大鼠脑缺血损伤后骨髓间充质干细胞移植抑制Bcl-2及Bax介导的神经元凋亡

背景:骨髓间充质干细胞移植技术对脑损伤修复具有重要的意义,但其作用途径尚需讨论.目的:观察脑缺血模型大鼠移植骨髓间充质干细胞后,皮质及海马区Bcl-2和Bax的表达变化,分析骨髓间充质干细胞颅内的移植抑制神经元凋亡的作用机制.设计:随机对照实验.单位:青岛大学医学院附属医院脑血管病研究所.材料:选用雄性成年Wistar大鼠24只,体质量180～240 g,由山东大学实验动物中心提供.实验大鼠随机分为对照组、损伤组、损伤移植组,每组8只.溴脱氧核苷尿嘧啶(BrdU,Sigma公司);TUNEL试剂盒,Bcl-2,Bax抗体试剂盒购自北京中山生物工程公司.方法:实验于2005-04/2006-09在青岛大学医学院附属医院脑血管病研究所完成.损伤组和移植组大鼠采用颈外动脉线栓法建立脑缺血模型,移植组大鼠造模成功7 d后在脑皮质和纹状体区注射浓度为2×1012L-1的原代体外培养的骨髓间充质干细胞悬液.实验过程中对动物的处置符合动物伦理学要求.主要观察指标:分别于造模成功后7和14 d进行TUNEL染色及免疫组织化学检测大脑皮质、海马区神经元凋亡和Bcl-2,Bax表达的变化.结果:①神经元凋亡情况:造模成功后7 d,对照组未发现凋亡细胞,移植组凋亡细胞的数量少于损伤组,差异有非常显著性意义(P＜0.01).②Bcl-2和Bax表达:造模成功后14 d,损伤组大鼠皮质和海马区Bcl-2阳性神经元的表达低于对照组和移植组,差异有非常显著性意义(P＜0.01).损伤组大鼠皮质和海马区Bax阳性神经元的表达高于对照组和移植组,差异有非常显著性意义(P＜0.01).结论:大鼠脑缺血后,骨髓间充质干细胞能够促进Bcl-2表达并抑制Bax表达,从而减少神经元凋亡.

应用免疫荧光双标记染色技术检测乙型肝炎病毒感染胎盘膜联蛋白Ⅴ的表达

背景:膜联蛋白Ⅴ是近年来被作为肝细胞膜上存在的与乙型肝炎病毒感染相关受体研究的热点之一,并在胎盘组织中也有表达.目的:探讨膜联蛋白Ⅴ在HBV宫内感染中的作用;揭示HBV进入胎盘组织细胞的方式,为HBV的宫内感染的机理提供理论依据.设计:随机对照实验.单位:泰山医学院.对象:选择2003-01/2004-12济南市妇幼保健院、泰安市中心医院、泰安市妇幼保健院收集的30例HBsAg阳性孕妇足月分娩的胎盘组织,同时收集母血分离血清.实验经过孕妇知情同意及医院伦理委员会批准.兔抗人膜联蛋白Ⅴ亲和纯化抗体(第一抗体)、鼠抗人HBs mAb(第一抗体)、生物素化羊抗小鼠IgG(第二抗体)均购自武汉博士德生物工程有限公司.方法:用即用型SABC免疫组织化学染色试剂,检测30例HBsAg阳性的足月胎盘组织中,有18例检测到HBsAg,随机选取10例进行荧光双标染色,其染色主要过程为将待测石蜡切片标本常规脱蜡至水;抗原微波热修复;加入第一种一抗(兔抗人AnV亲和纯化抗体1:60,为单克隆抗体)置湿盒中,4 ℃冰箱过夜;第二种一抗(鼠抗人HBs mAb1:50),置湿盒中,4 ℃冰箱过夜;加入与第二种一抗相应的二抗(如生物素化的羊抗鼠IgG1:100);加入以PBS作适当稀释的第一种荧光抗体(如FITC-羊抗兔IgG1:50);加入第二种荧光抗体(Avidin-Cy3);缓冲甘油封固;激光共聚焦显微镜下观察并进行图像分析.用IPP4.5图像分析法,先进入IPP4.5系统的Image Analysis程序,然后调入分析文件进行分析.主要观察指标:乙型肝炎病毒感染的胎盘组织中HBsAg/膜联蛋白:Ⅴ的存在与分布情况.结果:选取10例进行荧光双标染色结合激光共聚焦显微镜检测胎盘组织上滋养层细胞乙型肝炎病毒/膜联蛋白Ⅴ的存在与分布模式.胎盘组织中存在着丰富的膜联蛋白Ⅴ,位于绒毛合体滋养层细胞,在基质细胞和血管内皮细胞都有膜联蛋白Ⅴ的表达.并发现在同一细胞中存在着乙型肝炎病毒和膜联蛋白Ⅴ的共存现象.结论:乙型肝炎病毒感染胎盘细胞可能是通过与细胞上的受体膜联蛋白Ⅴ结合,促使病毒进入胎盘细胞,导致宫内感染.

真菌DNA提取方法的建立和比较

目的:DNA的提取效率,尤其是DNA的纯度严重影响实验结果,同一标本采用不同方法或不同标本采用相同方法提取DNA,其纯度和提取率有很大差异.以丝状真菌为材料,进行DNA提取,对真菌DNA的提取方法进行优化,探讨其佳DNA提取方法.方法:实验于2004-06/2006-12在吉林大学基础医学院真菌实验室进行.以临床常见致病真菌标本为材料,采用玻璃珠-盐析法、CTAB法、Gene TLETM法3种不同方法提取DNA,通过琼脂糖凝胶电泳比较不同方法提取DNA的效率.结果:同等菌体量下,A260和A280的比值采用Gene TLETM法获得的样品高,表明其蛋白质含量相对少.3种提取的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图都在相应的多重PCR体系中扩增出目的片段,Gene TLETM DNA抽提法带型清楚、明亮.结论:Gene TLETM法提取DNA效率高、质量好,操作简单,适于DNA的提取.

成体肝脏干细胞的体外分离、培养及鉴定

背景:肝脏干细胞的多能性在肝脏移植方面具有重要价值.目前已经成功地鉴定并分离出动物肝脏干细胞,但人肝脏组织是否存在干细胞、如何对其进行分离鉴定的报道不多.目的:尝试从人类肝癌旁组织中分离和体外培养肝脏干细胞,并对其表面标志物进行鉴定,寻找肝脏干细胞新的来源.设计:细胞观察实验.单位:吉林大学第一医院普外科,东丰县中医院普外科.材料:①组织来源:10例标本来自2005-10/2006-06吉林大学第一临床学院肝胆外科收治的肝细胞癌患者,年龄45～58岁,在行肝叶切除术时切取距癌巢边2 cm处的肝组织,经病理证实无癌细胞,对本实验均签署知情同意书.②主要试剂:细胞培养用DMEM/F12干粉由美国Hyclone公司提供,新鲜胎牛血清由天津联星生物技术有限公司配制,各种细胞生长因子为美国Cytolay公司产品.方法:将肝脏癌旁组织剪碎,Hank's液冲洗,Ⅳ型胶原酶溶液消化后将细胞悬浮在含体积分数为0.15胎牛血清的DMEM/F12培养液中,加入肝细胞生长因子、表皮生长因子、α-成纤维细胞生长因子,浓度均为25 μg/L.待培养细胞约铺满2/3瓶底后,胰蛋白酶消化传代,按2×107 L-1密度接种继续培养.细胞传至3～4代时,加入胰酶制成浓度为2.60×109 L-1细胞悬液,依次加入抗人C-kit抗体、免疫磁珠、Buffer液,免疫磁珠法初步分离C-kit+细胞.HE染色和免疫荧光细胞化学染色检测癌旁组织中是否存在肝脏干细胞.制备C-kit+细胞爬片,免疫荧光化学染色鉴定肝脏干细胞表面标志物CK19及AFP的表达.主要观察指标:①细胞形态观察.②癌旁组织肝脏干细胞的鉴定.③C-kit+细胞免疫荧光化学鉴定.结果:①原代培养2周,贴壁细胞呈集落样生长,换液后成熟肝细胞逐渐破碎、消失,小圆形细胞增殖成片,多位于集落中央,呈簇状排列,多数细胞只有1个核,胞核较大,胞浆较少,细胞边界清楚.传至1～2代时仍可见细胞呈集落样生长,生长速度加快,经免疫磁珠分离获得的C-kit+细胞呈类圆形,胞核较大,胞浆较少,体外培养1周后呈栅栏状、漩涡、片状或不规则样生长.②癌旁组织HE染色后汇管区内可见不典型增生的小胆管,其内部存在小圆形细胞;免疫荧光细胞化学染色后癌旁组织汇管区内增生的小胆管内的小圆形细胞共表达红色荧光AFP和绿色荧光CK19,二者叠加部分呈黄色.③C-kit+细胞免疫荧光化学后,胞浆内表达AFP红色颗粒与CK19绿色颗粒,二者重叠部分即AFP+/CK19+双阳性细胞,呈黄色荧光.结论:人类肝癌旁组织中存在肝脏干细胞,可联合其表面标志物的表达,将C-kit+/AFP+/CK19+作为鉴定分离肝脏干细胞的一种方法.体外分离培养得到的小圆形细胞即卵圆细胞,具备向肝细胞及胆管上皮细胞双向分化的潜能.

全骨髓贴壁培养大鼠骨髓间充质干细胞体外成骨的定向诱导及鉴定

背景:许多分离纯化骨髓间充质干细胞操作繁琐、费用昂贵,且对细胞的活性影响较大,许多研究都致力于寻找有效且价格低廉的培养鉴定方法.目的:采用全骨髓贴壁培养法对大鼠骨髓间充质干细胞经体外进行成骨诱导和分化,并进行细胞鉴定.设计:观察对比实验.单位:青岛大学医学院.材料:实验于2005-11/2007-03在青岛大学医学院口腔研究室及分子生物学实验室完成,选用20只生后三四周Wistar大鼠,SPF级,雌雄不拘,体质量120～150 g,由青岛市实验动物中心提供.实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.胎牛血清购自杭州四季清生物技术有限公司,碱性磷酸酶检测试剂盒由南京建成生物工程研究所提供,逆转录试剂盒为PROMEGA产品,引物由上海生工公司合成.方法:采用全骨髓培养法分离培养成年大鼠骨髓间充质干细胞,用2.5 g/L的胰蛋白酶消化后分瓶,以5×107 L-1的密度接种于6孔培养板,诱导分化组加入诱导分化培养液,对照组加入等量基础培养液培养.①倒置相差显微镜观察细胞诱导分化结果及钙结节形成情况.②采用钙结节Von Kossa染色、钙结节茜素红染色进行诱导后细胞的生物学特性检测.③采用重氮盐法染色观察碱性磷酸酶活性.④RT-PCR检测细胞内成骨细胞转录因子、骨钙素、成骨细胞特异性基因mRNA的表达.主要观察指标:①细胞诱导分化结果.②大鼠骨髓间充质干细胞诱导后细胞的生物学特性.③碱性磷酸酶活性.④成骨细胞转录因子、骨钙素、成骨细胞特异性基因mRNA的表达.结果:①诱导分化组加入诱导分化培养液后,9 d后开始密集重叠生长,21～28 d出现较多散在的致密圆形矿化结节.对照组细胞虽密集重叠生长,但不形成矿化结节.②诱导分化组成骨诱导21～28 d形成明显的圆形或卵圆形肉眼可见的钙化结节.Von Kossa染色为黑色沉淀,茜素红染色为橙红色结节状,对照组未见钙结节形成.③诱导分化组诱导2周细胞碱性磷酸酶活性明显增高,对照组活性较弱.④诱导分化组经诱导后成骨细胞转录因子、骨钙素、成骨细胞特异性基因mRNA的表达均较强.结论:大鼠的骨髓间充质干细胞经全骨髓培养法体外诱导和分化,表现出与典型的成骨细胞相似的形态特征和生物学特性.

嗅鞘细胞移植对脊髓损伤区RhoA表达的影响

目的:轴突生长抑制分子须与其共同复合受体结合后才能激活下游抑制信号RhoA,从而导致细胞骨架塌陷,抑制神经再生.基础及临床研究均证实嗅鞘细胞能够促进脊髓功能的恢复,观察嗅鞘细胞移植前后脊髓损伤区RhoA的动态变化,探讨嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤的可能机制.方法:实验于2005-09/2006-05在西安交大医学院环境与基因重点实验室完成.①实验动物:成年SD大鼠40只,随机数字表法分为正常组、模型组、嗅鞘细胞组、DF12对照组,10只/组.另取30只健康成年雄性SD大鼠作为嗅鞘细胞的来源.实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.②实验方法:大鼠麻醉后处死,迅速取出头部两侧嗅球,除去软膜,剪取嗅球外面的嗅神经层和小球层,剪碎后离心,胰蛋白酶消化获取嗅鞘细胞悬液.除正常组外,其余各组均建立全横切脊髓损伤模型.嗅鞘细胞组将原代培养12 d的嗅鞘细胞悬液调整为1×1011 L-1,在距损伤缘上下各1 mm处分4点应用微量注射器注射,深度1.0 mm,每处各注射1 μL.DF12对照组同法每点注射等量DF12培养液,模型组、正常组不进行任何处理.③实验评估:各组分别于移植后1,2,4,6,8周采用免疫组化和Western blot免疫印迹技术动态检测脊髓损伤区RhoA表达的变化.同时在移植后8周行嗜银染色检测组织形态学变化.结果:①RhoA表达的变化:正常组RhoA表达的吸光度值明显低于其余3组(P＜0.05).嗅鞘细胞组于移植后1,2,4,6,8周脊髓损伤区RhoA的表达均明显低于模型组和DF12对照组(P＜0.01),而模型组和DF12对照组差异无显著性意义(P＞0.01).②组织形态学变化:嗅鞘细胞移植8周后除正常组外,其余各组均可见明显的神经纤维再生,但模型组与DF12对照组大部分纤维排列紊乱,再生纤维方向性较差;嗅鞘细胞组可见明显的新生轴突,且神经纤维跨越损伤部位修复脊髓损伤,无论在数量还是质量上均优于模型组及DF12对照组.结论:嗅鞘细胞移植可能通过降低脊髓损伤区RhoA蛋白的表达,从而促进损伤脊髓的修复.

标本固定对组织总RNA和病毒RNA的影响

目的:探讨固定剂、固定时间及温度对RNA病毒感染组织总RNA的完整性、得率及病毒RNA扩增的影响.方法:实验于2004-01/2006-09在武汉大学公共卫生学院流行病学实验室及武汉大学医学院病毒研究所实验室完成.取汉坦病毒76-118株接种乳鼠的感染组织,以沉淀脱水类固定剂体积分数为1的甲醇、体积分数为0.75的乙醇、体积分数为1的丙酮以及醛类固定剂4%的多聚甲醛磷酸缓冲液(4%PFA)、体积分数为0.1的甲醛共5种固定剂,分别在4 ℃和室温下固定病毒感染组织6,12,24 h和48 h.从固定后的标本中直接提取组织总RNA,检测RNA完整性及组织总RNA得率.用巢式RT-PCR扩增病毒RNA序列,电泳检测PCR产物并行灰度扫描.对RNA得率及PCR产物电泳所测灰度值进行统计学分析,反映各种固定方式对病毒RNA和细胞总RNA降解的影响.结果:①RNA完整性:与立即冰冻或新鲜组织比较,体积分数为1的甲醇固定24 h,RNA完整性损伤不明显;体积分数为0.75的乙醇、体积分数为1的丙酮固定12 h后RNA开始出现损伤带,24 h出现明显的损伤;而体积分数为0.1的甲醛、4%PFA固定6 h就开始出现明显的损伤,固定24 h几乎很难看清RNA条带.②RNA得率析因分析结果显示,不同固定剂、固定时间、固定温度下固定的组织中所提RNA的得率差异有显著性(P＜0.01),并有显著性交互作用(P＜0.01).4 ℃甲醇固定6 h的RNA得率高,体积分数为0.1的甲醛在室温下固定48 h得率低.③固定后标本巢式RT-PCR,除体积分数为0.1的甲醛固定48 h后扩增结果不稳定外,其余各固定方式均能扩增出特异性带.对电泳结果进行灰度扫描时,与甲醛相比,甲醇、乙醇和丙酮固定的标本中扩增的产物电泳条带更亮,灰度值更高(P＜0.01).结论:①对RNA完整性的保存沉淀脱水类固定剂明显优于醛类固定剂.②对RNA病毒感染组织固定时间不宜偏长,固定过程的温度宜选用4 ℃.

大鼠血清转铁蛋白受体及促红细胞生成素水平在高住低训过程中的变化

目的:"高住低训"过程中红细胞变化过程和机制还不完全清楚.实验模拟"高住低训"训练法,观察高住低训习服过程中大鼠血清转铁蛋白受体及促红细胞生成素水平的动态变化.方法:实验于2007-06在辽宁师范大学体育学院运动生理实验室进行.①实验材料:50只健康SD大鼠由大连医科大学实验动物中心提供,雌雄不分,适应性喂养1周后随机分为2组:常氧对照组(n=10)、高住低训组(n=40).②实验方法:高住低训组大鼠每天在模拟2 500 m的高原环境中生活,并模拟海拔1 250 m环境游泳运动1 h,6 d/周,共4周.③实验评估:训练第1,2,3,4周检测大鼠红细胞数及血红蛋白浓度,采用免疫散射比浊法测定血清转铁蛋白受体.结果:50只大鼠均完成实验,并进入结果分析.与常氧对照组相比,高住低训第1周的促红细胞生成素水平明显提高(P＜0.01),高住低训第2周和第3周促红细胞生成素水平仍处在较高水平(P＜0.05),血清转铁蛋白受体、血红蛋白和红细胞水平明显升高,并达到峰值(P＜0.01),高住低训第4周血清转铁蛋白受体的水平仍处在较高水平(P＜0.05),血红蛋白和红细胞水平仍继续升高(P＜0.01).结论:高住低练能使大鼠血清转铁蛋白受体、促红细胞生成素和血红蛋白及红细胞水平均明显增加.

人外周血单核细胞来源树突状细胞转染重组腺相关病毒诱导特异性T细胞的效应

目的:观察人外周血单核细胞来源的树突状细胞转染含前列腺特异性抗原片段的重组腺相关病毒后,其所诱导的特异性T细胞对前列腺癌细胞株LNCaP和DU145的体外杀伤抑制作用.方法:实验于2006-05/10在南方医院肿瘤科生物室完成.①对象:HLA-A2基因亚型的健康自愿供血者1名,对本实验知情同意,实验经医院医学伦理委员会批准.作为靶细胞的前列腺癌细胞株LNCaP、DU145以及携带前列腺特异性抗原基因的重组腺相关病毒由美国阿肯色大学生物治疗中心刘勇教授惠赠.②实验方法:抽取HLA表型为A2的健康自愿供血者外周血50 mL,Ficoll法分离单核细胞体外培养,磷酸盐缓冲液洗涤6孔板,收集悬浮细胞作为效应T细胞,贴壁细胞即为树突状细胞.向6孔板内加入粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和携带前列腺特异性抗原基因的重组腺相关病毒,第4天加入白细胞介素4,第6天加入肿瘤坏死因子α,至培养第7天收获悬浮细胞即为成熟的树突状细胞.③实验评估:应用流式细胞仪检测树突状细胞表面分子标记的表达.以ELISA法检测树突状细胞分泌白细胞介素12的含量.将成熟树突状细胞与效应T细胞分别按1:10、1:20、1:40进行共培养,将未经过树突状细胞共育的T细胞设置为空白对照组,ELISA法检测效应T细胞分泌干扰素γ的含量.LNCaP、DU145靶细胞分别与效应T细胞按效靶比5:1、10:1、20:1、40:1进行共培养,MTT法检测效应T细胞对两种靶细胞的杀伤作用.结果:①树突状细胞表面分子标记的表达:经携带前列腺特异性抗原基因的重组腺相关病毒致敏后的树突状细胞,培养8 d后高表达CD83,CD40,HLA-DR,CD80,CD1a,CD86,分别为65.8%,66.0%,96.7%,70.0%,61.9%,79.0%.②树突状细胞释放白细胞介素12含量检测:与培养第1天比较,第7天成熟树突状细胞释放白细胞介素12的含量显著升高(P＜0.05).③效应T细胞释放干扰素γ含量检测:与空白对照组比较,树突状细胞:T细胞按1:10、1:20、1:40共培养后所释放的干扰素γ含量均明显升高(P＜0.01,0.01,0.05),且随树突状细胞加入比例的提高有所增加.④效应T细胞的细胞毒性作用检测:效应T细胞可有效识别并杀伤HLA-A2阳性的LNCaP细胞,其抑制作用在效靶比为10:1、20:1、40:1时均显著强于DU145细胞株(P＜0.01).结论:经携带前列腺特异性抗原基因的重组腺相关病毒转染后的树突状细胞,其细胞表型和刺激淋巴细胞增殖、分化的功能无明显改变,可诱导自体效应T细胞增殖,该效应T细胞对LNCaP细胞具有明显杀伤作用.

经静脉移植骨髓间质干细胞在脑缺血前后大鼠脏器组织中的分布

目的:骨髓间质干细胞通过局部直接注射或经静脉、动脉移植均可有效趋化到达脑缺血、损伤组织,但目前除了对到达靶部位的干细胞分布有一定了解外,对干细胞在非损伤组织或损伤组织之外的其它部位迁移分布与生存情况的研究较少.观察经静脉移植的大鼠骨髓间质干细胞在脑缺血前后大鼠体内的生存与分布,为干细胞移植研究提供实验基础和可能的理论依据.方法:实验于2006-05/2007-05在福建省神经病学研究所完成.实验材料:选取清洁级健康雄性近交系F344大鼠48只,体质量250～300 g,由中国科学院上海实验动物中心提供,按随机数字表法分为3组:正常移植组、脑缺血前移植组、脑缺血后移植组,每组16只.实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.实验方法:①体外培养扩增2月龄F344大鼠骨髓间质干细胞,传至第三四代备用.用带增强型绿荧光蛋白基因的慢病毒感染大鼠骨髓间质干细胞.②建立大鼠短暂大脑中动脉闭塞脑局灶缺血模型.取增强型绿荧光蛋白标记的大鼠骨髓间质干细胞,经股静脉移植入大鼠体内.正常移植组:细胞移植前大鼠未经任何处理;脑缺血前移植组:先在正常大鼠静脉移植细胞,24 h后行大脑中动脉闭塞术;脑缺血后移植组:大鼠先行大脑中动脉闭塞术,24 h后移植细胞.③实验评估:采用改良的神经功能缺损量表测定各组大鼠神经功能情况;取大鼠骨髓制作涂片,同时取脑、心、肺、肝、脾、肾、骨骼肌、小肠组织标本制作冰冻切片,在荧光显微镜下观察增强型绿荧光蛋白阳性细胞在各时间点的分布情况.结果:48只大鼠均进入结果分析.①脑缺血前移植组和脑缺血后移植组大鼠神经功能在移植后12周内均有明显恢复,但脑缺血后移植组恢复较快,术后1,3,12周明显优于脑缺血前移植组(P＜0.01,P＜0.05).②在正常移植组和脑缺血前移植组大鼠肺、骨髓、脾、小肠发现增强型绿荧光蛋白阳性细胞,而在其他组织未发现.在脑缺血后移植组大鼠脑半球缺血区发现大量增强型绿荧光蛋白阳性细胞聚集,在肺中也可见阳性细胞分布,在脑缺血对侧半球及其他组织中未发现.结论:移植前的脑损伤对移植的大鼠骨髓间质干细胞向脑局灶缺血损伤区迁移,进而促进神经功能修复非常重要,否则,移植干细胞将在骨髓和脾脏较长时间停留且不易再次迁移.

胚胎嗅鞘细胞移植治疗脊髓炎后遗症:32例应用ASIA评分自身对照

背景:动物实验研究已证实,采用细胞移植、神经营养因子注入或移植等方法可改变损伤脊髓局部环境,促使损伤脊髓恢复部分功能.目的:开展嗅鞘细胞移植治疗脊髓炎后遗症的临床实验,观察其对脊髓损伤的恢复作用.设计:非随机自身对照.单位:山东省泰安荣军医院外二科病房.对象:选择2004-06/2007-07来源于全国各地的陈旧性脊髓炎患者32例,伤后时间为0.5～7年.患者经各种传统治疗及肢体功能锻炼后神经功能无明显改善,并遗留各种感觉运动及植物神经功能障碍.男21例,女11例,年龄5～48岁,急性病毒性脊髓炎18例,急性化脓性脊髓炎8例,结核性脊髓炎6例,发病后均曾给予大剂量甲基强地松龙、地塞米松、抗炎、抗免疫及各种神经营养药物治疗.26例临床表现均为完全性损伤.6例为不完全性损伤,患者对治疗知情同意,治疗方案经过医院伦理委员会批准.胚胎嗅球来自流产胚胎,由患者或家属自愿捐献.方法:取胚胎嗅球,经细胞分离、培养、纯化7～14 d,后消化成单细胞混悬液,然后在手术显微镜下移植到患者损伤脊髓区域的上下方.术后2周～2个月,采用2000年美国脊髓损伤学会制定的ASIA评分标准进行术后评定,并进行手术前后对比.主要观察指标:①感觉功能变化.②运动功能变化.结果:嗅鞘细胞移植术后0.5-2年,32例患者感觉和运动功能均有明显改善(运动功能:51.53±13.41,55.72±10.50;轻触觉:63.06±15.98,69.53±11.68;疼痛觉:64.03±15.01,69.50±12.20,P均＜0.01).结论:嗅鞘细胞移植能够有助于脊髓炎后遗症患者的神经功能恢复,但长期疗效有待于进一步观察.

循环内皮细胞参与人工血管体内内皮化过程的动物实验

背景:已有实验表明,通过自体血管内皮细胞种植于人工血管腔面提高了血管移植的通畅率.骨髓内皮细胞衬里人工血管是否有利于人工血管体内的内皮化过程?目的:通过骨髓内皮细胞衬里人工血管间置移植的动物实验观察人工血管内皮化效果.设计:观察对比动物实验.单位:上海市第六人民医院.材料:实验于2000-09/2001-10在上海市第六人民医院完成.选用20只上海地区杂种犬,犬龄1.0～2.0岁,雌雄不拘,体质量(18.7±2.3)kg.方法:分离犬骨髓单核细胞,ePTFE人工血管以2种规格(4 mm×4 cm和8 mm×5 cm)完成内皮化.颈总动脉移植:选用10只实验犬切除颈总动脉主干4 cm,将直径4 mm长4 cm的ePTFE人工血管间置移植于双侧颈总动脉,内皮化人工血管为实验组,未经内皮化人工血管为对照组,每组5只.术后2周及2个月采用彩色超声检查移植血管通畅率及血流速率.下腔静脉移植:选用剩余10只实验犬,6只为实验组,实验犬麻醉下将下腔静脉游离约8～10 cm,阻断两端,切除约5 cm,取直径8 mm长5 cm内皮化ePTFE人工血管,以5-0 Prolene作端端吻合,4只为对照组,以相同规格ePTFE人工血管为移植血管.术后2个月测定血管通畅率.同时与上述时间点计算各组移植血管内皮细胞覆盖率及内膜厚度.主要观察指标:①各组实验犬不同时间点移植血管通畅率及血流速率.②各组移植血管内皮细胞覆盖率及内膜厚度.结果:①颈总动脉移植术后2周和2月实验侧通畅率分别为100%(5/5)和60%(3/5),同期对照侧通畅率分别为40%(2/5)和0%(0/5).术后2个月实验组平均血流速率明显小于对照组(P＜0.05).下腔静脉移植实验组和对照组2月移植血管通畅率为83%(5/6)和50%(2/4).②颈总动脉及下腔静脉移植术后2周实验组血管腔面内皮细胞覆盖率大于对照组,差异有显著性意义(P＜0.05),术后2个月实验组血管内膜厚度小于对照组,差异有显著性意义(P＜0.05).结论:骨髓内皮细胞衬里的ePTFE人工血管在体内能较快完成内皮化过程,能抑制内膜增生;循环内皮细胞作为内皮细胞的潜在来源,具有一定临床应用价值.

比较机械分离法和组合酶消化法分离大鼠生精细胞的差异

目的:采用机械分离法和组合酶消化法分离大鼠生精细胞,比较两者在细胞数量、细胞纯度及存活率等方面的优劣.方法:实验于2007-03/05在广东省人民医院医学研究中心进行.分别采用机械分离法和组合酶消化法分离成年SD大鼠睾丸生精细胞,即机械分离法采用锐性分离结合筛网过滤,依次将间质细胞、血细胞剔除,经过滤筛选后,获得较为纯净的生精细胞,后经差速贴壁法获得纯度较高的生精细胞.组合酶消化法采用胶原酶和胰酶消化相结合的方法,首先用胶原酶Ⅳ将间质细胞分离出来,经胰酶消化后获得单细胞的生精细胞悬液.分析比较两者所得细胞总数及细胞纯度的差异,并检测分离培养前后细胞存活率的变化.结果:组合酶消化法分离的生精细胞数量与机械分离法相当,两者比较差异无显著性意义(P＞0.05).但机械分离法所得生精细胞的纯度高于组合酶消化法,并且分离培养前后细胞存活率也明显高于组合酶消化法,两两比较差异均有显著性意义(P＜0.05).机械分离法所得生精细胞悬液中以支持细胞混杂为主,而组合酶消化法则混杂较多支持细胞和间质细胞.结论:机械分离法分离生精细胞纯度高、细胞存活率高及费用低,是一种简单、经济、有效的生精细胞分离方法.

鼠胚神经干细胞体外培养方法的优化

目的:神经干细胞能够分化为神经元和神经胶质细胞,但其纯化、培养技术尚不完善.通过不同接种密度和传代方法,筛选优化神经干细胞的体外培养技术.方法:实验于2006-05/12在四川大学移植免疫实验室完成.①动物:选取清洁级孕12～16 d雌鼠,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.②实验方法:取孕鼠胚胎脑皮质,胰蛋白酶+乙二胺四乙酸消化组织,分离神经干细胞,加入含B27、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子的DMEM/F12培养基,传至第3代时,调整细胞密度至1×107 L-1,1×108 L-1,1×109 L-1,1×1010 L-1进行培养.另取原代培养7～10 d后的神经干细胞,收集形成的细胞球,机械吹打法传代是离心后用由粗到细的吸管轻柔吹打,或用带5号针头的无菌注射器吹打分离细胞,操作中避免产生气泡,使用注射器时吹打的次数保持5次.胰酶消化联合机械吹打法传代是离心后加入胰蛋白酶,37 ℃水浴10 min,用由粗到细且经火焰抛光的吸管轻柔吹打,或用带5号针头的无菌注射器吹打,以胎牛血清终止消化.③实验评估:观察第3代神经干细胞生长状态,MTT法检测各密度下培养1,3,5,7 d时的增殖情况.计数两种传代方法亚代神经干细胞形成的克隆球数目,比较增殖效果.免疫荧光染色检测神经球巢蛋白、BrdU标记、神经元特异性烯醇化酶、胶质细胞原纤维酸性蛋白的表达.结果:①神经干细胞的培养和鉴定:从胚胎大鼠脑皮质分离培养出的细胞可聚集成球状,并在体外大量扩增和长期存活,巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶、胶质细胞原纤维酸性蛋白均呈阳性表达,免疫荧光染色可见大量BrdU标记的阳性细胞.②不同接种密度对神经干细胞增殖的影响:按1×109 L-1密度培养的细胞分裂增殖为迅速,于第7天达高峰,且克隆球生成数量明显多于1×107 L-1,1×108 L-1,1×1010 L-1密度(P均＜0.05).③不同传代方法对亚代神经干细胞克隆增殖效果的影响:采用机械吹打法传代的神经干细胞所增殖形成的细胞球结合紧密,抛光玻璃管+注射器吹打后细胞球能较好地分开,但不能完全分散成单细胞,传代后细胞能够继续生长,并形成亚代神经干细胞球.经胰酶消化的神经球在机械吹打后也不能完全形成单细胞,且其亚代克隆的形成能力明显低于机械吹打法(P＜0.05).结论:①从胚胎大鼠脑皮质分离培养出的细胞具有神经干细胞特性,可诱导分化为神经元和星形胶质细胞.②1×109 L-1为佳细胞接种密度,机械吹打法亚代克隆的活性和增殖能力明显优于胰酶消化联合机械吹打法.

骨髓间充质干细胞体外转化为神经细胞的环境特征

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养条件,体外定向诱导传代骨髓间充质干细胞向神经干细胞转化并进一步向神经细胞分化的环境,并对分化的神经元进行鉴定.方法:实验于2005-08/2007-03在南京大学医学院附属鼓楼医院科研部完成.①选用健康SD大鼠,分离纯化并培养大鼠骨髓间充质干细胞.②应用流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达,通过免疫表型鉴定骨髓间充质干细胞.③贴壁培养诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化,分为对照组和诱导剂组,对照组中不加诱导剂,诱导剂组分两步诱导:首先加入含终浓度均为10 μg/L的表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子诱导分化剂,连续培养12 d;然后应用20 μg/L的脑源性神经营养因子和1 μmol/L的全反式维甲酸继续诱导6 d,分别收集诱导1 d,6 d,12 d,18 d的细胞进行细胞免疫荧光鉴定.结果:①传代第3代骨髓间充质干细胞为梭形成纤维样细胞,均一稳定的表达与间充质干细胞相关的表面抗原标记物CD29,CD44,CD90,阳性率分别为98.88%,96.90%,95.86%,但极少表达造血细胞标志CD34.②经碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子诱导12 d后诱导剂组巢蛋白阳性表达率为(89.24±2.12)%,而对照组细胞未表达巢蛋白.③经脑源性神经营养因子和全反式维甲酸联合诱导6 d后,诱导剂组均可见微管相关蛋白2阳性细胞,大部分细胞转变为神经元样细胞形态;对照组微管相关蛋白2阴性,细胞形态仍为梭形成纤维样细胞.结论:实验采用并改良了全骨髓贴壁法,操作简单快速,细胞活性好,是一种较为理想的分离和纯化骨髓间充质干细胞的方法.骨髓间充质干细胞可分化成神经干细胞,进一步诱导分化为神经细胞.

骨髓间充质干细胞移植对实验性肺气肿大鼠动脉血气及肺组织病理学变化的影响

背景:根据现有肺气肿的发病机制,肺气肿病理改变无法逆转.在多年研究肺减容手术和支气管腔内栓堵治疗肺气肿的基础上,作者提出肺毛细血管的损伤可能参与肺气肿发病的新发病机制.骨髓间充质干细胞具有分化成血管内皮细胞等多向分化潜能,因此,其可能促进肺血管生成并修复肺组织.目的:观察骨髓间充质干细胞移植对肺气肿模型大鼠动脉血气和肺组织病理学变化的影响,探讨骨髓间充质干细胞对肺气肿的治疗作用及肺气肿的发病机制.设计:随机对照的动物实验.单位:山西医科大学第二医院.材料:选用健康6周龄Wistar大鼠30只,体质量180～200 g,雌雄不拘.购自山西医科大学生理实验动物中心.按随机数字表法分为骨髓间充质干细胞治疗组、模型组和对照组3组,每组10只.方法:实验于2005-04/2006-04在山西医科大学生理实验室完成.将骨髓间充质干细胞治疗组和模型组大鼠麻醉后气管内注入猪胰弹性蛋白酶250 U/kg制作肺气肿模型,对照组以生理盐水对照,4周后模型制成.将所有大鼠麻醉后取出股骨、胫骨,体外分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞.免疫细胞化学方法检测CD71的表达以鉴定骨髓间充质干细胞.溴氮胞苷标记骨髓间充质干细胞,经尾静脉注入治疗组大鼠体内,模型组和对照组注入等量PBS溶液.主要观察指标:①各组大鼠动脉血气变化.②取肺组织制作病理切片,观察并计算平均肺泡数、平均肺泡面积和平均肺泡间隔.③免疫组织化学染色测定CD34+细胞个数以确定肺泡毛细血管增生情况.结果:纳入的30只Wistar大鼠在造模过程中有3只死亡,另选动物补足,30只进入结果分析.①骨髓间充质干细胞的培养及鉴定:接种3 d后,骨髓间充质干细胞基本全部贴壁,贴壁的骨髓间充质干细胞呈梭形.传至第3代,骨髓间充质干细胞表面有CD71的表达.②各组大鼠动脉血气分析比较:pH值,氧分压,二氧化碳分压和氧饱和度组间比较,差异无显著性意义(P＞0.05).③肺组织病理改变观察结果:治疗组病理改变明显轻于模型组.骨髓间充质干细胞治疗组平均肺泡数明显高于模型组,差异有显著性意义(F=80.201,P＜0.05),平均肺泡面积和平均内衬间隔小于模型组,差异有显著性意义(F=26.755,26.875,P＜0.05).④肺组织CD34+表达比较:骨髓间充质干细胞治疗组和模型组CD34+相对阳性面积均小于对照组,差异有显著性意义(F=20.411,P＜0.05).骨髓间充质干细胞治疗组大于模型组,差异有显著性意义(F=20.411,P＜0.05).结论:骨髓间充质干细胞能逆转肺气肿的病理改变;肺毛细血管的减少可能是肺气肿主要的发病机制之一.

小鼠白细胞介素21原核表达载体的构建及活性鉴定

目的:白细胞介素21是近年发现的由T细胞分泌的细胞因子,具有广泛的免疫调节作用和抗肿瘤活性.为进一步观察其体内外免疫作用,拟构建小鼠白细胞介素21(mIL-21)原核表达载体,并对其表达的活性进行鉴定.方法:实验于2006-03/2007-05在南京医科大学附属南京儿童医院儿科研究所和东南大学基础医学院病原生物学与免疫学系完成.实验材料:实验中所用BALB/c小鼠由扬州大学比较医学中心提供,六七周龄,雌雄兼备,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.pcDNA3.1/mIL-21质粒由东南大学基础医学院免疫学实验室提供.实验方法:以pcDNA3.1/mIL-21质粒为模板,PCR获得长度为369 bp的mIL-21基因片段.将其定向克隆至pET-28a(+)质粒中,采用PCR酶切和测序等方法对重组质粒进行鉴定.并对重组蛋白进行IPTG诱导表达、Western blot及体外生物学活性检测.结果:构建了重组原核表达载体pET-28a(+)/mIL-21,经鉴定后证实重组质粒构建正确.SDS-PAGE显示含重组质粒的诱导菌在Mr16 000位置出现一蛋白条带.Western blot结果显示该蛋白具有良好的免疫原性.体外生物学功能检测显示该重组蛋白能够增强小鼠脾细胞中的NK细胞杀伤活性.结论:成功构建了重组原核表达载体pET-28a(+)/mIL-21,表达的mIL-21具有良好的免疫原性.

自体骨髓间充质干细胞移植后心肌缝隙连接蛋白43表达与室性心动过速发生的关系

目的:缝隙连接蛋白43对维持心肌细胞的连接通讯功能、电信号传导和正常的节律性收缩起重要作用,其表达和分布的异常是多种室性心律失常的解剖学基础.建立小型猪急性心肌梗死模型,观察自体骨髓间充质干细胞移植后室性心动过速的发生及心肌缝隙连接蛋白43的表达.方法:实验于2006-01/2007-01在河北省人民医院导管室完成.①材料:选取8～12月龄小型猪22头,由河北医科大学实验动物中心提供,体质量20～30 kg,随机数字表法分为细胞移植组12头、模型对照组10头,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.②实验方法:无菌条件下抽取猪双侧股骨骨髓20 mL,percoll法+贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,待细胞生长达75%融合时用胰酶消化传代.将传至第2代细胞加入终浓度为10 μmol/L的5-氮胞苷进行诱导,用胶体金标记12 h后继续培养20 d用于移植.两组小型猪均采用球囊堵闭法建立急性心肌梗死模型,心电图监测示相关至少2个导联ST段抬高大于0.2 mV、术后血肌钙蛋白和肌酸磷酸激酶同工酶升高超过正常的两倍为建模成功标准.细胞移植组于造模成功后经OTW球囊于第一对角支远端1 cm处再次阻断血流,注入经胶体金标记的10×107个骨髓间充质干细胞.③实验评估:于细胞移植后2 h及4周行电生理程序刺激,观察室性心动过速的发生情况.末次电生理检查后,采用免疫组化染色法检测心肌缝隙连接蛋白43的表达,计算其积分吸光度值.结果:①模型建立指标检测:与术前比较,造模后所有小型猪血肌钙蛋白含量和肌酸磷酸激酶同工酶活性均增高,峰值浓度分别为(21.3±3.6) μg/L和(178.3±41.4)IU/L,术中心电图ST段平均抬高(10.67±1.43)mm,证明急性心肌梗死模型成功建立.②骨髓间充质干细胞移植后室性心动过速的发生情况:与模型对照组诱发出室性心动过速的动物数量比较,术后2 h细胞移植组无明显变化(χ2=0.201,P=0.650),术后4周细胞移植组明显降低(χ2=4.455,P=0.035).③骨髓间充质干细胞移植后梗死心肌缝隙连接蛋白43的表达:术后4周移植到梗死心肌的骨髓间充质干细胞与宿主心肌生长为一体,移植部位颜色变黑,苏木精-伊红染色示移植细胞的胞浆呈紫红色.细胞移植组心肌梗死区缝隙连接蛋白43积分吸光度值明显高于模型对照组(t=16.82,P=0.00),细胞移植组中未发生室性心动过速小型猪的梗死心肌缝隙连接蛋白43的表达明显高于发生室性心动过速小型猪(t=5.06,P=0.00).结论:自体骨髓间充质干细胞移植可促进急性心肌梗死猪心肌缝隙连接蛋白43的表达,其表达程度可能与急性心肌梗死室性心动过速的发生有关.

自体骨髓来源内皮祖细胞移植对移植静脉桥血管再内皮化及内膜增生的影响

目的:已有实验研究证明,移植骨髓来源内皮祖细胞可以促进球囊损伤后血管内皮的修复及抑制内膜的增生,那么移植骨髓来源内皮祖细胞对自体静脉移植术后静脉血管内皮修复和内膜增生是否起同样的作用?观察自体骨髓来源内皮祖细胞移植对自体静脉移植术后静脉桥血管再内皮化及内膜增生的作用.方法:实验于2007-01/08在北华大学附属医院内科实验室完成.实验室级别:P2级.①实验材料:6～8月龄雄性新西兰大白兔由解放军第二军医大学实验动物中心提供,体质量(2.5±0.5)kg,清洁级,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:抽取成年兔骨髓分离制备骨髓单个核细胞,体外扩增法培养出骨髓来源内皮祖细胞,在培养第7天通过Ac-Dil-LDL、FITC-BS-1双染色及流式细胞仪检测CD34、CD133、FIK-1表达进行细胞鉴定,应用DAPI荧光染料体外标记培养7 d的骨髓来源内皮祖细胞.将成年新西兰大白兔23只随机分为细胞移植组(n=13)和对照组(n=10)进行自体左颈外静脉、颈总动脉移植术,在建模后第3天将DAPI标记的骨髓来源内皮祖细胞悬液经耳缘静脉植入细胞移植组动物体内,对照组植入等量的PBS液.③实验评估:细胞移植后4周,观察兔静脉移植段血管性及内膜厚度.结果:23只兔均进入结果分析,无脱落.①通过体外扩增法培养的骨髓来源内皮组细胞,培养至7 d可见AC-Dil-LDI及FITC-BS-1双染色阳性细胞并表达CD34、CD133及FIK-1.②在呈绿荧光染色的血管内皮中可见有部分不均匀的散发蓝色荧光(DAPI标记细胞的细胞核).③细胞移植组兔静脉血管内皮有DAPI标记的细胞,且内膜厚度明显低于对照组(P＜0.05).结论:自体骨髓来源的内皮祖细胞移植可以促进损伤部位血管内皮的修复,并抑制内膜的过度增生.

干扰素α-2b对人类早幼粒白血病细胞株HL-60细胞的抑制增殖与促进凋亡的作用

背景:儿童急性白血病复发的主要根源是微小残留白血病细胞的存在,在试图清除微小残留病的众多治疗方法中,免疫生物治疗越来越受重视.以前的研究发现干扰素α-2b能有效抑制神经母细胞瘤和恶性淋巴瘤患儿体内肿瘤细胞的增长,其能否抑制白血病细胞的增长?目的:通过体外实验观察干扰素α-2b对白血病细胞的影响.设计:以人类早幼粒白血病细胞株HL-60为观察对象,对比观察实验.单位:青岛大学医学院附属医院儿科研究所细胞培养室、免疫实验室、细胞室.材料:HL-60细胞系由山东省医学科学院基础所提供.干扰素α-2b购自Megagene公司,FITC-兔抗鼠Ig工作液(CatEK001)和CD13抗人单克隆抗体工作液(Cat.DK013Y)购自协和干细胞基因工程有限公司.方法:体外建立HL-60细胞培养体系,调整细胞浓度为1×109 L-1,分为对照组和实验组,各实验组中加入终含量分别为5×105,1×106,2×106,5×106,1×107 U/L的干扰素α-2b,对照组加入等量生理盐水,继续培养48 h.光镜下采用瑞氏染色观察HL60细胞的形态变化,采用吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)双染色观察细胞凋亡,通过CD13蛋白表达测定观察细胞膜抗原表达及成熟分化,通过MTT实验检测HL-60细胞增殖活性.主要观察指标:根据HL-60细胞核染色质是否均匀一致及着色情况,判断细胞是否发生凋亡;根据酶标仪检测的吸光度(A值)判断HL-60细胞增殖情况;根据CD13阳性细胞数量判断HL-60细胞成熟程度.结果:①HL-60细胞凋亡:培养48 h,当干扰素α-2b为5×105 U/L时,以早期凋亡细胞为主,当干扰素α-2b含量为1×107 U/L时,以晚期凋亡细胞为主,HL-60细胞凋亡率均高于对照组,差异有显著性意义(χ2=23.79,29.57,P＜0.01).②HL-60细胞增殖情况:当干扰素α-2b含量为2×106 U/L和1×107 U/L时,A值均低于对照组,差异有显著性意义(t=5.65,11.31,P＜0.01).③HL-60细胞成熟程度:当干扰素α-2b含量为1×106 U/L和1×107 U/L时,CD13+细胞百分比均低于对照组,差异有显著性意义(χ2=26.89,14.73,P＜0.01).结论:干扰素α-2b有促进HL-60细胞凋亡、抑制HL-60细胞增殖和促进分化成熟的作用.

EB病毒LMP2A和EB病毒BZLF1融合基因反转录病毒表达载体的构建

目的:将LMP2A和BZLF1基因进行融合同时可发挥LMP2A诱导特异性CTL和BZLF1基因诱导潜伏期EBV进入裂解期复制的作用,协同杀伤EBV阳性肿瘤细胞.实验拟构建含EB病毒潜伏膜蛋白2A编码基因和即刻早期基因融合基因的反转录病毒表达载体,并筛选建立携带该基因的高滴度产毒细胞系.方法:实验于2006-08/2007-08在济宁医学院微生物教研室和青岛大学医学院微生物教研室进行.应用反转录-聚合酶链反应分别获得潜伏膜蛋白2A和即刻早期基因编码序列的cDNA,采用剪接式重叠延伸技术将两段基因通过多肽接头(Gly4Ser)3的DNA序列进行连接,构建融合基因Z2A.将融合基因Z2A定向插入逆转录病毒表达载体pMSCVpuro,形成重组质粒pMSCVpuro-Z2A,脂质体法将pMSCVpuro-Z2A转染反转录病毒包装细胞PT67.嘌呤霉素筛选产毒细胞克隆,扩大培养产毒细胞克隆,收获病毒进行滴度测定,RT-PCR检测产毒PT67细胞目的基因的转录表达.结果:限制性酶切、PCR及测序鉴定证实Z2A正确插入逆转录病毒表达载体,筛选获得了稳定产毒的嘌呤霉素抗性细胞克隆,收获病毒的滴度为7.8×106 CFU/L,且重组逆转录病毒在PT67细胞能有效转录.结论:携带Z2A基因的重组反转录病毒表达载体pMSCVpuro-Z2A构建成功,转染PT67细胞后包装出重组反转录病毒,进而筛选获得了能转录表达Z2A的产毒细胞系PT67-Z2A.

神经干细胞及衍生支持因子在大鼠脊髓损伤后的变化

目的:神经干细胞及其支持因子均与中枢神经损伤后的神经再生有关,但目前有关神经干细胞及其衍生支持因子在体内和脊髓损伤后是否有变化的证据较少.观察神经干细胞及其衍生的神经干细胞支持因子在大鼠脊髓损伤后的变化规律,探讨它们之间的相互关系.方法:实验于2005-09/2006-03在南通大学神经科学研究所实验室完成.①实验材料:清洁级SD大鼠27只由南通大学实验动物中心提供,将12只大鼠分为假手术组和脊髓损伤组用于免疫组织化学,另15只用于RT-PCR检测,分为假手术组和脊髓损伤组,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:按Allen重物打击法制备大鼠脊髓损伤模型,假手术组仅切除椎板,未行脊髓打击.用免疫组织化学方法鉴定脊髓组织中神经干细胞标志物nestin、胶质细胞标志物GFAP和神经干细胞衍生的神经干细胞支持因子阳性细胞在脊髓损伤后8,16 d的数量和形态变化;采用半定量RT-PCR检测神经干细胞衍生的神经干细胞支持因子mRNA在脊髓中的表达及损伤后4、8、12、16 d的变化.结果:①假手术组脊髓中央管附近出现巢蛋白阳性细胞.脊髓损伤后8 d,巢蛋白阳性细胞增多,细胞变大,向外周迁移,并发出突起,以着力侧为著,胶质纤维酸性蛋白阳性细胞出现增多,并出现表达神经干细胞衍生的神经干细胞支持因子阳性类似神经元形态的细胞.脊髓损伤后16 d,nestin阳性细胞数量明显减少,以GFAP阳性细胞增生为主,神经干细胞衍生的神经干细胞支持因子阳性细胞少见.②RT-PCR检测神经干细胞支持因子mRNA在正常大鼠脊髓中有表达,脊髓损伤后4 d神经干细胞支持因子的mRNA表达上升,损伤8 d为高峰,16 d恢复到近正常水平.结论:①在正常大鼠脊髓中央管附近存在神经干细胞,在脊髓损伤后出现增殖,随后可能分化为神经胶质细胞.②在正常脊髓有神经干细胞支持因子表达,脊髓损伤后神经干细胞支持因子的mRNA表达随神经干细胞增殖和分化而增高和下降,两者在脊髓损伤修复中关系密切.

大鼠不同纯度胰岛样本中干细胞标志物细胞角蛋白19的表达

背景:胰腺中存在的干细胞在合适的培养条件下可分化为具有内分泌功能的细胞,可以作为一种新的胰岛来源治疗糖尿病.目的:分析大鼠胰岛纯化程度与其中所携带的干细胞数量的关系.设计:以细胞为观察对象,对比实验.单位:绵阳市第三人民医院.材料:实验于2005-03/2006-03在重庆医科大学附属一院中心实验室完成.选取30只清洁级健康雄性SD大鼠,鼠龄50 d.实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.细胞角蛋白19和β-actin引物由上海英俊生物有限公司设计.Brdu试剂、小鼠抗大鼠Brdu单克隆抗体、兔抗鼠CK-19多克隆抗体、Brdu免疫组织化学试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司.HistostainTM-DS免疫组织化学双染试剂盒购于北京中杉公司.方法:大鼠腹腔注射5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)标记,均采用胶原酶Ⅴ型通过胰管对胰腺进行灌注,切取胰腺,剪碎,吹打、消化、离心获得胰岛细胞沉淀物.离心后沉淀物进行如下处理:即,不纯化组:胰岛沉淀物不进行纯化;高密度介质纯化法组:胰岛沉淀物中加入体积分数为25%的Ficoll液纯化;两种不同密度梯度纯化法组:胰岛沉淀物依次加入25%及11%的Ficoll液纯化.主要观察指标:应用免疫组织化学法检测胰岛样本中Brdu及细胞角蛋白19阳性细胞的表达,应用反转录聚合酶链反应检测不同纯度胰岛中细胞角蛋白19 mRNA的表达.结果:①胰岛纯度:不纯化组低,3组获得的胰岛细胞纯度比较,差异有显著性意义(F=89.42,P＜0.05).②胰岛样本中Brdu和细胞角蛋白19阳性细胞的表达:不纯化组的阳性表达高于高密度介质纯化法组和两种不同密度梯度纯化法组,差异有显著性意义(F=18.64,22.12,38.61,P＜0.01).③胰岛中细胞角蛋白19 mRNA的表达:不纯化组强,两种不同密度梯度纯化法组弱.结论:不同纯度的胰岛中有Brdu及细胞角蛋白19阳性细胞,在低纯度胰岛中含有较多的干细胞.

重组人粒细胞集落刺激因子动员对淋巴细胞功能相关抗原1/细胞间黏附分子1信号途径诱导CD4+T淋巴细胞活化及增殖的影响

目的:观察在异基因外周血造血干/祖细胞移植中重组人粒细胞集落刺激因子动员对淋巴功能相关抗原1/细胞间黏附分子1信号途径诱导的外周血CD4+T淋巴细胞的影响,验证重组人粒细胞集落刺激因子动员对淋巴细胞功能相关抗原1/细胞间黏附分子1信号通路的抑制作用.方法:选择2006-06/2007-06在解放军总医院血液科异基因外周血造血干细胞移植前进行重组人粒细胞集落刺激因子动员的10例健康供者,对治疗方案均知情同意,且得到医院伦理道德委员会批准.给予重组人粒细胞集落刺激因子10 μg/(kg·d)进行动员,在动员前1天和动员后第5天取供者外周静脉血,用miniMACS磁珠分选系统分离纯化CD4+ T淋巴细胞,分别用CD3单克隆抗体OKT3+细胞间黏附分子1、佛波酯+离子霉素刺激活化CD4+ T淋巴细胞,用双色荧光标记检测动员前后CD4+ T淋巴细胞激活后活化标记CD69,CD25的表达;用四甲基偶氮唑盐法检测动员前后OKT3+细胞间粘黏附分子1、佛波酯+离子霉素刺激CD4+ T淋巴细胞增殖能力变化.结果:①纯化后CD4+ T淋巴细胞纯度均在90%以上.②动员后OKT3+细胞间黏附分子1组、佛波酯+离子霉素组CD4+ T淋巴细胞活化标记CD69和CD25的表达均明显低于动员前(P＜0.01).③动员后OKT3+细胞间黏附分子1组、佛波酯+离子霉素组CD4+T淋巴细胞增殖率均明显低于动员前(P＜0.05).结论:重组人粒细胞集落刺激因子动员可能抑制了淋巴功能相关抗原1/细胞间黏附分子1协同刺激信号,从而使CD4+ T淋巴细胞活化、增殖能力下降.

腺病毒介导人血管内皮生长因子165基因转染促进人骨髓间充质干细胞的成骨特点

目的:课题组以前的实验证实,人血管内皮生长因子165基因重组腺病毒可高效感染人骨髓间充质干细胞,使之大量表达人血管内皮生长因子165,促进局部新生血管生成,有利于组织修复.实验观察腺病毒介导人血管内皮生长因子165基因转染对人骨髓间充质干细胞成骨能力的影响.方法:实验于2005-03/2006-01在郧阳医学院附属人民医院临床研究所和创伤骨科完成.人骨髓间充质干细胞取自健康成年男性自愿者,得到医院伦理道德委员会批准.将人骨髓间充质干细胞体外扩增纯化后随机分为4组:①人血管内皮生长因子基因重组腺病毒组.②β-半乳糖酐酶基因重组腺病毒组.③阳性对照组:培养液中添加地塞米松、抗坏血酸和β-甘油磷酸钠.④空白对照组:不给予特殊处理.各组细胞处理后12 d,应用全自动生化分析仪检测各组培养上液碱性磷酸酶活性;于处理后14 d,应用Von Kossa染色法检测人骨髓间充质干细胞中骨胶原结节形成情况.结果:①经多次换液传代,人骨髓间充质干细胞呈均一梭形形态.处理后人血管内皮生长因子基因重组腺病毒组与阳性对照组细胞形态逐渐趋于扁平,突起减少;β-半乳糖酐酶基因重组腺病毒组和空白对照组形态无明显变化.②Von Kossa染色人血管内皮生长因子基因重组腺病毒组与阳性对照组可见大量红色骨胶原结节形成,明显多于β-半乳糖酐酶基因重组腺病毒组和空白对照组.③人血管内皮生长因子基因重组腺病毒组与阳性对照组培养上清碱性磷酸酶活性显著高于β-半乳糖酐酶基因重组腺病毒组和空白对照组(F=165.18,P=0.00).结论:人血管内皮生长因子165基因重组腺病毒基因转染对人骨髓间充质干细胞成骨能力具有促进作用,验证了转染人血管内皮生长因子165的人骨髓间充质干细胞移植治疗骨疾病的可行性.

在端脑发育过程中胆碱能前体细胞发生和分化与不同浓度骨形态发生蛋白4的影响

目的:在神经元的发育过程中,骨形态发生蛋白具有多向诱导功能,实验观察不同浓度骨形态发生蛋白4对端脑胆碱能前体细胞发生和分化的影响,探寻其诱导条件及作用规律.方法:实验于2004-11/2005-03在吉林大学白求恩医学院组织胚胎学教研室细胞培养室和免疫组化实验室完成.采用无血清原代培养E16大鼠端脑细胞,分别在实验组培养液中加入终浓度为10,20和40 μg/L骨形态发生蛋白4,细胞培养4 d时,实施乙酰胆碱转移酶免疫细胞化学染色,同时计算乙酰胆碱转移酶免疫反应阳性细胞的百分率.结果:乙酰胆碱转移酶免疫阳性反应细胞分布于对照组和实验组细胞团的边缘和细胞团之间.20 μg/L骨形态发生蛋白4组细胞团之间分散的细胞多伸出突起为乙酰胆碱转移酶免疫阳性反应,可见少量具有典型放射状胶质细胞形态的细胞也呈乙酰胆碱转移酶免疫阳性反应.10 μg/L骨形态发生蛋白4组与对照组相比乙酰胆碱转移酶免疫反应阳性细胞数量差异无显著性(P＞0.05),20 μg/L骨形态发生蛋白4组乙酰胆碱转移酶免疫阳性反应细胞数量明显多于对照组(P＜0.05),40 μg/L骨形态发生蛋白4组乙酰胆碱转移酶免疫阳性反应细胞数量明显少于对照组(P＜0.05).结论:低浓度(20 μg/L)骨形态发生蛋白4可诱导端脑胆碱能前体细胞发生和分化;较高浓度(40 μg/L)骨形态发生蛋白4抑制端脑胆碱能前体细胞发生和分化.

脐血干细胞向巨核细胞分化后信号转导基因的表达

背景:造血干细胞具有多向分化的潜能,在合适的造血生长因子和系特异性生长因子的诱导下,可分化成巨核细胞.在体外诱导CD34+造血干细胞向巨核细胞分化可导致许多基因尤其是信号转导基因表达的变化.目的:观察脐血干细胞向巨核细胞分化后信号转导基因的表达,拟从基因水平验证其对巨核细胞分化发育的调控.设计:开放性实验.单位:福建省肿瘤医院肿瘤免疫学研究室.材料:无菌条件下应用血袋采集法收集足月正常分娩的胎儿脐带血60～145 mL,产妇及家属自愿捐献.VarioMACS免疫磁性吸附柱分离装置,CD34+ Isolation Kit;SCGM无血清培养基;CD单抗;细胞因子.人类全基因组寡核苷酸微阵列芯片V2.0;LuxScan 10K/A双通道激光扫描仪.实验经医院伦理委员会批准.方法:实验于2005-07/2006-06在福建省肿瘤医院肿瘤免疫研究室及北京博奥生物芯片有限公司完成.分别收集同一份脐血分化培养前CD34+细胞和培养后CD41+细胞,提取总RNA.逆转录合成和纯化cDNA探针,以Cy3-dCTP标记培养前CD34+细胞,以Cy5-dCTP标记培养后CD41+细胞.标记的DNA溶于30 μL杂交液中,42 ℃过夜.主要观察指标:应用基因芯片技术比较造血干细胞与分化的巨核细胞信号转导相关的基因表达差异.根据基因芯片结果,选定17个表达差异基因用RT-PCR作进一步验证.结果:芯片分析结果显示,共筛选出3 522个差异基因,其中上调基因1 705个,下调基因1 817个.3 522个差异基因中,与细胞信号相关的基因有343个,与转录调节相关的有150个,与分化相关的有21个.其中,CD61基因的表达增加了369.83倍,CD41基因的表达增加27.38倍,PF4基因的表达增加24.06倍;促分裂原活化蛋白激酶s、G蛋白偶联受体、RAS家族相关的基因多数表达上调;与STAT通路相关的基因中,SOCS1、JANUS激酶表达上调,STAT5A表达下调.对选定的17个表达差异基因用RT-PCR作进一步验证,以GAPDH为内对照,结果与芯片检测完全一致.结论:血小板生成素等造血生长因子可能主要通过G蛋白偶联受体-Ras-促分裂原活化蛋白激酶途径,促进脐血干细胞向巨核细胞系增殖、分化.

不同发育阶段人表皮干细胞端粒酶反转录酶表达的比较

目的:目前已知端粒酶活性的丧失及其增殖相关基因表达的改变是造成多种成体干细胞体外复制和扩增受限的主要原因,而端粒酶反转录酶对端粒酶活性起关键作用.体外分离培养人胚胎、少儿、成人3种不同皮肤来源的表皮干细胞,对比观察不同发育阶段端粒酶反转录酶表达的差异.方法:实验于2005-09/2007-04在南昌大学第一附属医院烧伤研究所完成.①对象:因创伤等原因致意外流产的妊娠24～26周龄胎儿皮肤标本,4～12周岁少儿及25～45岁成年人烧伤整形植皮手术剩余皮片标本,分别由南昌大学第一附属医院产科、烧伤科提供,产妇与烧伤患者对治疗及实验均知情同意,实验经医院医学伦理委员会批准.②实验方法:取胎儿、少儿和成年人的全层皮肤,用胰蛋白酶和EDTA联合消化法分离表皮,胶原快速贴附法纯化人表皮干细胞,用未黏附的角质细胞作为对照,以含表皮生长因子、角质细胞无血清培养液组成的表皮干细胞培养基进行体外培养.③实验评估:通过β1整合素、角蛋白19、p63免疫细胞化学染色对培养细胞进行鉴定,计算克隆形成率.以免疫细胞化学染色法和图像定量分析法检测3种不同皮肤来源的表皮干细胞端粒酶反转录酶的表达差异.结果:①细胞生长特征:分离培养的人表皮干细胞呈明显克隆性生长,克隆形成率高于角质细胞对照组(P＜0.05).②表皮干细胞的鉴定:细胞克隆经免疫细胞化学染色后,β1整合素、角蛋白19、p63均呈阳性表达.③端粒酶反转录酶免疫细胞化学染色及定量表达:不同皮肤来源的表皮干细胞端粒酶反转录酶均呈阳性,但表达强度不同,人胚胎＞少儿＞成人.3种皮肤来源的表皮干细胞平均吸光度值和阳性面积值均随年龄增加而逐渐降低,人胚胎＞少儿＞成人(P＜0.05).结论:人胚胎、少儿、成人皮肤来源的表皮干细胞均有端粒酶反转录酶表达,其表达强度依次减弱.提示诱导和增强端粒酶反转录酶的表达对维持表皮干细胞在体外自我更新和增殖能力可能具有重要意义.

永生化神经前体细胞膜表面μ阿片受体表达的鉴定

目的:阿片类物质可调控神经细胞的增殖和分化,为进一步明确阿片类物质对神经前体细胞的影响,对永生化神经前体细胞膜表面μ阿片受体的表达进行鉴定.方法:实验于2007-04/06在华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉科实验室完成.通过反转录-聚合酶链反应及免疫荧光化学技术,分别从mRNA水平及蛋白质水平直接检测永生化神经前体细胞膜表面μ阿片受体的表达.另外将永生化神经前体细胞分别予以μ阿片受体激动剂吗啡及非选择性阿片受体拮抗剂纳洛酮处理,通过激光扫描共聚焦显微镜定量检测加药前、后永生化神经前体细胞内钙离子浓度(intracellular calcium concentration,[Ca2+]i)的改变,从而间接鉴定永生化神经前体细胞膜表面μ阿片受体的表达.结果:反转录-聚合酶链反应结果表明永生化神经前体细胞内有μ阿片受体mRNA存在,免疫荧光化学结果显示μ受体主要定位表达于永生化神经前体细胞细胞膜及细胞浆.受吗啡刺激后,永生化神经前体细胞内[Ca2+]i较刺激前显著增高(t=7.61,P＜0.05);加入纳洛酮后[Ca2+]i亦呈显著增高趋势(t=4.96,P＜0,05);待纳洛酮作用平稳后再加入吗啡,[Ca2+]i无明显改变(t=1.00,P＞0.05).结论:永生化神经前体细胞膜表面确有μ阿片类受体表达,这为从体外水平研究阿片类物质对神经前体细胞增殖及分化的影响提供了一种易于培养、稳定可靠的工具细胞系.

肿瘤干细胞在伊马替尼耐药慢性髓系白血病细胞株中的表征

背景:慢性髓细胞白血病因为伊马替尼的应用出现了重大转机.但由于伊马替尼的耐药性,应用该药治疗的白血病患者预后较差,特别是对于急变期白血病患者.目的:观察肿瘤干细胞在伊马替尼STI571耐药的慢性髓细胞白血病细胞系K562中的表征,阐明白血病细胞系对伊马替尼STI571耐药的机制.设计:观察性对比实验.单位:河南省肿瘤医院,河南省血液病研究所.材料:选用5周龄BALB/c-nu/nu小鼠30只,雌性,由中国医学科学院动物中心提供.STI571由北京诺华制药有限公司提供.足叶乙甙(Vp16)购自德国Bristol-Myers Squibb;抗P-gp购自美国Santa Cruz 公司.抗ab1购自美国BD Biosciences公司.实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.方法:实验于2003-09/2005-11在河南省血液病研究所完成.经过对K562细胞系长期的足叶乙甙(Vp16)诱导和克隆筛选,建立了一株耐药细胞系K562/Vp16;利用干细胞高效能将Hoechst 33342荧光染料泵出细胞的特性,采用流式细胞分选方法从K562/Vp16细胞系中分选出一小群细胞,即边缘细胞(SP),称为K562/Vp16 SP细胞,余下部分为K562/Vp16非SP细胞.为了分析白血病细胞对伊马替尼STI571耐药的机制,分别检测K562,K562/Vp16非SP细胞或K562/Vp16 SP细胞中MDR1,Bcr-Abl和P-gp的表达.另外,按每只BALB/c-nu/nu小鼠1 000个K562、K562/Vp16非SP细胞或K562/Vp16 SP细胞的数量分别对其进行腹腔注射.主要观察指标:K562/Vp16非SP细胞或K562/Vp16 SP细胞对STI571的耐药性和致瘤性.结果:Bcr/Abl和Abl蛋白在K562细胞、K562/Vp16 SP细胞及K562/Vp16非SP细胞中的表达水平差异无显著性意义(P＞0.05);P-gp在K562细胞中不表达,在K562/Vp16 SP及K562/Vp16非SP细胞中均高表达且表达水平一致(P＞0.05);与K562/Vp16非SP细胞比较,K562/Vp16 SP细胞对伊马替尼的耐药性更强,并且这种抗性几乎不能被多种多药耐药逆转剂逆转;另外,体内外实验显示,K562/Vp16细胞的致瘤性几乎全部来源于K562/Vp16 SP细胞.结论:Bcr/Abl基因的扩增、过度表达和多药耐药基因及其蛋白表达产物P-gp的高表达,也许并不是白血病细胞产生对伊马替尼临床耐药的重要机制;白血病细胞对伊马替尼具有一定的抗性,可能与数量极少的白血病干细胞有直接的关系.因此,这类数量极少的干细胞样的肿瘤细胞应当成为有效治疗肿瘤的靶细胞.

干细胞因子基因cDNA克隆及其在造血干细胞中的表达

目的:克隆人干细胞因子基因cDNA,构建真核表达载体并转导脐带血造血干细胞,观察干细胞因子在造血干细胞中的表达,从而为脐血造血干细胞扩增及移植奠定实验基础.方法:实验于2005-09/12在承德医学院基础医学研究所和湖南师范大学医学院寄生虫病研究室完成.①实验材料:健康胎儿脐带由承德医学院附属医院提供,产妇均签署知情同意书;pcDNA3.1,大肠杆菌E. coliDH5α由本室保存;pUCm-T vector (promega公司);BamHⅠ,XbaⅠ(New England BioLabs公司).②实验方法:无菌收集胎儿脐带,胶原酶+胰蛋白酶+乙二胺四乙酸联合消化,分离培养人脐带内皮细胞.从上述含脐带内皮细胞的培养液中分离提取干细胞因子mRNA,用反转录-聚合酶链反应扩增干细胞因子cDNA.纯化的PCR产物与载体pUCm-T加入连接反应体系,构建及克隆pUCm-T/SCF质粒,其与pcDNA3.1分别进行BamHⅠ、XbaⅠ双酶切反应,产物经琼脂糖凝胶电泳后回收干细胞因子cDNA和pcDNA3.1片段,构建真核表达型载体pcDNA3.1/SCF.以密度梯度法+免疫磁珠法分离收集人脐血CD34+造血干细胞,导入pcDNA3.1/SCF,设立未转导对照组.③实验评估:转导后1～7 d检测两组细胞上清液中干细胞因子水平的表达.结果:①人干细胞因子基因cDNA克隆:扩增的人干细胞因子基因cDNA理论上应为690 bp,实际PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后,紫外线下可见一预期大小的条带,证明干细胞因子mRNA提取成功,反转录合成的cDNA完整.②分泌型真核表达质粒pcDNA3.1/SCF的构建:BamH Ⅰ和XbaⅠ双酶切后电泳可见690 bp的插入片段,与干细胞因子基因序列相同,表明分泌型真核表达质粒pcDNA3.1/SCF构建成功.③脐血造血干细胞培养上清中的干细胞因子水平:培养第1～7天,转导pcDNA3.1/SCF的脐血造血干细胞上清中的干细胞因子表达水平均明显高于未转导对照组(P＜0.01).结论:成功克隆人干细胞因子基因cDNA,并构建了重组质粒pcDNA3.1/SCF,该质粒转导脐血造血干细胞后,能在短期内有效表达.

干细胞移植干预下肢缺血性疾病

目的:探讨干细胞移植在下肢缺血性疾病治疗中的应用情况.方法:检索Pubmed 1997-03/2007-03与干细胞移植治疗下肢缺血性疾病有关的文章,检索词为"stem cells,transplantation,limb ischemia",并限定文章语言种类为英语.同时检索中国期刊全文数据库1997-03/2007-03相关的文章,检索词为"干细胞移植,下肢缺血性疾病",并限定文章语言种类为中文.然后对资料进行初审,并查看每篇文献后的引文.纳入标准:文章所述内容应与干细胞移植在缺血性下肢血管中的应用研究相关;以近5年且发表在较权威杂志者优先.排除标准:重复研究或Meta分析类文章.结果:共收集到330篇相关文献,排除277篇内容陈旧或重复的文献,53篇符合纳入标准,有33篇检索到全文,纳入其中的26篇:16篇涉及骨髓干细胞移植;6篇涉及自体外周血干细胞移植,其余为其他相关文献.阐述干细胞具有多重分化活性,可有效改善下肢缺血.基础研究表明骨髓、外周血干细胞移植能使肢体侧支循环增加.干细胞参与血管形成的机制主要有直接分化、成熟为新血管以及分泌血管内皮细胞生长因子等促进局部缺血组织的血管新生.临床研究表明自体骨髓干细胞或自体外周血干细胞移植治疗下肢缺血性疾病都取得了较好的临床效果,但仍然存在移植安全性、远期治疗效果、提高临床疗效等问题.结论:干细胞移植能促进下肢血管新生,已成为治疗下肢缺血性疾病的有效方法之一.

神经干细胞移植治疗帕金森病的研究与应用

目的:总结神经干细胞的来源以及神经干细胞移植治疗帕金森病的进展.方法:应用计算机检索中文科技期刊数据库1994-01/2007-06期间与神经干细胞移植和帕金森病相关的文献,检索词"神经干细胞移植、帕金森病",限定文章语言种类为中文.对资料进行初审,并查看每篇文献后的引文,文献所述内容应与神经干细胞移植、帕金森病相关,且以近5年发表在较权威杂志优先.排除重复性文章及Meta分析类文章.结果:①神经干细胞有很强的增殖能力和迁移能力,并替代受损伤的脑细胞,神经干细胞通过体外培养使其增殖后,移植到宿主脑内能够迁移并分化为黑质多巴胺能神经元.②神经干细胞联合基因治疗将神经干细胞作为基因治疗的载体,在体外转基因移入病变的神经组织,可阻止神经元变性并恢复其功能.③胶质细胞系源性神经营养因子的神经营养作用和酪氨酸羟化酶分泌黑质多巴胺能神经递质的功能,既能提高脑内黑质多巴胺水平,又能使黑质多巴胺能神经元长期存活,阻止黑质多巴胺能神经元变性,重建宿主神经通路.④神经干细胞作为基因载体,进行神经干细胞移植联合多基因治疗,为帕金森病治疗提供了新的思路.结论:随着神经干细胞研究的逐渐成熟及发展,神经干细胞移植已成为帕金森病治疗的主要发展方向.

骨髓间充质干细胞移植在肾脏疾病防治中的应用

目的:探讨骨髓间充质干细胞在肾脏疾病中的应用.方法:应用计算机检索中文科技期刊数据库1994-01/2007-06期间与骨髓间充质干细胞移植和肾脏疾病防治相关的文献,检索词"骨髓间充质干细胞、肾脏疾病",限定文章语言种类为中文.对资料进行初审,并查看每篇文献后的引文,文献所述内容应与骨髓间充质干细胞移植、难治性肾病、肾功能衰竭相关,且以近5年发表在较权威杂志者优先.排除重复性文章及Meta分析类文章.结果:①骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能和可塑性,在特定的条件下可以向肾病大鼠肾脏的肾小球及间质细胞转化.骨髓间充质干细胞移植后可对肾功能等生化指标有明显改善作用.②同种异基因骨髓移植治疗IgA肾病患者后,清除了在系膜沉积的IgA分子.③在慢性马兜铃酸肾病中,骨髓造血干细胞特异标志物CD34+细胞减少,推测慢性马兜铃酸肾病发病机理可能与骨髓间充质干细胞受损相关.④骨髓间充质干细胞还可以重建损伤后的肾小球系膜,将骨髓移植后的小鼠制成肾小球肾炎模型,一周后观察发现有骨髓间充质干细胞向系膜细胞分化.结论:骨髓间充质干细胞可分化成为各种肾脏细胞,从而修复肾损伤,为未来解决肾小球损伤、肾小管坏死及其导致的急、慢性肾功能衰竭提供了一种新型的治疗方案.

干细胞移植修复臂丛神经损伤的应用前景

目的:介绍神经干细胞和/或骨髓间质干细胞移植修复臂丛神经损伤的应用及其前景.方法:应用计算机检索Medline数据库1997-01/2007-08,万方数据库2001-01/2007-08与神经干细胞、骨髓间充质干细胞移植修复周围神经损伤、尤其是修复臂丛神经损伤相关的文章,无论中英文、有无对照组均纳入,排除重复研究或Meta分析类文章.共收集到80篇相关文献,34篇符合标准.结果:干细胞移植治疗神经系统疾病越来越引起关注,其中神经干细胞和骨髓间充质干细胞研究较多.神经干细胞和骨髓间充质干细胞在一些相关因素作用下可以分化为许旺细胞、神经元细胞、胶质细胞等,移植后对动物模型有较好的治疗效果,所以有巨大的潜能来修复包括臂丛神经在内的周围神经损伤.神经干细胞和骨髓基质细胞可用来构建组织工程神经,也许能够达到周围神经功能更完美的修复.如何为损伤神经提供有利的环境,如何促进干细胞的存活和增加向许旺细胞或神经元分化的数量,仍是研究者要面临的问题.结论:随着基础研究的深入,神经干细胞、骨髓间充质干细胞移植治疗臂丛神经损伤的技术得会更加成熟,有望更好地应用于临床.

异基因造血干细胞移植治疗慢性粒细胞白血病63例

目的:观察异基因造血干细胞移植治疗慢性粒细胞白血病的疗效,并分析63例患者治疗后的生存状况.方法:病例来源于1989-06/2007-04在解放军总医院血液科行异基因造血干细胞移植的63例慢性粒细胞白血病患者,男52例,女11例,中位年龄33.5岁.患者均经血液形态学和细胞遗传学确诊,并对治疗知情同意.10例行HLA相合同胞供者异基因骨髓移植,39例行HLA相合同胞供者异基因外周血干细胞移植,3例行非血缘关系骨髓移植,6例行非血缘关系外周血干细胞移植,5例行HLA相合的同胞异基因非清髓外周血干细胞移植.预处理采用改良的BuCy方案和全身放疗加环磷酰胺方案.以霉酚酸酯、环孢菌素A加短疗程的甲氨喋呤预防移植物抗宿主病.移植后按每3个月定期进行随访,观察患者生存情况.结果:63例患者均完成随访,并进入结果分析.63例患者中有39例移植后5年无病存活(61.9%).移植后100 d内死亡11例,死亡原因分别为急性移植物抗宿主病、播散性感染、复发和植入失败.移植后100 d至2年内死亡12例,死亡原因分别为慢性移植物抗宿主病、巨细胞病毒感染和疾病复发.1例于移植后1 413 d死亡,死亡原因为慢性移植物抗宿主病合并感染.其余移植超过2年均存活.结论:异基因造血干细胞移植可使部分慢性粒细胞白血病患者获得长期无病存活.

人β-神经生长因子和神经生长因子基因重组真核表达载体的构建

目的:人神经生长因子包括β-神经生长因子、神经生长因子这两种活性形式,拟分别构建这两种活性形式的基因重组真核表达载体,为进一步的转基因实验作好前期准备.方法:实验于2001～2004年在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成.①对象:健康志愿者5人,均对本实验知情同意.流产胎儿由青岛大学医学院妇产科提供,产妇均签署知情同意书,实验经医院医学伦理委员会批准.②实验方法:根据人β-神经生长因子与神经生长因子的全长基因序列设计合成特异性引物.抽取正常人外周血1.5 mL,提取基因组DNA后克隆出人β-神经生长因子基因片段.取胎儿海马部位脑组织100 mg,采用RT-PCR技术从胎儿脑组织中克隆出人神经生长因子基因片段.分别将纯化的β-神经生长因子产物与神经生长因子产物连接于真核表达载体pcDNA4上,构建重组真核表达载体.转入JM109大肠杆菌中,扩增后小剂量质粒提取,酶切鉴定及计算机自动测序.结果:β-神经生长因子和神经生长因子的PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果显示,在预期位置均有阳性条带.酶切鉴定结果及计算机自动测序均证实插入片段为目的基因片断.结论:实验分别从人外周血和胎脑海马组织中成功克隆获得β-神经生长因子与神经生长因子,并顺利构建这两种活性形式的重组真核表达载体pcDNA4-β-NGF与pcDNA4-NGF,为进一步将神经生长因子基因转入真核细胞并比较二者表达效率作好准备工作.

翼状胬肉逆行切除加相邻带干细胞自体结膜转位术治疗效果的随访观察

背景:翼状胬肉治疗方法以手术为主,手术方法多种多样.目的:观察自行设计的翼状胬肉逆行切除加相邻带干细胞自体结膜转位术对翼状胬肉的治疗效果.设计:病例随访观察.单位:中国医科大学附属第四医院眼科.对象:选择2003-05/2006-05就诊于中国医科大学附属第四医院的翼状胬肉患者50例(60眼),患者均同意接受手术治疗并配合随访观察,且得到医院伦理道德委员会批准.方法:逆行将翼状胬肉头部自角膜上分离,向泪阜方向及上下方向钝性分离结膜及其下方增生变性组织,直至近半月皱襞处,全部切除胬肉.转位相邻带干细胞的自体结膜于巩膜裸露区.术后定期随访.主要观察指标:①术后角膜上皮、结膜上皮的愈合时间.②翼状胬肉的复发率.结果:①50例翼状胬肉患者(60眼)的的角膜上皮、结膜上皮缺损区均在术后一两天内愈合.②拆线后随访8～16个月,其中8～12个月26眼,13～16个月34眼,平均12个月.58眼痊愈,2眼复发.结论:翼状胬肉逆行切除加相邻带干细胞自体结膜转位术简单易操作,并可较大程度地降低胬肉术后复发率.

AGTR1基因A10208G位点多态性与宁夏地区2型糖尿病与健康人的相关性

目的:糖尿病与心血管疾病可能存在着共同的遗传基础,AT1基因可能是心血管疾病与糖尿病共同的候选基因,人类编码AT1受体基因是AGTR1基因.分析2型糖尿病与健康者AGTR1基因A10208G位点多态性与胰岛素抵抗和β细胞功能之间的关系.方法:选择2005-03/2007-03于银川市第一人民医院内分泌科住院新诊断的2型糖尿病患者127例,符合1999年WHO糖尿病诊断标准,男68例,女59例,平均(54.86+11.05)岁,伴有腹型肥胖的2型糖尿病患者105例,不伴有腹型肥胖的2型糖尿病患者22例,所有患者均自愿参加本实验,实验经医院伦理委员会批准.健康对照组人群来自宁夏地区的健康志愿者224名,男117名,女107名,平均(56.68+11.39)岁.所有对象均无血缘关系,且两组人群在性别和年龄上均匹配,各项参数之间无统计学意义.采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术分析105例伴有肥胖2型糖尿病患者、22例不伴肥胖的2型糖尿病患者及224例健康对照者AGTR1基因A10208G位点多态性,并测定相应生化指标进行分析.结果:351名受试者均进入结果分析.①腹型肥胖糖尿病组AGTR1基因A10208G位点基因型分布和等位基因频率与健康对照组比较有统计学意义(基因型:χ2=10.85,P＜0.01;等位基因:χ2=5.57,P＜0.05).②腹型肥胖糖尿病组携G等位基因患者Homa-IR、Homa-β明显高于非腹型肥胖糖尿病组携G等位基因患者(P＜0.05).结论:①AGTR1基因A10208G位点多态性与2型糖尿病存在相关性,尤其是伴有腹型肥胖的2型糖尿病患者.②AGTR1基因A10208G位点A→G的突变可能参与胰岛素抵抗和胰岛β细胞分泌功能损伤.

克隆测序确认HLA新等位基因B*3712

目的:由于技术原理的限制,目前尚不能对所有的HLA等位基因进行严格的区分,特别是以往没有发现的新基因序列只能通过测序的方法解决,然而,当遇到等位基因杂合时,测序给出的结果仍然无法确认新的序列改变发生在等位基因的哪一侧,这时需要用分子生物学方法分离杂合子然后进行测序才能确定新的基因序列.采用基因克隆方法确认HLA新等位基因.方法:实验于2006-01/05在河南省红十字血液中心HLA实验室,美国海军骨髓库HLA实验室完成.造血干细胞血样由中华骨髓库提供.采用荧光微珠HLA分型方法对中华骨髓库捐献者血样进行HLA分型检测,无法给出确切结果的摸棱两可结果标本用基因克隆(TOPO TA Cloning)、DNA测序的方法确认新的HLA基因序列.结果:通过克隆分离杂合等位基因,再进行测序确认发现新的序列与B*3709相比,出现4个核苷酸改变:1.355nt C＞A,2.363nt C＞G,3.412ntG＞A,4.477nt C＞G,而且均发生在HLA-B基因外显子3(exon 3).4处改变引起氨基酸编码改变:①编码95 CTC＞ATC,氨基酸改变L＞I(亮氨酸＞异亮氨酸).②97 AGC＞AGG,S＞R(丝氨酸＞精氨酸).③114 GAC＞AAC D＞N(天门冬氨酸＞天冬酰胺).④135 GCC＞GCG A=A无氨基酸改变.结论:①新的基因序列已经在GenBnak注册,被WHO的HLA因子命名委员会得到正式命名为HLA-B*3712基因.②基因克隆是确认HLA新基因的根本方法.

骨髓单个核细胞与多孔乳酸制备的混合物修复家兔关节软骨缺损

目的:骨髓间充质干细胞用于软骨缺损修复方面的研究已有较多报道,实验以聚乳酸为载体,拟进一步验证骨髓单个核细胞与多孔乳酸混合物对关节软骨缺损的修复效果.方法:实验于2006-11/2007-06在华北煤炭医学院实验中心完成.①实验材料及分组:清洁级3至4个月龄家兔30只,雌雄不限,体质量2.0～3.0 kg.②实验过程及分组:参考文献制备多孔乳酸载体,抽取5只家兔骨髓,分离液分层,取单个核细胞体外培养,制备细胞-多孔乳酸混合物.取家兔25只随机分为3组,即细胞-多孔乳酸组17侧膝关节,缺损中植入细胞-多孔乳酸混合物;空白多孔乳酸组17侧膝关节,缺损中植入空白多孔乳酸混合物;未处理组16侧膝关节,缺损不作任何处理.③实验评估:分别于术后4,8,12周麻醉状态处死动物,进行大体及组织学切片观察.结果:实验过程家兔死亡4只,进入结果分析21只42膝.①大体观察:术后12周,细胞-多孔乳酸混合物组标本缺损处修复组织的色泽呈乳白色,但与周围正常软骨的界限已变得模糊不清;空白多孔乳酸混合物组与未处理组缺损处充填物的色泽与周围软骨组织类似,表面平坦,但边界仍清晰可辨.②组织学评分:术后4,8,12周,细胞-多孔乳酸混合物组的修复效果均优于其他两组(P＜0.05).结论:利用体外培养的骨髓单个核细胞-多孔乳酸混合物修复兔关节软骨缺损,缺损均由类透明组织修复,表明其对关节软骨具有修复能力.

新闻