中国组织工程研究杂志
Chinese Journal of Tissue Engineering Research 중국조직공정구여림상강복
- 主管单位： 中华人民共和国卫生部
- 主办单位： 中国康复医学会,《中国组织工程研究与临床康复》杂志社
- 影响因子： 1.38
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 2095-4344
- 国内刊号： 21-1581/R
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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4-间氨基酚-4去甲表鬼臼醚诱导K562细胞凋亡
目的:鬼臼毒素具有抗炎作用,为限制其对机体产生不良反应,探讨经过结构改造的4-间氨基酚-4去甲表鬼臼醚对K562细胞生长抑制及诱导凋亡情况.方法:实验于2004-03/2005-01在兰州医学院完成.①实验材料:4-间氨基酚-4去甲表鬼臼酯由兰州大学应用有机化学国家重点实验室田暄教授惠赠,纯度98%.依托铂甙(连云港恒瑞药业产品,批号04060121,20 g/L)临用前以5%二甲亚砜稀释至5 g/L.K562细胞由兰州大学中药新药临窗前研究重点实验室传代保种.②细胞生长抑制率检测:取K562细胞,离心后调整浓度为1×108L-1,以100μL等量接种于96孔培养板.4-间氨基酚-4去甲表鬼臼醚组分别加入0.313,0.625,1.25,2.5,5,10.20,40 mg/L的4-间氨基酚-4去甲表鬼臼醚药液10μL;依托铂甙组分别加入以上8种终浓度的依托铂甙药液10 μL;正常对照组加入等量的溶媒;空白对照组不加细胞和任何药物,只加入等量的完全培养液.采用噻唑蓝法检测药物与细胞作用24,48,72 h时K562细胞的生长抑制率.③细胞超微结构观察:取K562细胞,离心后调整浓度为1×109 L-1,以2 mL等量接种于24孔培养板.4-间氨基酚-4去甲表鬼臼醚组加入2.5 mg/L的4-间氨基酚-4去甲表鬼臼醚药液200μL,正常对照组加入等量的溶媒.制作超薄切片,用醋酸双氧铀、柠檬酸铅染色,透射电镜观察细胞形态及细胞质、细胞核的变化.④细胞周期及凋亡检测:取K562细胞,离心后调整浓度为1×108L-1,以2 mL.等量接种于24孔培养板.4-间氨基酚-4去甲表鬼臼醚组分别加入1.25,2.5,5,10,20 mg/L的4-间氨基酚-4去甲表鬼臼醚药液200μL,正常对照组加入等量的溶媒.在流式细胞仪上检测细胞周期,用Multicycle软件计算凋亡细胞百分率.结果:①4-间氨基酚-4去甲表鬼臼醚抑制K562细胞生长情况:在0.313～20 mg/L范围内,其对K562细胞的抑制作用随浓度升高而增强,具有量效关系,同时抑制率随着作用时间的延长而升高,具有时效关系;超过20 mg/L.时抑制作用逐渐下降.依托铂甙对K562细胞的抑制情况与4-间氨基酚-4去甲表鬼臼醚类似.②细胞超微结构:正常对照组K562细胞核形状规则,核膜清晰可见,内质网丰富,内含大量线粒体,细胞表面微绒毛多,染色体分布于核中央.4-间氨基酚-4去甲表鬼臼醚组K562细胞出现明显的凋亡特征,微绒毛消失,细胞浆固缩,染色体凝集为团块状分布于核膜边缘,细胞内出现大量空泡,线粒体和内质网减少,细胞周围出现凋亡小体.③细胞周期及凋亡情况:1.25,2.5,5,10,20 mg/L 4-1间氨基酚-4去甲表鬼臼醚作用24 h,分别有19.4%,34.8%,34.0%,6.9%,4.5%的K562细胞发生凋亡,G0/G1期和S期K562细胞减少,于G2/M期明显增多.正常对照组凋亡率仅为0.3%.结论:①4-间氨基酚-4去甲表鬼臼醚能够抑制K562细胞的生长,呈时效、量效关系.②4-间氨基酚-4去甲表鬼臼醚可诱导K562细胞凋亡.
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首次换液时间对贴壁法培养骨髓间充质干细胞纯度及增殖的影响
目的:观察不同时间首次换液对贴壁法培养骨髓间充质干细胞形态和表面标志物表达的影响.方法:实验于2005-09/2006-12在湖南中医药大学内科实验室完成.实验材料:三四周龄昆明种小鼠由湖南中医药大学实验动物室提供(许可证号:医动字第20-002号).实验方法:无菌条件下分离小鼠股骨,以低糖DMEM培养液冲出骨髓,1 000 r/min离心10 min,去除脂肪和上清液,DMEM重悬,洗涤细胞,同样条件下离心,弃上清液,将获得的骨髓间充质干细胞用含体积分数为0 15胎牛血清、105 U/L青霉素G、100 mg/L链霉素的低糖DMEM完全培养基重悬沉淀,以1×108L-1接种于24孔板,置于37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养箱中培养.第1组于24 h全量换液,第2组于3 d全量换液,第3组于5 d全量换液.比较骨髓间充质干细胞在原代培养24 h、3 d、5 d首次换液后细胞形态、生长曲线和表面标志物表达.结果:①骨髓间充质干细胞形态:原代培养24 h换液,可见少量贴壁细胞,形态不规则.原代培养3 d首次换液,可见较多贴壁细胞,并形成细胞团,细胞为椭圆形、短梭形.原代培养5 d换液,可见明显集落形成,贴壁细胞量多,细胞呈梭形.②骨髓间充质干细胞生长曲线:原代培养24 h首次换液,骨髓间充质干细胞生长较缓慢,对数生长期晚;原代培养3 d首次换液,骨髓间充质干细胞增殖速度快,对数生长期早;原代培养5 d首次换液,骨髓间充质干细胞前6 d生长速度较快,6 d后生长渐缓慢.③骨髓间充质干细胞表面抗原:三组间比较CD44、CD45阳性表达率差异均具有显著性意义[24 h首次换液:(88.13±1.60)%,(26.25±2.60)%;3 d首次换液:(85.21±1.80)%,(29.37±1.30)%;5 d首次换液:(79.85±1.50)%,(36.54±1.20)%,P＜0.01].结论:不同时间首次换液对贴壁法骨髓间充质干细胞的生长有影响,单从细胞纯度来考虑,24 h首次换液较为理想,从细胞生长情况和纯度综合考虑,3 d首次换液较为理想.
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人脐静脉间充质干细胞原代培养换液频度与细胞增殖生长的关系
目的:体外分离培养人脐静脉内皮及内皮下间充质干细胞,观察采用不同的换液频度与细胞增殖和生长的关系.方法:实验于2006-03/11在辽宁医学院解剖学实验室完成.①选取正常健康产妇顺产或剖宫产的新生儿脐带,由辽宁医学院附属第一医院提供,产妇及其家属均知情同意.②根据更换细胞培养液时间的不同,分为接种后每24 h,48 h,72 h更换培养液组.③无菌条件下将脐带用预热的磷酸盐缓冲液充分洗涤去血渍,从脐静脉一端插入留置针,用预热的磷酸盐缓冲液冲净静脉腔血,止血钳夹闭另一端,采用胶原酶消化法分离人脐静脉内皮及内皮下细胞,取消化30 min的细胞悬液进行贴壁培养,以1×108L-1密度接种于24孔培养板中,每孔的细胞数和培养液量相同,按实验设计分组的时间方法更换培养液.④各组自培养24 h开始,每天分别取各组细胞4孔,以噻唑蓝比色法测定生长曲线.并采用免疫细胞化学方法对分离的细胞进行表面抗原鉴定.结果:①间充质干细胞的形态学观察:原代培养1周,细胞以梭形细胞为主.传代培养2 h细胞开始贴壁变形,24 h基本完成贴壁,48 h可见部分已贴壁的细胞开始分裂增殖,细胞形态多样,呈椭圆形、梭形、三角形等.5～7 d贴壁细胞可见多核的成纤维细胞样.在细胞生长增生过程中,接种后每24 h更换培养液组细胞增殖明显,生长状态均好;接种后每48 h更换培养液组次之;接种后每72 h更换培养液组细胞增殖较慢,细胞生长状态也较差.②生长曲线:接种后每24 h更换培养液组的细胞生长增殖较快,比接种后每48 h及72 h更换培养液组达到的同样细胞数平均提前2～3 d(P＜0.05);接种后每48 h及72 h更换培养液组之间差异无显著性意义(P＞0.05).③间充质干细胞表面抗原特性:免疫细胞化学分析显示CD166呈阳性,vWF呈阴性.结论:胶原酶消化法体外分离获得的人脐静脉内皮及内皮下细胞数量高、活性佳.更换培养液的频度不同,细胞的增殖生长过程和形态变化时间不同,接种后每24 h更换培养液更有利于间充质干细胞的增殖生长和纯化.
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大鼠骨髓间充质干细胞体外分离、纯化与培养适宜条件的筛选
目的:为获得大量、高纯度的骨髓间充质干细胞,筛选体外分离、纯化和培养的适宜条件.方法:实验于2006-08/2007-07在解放军兰州军区兰州总医院进行.①实验材料:2月龄SD大鼠,雄性,体质量(100±20)g,由解放军兰州军区兰州总医院实验动物科提供.②实验方法:分别采用全骨髓法(贴壁筛选法)和密度梯度离心法分离和纯化大鼠骨髓间充质干细胞.将采用密度梯度离心法获得的单个核细胞按1×107,1×107,1.5×108,2×108,1×109,2×109 L-1的接种密度分别分成1～6组,接种在24 孔板内,每组接种6孔.比较细胞出现伸展时间、原代培养时间.于细胞接种后第1,2,3,4,5,6天进行首次换液.将换下的部分细胞置于新的培养皿中进行培养,至少培养3 d,观察是否还有新的贴壁细胞出现,以确定首次换液时间.观察体积分数为0.10,0.12,0.15,0.18,0.20血清对原代及传代后细胞生长的影响,比较不同浓度血清中细胞数量、集落形成率.集落形成率=集落数目/接种细胞数目×100%.采用流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞细胞周期.选取第5代扩增的骨髓间充质干细胞,接近完全融合后进行成骨和成脂肪诱导培养.诱导剂分别为:10 nmol/L.地塞米松、0.05 nmol/L抗坏血酸及10 nmol/L β-甘油磷酸钠;1μmol/L地塞米松、0.5 mmol/LIBMX、0.01 mmol/L人胰岛素、0.01 mmol/L吲哚美辛.并设未加诱导剂培养液培养的骨髓间充质干细胞对照.③实验评估:采用碱粒酶测定成骨诱导后细胞,采用油红O染色鉴定成脂肪诱导后细胞.结果:①细胞出现伸展时间、原代培养时间:密度梯度离心法培养细胞出现伸展时间与全骨髓法相比,差异无显著性意义.密度梯度离心法原代培养时间较全骨髓法长[(9.41±1.11),(14.73±2.86)d,P＜0.05].②不同接种密度对密度梯度离心法所获细胞生长影响:1×109 L-1组细胞出现伸展时间及原代培养细胞融合时间较早.1×107 L-1组培养20 d内不能传代.③首次换液时间对细胞生长的影响:第5天开始在换下的液体中,很少有再贴壁的细胞出现.因此首次换液时间应为第5天.④不同体积分数血清对细胞生长的影响:在其他条件相同的前提下,骨髓间充质干细胞在含体积分数为0.12胎牛血清中细胞集落形成率高.⑤成骨及成脂诱导:成骨诱导的骨髓间充质干细胞经碱粒酶测定,结果钙化结节呈蓝色.成脂诱导的骨髓间充质干细胞经油红O染色,苏木精-伊红复染后胞内脂滴呈桔红色,核呈蓝色.结论:采用密度梯度离心法分离纯化的骨髓间充质干细胞以1×109 L-1密度接种,在含体积分数为0.12胎牛血清的MEM培养基中培养,生长状况良好,增殖速度快.
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酶消化法体外分离培养的大鼠嗅鞘细胞形态及表型特征
目的:目前国内外研究介绍的嗅鞘细胞培养方法存在繁杂或重复性差的问题,不利于实际应用.为此实验应用酶消化法体外分离培养大鼠嗅鞘细胞,观察其形态学及表型特征.方法:实验于2005-11/2006-03在上海中医药大学附属龙华医院脊柱病研究所完成.①选取新生1周龄雄性SD大鼠1只,浸人体积分数为0.75的乙醇中3 min,碘伏消毒.打开前颅,暴露嗅球,完整取下两个嗅球,放人4℃预冷的DMEM抗菌液中清洗2遍,洗掉嗅球表面的血液等杂质,剥下嗅球被膜,将嗅球用眼科剪剪碎,加入质量浓度为2.5 g/L的胰酶,在37℃孵育箱磁力搅拌下孵育15 min,DMEM终止消化.细胞液过100μm细胞筛,离心去除上清液,用DMEM稀释细胞浓度至1×109L-1,种植于无包被处理的6 孔细胞培养板内常规培养.按差速贴壁法在培养18～20 h后吸出细胞悬液,重新种植于包被神经生长因子低亲和力受体p75的6孔细胞培养板内.观察细胞生长情况,每2～3 d换液1次,培养14 d.②将培养不同时间的嗅球成鞘细胞于倒置显微镜、透射电镜下观察其形态变化,并行苏木精-伊红染色.使用免疫组化法检测嗅鞘细胞的特征性标志神经生长因子低亲和力受体p75的表达情况,阳性表达为棕黄色,无着色为阴性.结果:①倒置显微镜形态学观察:差速贴壁培养第2天可见有较多嗅鞘细胞贴壁生长,细胞突起较短,胞体较大,透亮度一般,成团或散在生长,较难辨认细胞的形态.5～6 d可见较典型的嗅鞘细胞形状,主要以梭形和多突起细胞为主,细胞立体感强、透亮、杂质细胞较少、本底清楚,亦可见有少量成纤维细胞开始生长.9 d时嗅鞘细胞数量明显增加,其生长方向呈较一致的条索状.至14 d无论在细胞数量及质量上都呈明显的降低趋势.②苏木精-伊红染色结果:细胞多呈梭形,还可见扁平细胞,核为圆形或椭圆形,有时见双核,胞浆充实无空泡.③透射电镜形态学观察:细胞形态多为双极梭形,少数为3极,核不规则,核膜明显,可见核仁,染色质均匀分布于核中,异染色质可在核膜下形成块状结构,胞体表面有伪足样短突起,胞浆内有丰富的粗面内质网系统及线粒体.胞膜有时可见伪足样突起形成皱褶.④神经牛长因子低亲和力受体p75免疫组化检测结果:大鼠嗅鞘细胞神经生长因子低亲和力受体p75免疫反应呈阳性.结论:酶消化法体外分离培养的大鼠嗅鞘细胞表达特征性标志神经生长因子低亲和力受体p75.
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地塞米松在家兔脂肪基质干细胞定向诱导为成骨细胞的作用
目的:观察不同浓度地塞米松对家兔脂肪基质干细胞生长、增殖及向成骨细胞分化的影响.方法:实验于2006-11/2007-01在南方医科大学组织工程研究中心完成.实验材料:成年新西兰大白兔购于南方医科大学实验动物中心(机构许可证号SYXK(粤)2005-0058).实验方法:①脂肪基质干细胞获取:取成年新西兰大白兔腹股沟皮下脂肪组织一二毫升,分离培养脂肪基质干细胞,井按1:3进行传代培养.选取生长良好P3代细胞进行免疫组织化学染色测定CD44抗原表达.并于第3,7,14天观察细胞增殖情况.②脂肪基质半细胞成骨诱导:成骨诱导液由不同浓度地塞米松、50 mg/L的维生素C、10 mmol/L的β-磷酸甘油和DMEM完全培养基组成.实验分6组:0 mol/L地塞米松组、10-8 mol/L地塞米松组、10-7 mol/L地塞米松组、10-6mol/L地塞米松组、10-5mol/L地塞米松组、对照组.选择生长良好P3代兔脂肪基质干细胞,用0.25%胰酶消化3～5 min,制成单细胞悬液,调整细胞密度为1×104,接种于25 cm2的培养瓶中,在体积分数为0.05的C02饱和湿度、37℃恒温培养箱培养.24 h后所有诱导组更换为成骨诱导培养液,进行成骨细胞诱导分化处理,记为诱导第0天,对照组换DMEM完全培养液.诱导期间,每隔二三天换1次成骨诱导液,对照组换1次常规DMEM完全培养液.③第7,14,21天茜素红染色鉴定成骨细胞特性,观察不同浓度地塞米松对兔脂肪基质干细胞的生长、增殖及向成骨细胞分化的影响.结果:①地塞米松对脂肪基质干细胞增殖的影响:与对照组相比较,10-6,100-5 mol/L组细胞数目明显减少(t=2.862 3,3.424 5.3.520 3,3.959 4,2.264 1,2.701 2.P＜0.05).②地塞米松对脂肪基质干细胞成骨分化的影响:光镜下观察整个诱导分化期,对照组未观察到钙化结节形成,0 mol/L地塞米松组只观察到个别钙化结节形成.在诱导第14天,10-5,10-6,10-7,10-8 mol/L地塞米松组均可观察到少数钙化结节形成,10-5,10-6,10-7 mol/L组间钙化结节数差异无显著性意义(t=0.557 1, 0.592 9.1.114 2.P＞0.05),但钙化结节数目明显多于10-8 mol/L组(t=5.496 0,6.281 1,6.364 0,P＜0.05).在诱导第21天;10-5,10-6,10-7 mol/L组均可观察到大量钙化结节形成,均明显多于10-8 mol/L组(t=6.270 3,6.406 5;5.634 9,P＜0.05).结论:＞10-7 mol/L高浓度地塞米松对脂肪基质干细胞的生长、增殖有明显抑制作用;在其他镌导条件一致的情况下,10-7 mol/L地塞米松有年于脂肪基质干细胞向成骨细胞分化.
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慢性乙型肝炎患者外周血髓样树突状细胞功能分析
目的:对慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞来源的髓样树突状细胞进行功能分析.方法:实验于2005-01/2006-07在泰山医学院完成.①髓样树突状细胞来源于2005-0712泰山医学院附属医院传染科收治的20例慢性乙型肝炎患者,男12例,女8例,年龄21-42岁,乙型肝炎病毒标志物均为HBsAg(+)、HbeAg(+)、HbcAb(+),乙型肝炎病毒DNA均为阳性,3个月内均未使用抗病毒药物和免疫调节剂.诊断参照2000年西安全国病毒性肝炎会议修订的临床诊断标准,排除甲型肝炎、丙裂肝炎、丁犁肝炎、戊型肝炎等病毒重叠感染及其他原因引起的肝脏损害.②以14例健康供血员的髓样树突状细胞作为正常对照,男8例.女6例,年龄21～36岁.③慢性乙型肝炎患者与健康供血员各取外周血20 mL,肝素抗凝,用淋巴细胞分离液分离去除红细胞和粒细胞,收集外周血单个核细胞.应用粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素4诱导培养其分化发育为髓样树突状细胞,锥虫篮染色检测细胞活力并进行细胞计数.④收集培养第10天的1×109L-1髓样树突状细胞,离心管中分别加入荧光标记抗体HLA-DR-FITC和CD86-FITC,终浓度为5mg/L,4℃标记45 min,用流式细胞仪检测细胞表面表型.⑤取培养第7天的1×109L-1髓样树突状细胞,加入含体积分数为1的胎牛血清、50μg/L粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、10μg/L白细胞介素4、1 U/L肿瘤坏死因子α的新鲜培养基继续培养,24 h后收集培养上清,ELISA法检测白细胞介素10与白细胞介素12的含星.⑥培养第10天的髓样树突状细胞以30Gy γ放射线灭活后,每孔分别按髓样树突状细胞:T细胞=1:40,1:20,1:10,1:5加入到已含有纯化T细胞的996孔板中,采用3H-TdR掺人法检测髓样树突状细胞刺激同种异体T细胞增殖反应的能力.结果:①髓样树突状细胞的形态学特征及生成量:慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞诱导培养10 d时,呈典型的髓样树突状细胞,低密度,圆形或不规则形,表面有丰富的伸长毛刺,悬浮不贴壁,与正常人群外周血单个核细胞诱导的髓样树突状细胞形态学无明显区别.锥虫篮染色结果显示两单髓样树突状细胞活力均大于95%.慢性乙型肝炎患者髓样树突状细胞数量明显低于正常人群[(3.4±0.3)×109L-1,(5.2±0,3)×108L-1=17.218 3,P＜0.01].②髓样树突状细胞表型分析及细胞因子含量变化:与正常人群比较,慢性乙型肝炎患者髓样树突状细胞表面CD86和HLA-DR分子表达率均明显降低(t=5.435 1～8.706 2,P均＜0,01);培养上清中白细胞介素12的含量明显降低(t=13.720 8,P＜0.01),白细胞介素10的含量无明显变化.③混合淋巴细胞效应:在髓样树突状细胞:T细胞=1:5,1:10,1:20,1:40时,慢性乙型肝炎患者髓样树突状细胞激活T细胞增殖的能力明显低于正常人群(t=17.709 6～28.022 5,P均＜0.01).结论:慢性乙型肝炎患者外周血中髓样树突状细胞数目减少、功能降低,可能是导致机体对慢性乙型肝炎病毒感染产生免疫耐受的原因之一.
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免疫磁珠法分离纯化骨髓间充质干细胞及向神经细胞定向分化
目的:利用免疫磁珠法分离成人骨髓神经生长因子受体阳性细胞,获得同质性骨髓间充质干细胞,并向神经细胞诱导分化.方法:实验于2005-01/08在吉林大学第一医院中心实验室完成.①骨髓来源于正常成人献髓者,由解放军三零七医院骨髓库提供.采用Percoll密度梯度离心法分离收集骨髓单个核细胞,分别进行常规贴壁分离及免疫磁珠分离.②常规贴壁分离法是将2×107骨髓单个核细胞接种于添加骨髓间充质干细胞培养液的25 cm2 培养瓶中孵育,48 h后除去未贴壁细胞,更换新鲜培养液,待细胞生长至90%融合时消化传代.③免疫磁珠分离法是将骨髓单个核细胞先后与鼠抗人神经生长因子受体单克隆抗体、羊抗鼠IgG免疫磁珠4℃反应15 min,然后将细胞放入分离系统的细胞分离柱内,经免疫磁珠标记的骨髓单个核细胞(神经生长因子受体阳性部分)由于磁场作用滞留于分离柱中.移走磁场后,冲洗分离柱即得到神经生长因子受体阳性细胞.④分别检测神经生长因子受体阳性细胞和常规贴壁培养所获骨髓间充质干细胞体外扩增和集落形成能力,分析其细胞表型和细胞周期,并将骨髓间充质干细胞向神经细胞诱导分化.结果:①平均在每百个骨髓单个核细胞中有(2.6±1.2)个神经生长因子受体阳性细胞存在.经过免疫磁珠分离获得的神经生长因子受体阳性细胞数占骨髓单个核细胞总数的(0.57±0.31)%,纯度为(90.6±5.1)%.②神经生长因子受体阳性细胞培养4周后,神经生长因子受体、CD34、HLA-DR、CD133、CD105阳性率分别为(35.5±5.9)%,(2.3±1.7)%,(2.6±2.3)%,(1.4±1.1)%,(89.8±12.8)%.③经免疫磁珠分离获得的1×106个神经生长因子受体阳性细胞平均可以形成3 100个集落,而接种同样数目的骨髓单个核细胞平均只能形成56个成纤维细胞集落.④神经生长因子受体阳性细胞可以在体外扩增10周,其扩增倍数较常规贴壁法纯化骨髓间充质干细胞平均高出2～3个数量级.⑤培养4周后,免疫磁珠法分离的骨髓间充质干细胞中处于分裂期的细胞比例高于常规贴壁法(12.37%,9171%,P＜0.05).⑥诱导后5 h,约60%细胞变成双极形、多极形和锥形,出现类似神经元细胞的形态,并可见多数细胞相互交织成网络结构.⑦经诱导分化后的骨髓间充质干细胞微管蛋白生物素单克隆抗体TuJ-1表达明显增强,无神经胶质纤维酸性蛋白表达.结论:①利用免疫磁珠分离骨髓神经生长因子受体阳性细胞可以获得同质性原始骨髓间充质干细胞.②免疫磁珠分离的神经生长因子受体阳性细胞较常规贴壁分离获得的骨髓间充质干细胞具备更强的增殖能力和成神经分化潜能.
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影响恶性肿瘤患者造血系统自体外周血造血干细胞数量和质量的因素分析
背景:造血系统恶性肿瘤的造血重建除与疾病本身、预处理方案、移植后支持治疗手段等相关外,自体外周血造血干细胞的动员、采集和冻存是影响其移植后造血系统顺利重建的关键因素.目的:观察造血系统恶性肿瘤患者自体外周血造血干细胞经动员、采集和冻存后,重新回输至造血系统的重建情况,并分析影响外周血造血干细胞数量和质量的因素.设计:以造血系统恶性肿瘤为对象的病例分析.单位:解放军广州军区广州总医院血液科,南方医科大学珠江医院血液科.对象:选取2000-02/2004-12解放军广州军区广州总医院血液科收治的18例造血系统恶性肿瘤住院患者,年龄16～56岁,其中急性髓性白血病2例,急性淋巴细胞白血病1例,淋巴瘤白血病2例,慢性粒细胞白血病2例,多发性骨髓瘤4例,非霍奇金淋巴瘤7例.粒细胞集落刺激因子(Granocyte,中外制药产品,批号N3G31).方法:①全部病例均采用对肿瘤有效的联合化疗方案+粒细胞集落刺激因子进行动员.联合化疗方案:白血病患者第1～3天每隔12 h给予阿糖胞苷2 g/m2,第1～5天给予足叶乙甙200 mg/m2或氟达拉宾50 mg/m2.多发性骨髓瘤患者给予阿糖胞苷方案同上,第1～2天给予环磷酰胺1 g/m2.淋巴瘤患者第1～2天给予环磷酰胺2 g/m2.各类型患者化疗后白细胞降至1.0×109 L-1以下时开始进行粒细胞集落刺激因子动员,5μg/(kg·d)皮下注射至采集结束.②当白细胞恢复至(4.0～10.0)×109L-1时开始采集外周血造血干细胞,单个核细胞计数≥4.0×108/kg或CD34+细胞≥2.0x105/kg时结束采集,经程序降温仪处理置入-196℃液氮中保存,37～40℃水浴解冻.③患者病灶部位行局部照射预处理,200 cGy/次,5次/周,连续4周,总剂量40 Gy.结束后48 h回输外周血造血干细胞(55.3±28.7)Ml,回输日距采集日平均为(56.5±22.3)d.全部患者于干细胞移植后第1天起皮下注射粒细胞集落刺激因子300 μg/d,至中性粒细胞≥0.5×109L-1时停止.检测冻存前及解冻后自体外周血造血干细胞的锥虫蓝拒染率、单个核细胞计数、粒-单系祖细胞集落数及CD34+细胞百分率.主要观察指标:①自体外周血造血干细胞的采集情况.②冻存后自体外周血造血干细胞存活率及相关指标检测.③自体外周血造血干细胞移植后造血系统重建情况.结果:18例造血系统恶性肿瘤患者全部进入结果分析.①18例患者自体外周血造血干细胞平均采集时间为化疗后12.6 d,采集次数为1.9次,采集第1天白细胞总数为(8.93+1.27)×10g L-1,单个核细胞采集率为(138.33±28.61)%.②冻存后18例自体外周血造血干细胞标本锥虫蓝拒染率与冻存前基本相似[(96.26±1.33)%,(92.75±2.04)%,P＞0.05].解冻后单个核细胞、CD34+、粒-单系祖细胞回收率分别为(91.96±1.37)%.(85.94±0.64)%,(87.69±4.53)%.骨髓瘤患者的单个核细胞采集率、CD34+细胞百分率及粒-单系祖细胞集落数均明显低于白血病和淋巴瘤患者(t=2.524～3.268,P＜0.05).③移植后15 d,15例患者中性粒细胞恢复至≥0.5×109L-1;移植后20 d,血小板恢复至≥20x109L-1.化疗疗程＞10次的5例患者粒-单系祖细胞生长不良.为(18.67～26.82)×105/kg,其中3例出现自体外周血造血干细胞移植后造血重建延迟.结论:①重组粒细胞集落刺激因子与大剂量化疗联合的动员方案可缩短外周血造血干细胞采集时间,提高单个核细胞采集率.②移植前化疗次数增多可影响自体外周血造血干细胞的数量和质量,导致造血重建延迟.
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脑微血管内皮细胞对体外缺氧神经干细胞增殖及凋亡的影响
目的:观察脑微血管内皮细胞对体外培养缺氧神经干细胞增殖、凋亡的影响.方法:实验于1996-01/1996-12在佳木斯大学神经科学所完成.实验材料:同一基因背景新生的Wistar大鼠由哈尔滨医科大学实验动物学部提供(黑动字第99102001).实验方法:①取新生24 h Wistar大鼠大脑培养神经干细胞,采用免疫组织化学方法鉴定神经干细胞.②取出生1～7 d Wistar大鼠大脑培养脑微血管内皮细胞,采用免疫细胞化学方法鉴定.③将培养传代纯化的脑微血管内皮细胞,用0.25%胰酶消化成单细胞液后接种于涂有多聚赖氨酸包被的盖玻片上,接种传3代后用胰酶消化的神经干细胞,以1:10接种比例加入神经细胞完全培养液共培养.④用无菌石蜡油覆盖于低糖细胞培养液表面,制备低氧低糖溶液.对照组:正常神经干细胞置于37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养.缺氧共培养组:取共培养3 d细胞,吸出培养液,用无菌Hank's缓冲液清洗2次,加入低氧低糖溶液共同作用2,4,8,16 h后换液,用PBS缓冲液冲洗3次后,换神经细胞完全培养液,置于细胞培养箱中复氧培养.缺氧单纯神经干细胞组:取传3代神经干细胞,用无菌Hank's缓冲液清洗2次后,方法同上.实验评估:免疫组织荧光鉴定缺氧条件下神经干细胞的增殖与凋亡.结果:①免疫组织化学方法检测Nestin及Ⅷ因子相关抗原分别鉴定为神经干细胞及脑微血管内皮细胞.②对照组细胞胞体饱满,折光性强,周围有光晕.缺氧单纯神经干细胞组细胞胞体肿胀,折光性差,有大量细胞碎屑,仅有少量活细胞,并出现悬浮死细胞.缺氧共培养组细胞形态有所改善,细胞折光性仍较好,大部分细胞突起仍未见回缩,仅少数细胞肿胀,坏死.③随着缺氧时间的延长,细胞死亡明显增多,存活数明显下降.缺氧共培养组细胞存活数明显高于缺氧单纯神经干细胞组与对照组(321.76±22.20,180.00±17.89,255.33±10.33,P＜0.01).④缺氧条件下脑微血管内皮细胞对神经干细胞增殖及凋亡的影响:缺氧共培养组细胞存活数明显高于缺氧单纯神经干细胞组,细胞凋亡细胞数低于缺氧单纯神经干细胞组(P＜0.05).结论:脑微血管内皮细胞可以促进缺氧神经干细胞的增殖、减少其凋亡.
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二氧化碳和氦气气腹对幼猪红细胞免疫及腹腔液中肿瘤坏死因子α的影响
目的:分别以二氧化碳、氦气模拟气腹动物模型,观察其红细胞免疫功能及腹腔液中肿瘤坏死因子α含量的变化,探讨腹腔镜手术中气腹状态对机体红细胞免疫功能的影响.方法:实验于2004-12/2006-12 在西京医院实验外科完成.①实验动物:清洁级幼猪30只,随机数字表法分为3组:二氧化碳气腹组、氦气气腹组、正常对照组,10只/组.②实验方法:幼猪麻醉后,于剑突下正中作小切口,刺人气腹针后连接气腹机,二氧化碳气腹组、氦气气腹组分别注入二氧化碳和氦气,保持气腹压力为1.33～1.60 kPa,气体流量为0.3 L/min,持续性膨腹30 min.正常对照组未进行造模.③实验评估:造模后1,4 d,ELISA法检测各组幼猪腹腔灌洗液中细胞数量及其释放肿瘤坏死因子α的含量.各组幼猪分别于造模前1 d、造模后1,4 d采集外周静脉血,测定红细胞C3b受体花环率(高倍镜下计数200个红细胞,以1个红细胞上结合2个或2个以上酵母菌为阳性花环)、红细胞免疫复合物花环率(结果判断同前)、肿瘤红细胞花环率(高倍镜下计数100个癌细胞,以结合3个或3个以上红细胞为阳性花环).结果:幼猪30只全部进入结果分析.①腹腔液细胞数量及肿瘤坏死因子α含量检测:造模后氦气气腹组腹腔液中细胞数明显多于二氧化碳气腹组、正常对照组[(10 628±326),(5 721±271),(5 648±262)个/L;t=1.7×10-23,P均＜0.05].与正常对照组腹腔细胞释放肿瘤坏死因子α的含量比较,二氧化碳气腹组明显减少,氦气气腹组明显增多[(462±51),(273±28),(785±68).P均＜0.05].②红细胞免疫功能检测:造模前各组红细胞C3b受体花环率、红细胞免疫复合物花环率、肿瘤红细胞花环率均基本相似(t=0.61～0.92,P均＞0.05);造模后1,4 d,二氧化碳气腹组红细胞C3b受体花环率、红细胞免疫复合物花环率、肿瘤红细胞花环率均显著低于氦气气腹组和正常对照组(t=8.22×10-5～1.2×10-3,P均＜0.05).二氧化碳气腹组造模后1,4 d红细胞C3b受体花环率、红细胞免疫复合物花环率、肿瘤红细胞花环率均明显低于造模前(t=1.9x10-6,1.7×10-4,6.12×10-4,P均＜0.05).结论:不同气体产生的气腹对机体及腹腔内局部免疫功能影响各异,二氧化碳气腹对红细胞免疫功能和腹腔细胞释放肿瘤坏死因子α功能强于氦气气腹.
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冠状动脉粥样硬化性心脏病患者红细胞流变性特征在红花注射液干预后的表现
目的:经红花注射液干预后,观察冠状动脉粥样性心脏病患者红细胞电泳指标及红细胞变形性的变化.方法:①选取2001-02/2002-10 河北北方学院附属第一医院心内科住院的冠状动脉粥样硬化性心脏病患者50例作为冠状动脉粥样硬化性心脏病组,男31例,女19例,平均年龄(43.9±5.6)岁,对本实验知情同意,均自愿参加.②纳入标准:经心电图、超声心动图证实有典型心绞痛、心绞痛不典型或陈旧性心肌梗死史,由专科医师确诊冠脉造影狭窄率≥50%;治疗前均未进行降脂、利尿剂、促血尿酸排泄药、阿司匹林及肝素(包括低分子肝素钠)治疗;无肝肾疾病、内分泌系统疾病.③以30例自愿体检受试的健康学生及医务人员作为正常对照组,男女各15例,平均年龄(35.4±7.4)岁.两组间年龄、性别差异无显著性意义.④"得强"红花注射液,主要成分为红花黄色素,由太原华卫药业有限公司生产,批号010302.⑤冠状动脉粥样硬化性心脏病组取红花注射液6.0～8.0 mL,溶于500 mL葡萄糖注射液中,静点,1次/d,15 d为1个疗程,共1个疗程.正常对照组未给予任何干预措施.⑥治疗前后两组空腹抽取肘静脉血5 mL,应用红细胞变形分析仪检测红细胞电泳指标及红细胞变形性的变化.结果:50例冠状动脉粥样硬化性心脏病患者均进入结果分析.①治疗前后红细胞电泳指标的变化:与正常对照组比较,冠状动脉粥样硬化性心脏病组治疗前红细胞电泳时间显著延长,红细胞电泳长度与红细胞迁移率显著降低(t=3.198～6.963,P均＜0.01);治疗后红细胞电泳时间缩短,红细胞电泳长度与红细胞迁移率增加(t=2.212～3.672,P＜0.05或0.01),但仍与正常对照组存在显著性差异(t=1.700～4.792,P＜0.05或0.01).②治疗前后不同切变率下红细胞变形性变化:与正常对照组比较,冠状动脉粥样硬化性心脏病组治疗前在300 S-1,230 S-,115 S-1切变率下的红细胞变形性均显著降低(t=1.956～2.459,P＜0.05或0.01);治疗后各切变率下的红细胞变形性均显著增强(t=3.162～4.187,P均＜0.01),且在230 S-1、115 S-1、115 S-1切变率下冠状动脉粥样硬化性心脏病组红细胞变形性显著高于正常对照组(t=2.089～21748,P＜0.05或0.01).结论:冠状动脉粥样硬化性心脏病患者给予红花注射液后,红细胞电泳时间、电泳长度及迁移率均有所好转,且不同切变率下的红细胞变形性亦有所增强,提示红花注射液对冠状动脉粥样硬化性心脏病的干预与改善红细胞流变性异常有关.
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自体外周血干细胞经冠状动脉移植治疗急性心肌梗死:近期疗效随访
目的:观察经皮经腔冠状动脉内移植外周血干细胞治疗急性心肌梗死的可行性与近期临床疗效.方法:①实验对象:选取2003-11/2005-01辽宁省人民医院收治的急性心肌梗死患者70例,男56例,女14例,年龄(60±10)岁,体质量(73±11)kg,急性心肌梗死病程(5±2)d,均对本实验知情同意,实验方案经辽宁省人民医院伦理委员会批准.70例患者随机数字表法分为细胞移植组、常规治疗组,35例/组.两组基线资料基本相似.②实验方法:常规治疗组单纯给予药物治疗+冠状动脉造影术或支架植入术.细胞移植组在常规治疗的基础上应用粒细胞集落刺激因子皮下注射动员自体骨髓干细胞,连续5 d,第6天经血细胞分离机分离采集外周血干细胞悬液57 mL,经over the Wire球囊导管中心腔注入梗死相关动脉,注入CD34细胞数量为(7.25±7.33)×107个.③实验评估:在外周血干细胞动员、采集及经冠状动脉回输过程中观察患者不良反应.于术前及术后6个月检查两组患者左室形态、心功能、室壁节段性运动积分的改变.结果:术后6个月,细胞移植组全部完成随访,常规治疗组23例完成随访.①手术前后超声心动图参数值的变化:与术前比较,术后6个月细胞移植组左室收缩末容积、室壁节段性运动积分指数均明显下降(P＜0.05),左室射血分数显著升高(P＜0.05).术后6个月与常规治疗组比较,细胞移植组左室射血分数明显升高,室壁节段性运动积分指数显著降低,差异有显著性意义(P＜0.05).②安全性评估:外周血干细胞动员时不良反应占37.1%,分离和采集过程不良反应占15.3%,经冠状动脉内回输过程不良反应占20.0%.结论:经皮经腔冠状动脉移植自体外周血干细胞治疗急性心肌梗死,可在近期有效地减少心肌梗死缺血面积,减轻左室重构,改善心功能.
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层黏连蛋白与脑微血管内皮细胞对共同植入缺血模型大鼠脑内神经干细胞增殖与凋亡的调节
目的:将由神经干细胞、层黏连蛋白、脑微血管内皮细胞构建的共移植体植入缺血模型鼠大脑内,观察共移植体中神经干细胞的增殖和凋亡.方法:实验于1996-01/1996-12 在佳木斯大学神经科学所完成.实验材料:同一基因背景Wislar大鼠,体质量300～350 g,雄性,6月龄,购自哈尔滨医科大学实验动物学部.实验方法:①取出生24 h内Wistar新生鼠,培养冲经干细胞.②将传代脑微血管内皮细胞消化后,以3×107L-1密度接种于培养瓶中,12 h贴壁后吸出脑微血管内皮细胞培养液,涂以一层细胞外基质后,接种经0.125%胰酶消化20 min后吹打成单细胞的神经干细胞悬液,密度为6×108L-1,加入神经干细胞完全培养液.培养3～6 h,镜下观察神经干细胞完全贴壁后,吸出培养液,再涂以一薄层细胞外基质,接种以上相同密度脑微血管内皮细胞,加入神经干细胞完全培养液.共培养12～24 h,镜下观察脑微血管内皮细胞.利用免疫荧光方法检测共移植体.③制备大鼠脑缺血模型.模型制备完成后大鼠虽然有脑缺血症状,但伴下列情形之一的不纳入:神经学症状评分低于2分;取脑时发现蛛网膜下腔出血;脑组织石蜡切片苏木精-伊红染色无缺血病理改变;未到观察时相点便死亡的.共48只大鼠模型制作成功.将Wistar大鼠随机分为神经干细胞组、共移植体组,每组24只.2组分4个时间点3,7,14,60 d,每个时间点6只.模型建立后3 d,神经干细胞组移植神经干细胞,共移植体组移植共移植体,各5 μL.移植前神经干细胞经Brdu 5 mmol/L标记3 d,再将其溶解于PBS中,细胞密度调整为2×1011L-1,移植部位为右侧纹状体区.通过免疫组织化学和免疫荧光方法观察神经干细胞增殖和凋亡情况.结果:48只大鼠均进入结果分析.①神经干细胞增殖情况:细胞数3 d开始增加,14 d达高峰,60 d减少.两组3,7,14,60 d细胞数相比,差异显著(神经干细胞组:19.57±4.27,22.25±4.53,39.13±4.52,7.13±2.75;共移植体组:39.88±4.26,40.50±4.03,56.88±9.33,17.13±4.09,P＜0.05,P＜0.01).3,7 d细胞增殖数较稳定,Brdu阳性细胞主要集中在针迹部位,14 dBrdu阳性细胞多,散在分布,部分与周围组织整合,60 d Brdu阳性细胞细胞数下降,大部分已与周围组织整合.②神经干细胞凋亡率情况:随着时间延长,共移植体组细胞凋亡率降低,与神经干细胞组相比,差异显著[单纯神经干细胞组3,7,14,60 d分别为:(35.57±1.85)%,(28.58±1.26)%,(17.86±1.32)%,(2.05±0.67)%;共移植体组分别为:(24.77±2.44)%,(22.75±3.40)%,(9.88±1.81)%,(0.75±0.32)%,P＜0.05,P＜0.01].结论:层黏连蛋白和脑微血管内皮细胞与神经干细胞共移植体移植入缺血模型大鼠脑内可明显促进神经干细胞增殖,减少其凋亡.
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碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子β1诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为心肌细胞的作用比较
目的:对比观察碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子β1促进大鼠骨髓间质干细胞分化为心肌细胞的作用.方法:实验于2005-12/2006-07在中山大学干细胞与组织工程中心实验室进行.实验材料:清洁级大鼠由中山大学实验动物中心提供(SCXR(粤)2004-0011,粤监证字2004A089),三四周,大约50 g.实验方法:①分离培养大鼠骨髓间质干细胞,并采用流式细胞仪鉴定.②取第3代骨髓间质干细胞,以1×107L-1接种于24孔培养板和六孔板中,24 h后换液并分组:对照组:仅仅更换培养液;5-氮胞苷诱导组:10μmol/L 5-氮胞苷孵育24 h后更换新鲜培养液;5-氮胞苷+碱性成纤维生长因子诱导组:10μmol/L 5-氮胞苷孵育24 h后更换含10μg/L碱性成纤维生长因子的新鲜培养液;5-氮胞苷+转化生长因子β1诱导组:10μmol/L 5-氮胞苷孵育24 h后更换含10μg/L转化生长因子β1的新鲜培养液.以后每3 d换液1次,前2组换完全培养基,后2组分别换含10μg/L碱性成纤维生长因子和10μg/L转化生长因子β1的完全培养基.③30 d后应用RT-PCR法检测心肌细胞转录因子GATA-4、结蛋白表达,免疫细胞化学染色法检测细胞心肌肌钙蛋白,并在倒置显微镜下观察细胞跳动情况.结果:①骨髓间质干细胞的生长特性及鉴定:原代培养大鼠骨髓质干细胞3 d后镜下可见有细胞贴壁,形成克隆,七八天长满,随着换液和传代,细胞逐渐纯化,第3代细胞形成均一的长梭形,流式细胞仪检测发现CD44、CD29表达阳性,CD45、CD11b表达阴性.②骨髓间质干细胞向心肌细胞的分化:大鼠骨髓间质干细胞经5-氮胞苷、5-氮胞苷+碱性成纤维生长因子或5-氮胞苷+转化生长因子β1诱导30 d后,有部分细胞心肌肌钙蛋白表达阳性,GATA-4和结蛋白表达明显增强.镜下观察5-氮胞苷+碱性成纤维生长因子诱导组所诱导细胞变细、胞体伸长,呈心肌样细胞跳动,并较其他两组明显,心肌肌钙蛋白阳性细胞的比率较高(P＜0.05).结论:碱性成纤维生长因子在体外有协同5-氮胞苷促进大鼠骨髓间质干细胞分化为心肌细胞的作用,而转化生长因子β1无此作用.
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人骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞的诱导条件
目的:分析人骨髓间充质干细胞分离、纯化、体外扩增及其向软骨细胞分化的条件,为人骨髓间充质干细胞用于修复损伤的软骨组织提供依据.方法:实验于2005-03/2006-04在南昌大学医学院生化与分子生物学教研室完成.实验材料:无菌条件下采集无血液系统疾病和家族遗传史的28～65岁成人骨髓8份,进行骨髓间充质干细胞分离与培养,骨髓采集经患者及医院同意,并签署知情同意书.实验方法:取第3代对数生长期骨髓间充质干细胞,实验组使用特定的、内含2 mg/L胰岛素、3 mg/L转铁蛋白、1 mmol/L丙酮酸、100 nmol/L地塞米松和10μg/L转化生长因子β1的低糖DMEM培养基诱导人骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化,对照组细胞以低糖DMEM基础培养液培养.倒置显微镜下观察细胞形态,诱导7,14 d采用半定量RT-PCR方法检测细胞软骨特异性Ⅱ型胶原表达,蕃红花O-亮绿染色分析蛋白多糖粘多糖含量,观察细胞分化情况.结果:①光镜观察成人骨髓间充质干细胞的形态变化:培养7 d细胞集落明显,集落中央为数个至数十个圆形细胞,周围变形细胞围绕中央细胞呈放射状生长.培养14 d细胞呈平行状或旋涡状排布,细胞排列紧密.②骨髓间充质干细胞向软骨细胞的诱导分化:实验组细胞生长较对照组慢,培养7 d后细胞大多呈椭圆形或三角形,部分细胞伸出似触角突起,培养14 d细胞变形较明显,排列较为紧密,细胞突起多见,突起间相连,呈较明显软骨细胞形态特征.③骨髓间充质干细胞的番红花-O染色:实验组骨髓间充质干细胞蕃红花O-亮绿呈深染色,对照组人骨髓间充质干细胞呈阴性染色.④RT-PCR检测软骨特异性的Ⅱ型胶原COL2A1 mRNA表达:实验组诱导培养7,14 d人骨髓间充质干细胞有Ⅱ型胶原COL2A1 mRNA表达,400～500 bp条带间可见明显的荧光条带,诱导培养14 d时表达更明显.对照组未见Ⅱ型胶原COL2A 1mRNA表达.结论:采用直接贴壁培养法成功分离和培养出人骨髓间充质干细胞,并将人骨髓间充质干细胞诱导分化成软骨细胞,该软骨细胞具有软骨细胞的形态、生化特征.
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类胰岛素样生长因子1对3T3-L1前脂肪细胞增殖、分化的作用
目的:证实类胰岛素样生长因子1对3T3-L1前脂肪细胞增殖、分化的作用,并摸索该细胞因子对3T3-L1前脂肪细胞增殖、分化作用的佳质量浓度.方法:实验于2004-03/2004-07 在辽宁医学院科学实验中心完成.实验材料:小鼠胚胎3T3-L1前脂肪细胞株由ATCC提供,购于上海中科院生命科学院;类胰岛素样生长因子1购于美国Biological公司.实验方法:对照组为标准的高糖DMEM培养基,实验组为含有1,5,10,20,50,100μg/L类胰岛素样生长因子1的高糖DMEM培养基.用含体积分数为0.1胎牛血清的高糖DMEM培养基在37℃、体积分数为0.05 CO2的孵箱内培养3T3-L1前脂肪细胞,每48 h换液1次.实验评估:在倒置显微镜下观察类胰岛素样生长因子1作用前后3T3-L1前脂肪细胞的生长情况及形态学改变.待细胞铺满瓶底后,应用流式细胞仪检测细胞周期,应用噻唑蓝法测定3T3-L1前脂肪细胞增殖率:增殖率=实验组A值/对照组A值×100%,采用油红O染色提取法测定3T3-L1前脂肪细胞内脂肪含量增长率:增长率=实验组B值/对照组B值×100%.结果:①倒置显微镜下观察分化前3T3-L1前脂肪细胞呈梭形,胞浆内无脂滴,分化后3T3-L1前脂细胞呈圆形,胞浆内含有大量的脂滴,脂滴聚集于核周,被油红O染成橙红色,形成"戒环"样的形态.②噻唑蓝法检测结果和油红O染色提取法检测结果均显示,不同质量浓度类胰岛素样生长因子1对3T3-L1前脂肪细胞增殖、分化的作用,与空白对照组相比差异显著[培养1 d:(1.18±0.02)%,(1.29±0.01)%,(1.35±0.03)%,(1.47±0.04)%,(1.46±0.03)%,(1.47±0.05)%,(1.00±0.01)%;培养2 d:(1.40±0.03)%,(1.56±0.04)%,(1.67-+0.02)%,(1.82±0.05)%,(1.81±0.02)%,(1.82±0.09)%,(1.00±0.01)%,P＜0.05],20μg/L类胰岛素样生长因子1对3T3-L1前脂肪细胞增殖、分化的作用为明显(P=0.038 2);流式细胞仪分析结果与噻唑蓝法及油红O染色提取法基本一致.结论:体外细胞培养实验表明,类胰岛素样生长因子1对3T3-L1前脂肪细胞的增殖、分化有明显促进作用,其促进作用与质量浓度并非正比,而是达到一定的质量浓度后,其促进作用不再增加,而这个质量浓度接近本实验的佳质量浓度值,即20μg/L.
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肾包膜内注射骨髓间充质干细胞在链脲佐菌素糖尿病模型大鼠体内的定位及功能测评
目的:观察骨髓间充质干细胞在体外不诱导条件下,移植于链脲佐菌素所致糖尿病大鼠后在胰腺的定位及胰岛素分泌情况.方法:实验于2004-08/2006-03在2级实验室唐山工人医院中心实验室和具有国家认证的屏障动物环境实验室华北煤炭医学院动物中心完成.①实验材料:青年清洁级SD大鼠购自华北煤炭医学院动物中心(SCXK2002-0003),4周龄,体质量180～250 g,动物级别:SPF/VAF.②实验方法:体外培养雄性SD大鼠骨髓间充质干细胞,并采用流式细胞仪鉴定.选取雌性SD大鼠,按65 mg,kg剂量腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病大鼠模型.给药后二三天,大鼠血糖升高,当血糖≥16.7 mmol/L且稳定2 d,认为糖尿病模型建立成功.将建模成功的40只大鼠完全随机分为对照组、实验组,每组20只.对照组大鼠右侧肾包囊注射磷酸缓冲液0.2 mL,实验组大鼠右侧肾包囊下注射骨髓间充质干细胞0.2 mL,细胞数为4×105L-1.于移植前及移植后第 3,5,7天采大鼠尾静脉血检测血糖.③实验评估:于移植前及注射后7 d采大鼠心脏血检测C-肽值,移植后7 d取大鼠胰腺组织作石蜡切片,应用原位杂交技术检测Y染色体细胞.结果:40只大鼠全进入结果分析.①骨髓间充质干细胞鉴定:骨髓间充质干细胞呈梭形、放射状,形成数个细胞克隆时排列整齐,原代培养7～10 d即可长满,按1:3传代,生长四五天达融合.流式细胞术表面标志鉴定显示,培养的原代骨髓间充质干细胞表面标志CD90阳性,基质细胞表面标志CD44阳性,造血细胞表面标志CD45及内皮细胞表面标志CD31阴性.②大鼠尾静脉血血糖值、心脏血C-肽值分析:血糖结果显示,对照组治疗后第3,5,7天血糖值及C-肽值与治疗前相比,无明显变化(P＞0.05);实验组治疗后第3,5,7天血糖值较治疗前明显下降,治疗后第7天C-肽值明显上升,与对照组对应时间比较,差异均显著[实验组治疗前:(21.75±2.44)mmol/L,(0.21±0.01) μg/L;实验组治疗后:(12.23±1.95)mmol/L,(14.00±2.85)mmol/L,(12.75±2.86)mmol/L,(0.26±0.01) μg/L;对照组治疗后:(21.63±1.34)mmol/L,(23.03±1.11)mmol/L,(22.48±1.92)mmol/L,(0.21±0.01)μg/LP均＜0.01].③原位杂交技术检测Y染色体细胞:对照组大鼠胰腺组织切片中未见黄绿荧光Y染色体,实验组大鼠胰腺组织切片中可见黄绿荧光Y染色体,存在于胰腺腺泡间隙,或胰腺组织中.结论:雄性大鼠骨髓间充质干细胞在肾包囊注射下可到达雌性糖尿病大鼠胰腺组织,使糖尿病大鼠血糖下降,C-肽值升高,具有分化为胰岛素分泌细胞的可能性.
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间充质干细胞移植联合阿托伐他汀治疗大鼠急性心肌梗死
目的:观察间充质干细胞与阿托伐他汀联合应用对大鼠急性心肌梗死心功能的疗效,并与单纯间充质干细胞移植作比较.方法:实验于2005-02/2005-10在郑州大学基础医学院完成.①剥离6周龄、体质量60～80 g SD大鼠股骨和胫骨获取间充质干细胞,置于培养瓶中培养.在培养瓶中加入5-溴脱氧尿嘧啶,调整浓度至10 μmol/L,孵育72 h,调整细胞密度为4×1010L-1,移植备用.②选取体质量280～300 g成年SD大鼠建立急性心肌梗死模型.结扎大鼠左冠状动脉前降支,观察前壁心肌颜色变苍白,收缩力减弱,心电图相应导联ST段弓背向上抬高,确认心肌梗死模型建立成功.将建模成功40只大鼠分成4组.对照组:梗死部位分4点注射L-DMEM培养液;阿托伐他汀组:梗死部位分4点注射L-DMEM培养液,阿托伐他汀10 mg/(kg·d)溶人生理盐水2 mL,灌喂2周.间充质干细胞组:梗死部位分4点移植间充质干细胞,每点2×108个,50 μL.联合组:梗死部位分4点移植间充质干细胞,每点2×100个,50μL,阿托伐他汀10 mg/(kg·d),灌喂2周.③术后4周,应用超声检测大鼠左室射血分数和短轴缩短率,生理记录仪测定大鼠左室收缩压、舒张末压、压力变化大上升与大下降速率,采用免疫组织化学方法检测细胞组织学变化.结果:建模成功的40只大鼠全部进入结果分析.①大鼠心功能超声检查:间充质干细胞移植组与联合组左室射血分数、短轴缩短率均明显高于对照组和阿托伐他汀组,联合组升高更明显[左室射血分数:(20.87±2.25)%,(30.12±2.17)%,(43.40±3.57)%,(52.78±3.18)%;短轴缩短率:(17.74±1.77)%,(22.46±2.29)%,(29.89±2.50)%,(37.31±3178)%,P均＜0.05].②大鼠血流动力学检测:与对照组、阿托伐他汀组相比,间充质干细胞移植组与联合组左室收缩压、压力变化大上升与大下降速率均明显升高,舒张末压明显降低,联合组改善程度更明显[左室收缩压:(89.43±2.06),(97.58±3.13),(121.11±2.65),(129.84±3.46)mm Hg;舒张末压:(20.48±1.71),(17.37±1.17),(13.99±1.38),(9.89±1.74)mm Hg;压力变化大上升速率:(3 599±301),(4 043±216),(5 022±218),(5 515±408)mm Hg/s;压力变化大下降速率:(3 188±345),(3 226±387),(4 013±537),(4 657±401)mm Hg/s,P均＜0.05].③大鼠心脏组织学检测:对照组、阿托伐他汀组大鼠梗死区心肌纤维化明显,细胞排列紊乱,无新生心肌细胞.间充质干细胞移植组、联合组大鼠梗死心肌内可见5-溴脱氧尿嘧啶标记阳性细胞,对心肌肌钙蛋白T呈现阳性表达.结论:间充质干细胞联合阿托伐他汀应用治疗大鼠急性心肌梗死有协同提高疗效作用,其效果优于单纯间充质干细胞移植.
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自体骨髓单个核细胞移植治疗下肢缺血性疾病中细胞因子的作用
目的:评估自体骨髓单个核细胞移植治疗下肢动脉缺血性疾病中几种细胞因子的作用.方法:实验于2006-09/12在河北医科大学唐山临床学院中心实验室完成.实验材料:日本大耳白兔40只,清洁级,5月龄,体质量2.5～3.0 kg,由华北煤炭医学院动物中心提供(合格证为SCXK-2005-0002),采用完全随机设计方法将日本大耳白兔分为4组:对照组、缺血组、磷酸盐缓冲液组、骨髓单个核细胞治疗组,10只/组.实验方法:对照组不作任何干预措施,其他3组建立日本大耳白兔右下肢缺血模型.取右下肢缺血模型制备2周后的兔,分离获取骨髓单个核细胞.缺血组制备右下肢缺血模型后不作其他干预措施.磷酸盐缓冲液组模型制备2周后,用1 mL注射器将0.01 mol/L磷酸盐缓冲液分15点注射于右下肢股骨中点股内收肌群内.骨髓单个核细胞治疗组模型制备2周后,用1 mL注射器将1×109L-1骨髓单个核细胞悬液分15点注射于右下肢股内收肌群内.实验评估:造模后3 d切取内收肌组织标本,测量其组织匀浆中血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、白细胞介素1β的含量:4周后行数字减影血管造影术,术后取右下肢内收肌标本,采用CD34免疫组织化学法检测毛细血管密度,观察下肢血管再生情况.结果:40只日本大耳白兔均进入结果分析.①移植后4周腹主动脉造影检测:骨髓单个核细胞治疗组结扎股动脉处的远端毛细血管生成较明显,血管成网状.缺血组及磷酸盐缓冲液组结扎处远端毛细血管生成不明显.②CD34免疫组织化学方法检测毛细血管密度:对照组平均为16个/×400高倍镜,缺血组和磷酸盐缓冲液组平均为5个/×400高倍镜,治疗组毛平均为20.5个/×400高倍镜.骨髓单个核细胞治疗组肌肉标本毛细血管密度明显高于缺血组和磷酸盐缓冲液组(P＜0.05).③造模后3 d检测细胞因子含量:缺血组、磷酸盐缓冲液组、骨髓单个核细胞治疗组的碱性成纤维细胞生长因子含量明显高于对照组[(1.83±0.90),(3.22±2.10),(3.20±1.56),(3.75±1.07)ng/g,P＜0.05].骨髓单个核细胞治疗组白细胞介素1β含量明显高于对照组、缺血组、磷酸盐缓冲液组[(10.87±6.42),(10.74±6.32),(11.80±4.50),(16.73±4.21)ng/g,P＜0.05],各组血管内皮生长因子水平差异不明显(P＞0.05).结论:自体骨髓单个核细胞移植治疗缺血性疾病过程中,白细胞介素1β对毛细血管的生成起主要作用.
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人胚神经干细胞植入脑损伤大鼠的存活和分化状态
背景:神经干细胞的发现为中枢神经系统损伤修复带来希望,但脑损伤后的内部环境对神经干细胞存活和分化的影响是一个复杂多变的过程.目的:观察大鼠脑液压冲击伤后植入的人胚神经干细胞存活情况和分化状态.设计:开放性实验.单位:广东省中医院神经外科,北京市神经外科研究所.材料:实验于2002-09/2003-03在北京市神经外科研究所神经干细胞室完成.选取SD雌性大鼠24只(购自中国医学科学院实验动物研究所,动物质量合格证号:SCXK(京)2002-2003),7周龄,体质量(250±10)g.8周龄流产胎儿大脑(产妇及其家属均同意提供),流产过程中B超监测胎儿的存活状况.BrdU单克隆抗体(Sigma公司),兔抗巢蛋白多克隆抗体(Chemicon 公司),鼠抗微管相关蛋白2单克隆抗体(Neomarkers 公司),兔抗胶质纤维酸性蛋白多克隆抗体(Biogenex 公司).方法:①取8周龄流产胎儿大脑皮层细胞,体外培养获得人胚神经干细胞.②大鼠制作液压冲击伤模型.大脑皮质运动感觉区骨窗位置:以前囟为零点,向后2.5 mm,中线右3.0 mm.液压冲击参数:冲击压力0.3 Mpa,冲击时间25 ms,冲击次数为1次.③伤后24 h在损伤区移植标有BrdU的人胚神经干细胞,1周和4周后处死大鼠,邻片行BrdU/微管相关蛋白2和BrdU/胶质纤维酸性蛋白免疫组织化学双染.主要观察指标:①人胚神经干细胞移植后的存活及迁移.②人胚神经干细胞移植后的分化.结果:①BrdU阳性细胞为椭圆形棕褐色,移植后1,4周均可见其存活并向周围迁移,且移植后4周迁移的范围更广.②移植后1周,皮质颗粒层和皮层下均见较多的BrdU阳性细胞,且BrdU/微管相关蛋白2双阳性细胞多于BrdU/胶质纤维酸性蛋白双阳性细胞;移植后4周,BrdU阳性细胞数明显减少,脉络丛和微血管中可见BrdU阳性细胞,且BrdU/胶质纤维酸性蛋白双阳性细胞多于BrdU/微管相关蛋白2双阳性细胞.结论:人胚神经干细胞能够存活于脑损伤区域,移植后逐渐分化为星形胶质细胞,且易被内皮吞噬细胞所消化.提示免疫排斥反应可能影响人胚神经干细胞的存活.
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转化生长因子β1联合血管内皮细胞生长因子体外诱导胚胎干细胞向血管内皮细胞分化
目的:观察胚胎干细胞在转化生长因子β1和血管内皮细胞生长因子体外诱导分化血管内皮细胞的能力,探讨提高诱导效率的方法.方法:实验于2004/2006在南昌大学医学院第二附属医院血液病研究所进行.实验材料:成年昆明小鼠由南昌大学医学院动物科学部提供(机构许可证号:96021),经自然交配怀孕.小鼠胚胎干细胞129×1/SvJ细胞系,购于ATCC公司.实验方法:取孕12.5～14.5 d的胎鼠,制作小鼠胚胎成纤维细胞饲养层.在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上培养扩增胚胎干细胞.将饲养层上扩增后生长状态好的胚胎干细胞以0.25%胰酶消化,小心吹打成单个细胞悬液,以差速贴壁法将饲养层细胞去掉,按1×104L-1胚胎干细胞悬液悬滴在细胞培养皿的盖上,每滴10～20μL,不换液,3 d后形成拟胚体,培养液为不含白血病抑制因子的胚胎干细胞培养液.挑选状态好的拟胚体分3组:转化生长因子β1诱导组、血管内皮细胞生长因子诱导组、转化生长因子β1+ 血管内皮细胞生长因子诱导组.采用RT-PCR和免疫组织化学方法证实诱导的细胞是否为内皮细胞.结果:①胚胎干细胞体外诱导生长观察:3组中拟胚体贴壁后第2天,胚体均略摊开,周围有上皮样细胞出现,第3,4天有许多卵石样细胞产生,至第6天开始出现由卵石样细胞构成的管状结构,自胚体向周围呈辐射状生长,渐呈网状,诱导时间约2周.转化生长因子β1+ 血管内皮细胞生长因子诱导组中产生的管样结构的拟胚体数较转化生长因子β1诱导组、血管内皮细胞生长因子诱导组多(44.67±3.88,28.17±6.08,33.00±2.68,P＜0.05).②RT-PCR法检测基因mRNA水平:3组基因表达的扩增片断分别为1 086,733,265 bp,与DNAmark相比较,条带位置相符.③扩增细胞的免疫组织化学染色:Ⅷ因子抗体反应显示阳性.结论:转化生长因子β1与血管内皮细胞生长因子均能诱导胚胎干细胞为内皮细胞,两者合用有可能提高诱导效率.
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自体肌卫星细胞尿道内移植实验
目的:观察骨骼肌卫星细胞注射到尿道内存活的情况,探讨肌卫星细胞自体移植治疗压力性尿失禁的潜在可行性.方法:实验于2004-09/2005-09在福建医科大学附属协和医院内分泌学研究所和动物实验室完成.实验动物:清洁级3周龄雌性SD大鼠10只.实验分组:将大鼠分为实验组和对照组,每组5只.实验干预:①分别取其双下肢腓肠肌,采用1 g/L胶原酶-2.4 U/mLDispase和2.5 g/L胰蛋白酶两步法消化分离、纯化细胞并培养.采用0.01%的活体荧光染料荧光金对骨骼肌卫星细胞进行标记.②将荧光金标记的骨骼肌卫星细胞自体注射于实验组大鼠近端尿道3点和9点处的黏膜下及肌层,对照组大鼠于相同位置注射等体积的DMEM/F12无血清培养液.实验评估:①荧光显微镜下观察荧光金的标记效果,计算标记后细胞的死亡率.②三四天后麻醉下处死大鼠,取出后尿道组织进行冰冻切片,荧光显微镜下观察是否有标记的细胞,并进行Desmin免疫组织化学染色观察.结果:10只大鼠均进入结果分析.①培养细胞的鉴定,荧光标记的效果:成功分离、培养出原代细胞,免疫细胞化学染色示90%左右的细胞特异性结蛋白染色阳性,证实所培养出的细胞为骨骼肌卫星细胞;0.01%的荧光金对细胞的标记效果好,细胞的存活率与未标记组无明显差异,适合用于骨骼肌卫星细胞自体移植标记.②后尿道组织冰冻切片观察:实验组切片于荧光显微镜下可见到有荧光标记的细胞,免疫组织化学染色有Desmin阳性的细胞;而对照组切片未见到荧光标记的细胞,免疫组织化学染色为阴性.结论:骨骼肌卫星细胞注射到尿道内后仍有存活,有可能成为压力性尿失禁注射疗法的一种新型注射材料.
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诱导分化羊骨髓间充质干细胞作为组织工程瓣膜间质种子细胞的可行性
目的:对羊骨髓间充质干细胞加以诱导分化,并与大隐静脉来源的血管间质细胞进行比较,探讨其作为组织工程瓣膜种子细胞的可行性.方法:实验于2006-02/08在西京医院心血管病研究所完成.①家猪10只,屠宰后取主动脉瓣膜,尽量剔去血管外膜,浸入Hank's液中洗涤,制备去细胞主动脉瓣,苏木精-伊红染色比较脱细胞前后的组织特点.②成年杂种绵羊10只,麻醉后分别于股骨大转子穿刺抽取肝素化骨髓10 mL,稀释,离心,弃上清及脂肪层,余细胞用LG-DMEM无血清培养基重悬,铺于等体积的Percoll淋巴细胞分离液上,离心收集单个核细胞,消化传代培养.取第二、三代骨髓间充质干细胞,加入LG-DMEM条件培养基进行体外定向诱导分化.对诱导后细胞进行形态观察、免疫组化鉴定并绘制生长曲线.③上述10只绵羊抽取骨髓后,无菌条件下取大隐静脉,剥去静脉外膜,剪成1 mm3贴壁法培养,消化传代.④取第3代骨髓间充质干细胞与血管间质细胞,分别以5×104L-1密度接种于24孔培养板,常规孵育96 h.每孔各吸取培养基0.5 mL,测定两种细胞上清液中的羟脯氨酸含量.完毕后用胰蛋白酶消化处于对数生长期的细胞,加入冻存液,调整细胞密度为7x109L-1,置于液氮中,1周后复苏,计算两种细胞的存活率.⑤将去细胞猪主动脉瓣修剪成0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm大小,骨髓间充质干细胞、血管间质细胞均按105/cm2密度接种,置入37℃、体积分数为0.05的C02孵箱中.反复种植3次,每次间隔24 h,第4天各组均取出2份样本,扫描电镜观察.第7天向其余标本中加入四唑盐,采用酶联免疫检测仪490 nm处骨髓间充质干细胞组、血管间质细胞组的吸光度值,比较两种细结果:①新鲜的猪瓣叶中含有大量的成纤维细胞及内皮细胞.去细胞后,主动脉瓣中未见任何细胞及其碎片成分,纤维网架结构保持完整.②传代培养后的骨髓间充质干细胞和血管间质细胞形态相似,呈梭形或多角型,均于24 h内贴壁,3-4 d铺满瓶底;两种细胞对平滑肌肌动蛋白α、波形蛋白均呈部分阳性表达;且生长曲线相似,倍增时间分别为38 h和36 h(P＞0.05).③诱导分化后的骨髓间充质干细胞与血管间质细胞上清液羟脯氨酸含量基本相似[(1.52±0.21),(1.43±0.20)mg/L,P＞0.05].冻存复苏后,两种细胞的存活率亦基本相似[(85±3)%,(87±4)%,P＞0.05].④诱导分化后的骨髓间充质干细胞与血管间质细胞均能够种植在去细胞猪主动脉瓣上,两种细胞的吸光度值基本相似(0.50±0.04,0.48±0.03,P＞0.05).结论:诱导分化的骨髓间充质干细胞能够黏附在去细胞猪主动脉瓣膜支架上贴壁生长,与静脉来源的血管间质细胞在存活率、复苏后生长增殖情况、合成胶原功能等方面无明显差别,是合适的组织工程瓣膜间质种子细胞.
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猕猴骨髓间质干细胞移植修复脊髓损伤
目的:观察猕猴骨髓间质于细胞的诱导分化及其对损伤脊髓功能恢复的影响.方法:实验于2004-09/2007-01在中山大学实验动物中心完成,选用健康雄性恒河猴10只.①将体外分离传代获得的猕猴骨髓间质干细胞中加入Hoechst33342标记液,然后应用隐丹参酮进行诱导分化.②按照改良Allen氏法制作猕猴脊髓损伤模型,按随机数字表法分为2组,实验组(n=5)在脊髓损伤处头尾两端注射已初步诱导的猴骨髓间质干细胞,对照组(n=5)注射磷酸盐缓冲液.③细胞移植后1周至3个月,采用Tarlov评分方法(0～4级)评价猴损伤脊髓的功能恢复情况:0级为肢体完全瘫痪;4级为正常.④采用True blue逆行追踪实验评估轴突通路的再建情况.⑤移植术后3个月处死动物,将脊髓组织经苏木精-伊红染色后行组织学观察.结果:实验组5只动物均进入结果分析,对照组2只进入结果分析.①猴骨髓间质干细胞诱导分化半小时后,神经元样细胞的胞体和轴突呈神经元特异性烯醇化酶强阳性表达.细胞移植3个月后,实验组猴子的脊髓损伤段冰冻切片中有大量Hoechst33342 标记阳性的细胞.②实验组术后1周起即可见动物双下肢有轻微动作,至2个月左右,猴子的脊髓功能基本得以稳定,此时Tarlov评分介于2级与3级之间.与实验组相比,对照组动物脊髓功能无恢复.③实验组可见脊髓组织形态完整,细胞无变性衰亡.④实验组动物的胸段脊髓和大脑感觉运动区的冰冻切片上均发现了True blue标记阳性的细胞.结论:骨髓间质干细胞来源的神经元能够促进脊髓损伤猕猴的运动功能恢复.
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内皮前体细胞自体移植促进缺血心肌血管的新生
目的:观察内皮前体细胞自体移植后能否促进血管新生、改善心肌灌注、进而改善心脏功能.方法:实验于2004-01/05在解放军总医院心内科实验室完成.①实验分组:雄性新西兰白兔32只,体质量3.0～3.5 kg,随机分为治疗组和对照组,每组16只.②实验方法:治疗组自骨髓获取内皮前体细胞培养扩增.结扎动物冠状动脉前降支根部.心电图检测至少5个胸前导联出现ST段显著抬高作为模型制作成功标志.2.5 g/L胰蛋白酶消化细胞,洗涤干净后5 mL磷酸盐缓冲液悬浮细胞,结扎前降支2 h后将细胞悬液从耳静脉注入动物体内,移植细胞数量为(9.8±2.9)×100个/只.对照组注射磷酸盐缓冲液5 mL.饲养5周.③实验评估:分别行超声心动图检查和左心室压力曲线检测心脏功能和心肌组织的梗死情况以及通过免疫组织化学检测观察血管密度.结果:纳入新西兰白兔共32只,因前降支细小排除2只.对照组因心功能衰竭和腹泻各死亡1只.治疗组结扎前降支后突发室性心律失常死亡1只.终27只进入实验.①体外培养的内皮前体细胞生长迅速,能够在2～3周达到预定移植细胞数量.②内皮前体细胞移植5周后,超声心动图检测显示治疗组动物心肌功能指数显著降低(P＜0.01),左心室射血分数显著高于对照组(P＜0.01),左心室舒张末压明显低于对照组(P＜0.05),而等容收缩期左室压力大上升速率显著升高(P＜0.05).③治疗组心肌梗死面积显著减小(P＜0.01),而血管密度明显高于对照组(P＜0.01).④标记细胞主要位于梗死心肌组织,大部分整合至毛细血管中,参与血管新生.结论:内皮前体细胞自体移植能促进缺血心肌血管新生,有效改善缺血心肌的灌注,进而改善心脏功能.
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体外无血清培养基条件下诱导人骨髓基质细胞为神经干细胞的特征
背景:体外诱导骨髓基质细胞向神经元样细胞分化的方法主要是应用抗氧化剂如β-巯基乙醇、全反式维甲酸、丹参等,这些诱导方法分化的主要是神经元样细胞,这种细胞是否具有神经元的功能有待进一步观察.目的:观察体外无血清培养基条件下人骨髓基质细胞向神经细胞分化的特点.设计:观察实验.单位:潮州市中心医院.材料:实验于2004-04/2005-12在潮州市中心医院完成.成人骨髓来源于3例骨折患者的股骨和胫骨骨髓,获得患者及其家属的同意及潮州市中心医院伦理委员会批准.重组人碱性成纤维细胞生长因子和重组人表皮生长因子为Sigma公司产品;鼠抗波形蛋白单克隆抗体、鼠抗S100单克隆抗体、鼠抗TrkC单克隆抗体、鼠抗髓鞘基础蛋白单克隆抗体、SP-9000试剂盒和即用型AEC为北京中山公司产品;鼠抗GFAP单克隆抗体、兔抗巢蛋白多克隆抗体、鼠抗神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体和鼠抗神经微丝200单克隆抗体在武汉博士德公司购买;鼠抗βⅢ管蛋白单克隆抗体为Sigma公司产品.方法:在手术骨折内固定过程中获得成人骨髓,缓冲液冲洗后分离细胞,原代培养的细胞融合时传代培养,细胞种植在神经干细胞的N2培养基或B27培养基,同时加入20μg/L的碱性成纤维细胞生长因子及表皮生长因子,放入含体积分数0.05 CO2的培养箱中37℃常规培养,相差显微镜下观察骨髓基质细胞在无血清培养基中的形态变化,培养2 d后采用免疫细胞化学方法检测骨髓基质细胞的神经细胞相关标志物的表达.主要观察指标:骨髓基质细胞的形态变化及神经细胞相关标志物的表达.结果:①从成年人的骨髓中分离出骨髓基质细胞,在体外生长形态类似成纤维细胞,可以维持在未分化状态稳定增殖,体外扩增可超过10代.骨髓基质细胞在无血清神经干细胞的培养基中生长状态类似神经干细胞,可以形成典型的球状结构.②细胞球可表达神经干纽胞的标志物波形蛋白和巢蛋白;细胞分化可以表达神经元的标志物神经微丝200、神经元特异性烯醇化酶、TrkC和βⅢ管蛋白;部分分化的细胞表达胶质纤维酸性蛋白和S100,说明细胞分化为星形胶质细胞.结论:骨髓基质细胞在神经干细胞的无血清的培养基中细胞的生长状态、表达的标志物和分化的细胞类型与神经干细胞类似.
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脑源性神经营养因子基因修饰的人脐血干细胞移植对损伤脊髓组织的保护
目的:观察损伤脊髓组织经脑源性神经营养因子基因修饰的人脐血干细胞移植后,细胞内环境的改善及下肢运动功能、电生理指标的变化.方法:实验于2005-10/2006-09在广东医学院实验动物中心完成.①选取清洁级SD大鼠96只,随机数字表法分为4组:基因修饰细胞移植组、单纯细胞移植组、损伤对照组、正常对照组,24只/组.新鲜脐带血来源于广东医学院妇产科健康产妇,产妇及其家属均知情同意.脑源性神经营养因子的DNA由解放军第二军医大学提供.②基因修饰细胞移植组、单纯细胞移植组、损伤对照组大鼠制备脊髓半横断损伤模型,无菌条件下显露T7～9棘突及椎板,暴露T8平面脊髓,用弯刀将左侧半脊髓横向切断,再用负压吸引器吸除脊髓组织,形成一个2 mm×2 mm×2 mm的间隙.③采集人脐血单个核细胞,以1×109L-1密度接种于含10 mL DMEM,F12的培养皿中,同时以终浓度5μmol/L的Brdu标记,置于含体积分数为0.05的CO2细胞培养箱中,48 h后磷酸盐缓冲液反复离心洗涤,制备密度为6×109L-1的人脐血干细胞悬液,进行脑源性神经营养因子DNA质粒的提取、鉴定、纯化,转染.④将转染的人脐血干细胞悬液重悬为2.5×1010 L-1,取3μL浸透在与宿主脊髓损伤间隙大小一致的明胶海棉上,并将其植入基因修饰细胞移植组大鼠脊髓损伤处,确认植入后缝合硬脊膜、肌层及皮肤.单纯细胞移植组单纯植入含2.5×1010L-1高纯化的人脐血干细胞3μL的明胶海绵.损伤对照组仅植入明胶海绵.⑤移植术后24 h,每组取8只大鼠进行脊髓水肿程度及离子含量检测.移植术后6,12周,每组各取8只大鼠以爬坡试验检测其下肢运动功能情况,并采用颅刺激法检查运动诱发电位.结果:各组24只SD大鼠均进入结果分析.①脊髓水肿程度及离子含量:脊髓损伤后组织水肿及Na+、Ca2+含量升高,K+、Mg2+含量降低,经脑源性神经营养因子基因修饰的人脐血干细胞脊髓内移植后可显著改善上述指标.与损伤对照组比较,基因修饰细胞移植组脊髓含水量及Na+、Ca2+含量显著降低(t=1.77～1.79,P均＜0.05),K+、Mg2+含量升高(t=2.05～2.41,P均＜0.05).②下肢运动功能评估:移植术后6周,除正常对照组外各组大鼠左下肢均瘫痪,爬坡试验为0级.移植术后12周,基因修饰细胞移植组大鼠肌力恢复至Ⅱ级,单纯细胞移植组恢复至Ⅰ级.损伤对照组0级.③电生理检查:移植术后6周,基因修饰细胞移植组记录到运动诱发电位,而单纯细胞移植组、损伤对照组未记录到.术后12周,基因修饰细胞移植组、单纯细胞移植组大鼠均记录到运动诱发电位,但与基因修饰细胞移植组比较,单纯细胞移植组运动诱发电位潜伏期延长,波幅降低;损伤对照组仍未记录到运动诱发电位.结论:脑源性神经营养因子基因修饰的人脐血干细胞脊髓内移植对脊髓损伤起保护作用,其机制可能与减少神经细胞离子失衡、改善细胞内环境有关.
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人脐血CD34+ 细胞静脉移植对急性心肌梗死大鼠血流动力学指标和超声心动图指标的影响
目的:观察人脐带血CD34+ 细胞移植治疗急性心肌梗死大鼠的可行性及其对心功能的影响.方法:实验于2006-03/10在首都医科大学附属北京友谊医院完成.①选取11～13周龄雄性SD大鼠40只,随机数字表法分为假手术组10只、模型对照组15只、细胞移植组15只.脐血由北京市脐血干细胞库提供,采自无妊娠并发症、身体健康、新生儿足月分娩(37～40周)孕妇,均签署知情同意书,自愿捐献用于科学研究和临床治疗.②一次性血袋抽取孕妇脐带血80～120 mL,按5:1比例加入60 g/L羟乙基淀粉,4℃ 420 r/min离心8 min;去除红细胞,留取上层含有核细胞的血浆层,4℃1 180 r/min离心10 min,去除血浆,留取有核细胞,测CD34+ 含量为0.35%～0.42%.③模型对照组、细胞移植组大鼠建立急性心肌梗死模型,麻醉后切开第4、5肋间肌,暴露心脏,在动脉圆锥和左心耳间、距左心耳下1 mm处(相当于左前降支近段)用Prolene线结扎.假手术组只挂线不结扎.根据左室前壁颜色变白、活动减弱和心电图ST段明显抬高作为急性心肌梗死模型成功标志.④术后3 h内,细胞移植组经尾静脉注射0.5 mL 人脐血干细胞悬液(含干细胞2×1010L-1),模型对照组经尾静脉注射0.5 mL生理盐水.饲养30 d.⑤分别于术前、术后1 d和术后30 d进行超声心动图检测.并于术后30 d进行血流动力学检测.结果:假手术组挂线过程中死亡1只,模型对照组造模及细胞移植过程死亡4只,细胞移植组造模及细胞移植过程死亡5只.①人脐血CD34+细胞移植30 d后对大鼠血流动力学的影响:与假手术组比较,模型对照组左室收缩压、左室压力大变化率均明显减小(f=2.16～5.14,P均＜0.05),左室舒张末压、心率均明显增加(f=2.01～8.86,P＜0.01或0.05);与模型对照组比较,细胞移植组左室收缩压、左室压力大变化率均明显增加(t=2.72～2.35,P均＜0.05),左室舒张末压明显减小(t=4.24,P＜0.01),心率无明显变化(t=1.67,P＞0.05).②人脐血CD34+ 细胞移植前后超声心动图检查结果:与假手术组比较,术前模型对照组和细胞移植组各指标无明显变化;术后1,30 d模型对照组和细胞移植组左室舒张末期内径、左室收缩末期内径、左室舒张末容积、左室收缩末容积均明显增加(t=2.14～9.98,P＜0.05或0.01),左室前壁厚度、左室后壁厚度、左室射血分数、左室短轴缩短率均明显减小(t=2.52～14.23,P＜0.05或0.01).与模型对照组比较,术前和术后1 d细胞移植组各指标无明显变化,但术后30 d左室舒张末期内径、左室收缩末期内径、左室舒张末容积、左室收缩末容积均明显减小(t=2.07～7.04,P＜0.05或0.01),左室前壁厚度、左室后壁厚度、左室射血分数、左室短轴缩短率均明显增加(t=3.22～9.85,P均＜0.01).结论:在未使用免疫抑制剂的情况下,人脐带血CD34+细胞静脉移植可明显改善急性心肌梗死大鼠各项心功能指标,未见明显不良反应.
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骨髓单个核细胞磁探针标记和自体移植后磁共振成像
背景:在多种移植细胞中.成体自身骨髓单个核细胞以其取材简便、无排异反应、无伦理学争议等优势成为具有临床应用价值的细胞来源.干细胞移植后,如何从受体辨别供体细胞,并观察其在受体中的生存状况,一直是让人困扰的问题.目的:应用超顺磁性氧化铁颗粒标记小型家猪骨髓单个核细胞,观察磁共振成像示踪磁探针标记细胞的可行性.设计:对照观察实验.单位:东南大学附属中大医院心血管病研究所.材料:实验于2006-04/2006-08在东南大学心血管病研究所完成.健康中国小型雄性家猪,三四月龄,体质量20-30 kg,由东南大学实验动物中心提供(SYXK(苏)2002-0012).方法:分离培养小型家猪自体骨髓单个核细胞,采用超顺磁氧化铁颗粒对骨髓单个核细胞分离当日细胞悬液中进行标记,普鲁士蓝染色显示细胞内铁,台盼蓝拒染法评估细胞活力.将11只用于心肌梗死模型制备的猪分为实验组9只和对照组2只.选择经皮行左或右颈动脉或股动脉穿刺途径,以1.5-2.0 mm球囊封堵左前降支下1/3,304～405 kPa,持续封堵60 min后,术前反复予缺血预适应三四次.由猪体表心电图证实心肌梗死模型成功后,经皮冠脉内骨髓单个核细胞输注:梗死模型建立24 h后,经皮股动脉穿刺行冠脉造影,应用OTW导管冠脉内输注骨髓单个核细胞细胞悬液,然后将盛放细胞的注射器及OTW导管以肝素生理盐水冲洗注入残余细胞,注射时间10 min,对照组2只猪经同样方法注入未标记细胞.术后磁共振活体示踪骨髓单个核细胞并与心肌组织切片普鲁士蓝染色对照.结果:实验组7只和对照组1只小型家猪进入结果分析,两组各1只死于心肌梗死模型制备,实验组1只死于磁共振检查前麻醉意外.①骨髓单个核细胞的超顺磁氧化铁颗粒标记率近100%,在含Fe203-多聚左旋赖氨酸的培养基中骨髓单个核细胞可继续增殖,细胞形态无明显变化.②8只心肌梗死模型中,5只标记细胞移植后T2*WI序列心肌梗死周边见模糊的低信号区,4周后低回声信号均消失,离体T2*WI序列示梗死区周边一个呈点状分布的低信号区.③组织学检查发现5只(细胞数106以上)普鲁士蓝细胞阳性,分布部位与磁共振信号减低区一致.结论:超顺磁氧化铁颗粒标记骨髓单个核细胞安全、有效;T2*WI对磁标记骨髓单个核细胞的示踪敏感;磁共振可对经冠脉途径植入的磁标记的干细胞进行活体示踪,磁共振信号改变与干细胞数目及分裂增殖状态相关.
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电刺激小脑顶核联合神经干细胞共移植体治疗大鼠局灶性脑缺血
目的:观察局灶性脑缺血大鼠植入神经干细胞共移植体联合电刺激小脑顶核对新生血管密度的影响.方法:实验于2005-08/2006-11在佳木斯大学神经科学研究所完成.①实验分组:选取同一基因背景大鼠96只,随机数字表法分成4组:神经干细胞组、电刺激+神经干细胞组、神经于细胞共移植体组、电刺激+神经干细胞共移植体组,24只/组,移植后3,7,14,60 d每个时间点各6只;另取新生24 h内Wistar鼠1只用于神经干细胞的培养.共移植体由神经干细胞、层粘连蛋白和血管内皮细胞构成,由本实验室提供并鉴定.②实验方法:各组大鼠均采用线栓法建立大脑中动脉缺血模型,其中电刺激+神经干细胞组、电刺激+神经干细胞共移植体组于造模前1 d行小脑顶核电刺激.以前囟为零点、正中线向后11.6 mm、正中线向右1.2 mm钻开颅骨后,用电针刺入脑内深5.6 mm,给予直角方波脉冲刺激,电流强度为50μA,频率为0～100 Hz,时程为0.5 ms,连续刺激1 h.各组均在造模后3 d进行移植,移植部位为右侧纹状体缺血半暗带区.移植前分别将培养的神经细胞、神经细胞共移植体溶解于磷酸盐缓冲液中,细胞浓度调整为2×1010L-1.单纯神经干细胞组、电刺激+神经干细胞组植入神经干细胞悬液10μL,神经干细胞共移植体组、电刺激+神经干细胞共移植体组植入神经干细胞共移植体悬液10 μL.③实验评估:各组分别于移植后3,7,14,60 d腹腔麻醉取脑,制作石蜡切片,免疫组织化学法检测新生血管生成情况.结果:①新生血管免疫组织化学检测结果:新生血管是由单层扁平上皮细胞构成的,经免疫组化DAB显色后,新生血管内皮细胞的胞浆呈棕黄色,存在基底膜完整、不完整或无基底膜3种情况.②各种干预因素在不同时间点对新生血管生成的影响:各组在移植后3 d均有新生血管生成,7 d生成数量达到高峰,14 d生成数量开始减少,至60 d有较少的新生血管生成.以上各时间点电刺激+神经干细胞共移植体组新生血管密度均显著高于另外3组(F=7.12～15.86,P均＜0.05).结论:电刺激小脑顶核与神经干细胞共移植体移植能够促进大鼠局灶性脑缺血区新生血管的生成.
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干细胞与胃癌
目的:概述与胃癌发生发展关系密切的干细胞的研究进展.资料来源:检索Pubmed 1998-02/2007-02关于干细胞与胃癌的文章.检索词为"stem cell;cancer stem cell;marrow stemcell;gastric carcinoma"并限定语言种类为英文.资料选择:对资料进行初审,纳入标准:①与肿瘤干细胞相关的研究.②胃干细胞、骨髓干细胞与胃癌相关的研究.排除标准:重复性研究.资料提炼:共收集到123篇文章,排除94篇重复性研究,纳入29篇与纳入标准为贴近的文章.资料综合:肿瘤干细胞是指肿瘤组织中存在的一小部分具有干细胞性质的细胞群体,具备面度的自我更新能力和增埴能力,也具备多向分化的潜能,是形成不同分化程度肿瘤细胞和肿瘤不断扩大以及复发的源泉.其与干细胞具有许多共同的特性:具有自我更新能力和分裂增殖能力,具有相似的生长调控机制,具有很强的分化能力等.胃组织也存在自己特异的干细胞.据肿瘤干细胞理论,认为胃癌的发生与干细胞的突变有关.生长调控机制失控可解释胃癌与干细胞的关系.由于缺乏特异性标志,不了解调节胃干细胞增殖分化的分子通路,目前还没有理想的技术可以分离纯化出人类胃干细胞.在成体组织中,肿瘤的发生来自骨髓干细胞在再生修复过程中异常分化的结果,而并不是原组织中已分化成熟细胞的突变后产生,肿瘤的不断增大需骨髓干细胞持续的提供"原材料".结论:胃干细胞在胃黏膜上皮的克隆化、更新增殖及胃癌的形成中起重要作用,但还有许多空白,更多的观点是基于现象的分析和理论的推断,作为肿瘤学研究的一个新领域,还有许多问题需要进一步解决.
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干细胞移植在帕金森病治疗中的应用与进展
目的:综述干细胞移植治疗帕金森病的机制与进展. 资料来源:应用计算机检索Medline 2000-01/2006-12与干细胞移植治疗帕金森病相关的文章,检索词为"stem cell,Parkinson disease,transplantation".限定文献语种为"English";万方数据库2004/2007期间与有关文章,检索词为"干细胞,帕金森病,移植",并限定文章语言种类为中文.资料选择:对资料进行初审,并查看每篇文献后的引文.选择所述内容与干细胞移植治疗帕金森病的机制及应用进展相关的文章,无论观察对象是实验动物还是患者全部纳入,重复的研究以近3年且发表在较权威杂志者优先.资料提炼:共收集到500余篇相关文献,52篇符合纳入标准,选用其中31篇作为本文参考文献.资料综合:干细胞能向特定神经细胞定向分化,并在动物模型身上取得明显的治疗效果,为干细胞移植治疗帕金森病带来了新的希望.另外,联合TH、胶质细胞源性神经营养因子基因治疗帕金森病,由于胶质细胞源性神经营养因子的神经营养作用和TH具有分泌多巴胺能神经递质的功能.既能提高脑内多巴胺水平,又能使多巴胺能神经元长期存活、阻止多巴胺能神经元变性,重建宿主神经通路.因此,把干细胞作为基因载体、进行干细胞移植联合多基因治疗,为帕金森病的治疗提供了新的思路.结论:目前大部分的干细胞治疗帕金森病的研究结论是基于动物实验的结果,它们能否在人类身上得到类似或更好的的结果,目前尚未可知,其分子机制、致瘤性及免疫排斥等问题还需进一步研究.
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干细胞在妇产科领域的研究进展
目的:介绍干细胞在妇产科领域中的新研究及应用进展.资料来源:应用计算机检索Medline 1996-01/2006-12与干细胞在妇产科中的研究及应用相关的文章,检索词为"stem cell,qene therapy in the uterus,ovarian cancer,hysterocarcinoma",限定文献语种为"Englishl";同时检索万方数据库2000-01/2006-12相关文章,检索词为"干细胞,宫内治疗,卵巢癌,子宫癌",限定文献语种为中文.资料选择:共检索到相关文献180余条,选择干细胞在宫内治疗、生殖器官再造、辅助治疗以及妇科肿瘤方面的文章,无论观察对象是人还是动物均纳入,筛除明显重复和综述文献.资料提炼:将筛选的文献进一步查找全文,纳入30条文献进行综述.其中15篇论述干细胞在生殖器官再造方面的研究,7篇关于产科领域的研究进展,另外8篇是介绍干细胞在生殖医学和妇科肿瘤方面的应用.资料综合:①干细胞的发现和研究,为宫内治疗开辟了条新途径.目前进行宫内基因治疗的方法主要有两种:一是将作为靶细胞的干细胞,在体外进行转染后再输入受体胎儿体内,即间接法;另一种是直接将带有目的基因的载体注入到受体胎儿体内,在体内转染干细胞、表达外源基因而达到治疗目的,即直接法.②干细胞在生殖器官再造、男性不育治疗和保存生育能力等生殖医学领域的研究也取得了重大进展.③干细胞对妇科肿瘤的早期诊断有重要截止,如宫颈上皮干细胞中DNA含量和DNA异倍体的检出对早期识别细胞癌变及判断预后有重要意义.另外干细胞介入妇科恶性肿瘤的基因治疗有着无可比拟的优势,而且干细胞还可用于妇科恶性肿瘤的免疫治疗以及化疗或放疗所致的组织损伤的修复.结论:干细胞在妇产科应用广泛,特别是在器官再造、宫内治疗、辅助治疗以及妇科肿瘤等方面有很好的临床应用前景.
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嗅鞘细胞移植修复脊髓损伤的新思考
目的:针对嗅鞘细胞移植在脊髓损伤修复中的作用进行综述,并对可能导致佳细胞移植干预脊髓损伤效果的特定因素进行深入探讨.资料来源:应用计算机检索Medline 1994-01/2007-03期间关于嗅鞘细胞移植与脊髓损伤的文章,检索词"olfactory ensheathing cells,spinal cord injury",并限定语言种类为English.同时计算机检索万方数据资源系统与中国期刊全文数据库1994-01/007-03关于嗅鞘细胞移植与脊髓损伤的文章,限定文章语言种类为中文,检索词"嗅鞘细胞,脊髓损伤".资料选择:对资料进行初审,选取包括实验组和对照组的文献,筛除非随机实验,对剩余的文献开始查找全文,进一步判断为随机对照实验.纳入标准:①随机对照实验,采用单盲,双盲或非盲法.②实验包含平行对照组.排除标准:重复性实验研究及综述类文章.资料提炼:共收集到45篇关于嗅鞘细胞干预脊髓损伤的随机实验文章,30篇符合纳入标准,排除的13篇为重复的同一研究和综述.资料综合:综述神经干细胞、胚胎干细胞移植以及基因修饰的嗅鞘细胞治疗脊髓损伤的方法,并对各方法给予评价.细胞联合移植治疗各有特色,但所有的实验结果主要以啮齿类动物-大鼠的脊髓损伤模型为基础而获得的,选择的模型包括脊髓完全横断模型、挫裂伤模型、脱髓鞘模型等,目前还不能获得完全模拟人的脊髓损伤的动物模型.如何选择适当的细胞类型联合应用,并使之实现从实验室走向应用研究是不同细胞移植策略中应重点考虑的问题.结论:尚无充分证据证明目前的嗅鞘细胞联合干预策略对人类脊髓损伤后的功能恢复有十分确切的作用,但单一、纯化的嗅鞘细胞移植可能不是干预脊髓损伤的佳选择.
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间充质干细胞生物学特征及体外向血管内皮细胞的诱导分化
目的:间充质干细胞具有跨胚层分化等特性,因其体外分离培养可分化为血管内皮细胞,成为血管组织工程学的研究热点.本文对近期国内外间充质干细胞生物学特性和向血管内皮细胞分化的研究作一综述.资料来源:应用计算机检索Medline数据库2000-01/2007-02间充质干细胞生物学特性和向血管内皮细胞诱导分化的文章,检索词"endothelial,mesenchymal stem cells,differentiation",限定文章语言种类为English.同时计算机检索中国期刊全文数据库、万方数据库2000-01/2007-02期间的相关文章,检索词"血管内皮细胞,间充质干细胞,分化",限定文章语言种类为中文.资料选择:对资料进行初审,选取符合要求的文章查找全文.纳入标准:①有关间充质干细胞生物学性状的研究.②有关间充质干细胞诱导分化为内皮细胞方面的研究.排除标准:重复研究.资料提炼:共收集到95篇有关间充质干细胞生物学特性及向血管内皮细胞诱导分化的文章,排除重复的同一研究,28篇文章符合要求.资料综合:①国内间充质干细胞生物学特性及向血管内皮细胞定向诱导分化的研究:利用间充质干细胞向内皮细胞分化的特性在相关实验研究方面已取得一定的进展.②国外间充质干细胞生物学特性及向血管内皮细胞定向诱导分化的研究:研究的重点在间充质干细胞诱导分化为内皮细胞的机制,并在动物实验方面取得了良好效果.③间充质干细胞生物学特性及向血管内皮细胞定向诱导分化的研究展望:利用间充质干细胞生物学特性和血管组织工程学技术等方法为临床血管移植提供新策略.结论:通过间充质干细胞的分离扩增技术并添加内皮细胞诱导剂,在体外定向诱导出内皮细胞,这将为血管组织工程学提供广阔的应用前景.
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β-巯基乙醇在大鼠骨髓基质细胞向神经干细胞诱导分化中的作用
目的:探讨骨髓基质细胞诱导分化为神经干细胞的更佳培养液组成.方法:实验于2005-10/2006-08在省级实验室北华大学医学院实验中心完成.①实验材料:体质量120～160 g的Wistar大鼠,由北华大学动物中心提供.②实验方法:取120～160 g大鼠3只,体外分离培养大鼠骨髓基质细胞.培养约14 d,待原代细胞贴满培养瓶,呈成纤维细胞样生长,用0.25%胰蛋白酶消化原代细胞约3 min,在倒置显微镜下见贴壁细胞基本收缩成类圆形后,加入含胎牛血清的DMEM培养液终止消化,并将细胞液吹打均匀,以1×107L-1接种于2个细胞培养瓶中进行1:2传代扩增培养.在传代培养细胞培养液中加入神经细胞诱导剂,选取生长良好的2,3,4代细胞进行实验.取第5代培养细胞,以8×103/cm2接种于预铺有盖玻片3.5 cm培养皿中制备细胞爬片,每孔加入含体积分数为0.1胎牛血清的DMEM培养液2 mL,达80%融合时更换新鲜培养液,并在培养液中加入1 mmol/L β-巯基乙醇,诱导24 h,磷酸盐缓冲液洗涤,换成含1 mmol/L/L β-巯基乙醇的无血清培养液,5 h后更换为改良神经细胞培养液,并设立未加入含β-巯基乙醇培养液的为对照.利用免疫组织化学方法检测神经元特有巢蛋白.结果:①培养的骨髓基质细胞形态学变化:接种初期,细胞贴壁生长是以分散的、克隆集落方式增殖,细胞呈圆形漂浮于培养液中,培养10 d后,细胞形态基本为纺锤形的成纤维细胞样,偶有宽大扁平的多边形细胞,细胞逐渐长出小突起,出现出芽现象,14～20 d后,突起细胞增多,突起延长并相互连接成网,具有神经细胞形态特征.②免疫组织化学染色检测神经元特有巢蛋白:1周左右,细胞可表达巢蛋白阳性,细胞大而圆,呈棕褐色,经培养诱导分化2周后的长突起细胞,表达神经元特异性抗原巢蛋白阳性细胞互相成网状连接.实验组第4代90%细胞巢蛋白阳性,在荧光显微镜下细胞发黄绿荧光,对照组第1代细胞约30%细胞呈巢蛋白阳性,荧光弱.结论:在诱导培养液中加入β-巯基乙醇,可明显促进骨髓基质细胞的分化,并可获得神经干细胞.
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扫描电镜观察组织工程神经支架与骨髓间充质干细胞的共同培养
目的:扫描电镜观察骨髓间充质干细胞在组织工程神经支架中生长、附着状态,探讨骨髓间充质干细胞与该支架细胞的亲合性.方法:实验于2006-02/2006-12在中国医科大学神经解剖研究室完成.实验材料:180～200 g成年清洁级健康雄性wistar大鼠,用于制备无细胞神经移植物,100～120 g成年清洁级健康雄性wistar大鼠,用于制备骨髓间充质干细胞,均由中国医科大学实验动物部提供(SCXK(辽)2003-0009).实验方法:①无细胞神经移植物的制备:参考刘承吉等组织工程化天然神经支架制备方法制备无细胞神经移植物.②骨髓间充质干细胞的体外培养与鉴定:无菌条件下分离wistar大鼠股骨、胫骨,用低糖DMEM培养液反复冲洗骨髓腔,收集冲洗液,1 000 r/min 4℃离心10 min,去上清液,DMEM培养液重悬细胞,置于37℃、体积分数为0.05的CO2孵箱内培养,24 h半量换液,48 h全量换液,每二三天换液1次,5～7 d后达到80%融合,0.25%胰酶消化,离心,按1:2传代培养,留取3代备用.采用免疫组织化学染色法鉴定.③骨髓间充质干细胞植入并与无细胞神经支架联合培养:手术显微镜下将1×107L-1骨髓间充质干细胞多点注入无细胞神经支架内,见支架膨胀隆起后,将支架重新放人培养液内培养7 d.④实验评估:将制备的无细胞神经移植物横断面进行扫描电镜观察,骨髓间充质干细胞接种于支架上混合培养7 d后,对移植物支架进行扫描电镜观察.结果:①免疫组织化学法鉴定骨髓间充质干细胞:培养的细胞不表达CD34、CDl4,表达CD44、CD29,说明实验中分离、培养的细胞不是造血干细胞而是骨髓间充质干细胞.②扫描电镜观察无细胞神经移植物与移植物支架:无细胞异体神经支架在扫描电镜下见正常神经的髓鞘、轴突均消失,仅剩下空虚呈网格状的施万细胞基底膜管.联合培养7 d后骨髓间充质干细胞在基底膜管内均匀分布,在管腔内贴附生长,细胞呈椭圆形或多突起形.骨髓间充质干细胞在该支架内均匀分布,并伸出伪足贴附于该支架内.结论:骨髓间充质干细胞在组织工程神经支架内生长良好,形态正常,并伸出伪足与管壁粘连紧密,该支架对骨髓间充质干细胞具有良好的细胞亲合性.
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自体骨髓干细胞移植治疗神经系统损伤和变性疾病42例报告
目的:观察42例神经系统损伤和变性疾病患者经自体骨髓干细胞移植后,其神经系统症状与体征的改善.方法:①选取2005-06/2006-09解放军第四六三医院神经外科收治的神经系统损伤和变性疾病患者42例,对本试验均签署知情同意书.其中各种原因所致脊髓损伤30例,脑血管意外引起的偏瘫4例,老年痴呆2例,小脑疾患引起的共济失调2例,运动神经元变性疾病4例.患者入院后常规检查身体各项指标以评估是否适合行干细胞移植术.②术前患者均于皮下注射粒细胞集落刺激因子进行骨髓干细胞动员,5～12μg/(kg·d),连续4-5 d.动员结束后患者在局麻状态下,于髂后上棘采集自体骨髓血约200 mL,去除红细胞,密度梯度离心,分离出单个核细胞,再将收获的单个核细胞制成1.5 mL细胞悬液(约1×108个细胞)备用.③通过手术或立体定向的方法将干细胞直接移植在神经损伤或变性部位,然后再根据病情经腰穿或静脉途径进行细胞移植,每次给予干细胞量按(2～3)×102个/kg计算,1次/周,共4周.④自体骨髓干细胞移植治疗过程中,为促进干细胞的生长和分化,根据患者病情及个人身体状况给予物理疗法、作业疗法等相应的康复功能锻炼,同时配以针灸、高压氧及药物营养神经和改善微循环治疗.结果:42例神经系统损伤和变性疾病患者均进入结果分析.自体骨髓干细胞移植治疗后1～3个月,17例脊髓损伤患者肢体症状明显改善,尤其是脑损伤后遗症引起的脊髓损伤其肢体症状改善更为显著;2例脑出血和1例脑血栓引起偏瘫的患者其肢体症状改善效果均较好;遗传性共济失调的2例患者疗效均不明显;1例老年痴呆患者其老年痴呆症状得到明显改善,并能在搀扶下行走,与旁人进行正常的交流;运动神经元变性病中1例患者肌萎缩性侧索硬化症改善效果较好,肌张力正常,颤抖减轻及至消失,多发性硬化中2例患者症状减轻.结论:干细胞移植配合功能锻炼等辅助手段对神经系统损伤和变性疾病的治疗效果肯定,有一定的临床应用价值.
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四种缓解化学药物治疗后骨髓抑制中成药对环磷酰胺所致小鼠血虚模型外周血和骨髓象的影响
目的:观察补气养血、健脾益肾的参芪颗粒,补气养血的复方阿胶浆,补气养阴的贞芪扶正颗粒,温肾健髓、益气养阴、生血止血的复方皂矾丸4种中成药对环磷酰胺所致小鼠血虚模型外周血及骨髓象的影响.方法:实验于2005-06/09在河南中医学院药理实验室完成.①选用健康昆明种成年小鼠150只,雌雄不拘.按随机数字表法分为15组,每组10只:高、中、低剂量贞芪扶正颗粒组分别按15,10,5 g/kg(20 mL/kg)剂量灌胃贞芪扶正颗粒混悬液(主要成分:黄芪、女贞子;甘肃扶正药业科技股份有限公司生产,批号040803);高、中、低剂量复方阿胶浆组分别按10,20,30 mL/kg剂量灌胃复方阿胶浆(主要成分:阿胶、熟地黄、党参等;山东东阿阿胶股份有限公司生产,批号050446);高、中、低剂量复方皂矾丸组分别按2.4,1.6,0.8 g/kg(20 mL/kg)剂量灌胃复方皂矾丸混悬液(主要成分:皂矾、西洋参、海马等;陕西郝其军制药有限责任公司生产,批号041014);高、中、低剂量参芪颗粒组按3,2,1 g/kg(0.2 mL/10g)剂量灌胃参芪颗粒混悬液(主要成分:人参、黄芪、当归等;江西山高制药有限公司生产,批号040702);鲨肝醇组按10 g(20 mL)/kg剂量灌胃鲨肝醇混悬液;空白组和模型组灌胃同体积的生理盐水(0.2 mL/10 g).每天给药1次,连续给药10 d.从实验的第6天开始除空白组外,各组小鼠腹腔注射环磷酰胺40 mg/kg,连续给药5 d.②各组小鼠分别于末次给药后24 h,进行血常规检测.另取右侧股骨,镜下计数骨髓有核细胞数.③计量资料符合正态分布、方差齐者用t检验.结果:小鼠150只均进入结果分析.①对外周血的影响:模型组小鼠血白细胞、红细胞和血小板计数及血红蛋白水平、血细胞比容均明显低于空白组(t=2.49～8.19,P＜0.05～0.01).鲨肝醇组、各剂量参芪颗粒组和复方阿胶浆组及贞芪扶正颗粒组、复方皂矾丸组小鼠血白细胞计数均明显高于模型组(t=3.67～9.12,P＜0.01).中剂量复方阿胶浆组、贞芪扶正颗粒组和复方皂矾丸组和高剂量贞芪扶正颗粒组小鼠血红细胞计数明显高于模型组(t=2.58～3.05,P＜0.05～0.01).高、中剂量复方阿胶浆组和中、低剂量贞芪扶正颗粒组小鼠血血小板计数明显高于模型组(t=2.48～2.84,P＜0.05～0.01).各剂量复方阿胶浆组和各剂量贞芪扶正颗粒组和中、低剂量复方皂矾丸组小鼠血血红蛋白水平明显高于模型组(t=2.21～3.28,P＜0.05～0.01).中剂量参芪颗粒组、各剂量复方阿胶浆组、高剂量贞芪扶正颗粒组,以及高、中剂量复方皂矾丸组小鼠血细胞比容明显高于模型组(t=2.15～2.86,P＜0.05).②对骨髓象的影响:与空白组比较,模型组小鼠骨髓有核细胞数均明显低于空白组(t=8.08,P＜0.01).鲨肝醇组,各剂量参芪颗粒组、复方阿胶浆组、贞芪扶正颗粒组、复方皂矾丸组小鼠骨髓有核细胞数明显高于模型组(t=3.05～5.67,P＜0.01).结论:参芪颗粒、复方阿胶浆、贞芪扶正颗粒、复方皂矾丸对环磷酰胺所致小鼠血虚模型外周血血细胞状况和骨髓象均有改善作用;其中贞芪扶正颗粒和复方皂矾丸对白细胞计数、红细胞计数的升高作用为优;贞芪扶正颗粒和复方阿胶浆对血小板计数升高作用为优;贞芪扶正颗粒、复方阿胶浆和复方皂矾丸对血红蛋白升高作用为优;4种中成药对血虚模型血细胞比容的影响相近;贞芪扶正颗粒对血虚模型有核细胞的升高作用为优.
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骨髓液采集操作技术对自体骨髓干细胞移植质与量的影响
目的:探讨骨髓液采集操作技术对自体骨髓干细胞移植过程中细胞数量的影响,并分析其与疗效的关系.方法:以唐山市工人医院2004-09/2005-06收治的11例心肌梗死骨髓干细胞移植患者为常规对照组,以2005-06/2006-04收治的15例心肌梗死骨髓干细胞移植患者为技术操作组,两组患者性别、年龄、病程等基线资料比较差异无显著性意义(P＞0.05),均经医院伦理委员会批准并获得患者知情同意.两组患者均行骨髓干细胞移植,手术前后根据临床需要给予标准药物治疗,术后进行抗炎、抗凝及显微外科常规护理.此外,技术操作组在骨髓采集、保存、净化处理过程中给予以下相应的干预措施:①严格执行无菌操作,控制采集时的压力.②控制溶血和凝集.③防止外周血混入.④控制骨髓干细胞存储的温度和时间.两组分别于术前及术后3,6个月,采用多普勒超声心动图测定患者左室射血分数;并行核素心肌灌注断层显像,观察心肌灌注稀疏缺损区占心肌的比例;6min步行试验.结果:常规对照组11例患者与技术操作组15例患者均进入结果分析.①两组骨髓液中分离单个核细胞数量和术后并发症情况:技术操作组采集的骨髓液中单个核细胞数明显高于常规对照组(1.5×109个,1×109个,P＜0.05).技术操作组发生骨髓液标本凝集、溶血、混血、迷走神经反射、血管急性闭塞例数明显少于常规对照组(P均＜0.05).②两组手术前后心功能指标及6 min步行实验检测结果:术前两组心功能指标及6 min步行距离均基本相似(t=0.86～1.94,P均＞0.05).术后3,6个月,技术操作组多普勒超声测定左室射血分数、心肌双核素检查左室射血分数均明显好于常规对照组(t=2.12～3.13,P均＜0.05),6 min步行距离无明显变化(t=1.92～1.94,P均＞0.05).结论:自体骨髓液的采集过程中,采取控制骨髓采集压力,防止溶血、凝血及混入外周血,控制骨髓液的存储温度和时间等干预,能够保证移植骨髓液的有效干细胞数量,减少并发症,提高骨髓干细胞移植疗效.
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神经干细胞移植治疗脑卒中后遗症59例
目的:探讨神经干细胞移植注射治疗脑卒中后遗症的方法、效果、安全性及可行性.方法:选择于2002-11/2004-11河南省安阳市人民医院神经内科收治的59例脑卒中后遗症患者.纳入标准:①年龄＜85岁.②无意识障碍.③病程1年以上.④患者及家属同意,并经医院伦理委员会批准.⑤无心、肝、肾和其他脏器严重的功能伤害.⑥不伴有癫痫.其中男39例,女20例,年龄27～83岁,平均(56.2±12.8)岁,脑梗死41例,脑出血18例,合并高血压38例,冠心病12例,糖尿病13例,高脂血症15例,病程1～30年,平均(5.1±6.0)年.采用鞘内注射法将培养的人胚胎神经干细胞移植到脑卒中后遗症患者脑内,并随访观察24个月,采用欧洲卒中量表评分标准、生活功能评分标准进行评分评价其疗效.欧洲卒中量表评分标准提高1分以上为有效,无提高或下降为无效.对所有患者行头颅电子计算机体层扫描、头部磁共振成像、心由图、肺部X射张片以及血液生化学检查,评价此方法临床应用的安全性结果:59例患者均进入结果分析.59例行鞘内注射患者中8例无效,51例有效.移植6个月后59例患者欧洲卒中量表评分标准及生活功能评分标准评分均较移植前明显提高[欧洲卒中量表评分标准:(54.5±222.3),(51.8±22.1)分,P＜0.05;生活功能评分标准:(42.1±32.4),(36.3±32.7)分,P＜0.05].12例患者术后24 h内出现一过性发热,体温37.4～38.5℃,给予对症处理后体温渐降.6例患者术后感轻微头痛.随访24个月时,检查患者头颅CT、磁共振成像、心电图、肺片及血液生化学指标较移植前均未发现明确变化.结论:鞘内注射移植神经干细胞治疗脑卒中后遗症有效可行.
