,建立成牙本质细胞样细胞体外培养体系.方法:实验于2004-07/2005-07在中山大学光华口腔医学院完成.利用组织块酶解法培养人牙髓细胞并进行鉴定,取第3代牙髓细胞,胰酶消化后进行细胞计数,连续观察7 d,绘制生长曲线.第3代牙髓细胞,使用矿化诱导液诱导其向成牙本质细胞样细胞分化,观察细胞形态改变和碱性磷酸酶活性变化,用Von kossa染色法观察诱导后的细胞形成矿化结节的能力.结果:①获得的牙髓细胞均为波形丝蛋白阳性,角蛋白阴性,证明为中胚层来源的细胞.②诱导分化的牙髓细胞在2周左右进入复层生长期;3周左右开始有细胞结节形成,周围细胞呈放射状排列,部分细胞出现细长突起并呈极性排列.4周左右细胞团中央Von Kossa染色为阳性.③与未诱导的细胞相比,矿化诱导开始3周碱性磷酸酶活性逐渐升高,但到第4周后活性有所降低.结论:实验成功建立了成牙本质细胞样细胞体外培养体系,所获得的成牙本质细胞样细胞具有成牙本质细胞的部分形态和生物学功能,是研究成牙本质细胞的较好模型.
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血小板膜糖蛋白表达变化在出血性血小板病患者与健康人之间的差异
背景:已证实出血性血小板病患者血小板聚集功能存在缺陷,血小板膜糖蛋白在血小板聚集过程中具有重要作用.目的:以健康人作为正常对照,观察出血性血小板病患者血小板膜糖蛋白表达的变化.设计:病例-对照分析.单位:华中科技大学同济医学院附属协和医院中西医结合科.对象:①选取2001-01/2003-03华中科技大学同济医学院附属协和医院中西医结合科和血液专科收治的79例出血性血小板病患者,男31例,女48例,平均年龄(35.76±14.14)岁,病程1～14年,符合1996年出血性血小板病的诊断标准,患者及其家属对本实验知情同意.共计167个出血部位,其中肢体皮肤瘀斑或瘀点64例,鼻出血33例,月经过多29例,齿龈出血28例,眼底出血8例,球结膜出血5例.②纳入标准:均有多部位出血临床表现;血小板计数、出血时间、凝血象检测无明显异常改变;根据出血部位,经内科、耳鼻喉科、妇科、口腔科和眼科等科室诊视,未发现特异诊断性病灶;血压、心率正常;经瑞斯托霉素检测,排除血小板无力症.③另选取健康献血员34例作为正常对照组,男15例,女19例,平均年龄(30.12±7.14)岁.方法:①血小板聚集率测定:以二磷酸腺苷(终浓度1.90μmol/L)、花生四烯酸(终浓度0.37 μmol/L),血小板活化因子(终浓度150 nmol/L)作为诱聚剂,采用Chronolog 430型血小板聚集仪检测正常对照与出血性血小板病患者的血小板大聚集率.血小板大聚集率21%～40%为反应不良,低于20%为反应缺如.②血小板膜糖蛋白检测:患者取肘静脉血3.6 mL,20 g/L的乙二胺四乙酸二钠1:9抗凝,正常对照组标本以同法收集.分离血浆,收集血浆层,离心去上清,加多聚甲醛室温固定,调整血小板浓度为3×107 L-1.取调整好的血小板溶液100 μL,分别加入异硫氰酸荧光黄标记的CD42b(抗血小板膜糖蛋白Ⅰ b)、CD41(抗血小板膜糖蛋白Ⅱb)、CD61(抗血小板膜糖蛋白Ⅲa)、CD42b/CD42a(抗血小板膜糖蛋白Ⅰb/Ⅸ)、CD41/CD61(抗血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa)、CD62p(抗P-选择素)克隆抗体200μL,混匀后室温避光孵育30 min,磷酸盐缓冲液补至终体积1 mL,每个样本分析10 000个血小板,于FACS420型流式细胞仪上测定荧光阳性百分标记率.主要观察指标:①血小板聚集率.②血小板膜糖蛋白的表达.结果:79例出血性血小板病患者与34例健康献血员全部进入结果分析.①每例出血性血小板病患者均对一项或多项诱聚剂诱导的聚集反应不良或缺如,而正常对照组血小板聚集检测均无异常发现.②与正常对照组比较,出血性血小板病患者血小板膜糖蛋白Ⅰb/Ⅸ,Ⅱb/Ⅲa,Ⅰ b,Ⅲa及P-选择素的荧光阳性标记率均明显降低(t=2.50～5.57,P均＜0.05);血小板膜糖蛋白Ⅱb荧光阳性标记率略微升高,但差异无显著性意义(t=0.86,P＞0.05).结论:血小板膜糖蛋白表达异常可能是导致出血性血小板病的因素之一.
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四种中成药对气血双虚模型小鼠血象及免疫水平的影响
目的:为艾滋病抗病毒疗法所致的骨髓不良反应筛选疗效确切的中成药,观察分析参芪颗粒、复方阿胶浆、贞芪扶正颗粒、复方皂矾丸四种中成药对放血和注射环磷酰胺联合复制的气血双虚模型小鼠血象及免疫水平的影响.方法:实验于2005-08/09在河南中医学院药理实验室完成.①参芪颗粒(江西山高制药有限公司生产,批号040702);复方阿胶浆(山东东阿阿胶股份有限公司生产,批号050446);贞芪扶正颗粒(甘肃扶正药业科技股份有限公司生产,批号040803);复方皂矾丸(陕西郝其军制药有限责任公司生产,批号041014);当归补血口服液(郑州市协和制药厂生产,批号041122);环磷酰胺(上海华联制药有限公司生产,批号050101).②选取清洁级昆明种小鼠150只,随机数字表法分为15组,10只/组:1～3组分别灌服参芪颗粒混悬液3,2,1 g/kg;4～6组分别灌服复方阿胶浆30,20,10 mL/kg;7～9组分别灌服贞芪扶正颗粒混悬液15,10,5 g/kg;10～12组分别灌服复方皂矾丸混悬液2.4,1.6,0.8 g/kg;第13组灌服当归补血口服液10 g/kg;剩余2组为空白对照组和模型对照组,分别给于同体积生理盐水10 g/kg.各组给药1次/d,连续给药10 d.③除空白对照组外,其他各组从给药第1天开始建立气血双虚模型.每只鼠尾部放血0.25 mL/10 g,然后分别于第2,4,6,8天腹腔注射环磷酰胺80,40,40,40 mg/kg.空白对照组同时间点仅腹腔注射等体积生理盐水.末次注射环磷酰胺后2 h,眼眶取血,一部分用于血象测定,另一部分离心取血清,测定血细胞比容及血清中巨噬细胞集落刺激因子水平;解剖取胸腺和脾脏,检测胸腺皮质厚度、胸腺淋巴细胞数、脾小结大小、脾脏淋巴细胞数病理学指标的变化.结果:150只小鼠全部进入结果分析,放血和注射环磷酰胺并用可成功建立小鼠气血双虚模型.①与模型对照组比较,参芪颗粒3 g/kg组、贞芪扶正颗粒10,5 g/kg组、复方皂矾丸1.6 g/kg组均可升高气血双虚模型小鼠白细胞水平(t=2.18～2.74,P＜0.05),贞芪扶正颗粒15 g/kg组作用更为显著(t=2.98,P＜0.01);参芪颗粒1 g/kg组、复方阿胶浆20 mL/kg组、贞芪扶正颗粒15,10 g/kg组均可升高红细胞水平(t=2.44～2.69,P＜0.05),复方阿胶浆30mL/kg组、贞芪扶正颗粒5 g/kg组、复方皂矾丸2.4,1.6 g/kg组作用更为显著(t=2.91～3.66,P＜0.01);当归补血口服液组、复方阿胶浆20 mL/kg组、参芪颗粒3,1 g/kg组、贞芪扶正颗粒15,10,5 g/kg组均可升高血红蛋白水平(t=2.27～2.85,P＜0.05),复方阿胶浆30 mL/kg组、复方皂矾丸2.4,1.6 g/kg组作用更为显著(t=3.07～4.04,P＜0.01);当归补血口服液组、参芪颗粒3,2 g/kg组均可升高血小板水平(t=2.20～2.41,P＜0.05).②与模型对照组比较,参芪颗粒2 g/kg组、贞芪扶正颗粒5 g/kg组均可升高气血双虚模型小鼠血细胞比容(t=2.01～2.62,P＜0.05),参芪颗粒1 g/kg组、复方阿胶浆30,20,10 mL/kg组、贞芪扶正颗粒15,10,5 g/kg组、复方皂矾丸2.4,1.6,0.8 g/kg组作用更为显著(t=3.18～4.36,P＜0.01);参芪颗粒2 g/kg组、复方阿胶浆30,20,10 mL/kg组、贞芪扶正颗粒15,10,5 g/kg组、复方皂矾丸2.4,1.6 g/kg组均可显著升高巨噬细胞集落刺激因子水平(t=3.60～6.80,P＜0.01).③与模型对照组比较,当归补血口服液组、参芪颗粒3,2,1 g/kg组、复方阿胶浆30,20,10 mL/kg组、贞芪扶正颗粒15,10,5 g/kg组、复方皂矾丸2.4,1.6,0.8 g/kg组均可显著增加气血双虚模型小鼠胸腺皮质厚度(t=3.71～9.34,P＜0.01),增大脾小结(t=3.36～11.97,P＜0.01),增加脾脏淋巴细胞数(t=4.29～10.44,P＜0.01);复方阿胶浆30 mL/kg组可明显增加小鼠胸腺淋巴细胞数(t=2.45,P＜0.05),当归补血口服液组、参芪颗粒3,2,1 g/kg组、复方阿胶浆20,10 mL/kg组、贞芪扶正颗粒15,10,5 g/kg组、复方皂矾丸2.4 g/kg组作用更为显著(t=3.22～8.20,P＜0.01).结论:①四种中成药对气血双虚模型小鼠血红蛋白升高作用相近,以复方阿胶浆和贞芪扶正颗粒对白细胞和红细胞水平升高作用为强,以复方阿胶浆和贞芪扶正颗粒对血小板水平升高作用为优.②四种中成药对气血双虚模型小鼠血细胞比容的影响无差异,以贞芪扶正颗粒和复方皂矾丸对巨噬细胞集落刺激因子水平的升高作用为优.③以参芪颗粒、复方阿胶浆、贞芪扶正颗粒对胸腺皮质厚度和淋巴细胞数的促进作用为优,以参芪颗粒、贞芪扶正颗粒、复方皂矾丸对脾小结和脾脏淋巴细胞数的促进作用为优.
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条件培养基诱导人骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞的连续进行性特征
背景:骨髓间充质干细胞具有多方向分化潜能,如何将其在体外诱导分化为软骨细胞是目前此研究领域的前沿方向.目的:加入一定条件培养基后以体外方式诱导人骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化,观察其在原代、传代培养一系列连续进行性过程中的特征变化.设计:单一样本、开放性实验.单位:苏州大学附属儿童医院骨科.材料:选取2002-08//2003-09苏州大学附属儿童医院收治的单纯性骨囊肿患者5例,3～12岁,在采用自体骨髓注射移植治疗时,均经家属同意每例患者采集5 mL骨髓,与浓度为20 U/mL的肝素1 mL混匀使用,作为本实验人骨髓间充质干细胞的来源.F-12培养液(美国,Gibco);新生牛血清(杭州四季青生物工程有限公司);胰蛋白酶(美国,Sigma);转化生长因子β1(美国,Sigma);维生素C(南京第三制药厂,批号021017).方法:①标准培养液的配制:向F-12培养液中加入体积分数为0.1的新生牛血清,青霉素、链霉素各100 U/mL,Hepes 5.8 g/L;NaHCO32 g/L,谷氨酰胺0.3 g/L,pH调至7.2～7.4.②条件培养液的配制:向标准培养液中加入转化生长因子β1使终浓度为1μg/L,再加入维生素C使终浓度为50μg/L,pH调至7.2～7.4.③细胞原代培养:抗凝骨髓5 mL,稀释后离心,取有核细胞层,以3×109 L-1密度接种于两个50 mL培养瓶,另以1×109 L-1密度接种于铺有盖玻片的6孔板.选1瓶及3孔加入条件培养液,另1瓶及余下3孔加入标准培养液,分别于37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中饱和湿度培养,48 h首次换液,以后2～3 d换液1次,均为全量换液.倒置显微镜下观察细胞形态.④细胞传代培养:当加入标准培养液的原代细胞培养10～14 d,铺满瓶底的80%以上时,用胰蛋白酶+乙二胺四乙酸的混合液消化传代.取传至3,6代的细胞,每一代均分装于两个50 mL培养瓶中,1瓶使用标准培养液,1瓶使用条件培养液;同时在铺有盖玻片的6孔板上,3孔使用标准培养液,3孔使用条件培养液.诱导培养时间≥7 d.倒置显微镜下观察细胞形态变化.⑤指标检测:采用阿尔新蓝染色法检测原代及传至3,6代细胞糖胺多糖阳性率.免疫组化法测定第3,6代细胞Ⅱ型胶原的阳性表达.主要观察指标:①细胞形态观察.②糖胺多糖的分泌检测.③Ⅱ型胶原的表达检测.结果:①倒置显微镜下,原代培养的骨髓间充质干细胞多数为成纤维细胞样的纺锤形细胞,偶有宽阔、平坦的多边形细胞,传代后表现为一致的纺锤形细胞,经转化生长因子β1+维生素C条件培养液诱导后变为圆形或椭圆形.②与原代细胞浆内糖胺多糖阳性率82.4%比较,使用条件培养液的第3代细胞糖胺多糖阳性率降低至76.3%(x2=1.14,P＞0.05),第6代细胞则显著降低至68.5%(x2=5.22,P＜0.05).使用标准培养液的传代细胞均为阴性.③使用条件培养液的第3,6代细胞Ⅱ型胶原均呈阳性表达,可见棕黄色的颗粒分布于细胞浆内;而使用标准培养液的传代细胞均为阴性.结论:人骨髓间充质干细胞在转化生长因子β1及维生素C条件培养基的作用下,糖胺多糖和Ⅱ型胶原表达阳性,表现出软骨细胞的生物学特性.
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端粒酶逆转录酶基因修饰人骨髓间质干细胞的实验
背景:人骨髓间充质干细胞经过有限次的细胞传代后,就会停止增殖,发生衰老和死亡.有研究表明,端粒与细胞寿命的控制密切相关,是否可通过外源性人端粒酶逆转录酶基因的异位表达,诱导人骨髓间充质干细胞的端粒酶活性,维持端粒长度的稳定,从而延长人骨髓间充质干细胞的生命周期并保持其多潜能分化特性?目的:观察外源性人端粒酶逆转录酶基因的异位表达对人骨髓间质干细胞端粒酶活性及细胞生命周期的影响.设计:重复测量实验.单位:郑州大学医学院干细胞研究中心.材料:实验于2003-10/2005-12在郑州大学医学院干细胞研究中心完成.人骨髓间质干细胞采自郑州大学第一附属医院及第三附属医院小儿外科和门诊20名健康志愿者.增强型绿色荧光蛋白-C1质粒和增强型绿色荧光蛋白-人端粒酶逆转录酶质粒由加拿大Dr.Chantal Autexier馈赠.DH5 α菌株由郑州大学医学院重点分子医学实验室侯卫红博士馈赠.方法:无菌条件下,抽取健康志愿者胸骨骨髓2 mL,经离心、洗涤及传代培养后备用.①阳离子脂质体转染及阳性克隆的筛选和扩增结果:将第5代人骨髓间充质干细胞接种至24孔培养板中,将携带有增强型绿色荧光蛋白报告基因和人端粒酶逆转录酶目的基因的质粒pEGFP-人端粒酶逆转录酶通过脂质体转染法转入人骨髓间充质干细胞中,转染共分4组:正常对照组、脂质体组、增强型绿色荧光蛋白-C1质粒组、增强型绿色荧光蛋白-人端粒酶逆转录酶质粒组,并用G418筛选法进行抗性克隆的筛选与扩增.②人骨髓间充质干细胞转染前后人端粒酶逆转录酶mRNA的表达及端粒酶活性的检测:通过RT-PCR和PCR-ELISA对选用转染增强型绿色荧光蛋白-人端粒酶逆转录酶质粒的第5代人骨髓间充质干细胞(以下简称为转H人骨髓间充质干细胞第5代)、转染增强型绿色荧光蛋白-C1质粒的第5代人骨髓间充质干细胞(以下简称为转C人骨髓间充质干细胞第5代)、未转染的第10代人骨髓间充质干细胞、K562细胞(阳性对照)转染前后人端粒酶逆转录酶mRNA的表达情况,对转H第5及30代人骨髓间充质干细胞、转C第5代人骨髓间充质干细胞及未转染的第10代人骨髓间充质干细胞端粒酶活性的影响进行检测.③转H人骨髓间充质干细胞染色体核型分析:采用胰蛋白酶-Giemsa染色法转H人骨髓间充质干细胞染色体核型分析.④转H人骨髓间充质干细胞定向诱导分化为神经元样细胞及RT-PCR鉴定:将转染细胞在重组人表皮生长因子和碱性成纤维生长因子的联合诱导下向神经元样细胞定向诱导分化,并用RT-PCR进行鉴定(蛋白微管相关蛋白和神经丝亚单位M表达).主要观察指标:①不同转染组阳离子脂质体转染及阳性克隆的筛选和扩增结果.②不同转染组人端粒酶逆转录酶mRNA的表达及端粒酶的活性.③转H人骨髓间充质干细胞染色体核型分析结果.④转H人骨髓间充质干细胞定向诱导分化为神经元样细胞及RT-PCR鉴定结果.结果:①随G418浓度的下降,正常对照组、脂质体组细胞全部死亡,从而得到稳定表达增强型绿色荧光蛋白的骨髓间充质干细胞;经G418加压筛选后得到1个连续传到第35代且生长旺盛的抗性细胞克隆,倒置显微镜下观察与未转染人骨髓间充质干细胞相比无明显差异.②转C第5代人骨髓间充质干细胞和未转染第10代人骨髓间充质干细胞的人端粒酶逆转录酶mRNA表达阴性,而K562和转H第5代人骨髓间充质干细胞的人端粒酶逆转录酶mRNA表达阳性.③转H第5代人骨髓骨髓间充质干细胞组和转H第30代人骨髓间充质干细胞端粒酶为阳性.④转H人骨髓间充质干细胞第10,20,30代的染色体总数均为23对,且含2条X性染色体,仍为正常2倍体,染色体形态和数目均正常.⑤较多转H人骨髓间充质干细胞出现了典型的神经元样形态,且经RT-PCR检测表明,神经元特征性蛋白微管相关蛋白和神经丝亚单位M表达增强.结论:外源性人端粒酶逆转录酶基因可以在人骨髓间充质干细胞中获得异位表达,并能诱导人骨髓间充质干细胞的端粒酶活性.外源性人端粒酶逆转录酶基因的异位表达不仅可以使人骨髓间质干细胞的寿命明显延长而且不影响其维持干细胞的多向分化潜能特性.
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小鼠精原干细胞染色体G带显示及其影响因素
背景:精原干细胞技术的快速发展为生殖工程带来了新希望,而在体外维持染色体数目及结构的稳定性是其使用的关键问题之一.目的:探索精原干细胞染色体G带显示技术及其影响因素,为如何鉴定培养状态下干细胞的染色体核型提供实验参考.设计:观察实验.单位:泸州医学院材料:实验于2004-03/2005-04在泸州医学院医学分子生物学实验室完成.生后10 d左右的昆明系小白鼠(雌雄均可)由泸州医学院动物科提供(许可证号:川实动管质第17号),低糖DMEM,10 mg/L丝裂霉素C,IMDM培养基,1×10-5 mol/L秋水仙素(磷酸缓冲液配置),7.5 mmol/L低渗氯化钾,甲醇:冰醋酸(3∶1)固定液,Giemsa染液,0.25%胰蛋白酶.方法:取小白鼠股骨骨髓,进行饲养层细胞的制备.取生后7～8 d左右雄性小白鼠睾丸并制成细胞悬液,调整细胞密度为3×105 L-1,接种到预先制备好的骨髓基质细胞饲养层上,细胞在37℃、体积分数0.05的CO2、70%湿度的二氧化碳培养箱中培养.待细胞生长到15～20 d时,吸出克隆细胞团,吹打分散后滴加秋水仙素处理4～6 h.收集细胞悬液,再经低渗处理后滴片染色.选择染色体分散良好,无重叠的分散中期的细胞进行记数,观察染色体形态.主要观察指标:骨髓基质及精原干细胞的培养及染色体显色与计数.结果:精原干细胞的核型与正常小鼠体细胞的染色体形态一致,染色体呈粒状、棒状,核型为20对,40条.在油镜下镜检可见3种染色体形态,一种呈高浓缩状态的染色体,可计数染色体总数,但不能显出带纹;第2种是已完全展开并铺于赤道板上的处于分裂中期的染色体,染色体总数和带纹显示都非常清楚;第3种是染色体已折转并向两极移动,并逐渐开始浓缩,染色体总数可以计数,带纹不能清楚显示.结论:小鼠精原干细胞染色体受到细胞所处的分裂时期、低渗处理的效果、滴片时细胞的分散程度及胰酶浓度及消化时间等因素的影响.
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氯吡格雷抑制血小板功能的两种检测方法比较:血小板聚集实验与血小板膜糖蛋白检测
目的:采用血小板聚集实验及血小板膜糖蛋白检测两种方法,观察比较正常人口服氯吡格雷后抑制血小板功能情况,寻求简便、经济、可靠、合理的氯吡格雷剂量监测方法.方法:①选取2006-03/05在解放军总医院进行体检的40名健康志愿者,对本实验均知情同意,随机数字表法分为4组,10名/组:第1组一次性服用75 mg氯吡格雷;第2组服用氯吡格雷75 mg/d,连服3 d停药;第3组服用氯吡格雷75 mg/d,连服7 d停药;第4组一次性服用300 mg氯吡格雷.②各组分别于服药前、停药后1,2,4,6,8,10 d这7个时间点取样;此外,第2组另于服药3 d后取样一次,第3组另于服药7 d后取样一次,第4组另于服药后2 h和8 h各取样一次.③于给药前后各时间点,采用血小板聚集仪检测血小板聚集率,流式细胞仪检测血小板膜糖蛋白PAC-1及CD62p活性,各指标间进行相关分析.结果:40名健康志愿者均进入结果分析.①各组不同时间点血小板聚集率及血小板膜糖蛋白PAC-1和CD62p活性检测:CD62p变化幅度大且不易恢复至服药前水平,PAC-1变化幅度小且容易恢复至服药前水平,血小板聚集率变化幅度介于PAC-1和CD62p之间.②各组不同时间点血小板聚集率与血小板膜糖蛋白PAC-1和CD62p活性的相关分析:服药前后各时间点血小板聚集率与血小板膜糖蛋白PAC-1,CD62p均成正相关(r大=0.666,P＜0.01;r大=0.755,P＜0.05);PAC-1与CD62p亦呈正相关(r大=0.728,P＜0.01).结论:口服氯吡格雷后,血小板聚集率与血小板膜糖蛋白PAC-1,CD62p活性这3个血小板功能指标变化具有较好的相似性.提示血小板聚集试验为氯吡格雷剂量监测简捷、实用、有效的方法之一.
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异基因外周血干细胞移植患者人类白细胞抗原B27的表达
目的:分析白血病患者行异基因外周血干细胞移植后人类白细胞抗原B27的表达特点,及其与慢性移植物抗宿主病的关系.方法:选择2003-09/2006-06在广西医科大学第一附属医院行异基因外周血干细胞移植术的45例白血病患者,按<血液病诊断和疗效标准>进行疾病的诊断和分型.全部患者均知情同意并签署知情同意书.男27例,女18例,22～51岁.其中急性髓细胞白血病13例、急性淋巴细胞白血病17例、慢性粒细胞白血病15例.供者均为白细胞抗原配型6个位点全相合的同胞兄妹.急性髓细胞白血病和慢性粒细胞白血病患者采用BU/CY方案:马利兰4 mg/(kg·d)×4 d,环磷酰胺60 mg/(kg·d)×2 d;急性淋巴细胞白血病患者预处理采用TBI/CY方案:全身照射5.0 Gy/d×2 d,环磷酰胺60 mg/(kg·d)×2 d.供者采用粒细胞集落刺激因子皮下注射动员干细胞.采用美国Baxter CS-3000 plus血细胞分离机采集外周血干细胞,每位供者采集0,+1,+2 d3次.回输单个核细胞、粒-单核系集落形成单位、CD34+细胞.采用流式细胞术动态检测45例白血病患者异基因外周血干细胞移植前后人类白细胞抗原B27表达的变化.结果:45例患者全部进入结果分析.①45例患者均获得造血重建,经荧光标记PCR短串联重复序列DNA位点分析,全部患者移植后血细胞的DNA与供者血细胞DNA完全一致.发生急性移植物抗宿主病4例,慢性移植物抗宿主病14例,出血性膀胱炎3例,肝静脉闭塞病4例.②移植后发生慢性移植物抗宿主病患者人类白细胞抗原B27表达水平明显低于无移植物抗宿主病患者[移植后180 d:(30.13±10.24)%,(39.61±10.89)%;移植后峰值:(33.53±10.36)%,(45.76±12.09)%,P＜0.05].③移植前未缓解白血病患者人类白细胞抗原B27表达水平则明显高于移植前达到完全缓解患者[(27.39±10.31)%,(16.62±8.58)%,P=0.005],移植后疾病复发患者复发时人类白细胞抗原B27表达水平明显高于其移植后完全缓解时[(27.76±10.09)%,(15.69±6.98)%,P=0.015].移植前未缓解和移植后复发患者人类白细胞抗原B27表达水平与肿瘤细胞占骨髓非红系细胞的百分比呈正相关关系(r=0.756,P=0.000).结论:移植前未缓解和移植后复发白血病患者人类白细胞抗原B27表达与肿瘤细胞占骨髓非红系细胞的百分比呈正相关,人类白细胞抗原B27表达水平随着肿瘤细胞百分比的增高而升高.
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骨髓基质细胞移植脊髓损伤大鼠后肢运动功能恢复的评估
目的:探讨骨髓基质细胞移植对脊髓损伤大鼠后肢运动功能恢复的作用.方法:实验于2004-03/12在中国医科大学盛京医院动物实验室完成.①选取清洁级2～4月龄Wistar大鼠95只,5只大鼠用于骨髓基质细胞的培养,剩余90只随机数字表法分为3组:正常对照组、模型对照组、细胞移植组,30只/组.②模型对照组、细胞移植组大鼠麻醉后,以T8棘突为中心取背部后正中切口长约5 cm,显露T7-11棘突及椎板,咬除T9棘突及全椎板,在左侧建立脊髓半横断模型.③细胞移植组在造模后10 min内将制备的骨髓基质细胞悬液多点缓慢注入到脊髓半切头侧和尾侧损伤临近区域的灰白质交界处(距脊髓表面约0.7mm),3μL/点,总细胞数6×105个.模型对照组同法注射等量磷酸盐缓冲液.正常对照组不造模,于T9脊髓左半侧相同部位注射等量磷酸盐缓冲液.④各组大鼠分别于术后1 d,1,2,3,4周进行后肢运动功能评分检测,评分标准分为0～6级,分数越低表示后肢运动功能恢复越差.⑤后肢运动功能测定30 min后,进行斜板实验,检测大鼠抓握、维持姿势能力.将大鼠身体轴线与斜板纵轴垂直放置,斜板每次升高5°,以大鼠能够在斜板上维持5 s不滑下的大角度为其功能值.结果:实验选用90只大鼠,正常对照组无脱落,造模后模型对照组死亡7只,细胞移植组死亡3只.①后肢运动功能检测结果:术后1 d,1,2,3,4周,模型对照组后肢运动功能评分随时间的延长而逐渐升高,但各时间点仍明显低于正常对照组(t=2.921～35.556,P＜0.05);与模型对照组比较,术后2,3,4周细胞移植组后肢运动功能评分均明显升高[(1.84±0.32),(3.43+0.58)分;(2.43±0.62),(4.23±0.78)分;(2.83±0.69),(4.58±0.76)分;t=2.953～4.157,P＜0.05].②斜板试验检测结果:术后1 d,1,2,3,4周,模型对照组斜板倾斜度数随时间的延长而逐渐增大,但各时间点仍明显低于正常对照组(t=3.284～8.381,P＜0.05);与模型对照组比较,术后1,2,3,4周细胞移植组斜板倾斜度数均明显增大(t=3.275～5.260,P＜0.05).结论:骨髓基质细胞移植可促进脊髓损伤大鼠后肢运动功能的恢复.
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经皮冠状动脉自体骨髓单个核细胞移植对重症心力衰竭患者心功能的影响
目的:观察自体骨髓单个核细胞经皮冠状动脉移植治疗重症心力衰竭的效果,探讨其可行性、安全性和有效性.方法:选取2006-02/08承德北方医院收治的20例重症心力衰竭患者,男14例,女6例,平均年龄(54±13)岁,由家属签署手术同意书.①患者俯卧位局麻,双测髂后上嵴行多点穿刺,抽取骨髓血60～260 mL,要求在60 min内完成.将采集的骨髓血进行骨髓细胞分离、洗涤,用生理盐水稀释单个核细胞悬液至20～30 mL.②用PTCA球囊以先后顺序放置在左前降支中段或右冠状动脉中段,以4～6个大气压扩张球囊临时阻断远端血流,从球囊导管尾端注入分离净化的骨髓单个核细胞,左冠状动脉注射总量2/3,右冠状动脉注射总量1/3.③分别于术后1,3个月进行随访,检测NYHA心功能分级与射血分数,以6 min标准步行实验评估运动能力.结果:实验选取20例重症心力衰竭患者,3例于术前发生猝死而退出试验,终17例成功进行自体骨髓细胞移植,均完成术后3个月随访.①自体骨髓单个核细胞移植过程中的不良反应:17例患者中,严重心律失常1例,急性左心室衰竭1例,心绞痛2例,头痛1例,术中呕吐2例,术后低热1例,穿刺点血肿1例.②自体骨髓单个核细胞移植后不同时间NYHA心功能分级的变化:与术前比较,自体骨髓单个核细胞移植术后1,3个月NYHA心功能分级均明显提高(t=9.294～10.102,P均＜0.01).③自体骨髓单个核细胞移植后不同时间心功能指标与运动能力的变化:与术前比较,自体骨髓单个核细胞移植术后1,3个月NYHA心功能分级、左心室射血分数、左心室舒张末期直径、6 min行走距离均得到明显改善(t=3.034～5.064,P＜0.05).④NYHA心功能改善程度与其他心功能参数的相关性:细胞移植后3个月,NYHA心功能分级改善程度与左心室射血分数、左心室舒张末期直径呈明显正相关(r=0.461～0.494,P均＜0.05).结论:经皮冠状动脉移植自体骨髓单个核细胞,可明显改善重症心力衰竭患者心功能及运动能力,安全可行.
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骨髓间充质干细胞移植对急性心肌梗死大鼠血管内皮功能的影响
目的:观察骨髓间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死对血管内皮功能的影响.方法:实验于2005-09/2006-06在唐山工人医院中心实验室完成.①选用清洁级健康近交系SD大鼠40只,随机数字表法分为假手术组、模型对照组、干细胞移植组、细胞培养基组,10只/组.另取1只大鼠用于骨髓间充质干细胞的提取.②大鼠处死后无菌条件下分离股骨和胫骨,剔除肌肉、骨膜,剪一侧骨端,用10 mL无血清DMEM低糖培养基冲出骨髓细胞后,收集冲洗液制成单细胞悬液,过滤离心,弃上清液,密度梯度法分离培养骨髓间充质干细胞.待细胞80%贴满培养瓶底时,用乙二胺四乙酸和胰蛋白酶混合消化传代.将4,6-二脒-2-苯基吲哚以50 mg/L浓度加入第3代细胞培养基中,制成细胞悬液备用.③术前各组大鼠均行气管插管,建立急性心肌梗死模型,以远端供血区心肌组织颜色苍白、心电图检测Ⅱ导联ST段持续抬高为模型建立成功的标志.假手术组仅开胸予以前降支穿线但不结扎.④造模成功后1～3 h,干细胞移植组用微量注射器吸取4,6-二脒-2-苯基吲哚标记好的第3代骨髓间充质干细胞悬液50 μL,直接注入梗死区边缘的心肌组织.细胞培养基组按干细胞移植组的方法于相同部位注射等量无血清DMEM低糖培养基(pH值6.9).⑤造模后4周处死各组大鼠,切取心脏组织,于梗死边缘区心肌组织制作切片,荧光显微镜下观察4,6-二脒-2-苯基吲哚标记的供体细胞.留取2 mL全血,离心后抽取血清500μL,酶联免疫吸附法测定血清中细胞间黏附分子1与血管内皮细胞黏附分子1的含量.结果:40只大鼠均进入结果分析.①体外培养骨髓间充质干细胞的性状观察:从正常大鼠骨髓中分离培养的原代骨髓间充质干细胞,24～48 h贴壁生长,短棒状;7～10 d达到80%～90%融合;传至第3代骨髓间充质干细胞分布均匀,呈纺锤形.②各组心脏标本4,6-二脒-2-苯基吲哚标记移植细胞的存活状况:干细胞移植组可见成团及散在的4,6-二脒-2-苯基吲哚标记的阳性细胞,其余3组心脏标本中均未见荧光细胞.③各组大鼠血清中细胞间黏附分子1与血管内皮细胞黏附分子1的含量检测:与假手术组比较,模型对照组、细胞培养基组、干细胞移植组细胞间黏附分子1与血管内皮细胞黏附分子1的含量均明显升高(P＜0.01或0.05);与模型对照组比较,干细胞移植组细胞间黏附分子1与血管内皮细胞黏附分子1的含量均有所降低[(3.37±0.14),(2.10±0.15)μg/L;(2.64±0.13),(1.74±0.06)μg/L;P均＜0.05].结论:骨髓间充质干细胞移植到实验性大鼠心肌梗死模型后成功存活,能降低血清中增高的细胞间黏附分子1与血管内皮细胞黏附分子1含量,提示骨髓间充质干细胞移植可能通过降低黏附分子的表达来改善血管内皮功能.
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缺血性脑损伤诱导内源性神经干细胞的增殖和迁移
目的:观察缺血性脑损伤对内源性神经干细胞增殖、迁移的影响.方法:实验于2004-09/2005-03在新乡医学院人体解剖与组织胚胎重点实验室进行.10～12周体质量300～350 g的健康雄性SD大鼠62只,由新乡医学院实验动物中心提供.按随机数字表方法将其分为正常组6只、假手术对照组14只、脑缺血再灌注组42只(分为再灌注1,3,5,7,10,15,20 d 7个时间点,每时间点6只).参照Pulsinelli-Brieriey法,夹闭大鼠双侧颈总动脉制作短暂性全脑缺血动物模型,全脑缺血10 min后再灌注,假手术对照组不夹闭颈总动脉.于脑缺血再灌注不同时间点应用SABC免疫组化法染色显示5-溴-2-脱氧尿嘧啶阳性细胞和巢蛋白阳性细胞,光镜下观察并分析脑缺血损伤后内源性神经干细胞增殖、迁移的变化过程.结果:正常组、假手术对照组大鼠均存活,脑缺血再灌注组大鼠1 d、5 d、15 d、20 d各死亡1只,共58只大鼠进入结果分析.①正常组与假手术对照组室管膜下区、海马CA1区、齿状回区域均偶见5-溴-2-脱氧尿嘧啶阳性细胞和巢蛋白阳性细胞.②脑缺血再灌注后1 d于海马、齿状回和室管膜下区均有5-溴-2-脱氧尿嘧啶阳性细胞和巢蛋白阳性细胞,随后逐渐增加,7～10 d达高峰,术后20 d仍有表达;在室管膜下区的5-溴-2-脱氧尿嘧啶阳性细胞和巢蛋白阳性细胞有向皮质、海马迁移的现象.结论:成年大鼠全脑缺血后7～10 d内源性神经干细胞增殖达到高峰;增殖的内源性神经干细胞存在由增殖区向靶区迁移的现象.
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自体骨髓干细胞移植治疗缺血性心肌病心力衰竭患者近期心功能变化:6个月21例随访
背景:有动物实验表明移植心肌梗死区的骨髓干细胞可以定向分化为具有正常生理功能的心肌细胞并可促进新生血管形成,达到修复梗死心肌,改善受损的心脏功能.目的:观察自体骨髓干细胞移植对缺血性心肌病心力衰竭患者近期心功能的影响.设计:自身前后对照.单位:湘潭市中心医院心内科.对象:选择2004-03/2006-01在湘潭市中心医院心内科收治的21例缺血性心肌病患者,男13例,女8例,平均(64±6)岁,纳入标准:既往至少患过1次心肌梗死,心脏B超提示心腔扩大,支架置入前存在明显的心功能不全或心绞痛且反复住院,均已成功完成经皮腔冠状动脉介入治疗且梗死血管血流恢复至TIMl3级达3月以上,尚存在不同程度心功能不全.冠状动脉造影显示冠脉内支架均无狭窄.患者均对手术项目知情同意.方法:患者入院后在常规药物治疗的基础上予骨髓干细胞移植,经皮腔导管技术建立梗死相关动脉通道,利用球囊封闭梗死相关动脉通道,并将分离的骨髓干细胞悬液经导管中心腔注入梗死相关动脉通道.①分别于移植前和移植后6月测量左室射血分数、左室舒张末内径.②移植前及移植后6月在未服抗心律失常药物的前提下,分别行24 h动态心电图评估.③对患者移植前及移植6月后临床心功能分级评定,采用NYHA分级方法,Ⅰ～Ⅳ级:级数越高,症状越严重.④观察术后不良事件和副反应.主要观察指标:①移植前和移植后6月测左室射血分数、左室舒张末内径.②24 h动态心电图评估结果.③临床心功能分级评定结果.④术后不良事件和副反应.结果:纳入21例患者全部进入结果分析.①骨髓干细胞移植6个月后患者左室射血分数大于移植前[(54.4±6.2)%,(44.6±6.4)%,t=-5.946,P＜0.01],左室舒张末内径小于移植前[(54.6±4.2),(60.2±4.4)mm,t=5.306,P＜0.01].②患者未出现新的心律失常类型,亦无恶性心律失常增多.③骨髓干细胞移植6月后,心功能Ⅲ、Ⅳ级患者共9例,而移植前为18例.④移植术中、术后均安全,无因胸痛复查冠脉造影显示支架内狭窄患者,未出现死亡病例.结论:经皮腔冠状动脉内移植骨髓干细胞治疗缺血性心肌病可行,术后能提高左室射血分数,心功能改善.
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自体骨髓干细胞移植配合针灸治疗糖尿病周围神经病变患者24例双下肢神经电生理的变化
目的:观察2型糖尿病并发周围神经病变患者自体骨髓干细胞移植配合针灸治疗后,双下肢胫神经与腓总神经的电生理变化.方法:①选取河北医科大学唐山临床医学院2005-01/2006-12收治住院的确诊为糖尿病足或糖尿病下肢动脉闭塞症同时并发糖尿病周围神经病变的24例患者,男16例,女8例,平均年龄(56.8±6.1)岁,平均病程(12.6±3.6)年,均无严重的心、肾、肝、肺病变,对本实验知情同意.随机数字表法分为干细胞组、针灸组、干细胞+针灸组,8例/组.②局麻下由双侧髂后上棘采集每位患者的骨髓血200～300 mL,应用密度梯度离心分离骨髓血中单个核细胞,镜下计数单个核细胞总数约为1.1×1012 L-1,用生理盐水稀释成30 mL干细胞悬液.③干细胞组给予单纯自体骨髓干细胞移植治疗,在硬膜外麻醉下将干细胞混悬液沿闭塞血管两侧多点肌肉注射到患者下肢,进针深度约1.4 cm,相邻两点间的距离及与闭塞血管间距离均为1.5 cm,每点注射0.8～1.0 mL,注射时避开血管与神经.针灸组给予单纯针灸治疗,用普通手法针刺足三里、环跳、阳陵泉、三阴交.针刺15 min/次,1次/d,持续治疗30 d.干细胞+针灸组行自体骨髓干细胞移植配合针灸治疗,过程同上.④使用肌电图仪检测治疗前及治疗后3个月各组患者双下肢胫神经与腓总神经的感觉神经传导速度、运动神经传导速度.结果:24例2型糖尿病并发周围神经病变患者均进入结果分析.①各组患者治疗后一般状况:干细胞+针灸组治疗24 h,足趾疼痛感和麻木感明显减轻;1个月后疼痛消失,足趾可轻微活动;3个月后足趾活动力量可达3级,除2例患者有跛行外,其余6例患者均可正常行走.干细胞组、针灸组患者预后情况较干细胞+针灸组差.②各组治疗前后双下肢神经传导速度的变化:与治疗前比较,各组患者胫神经、腓总神经的运动神经传导速度均显著增加(P＜0.05或P＜0.01);干细胞组、干细胞+针灸组胫神经的感觉神经传导速度均显著增加[(16.9±4.5),(25.2±5.5);(17.1±4.9),(29.4±8.5)m/s;P均＜0.01],腓总神经的感觉神经传导速度亦均显著增加[(16.5±5.9),(30.3±5.2);(17.8±5.2),(31.7±7.2)m/s;P均＜0.01];针灸组感觉神经传导速度变化不明显(P＞0.05).组间比较,各组改善运动神经传导速度的效果差异无显著性意义(P＞0.05);与干细胞组改善胫神经、腓总神经的感觉神经传导速度比较,针灸组治疗效果较差[(25.2±5.5),(20.1±4.9);(30.3±5.2),(20.3±5.4)m/s;P均＜0.05],而干细胞+针灸组改善效果显著[(25.2±5.5),(29.4±8.5);(30.3±5.2),(31.7±7.2)m/s;P均＜0.01].结论:自体骨髓干细胞移植配合针灸治疗可显著改善糖尿病并发周围神经病变的电生理指标.
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体外纯化后和诱导后骨髓间充质干细胞与骨髓单个核细胞移植治疗心肌梗死的效果比较
目的:将骨髓单个核细胞、体外培养纯化后及诱导后的骨髓间充质干细胞注射至大鼠心肌梗死区域,观察移植细胞的增殖及分化情况,分析其对缺血心肌细胞修复重建能力与心功能改善的影响.方法:实验于2005-07/2006-04在安徽省干细胞研究和治疗中心完成.取清洁级健康雄性新西兰白兔40只,按随机数字表法分为4组:骨髓间充质干细胞组、5-杂氮胞苷诱导组、骨髓单个核细胞组、对照组,10只/组.均于左心耳下缘结扎冠状动脉左前降支建立心肌梗死模型,心电图出现S-T段弓背样抬高认为结扎成功.2周后骨髓间充质干细胞组注射第3代自体骨髓间充质干细胞1×106个,5-杂氮胞苷诱导组注射经5-杂氮胞苷诱导24 h的第3代自体骨髓间充质干细胞1×106个,骨髓单个核细胞组注射骨髓单个核细胞2.5×107个/400μL,对照组仅注射400μL L-DMEM培养基.分别在术前、移植前、移植后2,4周应用超声心动图评价心脏功能,同时利用心肌声学造影观察缺血区的血流灌注情况.细胞移植后8周采用免疫荧光检测移植细胞在梗死区的生长状况,苏木精-伊红染色于普通显微镜下记数梗死区毛细血管密度.结果:骨髓间充质干细胞组9只、5-杂氮胞苷诱导组9只、骨髓单个核细胞组10只、对照组6只进入结果分析,其余动物因造模死亡未能完成整个实验.①超声心动检查发现术前、细胞移植前4组左室射血分数、左室短轴短缩率组间比较差异不显著;与对照组相比,细胞移植后2,4周骨髓间充质干细胞组和5-杂氮胞苷诱导组左室射血分数、左室短轴短缩率明显升高[对照组:(60.4±5.1)%,(62.4±7.8)%;(28.8±1.4)%,(27.2±5.3)%;骨髓间充质干细胞组:(70.8±4.6)%,(70.4±6.1)%;(33.8±3.4)%,(33.9±3.5)%;5-杂氮胞苷诱导组:(71.7±6.8)%,(70.3±5.8)%;(34.7±5.7)%,(35.5±6.3)%,P＜0.05];左室收缩末内径、左室舒张末内径细胞移植组与对照组相比,差异不显著;心肌声学造影见细胞移植后心肌梗死区血流灌注改善明显.②细胞移植术后8周,所有细胞移植组均见Dil阳性移植细胞存活,并表达α横纹肌肌动蛋白和结蛋白.5-杂氮胞苷诱导组Dil阳性细胞出现具有典型横纹和肌小节样结构的心肌样细胞,各细胞移植组毛细血管密度均较对照组明显增多[(38.6±7.6)/mm2,(32.9±5.7)/mm2,(38.5±2.0)/mm2,(21.4±3.9)/mm2,P＜0.05],各移植组间差异不显著.结论:①体外纯化培养与经5-杂氮胞苷诱导24 h的骨髓间充质干细胞,以及新鲜分离的骨髓单个核细胞自体移植8周后均存活于梗死心肌中,并表达心肌细胞特异性标志α横纹肌肌动蛋白和结蛋白,移植后可明显改善左室收缩功能,增加毛细血管密度,改善局部血流灌注.②5-杂氮胞苷有助于促进骨髓间充质干细胞在体内向心肌细胞的分化成熟.
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控释胶质细胞源性神经营养因子对骨髓间质干细胞源性神经元样细胞移植修复猴脊髓轴突的协同作用
目的:采用甘氨酸银浸镀法评价控释胶质细胞源性神经营养因子与骨髓间质干细胞源性神经元样细胞联合移植后,其对猕猴脊髓损伤后轴突的修复效果是否优于单纯神经元样细胞移植.方法:实验于2006-03/08在北京市垂杨柳医院病理科完成.①选择2004-01/2005-01中山大学邓宇斌教授课题组研究的猴脊髓石蜡标本12例作为回顾性实验分析对象,其中控释神经营养因子+神经元样细胞联合移植组4例、单纯神经元样细胞移植组4例、磷酸盐缓冲液对照组4例.课题前期实验各组动物均建立急性重度脊髓损伤模型,并于造模后第10天给予对应细胞悬液.②各组每例石蜡标本均制备连续切片3张,片厚0.4μm,对所有切片进行一次性甘氨酸银浸镀法染色.具体步骤:切片脱蜡入水,酸性甲醛液处理10 min,蒸馏水清洗后,置于甘氨酸银溶液中,37℃作用5 min.取出切片,用滤纸吸干多余银液,入预热45℃的还原液作用1 min.用乙醇洗切片10 min,再行蒸馏水冲洗,入氯化金水溶液5 min,直到棕黄色脱去.滴入苯胺油乙醇液加强染色,冲洗.50 g/L硫代硫酸钠液处理30 s,冲洗,梯度乙醇脱水,然后在石碳酸二甲苯中浸泡2 min,二甲苯透明,中性树胶封固.③应用图像分析系统进行检测,观察各组皮质脊髓束纵切面病理改变,统计每个视野内上行性(后索)与下行性(皮质脊髓束)横切面轴突的数量及横、纵切面面积,取切片两侧各5个非重叠视野,计算平均吸光度值.结果:①各组脊髓损伤处轴突病理改变:控释神经营养因子+神经元样细胞联合移植组皮质脊髓束纵切面部分区域存在较多连续性的轴突;磷酸盐缓冲液对照组脊髓结构破坏严重,轴突大面积消失,纵切面可见崩解的轴突碎片,几乎观察不到连续性轴突;单纯神经元样细胞移植组的变化介于两者之间.②后索与皮质脊髓束的横切面轴突数量、横切面面积、纵切面面积、平均吸光度:控释神经营养因子+神经元样细胞联合移植组、单纯神经元样细胞移植组后索与皮质脊髓束各项检测指标均高于磷酸盐缓冲液对照组,3组间比较差异有显著性意义(F=38.45～487.54,P均＜0.01;F=52.66～313.99,P均＜0.01).控释神经营养因子+神经元样细胞联合移植组与单纯神经元样细胞移植组比较,前者对后索轴突的修复作用略优于后者,表现在纵切面面积显著升高(P＜0.01);对皮质脊髓束的修复作用明显强于后者,轴突数量、横切面面积、纵切面面积、平均吸光度值差异均有显著性意义(P＜0.01或P＜0.05).结论:控释胶质细胞源性神经营养因子可以增强骨髓间质干细胞源性神经元样细胞对猕猴损伤脊髓轴突的修复作用,尤其有利于运动性损伤轴突的修复,其效果优于单纯神经元样细胞移植.
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血管内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子体外联合诱导外周血单个核细胞定向分化为血管内皮细胞
目的:在体外培养的条件下,应用血管内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子联合诱导人外周血单个核细胞向血管内皮细胞分化,解决组织工程血管化的种子细胞来源问题.方法:实验于2005-11/2006-05在安徽省立医院中心实验室完成.①血管内皮细胞生长因子(Pepro Tech公司,批号090310);碱性成纤维细胞生长因子(Pepro Tech公司,批号0704CY081);人淋巴细胞分离液Ficoll-paque(天津灏洋生物制品科技有限公司);PE标记的CD31,鼠抗人vWF单克隆抗体(BD Biosciences公司);FITC标记的兔抗鼠IgG(北京中杉金桥公司).②无菌条件下取健康人外周血20 mL,肝素抗凝,Hanks液双倍稀释,按1∶2置于淋巴细胞分离液上层,离心后提取分液层与上层交界部位呈混浊的灰白色层,即为单个核细胞层.③取离心后的细胞,向DMEM-F12培养基中分别加入含体积分数为0.2的胎牛血清、10μg/L血管内皮细胞生长因子、10μg/L碱性成纤维细胞生长因子.以不含血管内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子诱导剂的DMEM-F12培养基作为空白对照.吹打均匀并计数,按1×1010 L-1接种于25 cm2培养瓶中,于37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养箱中培养,第3天更换培养基,去除未贴壁的细胞,以后每2 d换液1次.④倒置相差显微镜下观察细胞单层排列是否呈"铺路石"样结构.运用流式细胞术检测诱导后的细胞表达CD31和vWF情况.透射电镜观察细胞的超微结构.结果:①诱导分化后细胞形态学变化:经血管内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子诱导后的细胞形态上呈典型的"铺路石"样外观,经历从小圆→梭形→扁平细胞的过程,符合内皮细胞的演变过程.②诱导分化后细胞的表面标志鉴定:诱导分化20 d,贴壁细胞中62.5%表达CD31,58.2%表达vWF,54.3%表达CD31/vWF.③培养细胞的超微结构观察:透射电镜下细胞胞浆内可见特征性W-P小体.结论:外周血单个核细胞在血管内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子体外联合诱导下,可分化为血管内皮细胞.
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外源性绿色荧光蛋白和蛋白酪氨酸激酶受体B基因在大鼠骨髓源性神经干细胞内稳定表达的检测特征
目的:利用本实验室构建的携带蛋白酪氨酸激酶受体B基因的荧光真核表达质粒-pEGFP-C2-蛋白酩氨酸激酶受体B,转染大鼠骨髓基质细胞源性的神经干细胞,观察其在神经干细胞中的表达情况.方法:实验于2005-06/2006-06在南方医科大学珠江医院神经医学研究所完成.实验选用SD大鼠进行骨髓的采集及骨髓基质细胞的获取,培养1周后得到较纯化的骨髓基质细胞,进行细胞传代培养,传代培养的细胞加入10%胎牛血清及维甲酸以诱导骨髓基质细胞向神经干细胞分化.细胞培养2周后,pEGFP-C2-蛋白酪氨酸激酶受体B经LIPOEECTAMINE.2000脂质体转染培养的大鼠骨髓基质细胞源性的神经干细胞,24 h后观察绿色荧光蛋白的瞬时表达情况,以酶切和测序鉴定质粒的正确性,凝胶电泳鉴定PCR产物大小,应用免疫组化定量分析法检测转染该质粒的细胞中蛋白酪氨酸激酶受体B的含量,并与正常细胞作比较.结果:①细胞转染24 h后,荧光显微镜下可观察到绿色荧光蛋白的表达,表达率约18.1%,随着培养时间的延长,表达绿色荧光蛋白的细胞数量逐渐增多,于1周左右达到高峰,表达率约42.8%,继续观察1个月未发现荧光表达减弱.②酶切、PCR和DNA序列鉴定均证实插入片段的正确性,扩增的PCR产物凝胶电泳结果与设计引物间的片段大小1 461 bp完全一致,转染细胞电泳未见目的条带.③免疫组化结果表明,所有细胞均含有蛋白酪氨酸激酶受体B抗原成分,转染pEGFP-C2-蛋白酪氨酸激酶受体B的细胞该抗原成分较未转染细胞明显增加(19.76±3.98,32.17±6.29,P＜0.05).结论:LIPOEECTAMlNE.2000是一种简单而高效的转染大鼠骨髓基质细胞源性神经干细胞的方法,转染的pEGFP-C2-蛋白酪氨酸激酶受体B基因在细胞内可以稳定表达,增强型绿色荧光蛋白可以作为该基因表达的标记.
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同种异体胚胎神经干细胞移植修复脊髓损伤的时效性观察
目的:观察同种异体胚胎神经干细胞移植对脊髓损伤大鼠双后肢运动功能的修复作用,并分析其移植时效性.方法:实验于2003-07/08在大连医科大学分子生物学实验室和大连理工大学环境与生命学院生物医学实验室完成.①取孕14～16 d的大白鼠1只,引颈处死,剖腹,取出胎鼠,钳取大脑皮质及皮质下脑室旁的脑组织,体外培养大鼠胚胎神经干细胞.②将30只成年SD大鼠按随机数字表法分为3组,即损伤对照组、早期移植组和延期移植组,每组10只.3组大鼠均制作脊髓横断损伤模型,造成大鼠下肢瘫痪,早期移植组、延期移植组大鼠分别在伤后3 d及3周移植胎鼠脑组织神经干细胞.观察移植后大鼠双后肢的运动功能恢复情况,通过胶质原纤维酸性蛋白及神经元特异性烯醇化酶免疫组化染色法观察各组大鼠的脊髓组织形态学变化,胶质原纤维酸性蛋白是星形胶质细胞特异性标志蛋白,神经元特异性烯醇化酶是神经元特异性蛋白.结果:脊髓损伤建模实验纳入大鼠30只,全部进入结果分析,无脱失.①各组大鼠神经干细胞移植后双后肢的功能恢复情况:早期移植组和延期移植组大鼠双后肢的运动功能均有明显改善,但早期移植组表现尤为显著.早期移植组和延期移植组细胞移植后五六天即可见瘫痪大鼠的后肢肌力开始恢复,二三周后可出现爬行,4周后后肢活动活跃;损伤对照组大鼠的瘫痪肢体无任何恢复.②移植4周后早期移植组大鼠移植区脊髓组织的形态学变化:脊髓移植区肉眼可见有增生的组织充填,镜下有大量新生的细胞,表现为神经元和神经胶质细胞阳性染色(胶质原纤维酸性蛋白(+),神经元特异性烯醇化酶(+)).结论:神经干细胞移植对脊髓横断大鼠运动功能恢复有促进作用,早期移植疗效更好.
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骨髓间充质干细胞不同移植方法对急性心肌梗死心功能的改善作用比较
目的:观察不同方法移植骨髓间充质干细胞对心功能的影响,分析移植方法与心功能改善的关系.方法:实验于2004-02/2005-10在郑州大学医学院干细胞中心和机能中心完成.体外获取、培养大鼠骨髓间充质干细胞.结扎左冠状动脉前降支制备大鼠急性心肌梗死模型,结扎后观察前壁心肌颜色变苍白、收缩力减弱、心电图相应导联ST段弓背向上抬高,确定心肌梗死模型建立.将建模成功的大鼠分成4组,每组10只,2周后进行细胞移植.静脉对照组:尾静脉注射L-DMEM0.6 mL;静脉移植组:尾静脉注射5溴脱氧尿嘧啶标记骨髓间充质干细胞悬液0.6 mL;心外膜对照组:在大鼠心肌梗死区分8点注射L-DMEM 0.6 mL;心外膜移植组:在大鼠心肌梗死区分8点注射5溴脱氧尿嘧啶标记的骨髓间充质干细胞悬液0.6 mL.移植4周后检测大鼠左室射血分数、短轴缩短率、血流动力学指标评价心功能,采用免疫组织化学检测大鼠心肌组织中骨髓间充质干细胞对心肌肌钙蛋白T的表达.结果:40只大鼠均进入结果分析.①与移植前比较,静脉对照组与心外膜对照组心脏功能逐渐恶化,左室射血分数及短轴缩短率降低.静脉移植组与心外膜移植组左室射血分数及短轴缩短率均较移植前升高,并且心外膜移植组高于静脉移植组[移植前:左室射血分数:(27.09±2.46)%,(26.62±2.31)%,短轴缩短率:(24.09±3.13)%,(24.52±3.01)%;移植后:左室射血分数:(35.12±2.68)%,(46.31±3.15)%,短轴缩短率:(28.32±3.68)%,(32.38±2.35)%,P＜0.05].与静脉移植组相比,心外膜移植组左心室收缩压、左室压力变化大上升速率、左室压力变化大下降速率升高、左室舒张末期压降低[静脉移植组:(105.27±5.56)mm Hg,(18.02±3.63)mm Hg,(4595±389)mm Hg/s,(3768±525)mm Hg/s;心外膜移植组:(123.89±9.64)mm Hg,(13.79±3.92)mm Hg,(4988±513)mm Hg/s,(4193±563)mm Hg/s,P＜0.05].②心外膜移植组和静脉移植组梗死心肌内均可见5溴脱氧尿嘧啶阳性移植细胞,对心肌肌钙蛋白T呈阳性表达.结论:心外膜移植细胞和静脉移植细胞对急性心肌梗死心功能均有改善作用,并且心外膜途径移植对急性心肌梗死心功能改善程度强于静脉移植途径.
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人胚胎脑皮质神经干细胞的体外分离及扩增特征
目的:观察从10～12周胎龄人流产胚胎脑皮质分离、培养的神经干细胞的生长特性.方法:实验于2005-02/12在新桥医院神经外科实验室完成.实验对象为孕10～12周流产的人胚胎脑皮质细胞,细胞的获取严格遵守医学伦理道德并得到医院许可.取胎龄10～12周的流产胚胎皮质,吸管反复吹打机械分离制成单细胞悬液,使用DMEM/F12(1∶1)加B27的无血清培养基培养,同时加入碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子(均为20 μg/L)以及白血病抑制因子(10 μg/L).连续传代培养,用有限稀释法观察神经干细胞的单细胞克隆情况.将部分经单细胞克隆扩增的细胞克隆种植于预先置有多聚赖氨酸涂布盖玻片的24孔培养板内,并加入新鲜培养基(体积分数为0.05的胎牛血清+DMEM/F12),采用免疫荧光细胞化学技术检测Nestin抗原和分化后特异性成熟神经细胞抗原的表达情况.结果:①从人胚胎脑皮质分离得到的纯化的单个细胞可以增殖形成细胞克隆,即使在培养基中使用各种细胞因子而不使用胎牛血清,部分细胞团块也会贴壁.②经单细胞克隆方式扩增而来的细胞克隆在胎牛血清诱导分化及多聚赖氨酸辅助贴壁作用数小时后观察细胞已贴壁.③从皮质分离的细胞群保持着未分化状态,能够自我更新以及具有多向分化潜能,其生长需多种细胞因子的联合刺激.结论:从10～12周胎龄人流产胚胎脑皮质分离的中枢神经系统的细胞具有自我更新能力和多向分化潜能,证实是神经干细胞.不论刺激因子及血清的有无,神经干细胞一旦贴壁就会启动其分化程序,而不再保持其干细胞特征,因此悬浮生长状态是神经干细胞体外培养生长的一种特性.
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骨髓间充质干细胞移植后大鼠脊髓损伤处多唾液酸神经细胞黏附分子的表达
目的:观察骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤对多唾液酸神经细胞黏附分子表达的影响及意义.方法:实验于2004-06/2005-06在中国医科大学实验动物中心完成.随机选择4只大鼠作骨髓间充质细胞的分离与培养,骨髓间充质干细胞传4代后大约长至60%汇合时,吸弃培养基,加入5溴脱氧尿嘧啶标记培养基.36只大鼠分成3组制作脊髓横断损伤模型:骨髓间充质干细胞移植组、磷酸盐缓冲液组、空白对照组,每组12只.制作大鼠脊髓损伤模型,于伤后立即移植骨髓间充质干细胞.应用免疫组化法观察细胞移植后7,14,28 d不同时间点移植细胞的存活情况,苏木精-伊红染色及常规链酶亲和素-生物素-过氧化酶复合物免疫组化法检测5溴脱氧尿嘧啶和多唾液酸神经细胞黏附分子的阳性细胞表达.结果:40只大鼠中36只制作脊髓横断损伤模型,6只因感染死亡,给予补足.①骨髓间充质干细胞移植组5溴脱氧尿嘧啶阳性细胞在移植后第7天可检测到,呈棕黄色的核标记,临近损伤区阳性细胞增多,在向头尾端迁移过程中阳性细胞逐渐减少,切片中可见远迁移至距离损伤区1.5 cm.磷酸盐缓冲液组及空白对照组均未见阳性细胞.②骨髓间充质干细胞移植组在移植术后第7天可于近端检测到多唾液酸神经细胞黏附分子阳性表达的细胞;磷酸盐缓冲液组可见少量阳性细胞;空白对照组未见阳性细胞.棕色颗粒定位于神经元的胞质和胞膜.移植术后第14天,骨髓间充质干细胞移植组脊髓切片的阳性神经细胞数开始增多,与磷酸盐缓冲液组比较,差异显著(16.0±2.6,6.0±2.3,P＜0.05).移植术后第28天,骨髓间充质干细胞移植组脊髓切片的阳性神经细胞逐渐减少.结论:骨髓间充质干细胞在移植后可明显促进多唾液酸神经细胞黏附分子的表达,是修复脊髓损伤并参与突触重建的重要机制.
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骨髓间充质干细胞移植治疗脑梗死的作用及近况
目的:文章就骨髓间充质干细胞治疗脑梗死的应用研究进展及其治疗作用机制进行综述.资料来源:应用汁算机检索Medline 1999-01/2006-11骨髓间充质干细胞相关细胞修复的文献,检索词"mesenchymal stem cells,cerebral ischemia,stroke"并限定文献语言种类为English.资料选择:对资料进行初审,选择包含骨髓间充质干细胞治疗脑缺血的基础研究文章,排除重复研究、综述类文献.资料提炼:纳人35篇符合标准的文献,对骨髓间质干细胞在脑梗死中的应用及其修复机制进行归纳.资料综合:①骨髓间充质干细胞具有高度的自我复制能力和多向分化潜能,可分化成多种细胞.骨髓间充质干细胞移植是近年来医学领域的研究热点,被用于脑梗死动物模型的治疗.②骨髓间充质干细胞对脑梗死动物模型具有较好的治疗作用.③骨髓间充质干细胞能够激活内源性的修复机制.④骨髓间充质干细胞移植后能够分泌大量营养因子从而发挥其神经保护和营养支持作用.结论:骨髓间充质干细胞对脑梗死具有较好的治疗作用,主要通过其移植后分泌大量营养因子从而发挥对脑梗死的治疗作用.
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间充质干细胞基因转染的相关研究现状
目的:对间充质干细胞的基因转染进行介绍,以及对骨形态发生蛋白、转化生长因子、血管内皮细胞生长因子等转染间充质干细胞的相关研究进行综述.资料来源:应用计算机检索Pubmed 1999-01/2007-01间充质干细胞基因转染的文章,检索词"mesenchymal stem cells,genetransfer",文章语言限定为英语,同时检索中文CNKI全文数据库1999-01/2007-01间充质干细胞基因转染的文章,检索词"间充质干细胞,基因转染",文章语言限定为中文.资料选择:对资料进行初审,并查看每篇文章后的引文.纳入间充质干细胞基因转染的相关实验研究及综述文献,排除陈旧、重复文献.资料提炼:共收集到165篇相关文献,入选29篇.资料综合:间充质干细胞具有高可塑性、可移植性、易接受外源基因、可以传送基因、自身可以参与组织修复等特点,被泛应用于骨形态发生蛋白、转化生长因子、血管内皮细胞生长因子等的转染,成为基因治疗的理想靶细胞.但间充质干细胞转基因技术在基因工程中还面临一些问题,如完善转基因技术,以及使转染后的靶细胞具有更大的生物效应等.结论:随着研究的进一步深入,间充质干细胞介导的细胞和基因治疗将会逐步成熟,有望更好的用于临床治疗.
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干细胞移植治疗在心血管疾病中的应用
目的:干细胞是一群较原始的细胞,具有极强的自我更新及多向分化潜能,可以代替病损的心肌细胞,构建新的血管,使无力的心脏重获泵血功能.为此综述干细胞移植治疗在心血管疾病中应用的研究进展.资料来源:应用计算机检索PUBMED 2000-01/2005-12期间的相关文章,检索词为"stem cell transplantation,cardiovascular diseases",并限定文章语言种类为English.资料选择:对资料进行初审,并查看每篇文献后的引文.纳入标准:文章所述内容应与治疗心血管疾病的干细胞的分类、移植途径及其在基础与临床中应用的研究现状、存在问题及未来发展相关.排除标准:重复研究或Meta分析类文章.资料提炼:共收集到50篇相关文献,31篇文献符合纳入标准,排除的19篇文献为内容陈旧或重复.符合纳入标准的31篇文献中,19篇涉及应用于心血管系统的干细胞分类,1篇涉及干细胞的移植途径,8篇涉及干细胞在心血管疾病中的应用,3篇涉及存在问题与展望.资料综合:随着生活水平的不断提高及人口老龄化,心血管系统疾病已上升为现代社会主要的致死、致残原因.干细胞具有多向分化潜能,已成为细胞替代治疗的主要种子细胞,为心血管疾病的治疗开拓了重要的研究及应用领域.目前可应用于心血管系统的干细胞种类较多,如胚胎干细胞、脐带血干细胞、外周血干细胞、骨髓干细胞、骨骼肌卫星细胞、心肌干细胞、脂肪组织源性干细胞等.干细胞的移植途径常用的有心肌直接注射法、经冠状动脉注射法、经静脉注射法.干细胞通过促进血管新生和心肌再生、降低心肌细胞凋亡以及减少心肌胶原表达来治疗心血管疾病,从而改善心脏功能,但仍存在许多问题需要解决,离常规临床应用仍有相当的距离.结论:干细胞作为心血管疾病防治未来基础研究及临床应用的重要领域,解决干细胞移植治疗中的重点及难点问题将为更加有效的预防及治疗心血管疾病提供强有力的理论及实践支持.
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心肌梗死的干细胞治疗
目的:认识国内外在干细胞移植治疗心肌梗死方面的研究现状.资料来源:检索Medline数据库1998-01/2005-12有关干细胞移植治疗心肌梗死的文章,检索词为"stem cells,myocardial infarction,cell transplantation",限定语言种类为英语.资料选择:对资料进行初筛,选择与干细胞移植治疗心肌梗死相关的文章,去除重复性研究和综述类文章.资料提炼:共收集到相关文章106篇,终纳入30篇,去除76篇.资料综合:心肌梗死是由于冠状动脉闭塞导致心脏血流供应中断而形成的以心肌细胞坏死为特征的疾病.细胞心肌成形术是在干细胞研究的基础上应运而生的,通过干细胞移植促进心肌细胞再生,防止心室重构和改善心脏功能.目前国内外已尝试应用多种类型的干细胞移植治疗心肌梗死,包括骨骼肌卫星细胞、胚胎干细胞和骨髓干细胞等.虽然还有许多尚待解决的问题,但是动物实验乃至临床研究结果都展现了干细胞移植治疗心肌梗死的广阔前景.结论:干细胞移植为治疗心肌梗死提供了一种很有潜力的新手段,但要真正用于临床还需要解决一些应用中的关键问题.
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胚胎干细胞与Nanog基因
目的:胚胎干细胞可塑性强,但只能从胚胎中提取,来源受限使研究阻力加大.Nanog基因的发现为胚胎干细胞的来源提供了一条崭新的途径,文章综述胚胎干细胞与Nanog基因的关系及研究进展.资料来源:应用计算机检索PUBMED 2002-01/2006-11期间的相关文章,检索词为"embryonic stem cells,Nanog gene",并限定文章语言种类为English.同时计算机检索中国期刊全文数据库2002-01/2006-11期间的相关文章,检索词为"胚胎干细胞,Nanog基因",并限定文章语言种类为中文.资料选择:对资料进行初审,并查看每篇文献后的引文.纳入标准:文章所述内容应与胚胎干细胞和Nanog基因研究相关.排除标准:重复研究或Meta分析类文章.资料提炼:共收集到162篇相关文献,35篇文献符合纳入标准,排除的127篇文献为内容陈旧或重复.符合纳入标准的35篇文献中,分别涉及胚胎干细胞的转录调节、Nanog基因与胚胎干细胞、Nanog基因与p53、Nanog基因与人类等方面的内容.选择其中的30篇作为支持文献.资料综合:胚胎干细胞来源于着床前胚胎的一类未分化的全能性(多能性)干细胞,在一定条件下可以分化为所有功能细胞.一个独特的转录因子网络可能赋予其自我更新,同时抑制分化.通过细胞融合技术,胚胎干细胞能够使一个已分化的细胞重新编排信息而进入具有多潜能的胚胎阶段.调节这一改变的基因应该就在胚胎干细胞中,而Nanog基因可能就是这一候选基因,它具有使未分化的胚胎干细胞产生增殖的能力.Nanog mRNA出现在人和老鼠的多功能干细胞中,但在成人干细胞中却没有.结论:Nanog基因是胚胎干细胞中的多潜能维持因子.通过细胞融合技术,胚胎干细胞能够使一个已分化的细胞重新编排信息而进入具有多潜能的胚胎阶段.
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成体干细胞在中枢神经系统疾病修复中的效应
目的:干细胞具有增殖能力和多向分化潜能,其成神经细胞特性为脑缺血神经细胞的保护及修复带来希望.文章回顾成体干细胞在中枢神经系统疾病修复中的研究和进展.资料来源:应用计算机检索Medline1997-01/2006-01期间的相关文章,检索词为"stem cells,cerebral ischemia",并限定文章语言种类为English.同时计算机检索中国期刊全文数据库1997-01/2006-01期间的相关文章,检索词为"干细胞,脑缺血",并限定文章语言种类为中文.资料选择:对资料进行初审,并查看每篇文献后的引文.纳入标准:①文章所述内容应涉及干细胞与脑缺血方面的研究.②选取有对照组的文章.③同一领域的研究选择近期发表或在权威杂志发表的文章.排除标准:重复研究的文章.资料提炼:共收集到187篇相关文献,86篇文献符合纳入标准,排除的101篇文献为内容陈旧或重复.符合纳入标准的86篇文献,涉及干细胞的分类以及干细胞在脑缺血损伤中的应用基础、途径、可能的作用机制等方面内容,选取其中的41篇作为文章参考文献.资料综合:干细胞是具有自我更新和多向分化潜能的细胞群体,可发育为某一器官或组织的特性为其在中枢神经系统疾病的保护与修复中的研究及应用奠定了基础.成体干细胞是多种组织中保留有未完全分化的原始细胞,具有横向分化特性,可分化为神经细胞,替代脑缺血损伤后丢失的神经元和神经胶质细胞,重建具有功能的神经环路;且成体干细胞可为梗死灶周围缺血半暗带组织提供营养支持,以及能促进内源性前体细胞的存活、迁移和分化,被认为是脑缺血有希望的治疗.此外,成体干细胞可避免胚胎干细胞应用的伦理问题和免疫排斥障碍,是脑缺血损伤后神经保护和修复所需的理想干细胞供体.结论:干细胞的多向分化潜能为脑缺血损伤后的神经修复开辟了新的途径,其在脑缺血损伤后的神经细胞保护和修复以及功能重建的研究方面已取得相当进展,被认为具有广阔的应用前景,与之相关的问题均有待于进一步的研究.
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骨髓间充质干细胞作为基因运载细胞在基因治疗中的应用
目的:近年来许多研究表明骨髓间充质干细胞在基因治疗中可能作为基因运载细胞而发挥作用,本文就骨髓间充质干细胞作为基因运载细胞在基因治疗中的研究现状作一综述.资料来源:应用计算机检索Medline、Pubmed、Eldrvier、Ovid等数据库中1970-01/2005-12与骨髓间充质干细胞在基因治疗中研究进展相关的文章,检索词为"marrow mesenchymal stem cells,genetransfection,gene therapy",并限定文章语言种类为English.同时检索中文CNKI全文数据库2000-01/2006-06与骨髓间充质干细胞在基因治疗中研究进展相关的文章,检索词为"骨髓间充质干细胞,基因疗法,基因载体",并限定文章语言种类为中文.资料选择:纳入标准:①骨髓间充质干细胞的来源及生物学特性.②骨髓间充质干细胞作为基因运载细胞在基因治疗中的研究.排除标准:综述文献、Meta分析、重复研究.资料提炼:共收集到115篇有关骨髓间充质干细胞与基因治疗研究相关的文章,排除重复或类似的研究,30篇符合纳入标准.资料综合:骨髓间充质干细胞具有干细胞的共性,即自我更新及多向分化能力,而正是由于其容易体外扩增培养、易于外源基因的转染与表达、自体移植不易引起免疫排斥反应、体内移植后能迁移到病变部位等特性,使得骨髓间充质干细胞在基因治疗中引起人们越来越多的关注.利用骨髓间充质干细胞向肿瘤微环境趋向转移的特性,将人骨髓间充质干细胞作为细胞载体来开展的肿瘤基因治疗,取得了一定的治疗效果.但骨髓间充质干细胞的转染技术还存在很多问题.结论:骨髓间充质干细胞有希望作为一种较理想的基因运载细胞.
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骨髓源干细胞与特发性肺纤维化的治疗
目的:综合目前国际上研究骨髓源干细胞对抗肺纤维化的研究进展,介绍目前对其机制的假定,为干细胞在肺纤维化治疗上的应用提供思路.资料来源:应用计算机检索Pubmed数据库2000-01/2006-12相关文献,检索词"stem cells,lung fibrosis",限定文章语言种类为"Englis".同时查阅中文期刊数据库2000-01/2006-12干细胞与肺损伤相关文章,检索词"干细胞,肺损伤",限定文章语言种类为中文.资料选择:对资料进行初审.纳入移植的异体骨髓源干细胞在肺损伤受体内行为的基础与临床相关研究,以及特发性肺纤维化进程中因子环境的相关文章.排除综述文献、重复研究.资料提炼:共收集到文献207篇,按上述标准引用其中31篇.资料综合:由于肺部结构的复杂性,干细胞的应用研究进展落后于其他器官.目前主要的研究还集中于动物模型阶段,临床上的研究多效果有限.动物模型研究多采用在模型鼠体内植入干细胞观察治疗效果的方法,主要通过性别不匹配或携带标记鼠的骨髓细胞或骨髓细胞亚群移植等手段.关于移植干细胞减缓炎症、对抗纤维化的机制,目前的研究结论还有待统一.一种假定是植入的干细胞替代Ⅱ型肺泡上皮,另一假定是外来的干细胞改变受损部位微环境.结论:骨髓来源干细胞在治疗及预防肺纤维化方面可能存在巨大潜力,其具体治疗方案与治疗机制还有待进一步研究.
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黏附分子在造血干/祖细胞归巢中的作用
目的:造血干/祖细胞能够顺利的归巢至骨髓造血微环境是干细胞移植成功的关键因素之一.在复杂的归巢过程中,造血干/祖细胞与骨髓微环境中的各种成分及黏附分子相互作用维护造血平衡.本文就黏附分子的种类、结构、功能及其在造血干/祖细胞归巢中的作用进行文献综述.资料来源:应用计算机检索Pubmed和Springer数据库2000-01/2006-11期间的相关文章,检索词为"hematopoietic stem/progenitor cell,adhesion molecule,homing",并限定文章语言种类为English.同时计算机检索CNKI中国全文期刊数据库2000-01/2006-11期间的相关文章,检索词为"造血干/祖细胞,黏附分子,归巢",并限定文章语言种类为中文.资料选择:对资料进行初审,并查看每篇文献后的引文.纳入标准:①文章所述内容应涉及黏附分子的种类、结构、功能及其在造血干/祖细胞归巢中的作用.②2000年以后发表的文章.排除标准:重复研究或Meta分析类文章.资料提炼:共收集到42篇相关文献,30篇文献符合纳入标准,排除的12篇文献为内容陈旧或重复.符合纳入标准的30篇文献中,分别涉及黏附分子的种类和结构、黏附分子在造血干细胞归巢中的作用等内容.资料综合:造血干细胞移植是治疗恶性血液病和多种实体肿瘤的有效方法,造血干细胞顺利归巢至骨髓是造血干细胞移植成功的关键因素之一,在归巢过程中黏附分子起到十分重要的作用.近年来有关造血干细胞归巢及黏附分子的医学研究进展,具体内容可被归纳为以下两个方面:①黏附分子的种类、结构及功能.②黏附分子在造血干细胞归巢过程中的作用.结论:黏附分子与造血干细胞归巢有着十分密切的关系,但究竟是哪些黏附分子在归巢中发挥决定性作用尚无一致性结论.随着对造血干细胞归巢机制的深入研究,将为造血干细胞移植在临床的广泛应用带来更加广阔的前景.
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神经干细胞诱导分化相关因素的研究
目的:综合分析神经干细胞分化诱导机制的研究现状.资料来源:应用计算机检索万方数据库和中国期刊全文数据库2002-01/2006-10有关神经干细胞分化诱导机制的文章,检索词"神经干细胞,分化",限定语种为中文;同时应用计算机检索Pubmed数据库2002-01/2006-10期间相关文献,检索词为"neural stem cell,differentiation",限定文章语种为"English".资料选择:对检索到的神经干细胞分化诱导机制研究方面的相关信息进行整理,选取针对性强的文章,排除综述类文献.资料提炼:共检索到80篇相关文献,其中31篇符合要求.资料综合:神经干细胞是一种终生具有自我更新能力的细胞,目前对于影响其分化的机制仍不清楚.现在得到的共识是,神经干细胞的定向分化是由细胞因子、特殊蛋白质和激素、化学物质等局部环境因素和自身基因信号共同调节的,二者互相作用,彼此补充,共同作用于神经干细胞,决定神经干细胞的分化方向.结论:诱导神经干细胞分化成需要的细胞表型,是神经干细胞移植应用于临床的必要条件.目前对于神经干细胞分化诱导机制的研究已取得了较大进展,但仍有一系列问题亟待解决.
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循环骨髓间充质干细胞在体内的分布
目的:骨髓间充质干细胞具有多向分化的潜能,进入循环的间充质干细胞在体内的分布对其应用有重要意义,本文综述其分布特点及机制的研究.资料来源:应用计算机检索Pubmed、OVID数据库1999-01/2006-06与间充质干细胞分布有关的文献,检索词为"bone marrow mesenchymal stem cells,distribution,homing,infuse,transplant".应用计算机检索清华全文数据库2000-01/2006-06相关文章,检索词为"骨髓间充质干细胞,分布,归巢,移植".资料选择:对资料进行初审.纳入标准:①骨髓间充质干细胞移植的研究.②骨髓间充质干细胞归巢和体内分布相关的文献.排除标准:重复性研究、综述.资料提炼:共检索与骨髓间充质干细胞移植和在体分布有关文献128篇,后符合纳入标准的37篇.资料综合:循环的骨髓间充质干细胞分布部位广泛,分布在损伤的骨髓、心肌、肺、脑、皮肤、肝脏、肾等重要脏器.全身放射性损伤后具有向损伤部位分布的规律,并且对于某些脏器存在倾向性.影响其分布特点可能与组织器官的血管分布和血流动力学特点、血管通透性、靶部位表达和释放趋化骨髓间充质干细胞因子、骨髓间充质干细胞自身表型的改变有关.结论:进入循环的间充质干细胞在体内分布有向某些器官和部位的倾向性,并且有向损伤部位靶向分布的特点,这与器官组织结构和间充质干细胞本身特点有关,机制有待进一步阐明.
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干细胞移植治疗时间窗与临床疗效的荟萃分析
目的:探讨寻找干细胞移植治疗急性心肌梗死的佳移植治疗时间,指导临床应用,提高临床疗效.方法:应用计算机检索medline2000-01/2006-05文章,检索词为:"stem cell transplantation and/or acute myocardial infarction(AMI)and/or chronic heart failure or ischemic cardiomyopathy",限定文章语言种类为English;同时计算机检索中国期刊全文数据库,相同时间的文章,检索词:"干细胞移植治疗,干细胞移植与急性心肌梗死,干细胞移植治疗与心力衰竭或慢性缺血性心肌病",限定文章语言种类为中文.共检索到300余篇与主题有关的文献,其中12篇有价值的文章见参考文献.移植时间取平均值,并按射血分数值和P值进行列表、作图.对干细胞移植时间与射血分数值之间的关系进行分析.结果:在急性心肌梗死后2～5 d和9 d以后进行干细胞移植治疗疗效较24 h内及6～8 d为好.结论:干细胞移植治疗急性心肌梗死的移植时间与临床疗效之间可能存在一定的相关性.经冠脉注入干细胞比经静脉或经心内膜下注入可以更好地改善左室功能,但还需要进一步的临床资料证实.
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长期培养自体骨髓基质上清中白细胞介素3、白细胞介素6及肿瘤坏死因子和干扰素水平的变化
选择大连医科大学附属二院血液内科、大连市友谊医院血液科、铁路医院血液科、大连大学附属医院血液科初诊或复发的20例急性髓细胞白血病为实验对象,男11例,女9例,19～55岁,诊断均符合张之南的<血液病诊断及疗效标准>.长期培养白血病骨髓基质上清,取14,28,35 d不同时间点的上清,应用ELISA法检测细胞因子水平.结果显示,培养14 d的白细胞介素3含量低于28 d及35 d时间点(P＜0.05),培养28 d、35 d其含量差异不显著(P＞0.05);培养14 d、28 d的急性髓细胞白血病基质上清中白细胞介素6含量差异不显著(P＞0.05),其含量均高于35 d时间点(P＜0.05);培养28 d的肿瘤坏死因子α含量明显高于14 d及35 d时间点(P＜0.05);14 d与35 d含量差异不显著;干扰素α含量随培养时间的延长而增高,各组间差异不显著.
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外周血DNA提取方法及其特点
为适应临床检验工作的需要,介绍几种外周血提取DNA的常用方法及其各自特点.全血酸性柠檬酸葡萄糖溶液B抗凝后,进行有核细胞分离,离心去上清,得到白细胞沉淀物,用于外周血DNA的提取.经典酚/氯仿提取法,可有效去除蛋白质及色素等物质,使DNA达到较高的纯度,但自行配制饱和酚费时耗力,而在市场上购买的饱和酚大多达不到pH 8.0,根据相似相溶原理,酸性酚会使DNA溶于其中,降低提取量,此外沉淀DNA时需要一价阳离子的参与.盐析法提取DNA可不用饱和酚,费用低,且沉淀DNA时不需加一价阳离子,目前多数实验均采用此法.碘化钾法提取DNA步骤少且时间短,DNA获得率较高,所用试剂价格便宜、性质稳定,不需特殊实验条件及蛋白酶K.煮沸裂解法提取DNA,可导致上清液中模板核酸量减少、抑制扩增效率,实验室除做一些感染性的指标外很少采用此方法.就实验本身而言,需根据实际情况合理选择提取方法,以节省时间和经费,顺利完成实验.
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静脉注射途径移植骨髓基质细胞的特点
目的:探讨在大鼠脑缺血的情况下经尾静脉注射移植骨髓基质细胞的可行性,为骨髓基质细胞脑移植治疗提供一种简捷、安全、有效的途径.方法:实验于2005-10/2006-08在北华大学医学院实验中心完成.取1～2个月龄SD大鼠双侧股骨和胫骨,体外分离培养大鼠骨髓基质细胞.取体质量为280～320 g的SD大鼠25只,采用颈内动脉线栓法制作大脑中动脉梗死模型,造模成功后在25只大鼠中随机盲抓分为2组:骨髓基质细胞移植组(n=15)、对照组(n=10).骨髓基质细胞移植组经静脉缓慢推入含Hoeschst33342标记的骨髓基质细胞细胞悬液1 mL(2.0×107个细胞),对照组用同样方法经尾静脉注入等量不含骨髓基质细胞的DMEM培养液作为对照.分别于移植后1 d、7 d、14 d时间点对两组大鼠进行神经功能损害严重程度评分及大脑组织切片观察比较.结果:25只大鼠均进入结果分析.①各代细胞90%以上表达巢蛋白阳性.②与对照组相比,骨髓基质细胞移植组大鼠运动、神经功能恢复明显[骨髓基质细胞移植组:(6.10±2.96),(3.30±1.83),(2.10±1.20)分;对照组:(7.43±1.51),(6.14±1.35),(4.43±1.40)分,P＜0.05].③骨髓基质细胞移植组大鼠脑组织结构较清晰、完整;对照组大鼠脑组织破坏溶解,组织结构松散,细胞结构不完整,胞浆疏松,染色变浅,间质水肿.结论:通过静脉注射进行骨髓基质细胞移植,方法简便、安全,对神经损伤动物组织重建及神经功能有确切的修复效果.
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当归注射液影响辐射损伤小鼠骨髓基质细胞血管内皮生长因子及其受体flt-1的表达
目的:观察当归注射液对辐射损伤小鼠骨髓基质细胞血管内皮生长因子及其受体Flt-1表达的影响.方法:实验于2005-08/2005-11在武汉大学人民医院儿科研究所进行.将56只健康BALB/c小鼠随机分为3组:正常组:8只小鼠不做处理;照射组:24只小鼠经60Coγ射线6.0Gy全身照射;当归注射液组:24只小鼠经60Coγ射线照射后给予腹腔注射当归注射液2.5 g/(kg·d).在照射后第3,7,14天采用免疫组化法检测小鼠骨髓基质细胞血管内皮生长因子及其受体Flt-1的表达,并用流式细胞术检测相应时间的骨髓基质细胞凋亡率.结果:56只小鼠均进入结果分析.①当归注射液组及照射组骨髓有核细胞计数均低于正常组,当归注射液组照射后7,14 d骨髓有核细胞计数高于照射组[正常组:(7.9±0.9)×106/根股骨;照射组:(1.3±1.0)×106/根股骨,(1.8±1.1)×106/根股骨,(2.1±0.7)×106/根股骨;当归注射液组:(1.6±0.9)×106/根股骨,(4.6±1.2)×106/根股骨,(5.6±0.9)×106/根股骨,P＜0.05或P＜0.01];当归注射液组照射后7,14 d血管内皮生长因子及其Flt-1受体表达明显高于照射组[当归注射液组:(122.5±1.0),(128.0±0.9),(139.2±0.8),(146.8±0.8)μm3;照射组:(112.6±1.0),(108.4±0.9),(124.4±1.3),(132.5±1.1)μm3,P＜0.05或P＜0.01].②照射组和当归注射液组骨髓基质细胞凋亡率明显高于正常组,当归注射液组照射后3,7,14 d骨髓基质细胞凋亡率均明显低于照射组[正常组:(2.2±1.0)%;照射组:(18.6±3.4)%,(17.6±1.5)%,(11.4±3.7)%;当归注射液组:(13.8±1.3)%,(11.6±4.7)%,(6.3±2.7)%,P＜0.05或P＜0.01].结论:当归注射液可能通过促进骨髓基质细胞血管内皮生长因子及其受体表达,修复骨髓微环境.
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人外周血树突状细胞的分离与鉴定
目的:体外分离培养并鉴定人外周血树突状细胞,并观察其抗原呈递功能.方法:实验于2005-05/2006-11在南方医科大学南方医院肿瘤中心生物治疗实验室完成.从人类白细胞抗原A2表达阳性的健康人外周血中分离获得单个核细胞.培养5 h后洗涤贴壁细胞,加入含有10%人AB血清的RPMI1640培养基,及重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和重组人白细胞介素4,于培养的第1,3,6天对树突状细胞的形态、表型进行分析,并定期检测树突状细胞的纯度与得率.抽取与以上树突状细胞不同来源的其他健康人外周血.经淋巴细胞分离液分离后,获取非贴壁细胞,用含10%人AB血清的1640培养基重悬,加入白细胞介素2继续孵育6 d,作为同种异体T淋巴细胞.将树突状细胞分为两组,一组按常规方法培养6 d,另一组在培养至第5天时加入黑色素瘤抗原基因A3编码的多肽继续培养24 h.在经紫外线处理后的96孔板中,分别加入树突状细胞悬液1×104,5×103,2×103,1×103细胞/每孔,以自身T淋巴细胞作为对照,每孔设3个复孔,分别加入1×105淋巴细胞/每孔.评价树突状细胞刺激T淋巴细胞增殖的能力.结果:①单个核细胞体外培养至第6天,可获得大量、90.81%高纯度的树突状细胞,能够较高地表达21.8%CD1a、99.0%HLA-DR、63.4%CD80、18.9%CD83和80.6%CD86.②将诱导培养6 d获得的两组树突状细胞作为刺激细胞,以不同的浓度与同种异体淋巴细胞混合,均可产生增殖反应;经过黑色素瘤抗原基因A3编码的多肽处理的各种比例的树突状细胞,较相应未经黑色素瘤抗原基因A3编码的多肽处理的树突状细胞激发淋巴细胞增殖的能力明显增强,浓度相对较高的树突状细胞刺激效果明显,能够强烈地激发同种混合淋巴细胞增殖.结论:得到了一群较高程度表达CD83、CD86和HLA-DR分子、体外可强烈激发同种异体T淋巴细胞增殖的树突状细胞群.
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蝎毒及其分离成分对60Coγ射线照射后骨髓粒-单系祖细胞的影响
实验于2004-09/2005-12在郑州大学基础医学院和郑州大学第一附属医院完成.将60只昆明小鼠随机分成5组:①空白对照、单独放射组各15只,腹腔注射无菌生理盐水0.2 mL.②蝎毒抗癌多肽组10只、蝎毒抗癌多肽+放射组10只,按选择配制的浓度腹腔给与蝎毒抗癌多肽0.2 mL.③蝎毒分离成分Ⅲ+放射组10只,腹腔注射0.2 mL一定浓度的蝎毒分离成分Ⅲ.两次给药间隔时间为5.5 h,连续给药7 d.后给药后24 h对小鼠进行60Coγ射线1次照射,源皮距80 cm,照射剂量7.5 Gy,剂量率0.27 Gy/min.照射后继续给药7 d.7 d后取骨髓,进行粒-单系干祖细胞培养.结果显示,蛇毒抗癌多肽+放射组、蝎毒分离成分Ⅲ+放射组的集落数明显高于单独放射组[(32±5),(27±3),(2±1)个/孔,P＜0.001].
