特殊类型的髋关节置换及其功能重建

目的:全髋关节置换术为某些特殊情况下的髋部病变提供了新的治疗手段,并获得良好的早期效果,比如髋臼骨折、老年人股骨颈或粗隆骨折等,由于手术技术成熟而越来越多患者采用了全髋关节置换术;但国内由于起步较晚,以及随访率低等原因,尚缺乏长期治疗结果的随访经验,翻修术中对髋臼骨缺损的处理仍是棘手的问题.对2000年以来的相关国外文献进行综述,希望能为髋关节置换术后的功能重建提供有效的参考.资料来源:应用计算机检索PubMed 2000-01/2004-12期间关于髋关节置换术后功能重建的文章,检索词"total hip arthroplasty(or revision),old,or necrosis,or acetabularfracture"等,限定文章语言种类为"English".资料选择:对资料进行初审,选择髋关节置换或翻修术中与老年患者或髋部骨折等有关的论著,排除综述类文章及未提供摘要类文章.剩余文献查找全文.资料提炼:共收集到168篇有关老年患者或髋部骨折等有关的髋关节置换或翻修术随访结果论著,通过阅读摘要或全文对文章内容进行分类整理,73篇与本文综述内容有关,排除95篇.资料综合:73篇论著中包括了髋臼骨折后全髋置换、老年患者全髋置换以及骨坏死、同期双侧全髋置换等特殊情况下全髋置换术后临床长期随访的结果.结论:在具备相应条件和技术的前体下,在某些特殊类型的髋部创伤或疾病治疗中,全髋关节置换(或翻修)术不仅可获得良好的早期效果,临床长期随访结果也表明可达到满意的功能重建.

应用组织工程学技术修复关节软骨缺损

目的:关节软骨缺损一直是临床上的一个难题.目前的治疗包括自体或异体骨软骨移植修复、软骨膜或骨膜移植修复.组织工程学技术的发展使体外培养软骨细胞修复关节软骨缺损进入了一个新的发展时期,通过查阅文献对体外培养软骨细胞修复关节软骨缺损进行综述. 资料来源:应用计算机检索Medline 1993-01/2004-06关于组织工程学技术修复关节软骨缺损的文章,检索词为"articular cartilage defects、tissue engineeringtechnology",限定语言种类为英文;同时计算机检索中国期刊数据库1993-01/2004-06相关组织工程学技术修复关节软骨缺损的文章,检索词"关节软骨缺损,组织工程学技术,体外培养",限定语言种类为中文.资料选择:对资料进行初审,纳入标准:①有关软骨细胞的结构、功能、及其体外培养的意义研究.②有关体外培养种子细胞的选择的研究.③软骨细胞修复关节软骨缺损的前景展望的研究.排除标准:文献中重复研究、综述、Mata分析类文章.未排除文章中资料是否应用了随机、对照和盲法.资料提炼:共收集到32篇相关文献,含追溯法查找文献6篇,18篇符合纳入标准,排除14篇文献,其中4篇系重复研究,7篇为临床应用,3篇为软骨细胞支架的研究.18篇文献中有7篇对软骨细胞的特征进行综述,5篇是理想种子细胞的选择的研究,6篇为软骨细胞修复关节软骨缺损的前景展望的研究.资料综合:软骨细胞体外培养大量扩增、分化维持其正常的表型及代谢的调控因素为组织工程化软骨修复软骨缺损、体外培养软骨细胞建立软骨细胞库开拓了一条新的途径.软骨细胞、间充质干细胞(骨髓、骨膜或软骨膜来源)、滑膜细胞或转基因细胞等均可作为种子细胞.可来源于同种异体甚至异种细胞.自体软骨细胞植入技术已经作为一个传统自体软骨细胞移植术的替代品被骨科界广泛接受.结论:体外培养软骨细胞技术,目前已经成熟.组织工程学技术修复关节软骨缺损的方法很多.组织工程学技术的发展使体外培养软骨细胞修复关节软骨缺损进入了一个新的发展时期,基质诱导的自体软骨细胞植入技术修复关节软骨缺损开辟了新的道路.

热传导银质针疗法对原发性髌下脂肪垫炎的作用

目的探讨热传导银质针对原发性髌下脂肪垫炎的治疗作用.方法将2003-05/2004-11解放军总医院门诊就诊的原发性髌下脂肪垫炎患者120例随机分为对照组(n=55)和治疗组(n=65),其中治疗组采用银质针疗法治疗,对照组采用局部封闭治疗;每例患者各治疗2次.全部病例均电话联系,门诊复诊随访,随访时间为1.0～1.5年,比较两组患者有效率和优良率.结果治疗组脱落2例,对照组脱落3例,纳入结果分析治疗组为63例,对照组为52例.治疗组优良率高于治疗组(86%和63%),差异有显著性意义(x2=7.66,P＜0.05);治疗组和对照组总有效率差异无显著性(93%和94%,P＞0.05).结论热传导银质针对原发性髌下脂肪垫炎具有较好的治疗作用.

治脊疗法配合腹针治疗颈源性头痛50例分析

目的观察治脊疗法配合腹针治疗颈源性头痛的疗效.方法选择兰州军区乌鲁木齐总医院康复医学科2003-02/2004-02门诊及住院的颈源性头痛患者100例,随机分为治疗组50例,对照组50例.治疗组先用治脊疗法纠正错位的上颈段然后在配合腹针治疗以巩固疗效.对照组用电针治疗,两组均1次/d,10 d为1个疗程,两个疗程后观察疗效.结果所纳入的100例患者均进入结果分析,无脱落者.治疗组和对照组显效、有效、无效分别有44,6,0;34,11,5例,治疗组痊愈率大于对照组(88%,68%,P＜0.01).结论治脊疗法配合腹针治疗,可改善患者的头痛症状,较电针治疗效果显著.

穴位药物注射配合经络导平治疗儿童坐骨神经损伤136例

背景:臀部肌肉注射导致坐骨神经损伤,是近年来临床上常见的一种周围性神经损伤疾病.

青少年腰椎间盘突出症治疗效果分析

目的探讨青少年腰椎间盘突出症的发病特点及其手术治疗效果.方法选取2002-12/2004-12第二军医大学附属长海医院骨科行手术治疗的27例青少年腰椎间盘突出症患者.本组27例患者均经3个月以上的正规保守治疗,包括卧床休息、机械牵引、手法推拿、电针刺激、口服消炎止痛药物等,无效后采用手术治疗.手术行单侧开窗术22例,扩大开窗4例,双侧扩大开窗1例.具体操作为全部病例采用全麻俯卧位,腰椎后正中切口暴露棘突及椎板,定位准确后于病椎间隙患侧椎板开窗打开椎管,单侧开窗大小为1.0 cm×1.0 cm的骨窗,需要扩大开窗的小于2.0 cm×2.0 cm,需双侧开窗者同法处理对侧.将硬膜囊及脊神经根往对侧牵开彻底切除髓核及破裂的透明软骨板,探查脊神经根松解后置负压引溜逐层缝合关闭伤口.术后按照日本骨科学会下腰痛手术疗效标准对患者体征及日常生活问题进行评定.结果按意向处理分析,本组27例患者术后均完成3个月随访,全部进入结果分析.按照日本骨科学会下腰痛手术疗效标准,27例患者中优20例,良5例,可2例,优良率为92.6%.结论青少年腰椎间盘突出症在严格保守治疗无效的情况下,以微小的手术创伤换来对神经功能的保护和生活质量的改善是值得的,应尽量采用对脊柱损伤较小的椎板开窗手术进行治疗,可以获得满意效果.

光动力作用对肿瘤患者外周血红细胞免疫功能的影响

目的观察小剂量光动力作用对肿瘤患者外周血红细胞免疫功能的影响.方法实验于2003-12/2004-04在解放军总医院临床实验科完成.对照组为外周血200μL中加入生理盐水200μL.实验组为200 μL外周血加入1 mg/L血卟啉200 μL后在2 mW/cm2红光下照射5 s,两组均用Ficoll液分离红细胞,采用红细胞CR1的酶联免疫竞争吸附实验,在分子水平上体外测定实验组及对照组红细胞CR1活性及红细胞粘附的免疫复合物C3b分子含量.结果①实验组的C3b含量(0.169 8±0.020)ng显著高于对照组(0.138 0±0.020)ng(t=3.211,P＜0.01).②实验组CR1活性(0.213 8±0.036)%显著高于对照组(0.147 9±0.025)%(t=3.198,P＜0.01).结论小剂量光动力作用可增强肿瘤患者外周血红细胞CR1活性及粘附的免疫复合物C3b分子的表达,促进其免疫粘附功能,有利于循环免疫复合物的清除,增强机体的免疫功能.

桡骨三维模型的建立及其生物力学意义

背景:桡骨骨折常遗留严重的并发症如骨不连等,采用新的生物力学分析手段为肱骨骨折、骨不连的功能预后提供新思路.目的:建立桡骨三维有限元模型,并探讨其相关的生物力学意义.设计:以三维有限元模型分析桡骨生物力学特征.单位:解放军第二军医大学附属长海医院骨科和同济大学生命科学与生物工程学院. 材料:实验于2001-01/2003-05在解放军第二军医大学长海医院骨科实验室和同济大学生命科学与生物工程学院实验室完成.选择典型的成年男性湿桡骨标本1根,行CT成像得到桡骨每层横截面图像.方法:采用大型有限元分析软件ANSYS 5.6建立桡骨三维模型,建模步骤为①对齐切片.②确定坐标原点.③提取轮廓.采用三维十结点四面体实体单元进行网格划分及计算.主要观察指标:①构建的桡骨三维有限元模型的生物力学特性.②三维有限元分析及计算.结果:所构建桡骨三维模型,共划分为76 089个结点、49111个单元,客观反映桡骨真实解剖形态及生物力学行为,同时与CT切片图相对比以判断其精确性.结论:桡骨三维有限元模型的构建,可以为桡骨正常力学行为以及骨折后内固定的力学基础研究提供精确模型.

骨水泥阻塞骨干髓腔后远侧骨内压的改变

目的:探讨骨水泥阻塞股骨近中段骨干髓腔后对股骨远端骨内压的近、远期影响.方法:实验于2002-07/2003-04在重庆医科大学实验动物中心完成.成年新西兰大白兔32只.采取兔左侧股骨髓腔内灌注聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥而右侧不灌注作为正常对照的方法,制作骨水泥阻塞股骨近中段骨干髓腔的动物模型.将32只实验兔分成5组,随机取出8只不做模型作为正常组,其余24只制作骨水泥阻塞骨干髓腔的动物模型,根据不同的观察时间段随机分成术后当天(0 d),4,8,16周组,每组6只.使用生理测压仪,对正常和模型动物双侧股骨远端骨内压进行测量和比较.结果:32只兔均进入结果分析.①各组实验侧和对照侧骨内压比较:正常组双侧股骨远端骨内压比较无差异性;造模后0 d,4,8,16周实验侧骨内压明显比对照侧增高[(4.6±0.5)比(3.1±0.4)kPa,(4.8±0.5)比(3.0±0.4)kPa,(4.7±0.4)比(3.1±0.4)kPa,(4.1±0.2)比(3.1±0.4)kPa,P＜0.01).②模型后不同观察时间段骨内压比较:造模后在不同观察时间段对照侧骨内压均无差异性;实验侧处于持续骨内高压状态,4周显著高于16周(P＜0.05).结论:骨水泥阻塞股骨近中段骨干髓腔后严重破坏了骨内和髓内的血液循环状态,引起了一系列血流动力学变化,导致股骨远端的骨内压持续升高并长期存在.

镍钛形态记忆合金与骨组织相容性的超微结构观察

背景:镍钛合金因具有形状记忆效应和高弹性的特性,成为有应用前景的金属生物医学材料之一.但其表面不具有生物活性,植入后不能与骨整合.目的:通过将表层涂有羟基磷灰石多孔修饰层的镍钛合金植入兔股骨,以观察其生物学特性.设计:空白对照观察.单位:天津医科大学组织胚胎学教研室实验室.对象:雄性成年纯系日本白兔24只,随机分为实验组和对照组各12只.方法:实验于2001-07/2002-12在天津医科大学组织胚胎学教研室完成.兔24只,选取其左侧股骨下1/3处为种植区,实验组12只动物植入镍钛合金,对照组12只仅手术钻孔,不植入任何材料,作空白对照.分别于术后4,8,16周各组取4只兔左侧股骨种植区标本进行组织学光镜及电镜观察. 主要观察指标:兔左侧股骨种植区标本组织学及超微结构观察.结果:24只兔均进入结果分析.①兔左侧股骨种植区标本组织学观察结果:术后4周,实验组骨膜反应稍重于对照组,术后16周,实验组有许多大片的类骨质,骨板排列较规则,新骨已基本形成;对照组骨板排列十分规则,新骨已完全成熟.②兔左侧股骨种植区标本超微结构观察:术后8周,实验组及对照组植入区骨小梁周围有大量成骨细胞,新生的骨板排列规则.术后16周,实验组及对照组哈弗氏系统已成熟,中央管内皮细胞完整,其周围哈弗氏骨板中骨细胞形态良好,细胞较小,细胞器相对较少.结论:此镍钛形态记忆合金植入机体后无排斥反应,与骨组织具有很好的相容性.

后外侧或后路环形融合内固定治疗改善腰椎峡部裂性椎体滑脱患者下腰痛及功能活动障碍的效果

目的:回顾性评估腰椎峡部裂性椎体滑脱(Ⅰ度～Ⅲ度)患者行后外侧或后路环形融合内固定术后患者腰和下肢痛及腰和下肢功能活动的改善效果.方法:选者1993-02/2002-09解放军第八十九医院骨科和第二军医大学长征医院骨科门诊治疗峡部裂性椎体滑脱患者44例,患者均签署知情同意书.均为单一椎体双侧峡部裂,其中行后外侧融合内固定26例,后路360°融合内固定18例.随访两年进行效果评定:①临床疗效评估为优:腰和下肢痛完全消失,可下蹲;良:腰和下肢痛大部分消失,能下蹲;可:疼痛部分消失,常用止痛药,下蹲轻度受限;差:疼痛同前或加重,常规用止痛药,没有支持不能下蹲.②植骨融合情况根据X射线片和CT片评定.结果:按意向处理分析,44例患者均进入结果分析.①后外侧融合内固定和后路360°融合内固定患者临床效果:优5例,良36例,可2例,差1例,优良率达93.2%(41/44).②植骨融合情况:除预后差的1例患者融合失败和另1例内固定取出时仍存在峡部异常活动外,其他42例均骨性融合,融合率为95.4%(42/44).③不良事件和副反应:7例患者遗有术后取骨部位的慢性疼痛,经对症处理后好转.结论:结果证实只要术中重视植骨融合技术,则峡部裂性椎体滑脱患者行后外侧融合内固定或360°融合内固定均能获得较好的滑脱纠正率和植骨融合率,较好缓解患者腰和下肢疼痛症状,并恢复下蹲等功能活动.

中华长城内固定系统及同种异体骨融合治疗青少年脊柱侧弯畸形

目的:针对于自体骨供区有限,采用中华长城系统内固定,自体骨与冷冻保存的同种异体干燥骨联合移植对青少年脊柱侧弯的改善.方法:选择2002-03/2004-05华中科技大学同济医学院附属荆州医院骨科收治的青少年特发性脊柱侧弯患者18例,Cobb's角48°～110°,旋转畸形2°～3°.按King分型,Ⅰ型5例,Ⅱ型6例,Ⅲ型6例,Ⅳ型1例.所有患者术前均行颈椎牵引2周,术前1 d预防性应用抗生素,内固定物采用中华长城内固定系统.术前2 h将异体皮质、松质骨片放入37℃庆大霉素生理盐水中浸润,将骨片周边的皮质骨去除后,将松质骨片剪成2～6mm的碎松质骨粒,用37℃温生理盐水反复冲洗,继续放入37℃庆大霉素温生理盐水中进一步浸润待使用.Ⅰ型患者经横突旁切口行侧前路胸、腹膜外松解,矫形椎体钉固定、自体骨、冷冻保存的同种异体干燥骨混合后椎体间植骨术.Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ型患者行后路椎弓根系统内固定,侧突变后突、分段撑开、剃刀背切除、自体骨、冷冻保存的同种异体干燥骨混合后椎板间植骨融合术.术后3周戴支具下地活动.结果:纳入患者18例,平均随访11.8个月,均进入结果分析.①手术一般情况:本组病例术中出血量为400～800 mL,手术时间为3～6 h,平均4.6 h,术中唤醒检测脊髓均未见异常,伤口均为Ⅰ类切口,甲级愈合.②手术前后cobb角矫正情况:与术前比较,术后1年侧凸主弯、代偿弯cobb角均明显减小[(68.3±12.6)°,(30.1±10.4)°;(31.2±9.5)°,(16.8±11.4)°;P均＜0.05].③顶椎旋转度矫正情况:与术前比较,术后1年明显减小[(2.4±0.5)°,(1.8±0.6)°,P＜0.05].④身高变化情况:与术前比较,术后1年明显增高[(146±19.2),(152±18.7)cm,P＜0.05].⑤植骨融合情况:所有病例在术后4个月,植骨颗粒已经模糊,开始形成新骨;术后8个月左右,已经有大量新骨形成,使得脊椎的正常结构已显示不清.无1例出现内固定物松动、断裂.均未出现3周后晚期感染以及因使用同种异体骨而感染肝炎或艾滋病者.结论:实验过程18例患者均未见明显排斥反应,切口愈合良好,植骨区均达骨性融合.提示中华长城内固定系统及同种异体骨融合对治疗青少年脊柱侧弯具有很好的稳定性.

智能方向性技术对噪声环境下言语识别率的影响

目的:比较智能方向性技术与全方向性技术对听力障碍患者噪声环境下言语识别率的影响,探讨智能方向性技术对噪声环境下言语识别率的改善作用.方法:选择2004-06/11在斯达克(中国)有限公司听力技术中心成功验配助听器的15例听力障碍患者.将配戴者助听器的记忆程序设定为:记忆1,智能方向性技术模式,记忆2,全方向性技术模式及记忆3,电话模式.使用记忆1,配戴者在噪声环境下感受智能方向性技术的效果;分别模拟现实生活安静、噪音环境下使用记忆1和记忆2,记录并分析患者应用不同的方向性技术在不同环境下的言语识别率、聆听满意度及偏好记忆.结果:按实际处理分析,15例患者均进入结果分析.①言语识别率:在噪声环境下应用智能方向性技术模式较应用全方向性技术模式时提高[(78±8)%,(60±7)%,P＜0.05].②聆听满意度:在噪声环境下应用智能方向性技术模式较应用全方向性技术模式时提高(86%,33%,P＜0.05).③偏好记忆:15例患者(15只助听器)在安静和噪声环境下分别偏好全方向性技术和智能方向性技术模式.结论:听力障碍者在噪声环境下偏好智能方向性技术模式,应用智能方向性技术模式时的言语识别率和满意度均较应用全方向性技术模式时提高.听力障碍患者应用智能方向性技术有利于提高噪声环境下的聆听效果.

自行设计微创植骨器修复骨缺损的疗效观察

目的:应用自行设计的微创植骨器进行微创植骨术修复骨缺损的生物力学和组织学观察.方法:实验于2004-04/10在上海第二医科大学附属仁济医院动物实验中心完成.将12只新西兰大白兔双侧桡骨截骨制成骨缺损模型,随机把每只兔双侧前肢分为两组:开放植骨术组沿原切口切开20mm长皮肤进入,开放桡骨髓腔,植入金世植骨灵骨块.微创植骨术组应用自行设计的微创植骨器进行植骨.分别在术后第4,8周,各随机取6只兔进行生物力学检查及组织学观察,比较两组家兔桡骨骨缺损修复情况.结果:12只兔均进入结果分析.①两组兔桡骨生物力学检查结果:第4周开放植骨术组和微创植骨术组分别有2根和5根桡骨可以进行生物力学检查,微创植骨术组桡骨的抗弯曲破坏应力值大于开放植骨术组[(69.58±34.99),(12.83±20.41)N,P＜0.05];第8周开放植骨术组和微创植骨术组均有6根桡骨可以进行生物力学检查,微创植骨术组桡骨的抗弯曲破坏应力值大于开放植骨术组[(220.97±33.79),(186.73±29.84)N,P＜0.05].②两组兔桡骨组织学观察结果:第4周微创植骨术组骨缺损区骨小梁密度(比值)大于开放植骨术组[(67.07±4.56),(51.29±5.95),P＜0.01];第8周,微创植骨术组骨缺损区骨小梁密度小于开放植骨术组[(40.82±6.37),(50.81±7.51),P＜0.05],骨小梁改建形成板层骨比开放植骨术组早.结论:通过生物力学检查及组织学观察,微创植骨术修复骨缺损的疗效优于开放植骨术.

冲击波体内胆结石爆破效应的冲击能量阈值

背景:冲击波对人体组织具有损伤作用,因此冲击波体内碎石仪有一定的能量阈值才具有使用安全性.目的:探讨应用冲击波对体内结石进行爆破的安全性和实用性.设计:观察对比实验.单位:解放军第四军医大学唐都医院实验外科.材料:实验于2001-07/2001-08月在解放军第四军医大学唐都医院实验外科完成.选择健康成年杂种犬6只,体质量9.5～24 kg,雌雄不拘.随机分为两组,术后处死组5只,术后饲养组1只.方法:将6只杂种犬全麻后将大小不等的人体结石固醇石、混合石或色素石放入胆囊内部;再选择3段不同的小肠段,用肠钳阻断一端,将结石放入小肠内,用胆道镜引入探头到胆囊及小肠腔内结石上方1 mm处,选用不同的冲击能量施放冲击波,直至结石粉碎(其大小＜2 mm×2 mm×2mm),并肉眼观察胆囊及小肠内膜损伤情况.术后处死组犬术后立即处死,分别取其胆囊和实验段小肠进行病理检查.缝合术后饲养组犬的胆囊和小肠,关腹进行饲养,1个月后处死,取其胆囊和实验段小肠,进行病理检查,观察其自行恢复情况.主要观察指标:①冲击波冲击能量与结石种类的关系.②各组犬术后胆囊和小肠组织的病理检查结果. 结果:6只犬全部进入结果分析,无脱失.①在同样的冲击能量下,击碎固醇石所需的冲击次数少,色素石多.②当冲击能量＜4.0 J时,犬胆囊和小肠黏膜细胞膜轻度充血,出现小出血点;当冲击能量＞4.0 J时,黏膜有脱落,出现黏膜下组织水肿.结论:冲击波体内碎石仪对于不同种类的胆结石具有能量依赖性,在冲击能量不大于4.0 J时,对组织所造成的损伤轻微,因此冲击能量4.0 J可以作为该仪器临床应用的能量阈值.

耳爆震伤患者听力追踪及相关因素21例分析

目的:分析爆震性耳聋的听力改变及相关因素.方法:对第三军医大学大坪医院野战外科研究所耳鼻咽喉-头颈外科1998-07/2003-07住院的爆震性聋患者21例(42耳)行纯音测听及声阻抗测定,作定期的听力追踪测试.并给予高压氧、药物和手术等方法治疗.对临床资料进行回顾性分析.按照疗效判定标准进行分析:鼓膜穿孔愈合,听力达实用水平(各频率听阈25 dBHL以内),无耳鸣、头痛头昏、眩晕等症状为治愈;鼓膜穿孔愈合,听力明显提高,但听阈＞25 dBHL,耳鸣、头痛头昏、眩晕等症状明显缓解为显效;鼓膜穿孔愈合,听力提高15 dBHL,耳鸣、头痛头昏、眩晕等症状减轻为有效;鼓膜穿孔未愈,听力提高不足15 dBHL或无变化,耳鸣、头痛头昏、眩晕等症状无变化或加重为无效.结果:按实际处理分析,进入结果分析患者21例.①感音神经性及混合性耳聋分别占34%(14/42)和33%(14/42);听力曲线以水平下降、斜坡下降和陡坡下降为主;鼓室功能曲线"A"型占多数达57%(24/42);蹬骨肌反射同侧刺激引出同侧占57%(24/42),对侧刺激引出同侧占43%(18/42).②在爆震后第9天测得差听阈,第20天听阈略有恢复.③21例(42耳)治疗后听力恢复正常17例(34耳),显效2例(4耳),无效2例(4耳),总有效率为90%(38/42);9例(14耳)鼓膜穿孔全部愈合.结论:爆震性聋听力恢复速度早期较快,逐渐变慢,早期听力损害严重者恢复不良.爆炸冲击波和脉冲波对内耳损伤严重,呈不可逆改变;对中耳结构影响相对较小.

足跟再造术后患足的系统性功能训练

背景:足跟再造术后系统性的功能训练措施是患者能否顺利康复的关键.目的:探讨足跟再造术后系统性功能康复措施对足功能恢复的作用.设计:自身前后对照.单位:解放军济南军区总医院骨科病房.对象:选择1987/01-2001/01济南军区总医院的骨科采用带腓骨的逆行岛状复合皮瓣修复足跟缺损12例.新鲜足跟缺损9例,陈旧性创面溃疡伴足跟缺损3例,其中全足跟缺损4例,大部分足跟缺损8例.干预:根据病情不同阶段制定训练计划.①第1阶段:术后2周,以被动活动为主,主要是活动髋、膝关节,并配合红外线超短波等理疗.②第2阶段:术后2周～6个月,逐渐下床活动,从不负重行走到负重行走.并辅助理疗.③第3阶段:术后6个月以后,可穿软底鞋行走.随访3年依据再造足跟的感觉和行走负重功能恢复情况进行综合评价(分为优,良,可,差).主要观察指标:足跟缺损患者再造足跟后感觉和负重功能恢复情况.结果:12例患者均进入结果分析.①患者再造足跟感觉和负重功能恢复情况:随访3年,所有患者术后1年可参加一般劳动,两三年均可参加重体力劳动,穿鞋袜不受影响,男患者可穿皮鞋,女患者可穿高跟鞋.②综合评价结果:优11例,良1例.结论:①系统的功能训练是再造足跟功能恢复的重要措施.②再造后足跟可恢复负重功能,完全满足患者的生活需要.

锁骨钩钢板内固定术后早期康复干预

目的:比较术后康复训练对重度肩锁关节脱位(PostⅢ-Ⅵ型)和锁骨远端骨折(NeerⅡ型)锁骨钩钢板内固定术后疗效的影响.方法:东莞市中医院骨科2001-01/2004-01治疗因肩锁关节脱位(PostⅢ-Ⅵ型)及锁骨远端骨折(NeerⅡ型)行锁骨钩钢板内固定术患者35例.肩锁关节脱位20例,其中PostⅢ型11例,PostⅣ型7例,Post Ⅴ型1例,PostⅥ型1例.锁骨远端骨折15例,均为NeerⅡ型.术后接受系统康复训练组24例,未接受系统康复训练组11例.训练组术后训练分3个阶段进行.①第1阶段康复(术后2周内):以肩关节被动活动为主,术后1周内除训练时间外均需三角巾悬吊患肢.术后第2天开始肩关节活动度的训练:包括钟摆练习;肩关节被动前屈上举练习;被动外旋练习;被动外展、内收和内旋练习.术后第2周开始肩关节肌力训练:包括肩关节前屈肌群训练;外展肌群训练;肩关节伸肌群训练;提肩胛骨肌群训练;内收肩胛骨肌群训练;内旋肌群训练;外旋肌群训练.②第2阶段康复(术后3～6周):以肩关节主动活动为主.包括活动度训练;肌力训练;耐力训练;日常活动训练.③第3阶段康复(术后6周以后):增加活动度训练强度,增大肩关节牵拉训练范围.但应避免接触性运动,佳运动有游泳、打乒乓球等.未训练组根据患者疼痛耐受程度自行锻炼.术后6周及1年采用Constant肩关节功能评分法(内容包括疼痛,日常活动和肩关节活动范围,总分为100分.优:90～100分;良:75～89分;中:60～74分;差:＜60分)检测肩关节活动范围及评分;观察不良事件及副反应.结果:35例患者均进入结果分析.①两组患者术后肩关节活动度:术后6周康复训练组患者肩关节的主动活动度分别为:前屈86°,后伸28°,外展87°,内收26°,外旋15°和内旋45°;未训练组度分别为:前屈69°,后伸25°,外展61°,内收24°,外旋14°和内旋43°.康复训练组患者前屈和外展活动范围显著大于未训练组(P＜0.05).术后1年两组间活动范围无差异.②两组患者肩关节功能评分结果:术后6周康复训练组评分显著高于未训练组(75,61分,P＜0.05).术后1年康复训练组优18例,良6例;未训练组优6例,良4例,中1例.术后6周,康复训练组肩关节前屈、外展活动范围较未训练组增强且Constant肩关节功能评分优于未训练组.③不良事件及副反应:训练过程中未见内固定物断裂、松动、骨折不愈合等现象,两组均未发生骨折不愈合和内固定物断裂等并发症.结论:应用锁骨钩钢板治疗重度肩锁关节脱位和NeerⅡ型锁骨远端骨折,术后早期在康复师指导下进行肩关节康复训练有利于增加肩关节活动范围,提高日常活动能力,明显地缩短了康复时间,并且不会引起骨折不愈合和内固定物断裂等并发症.

螺旋CT三维重建在复杂全髋置换术前的应用

目的:探讨用螺旋CT三维重建评价复杂的全髋置换术前的临床应用价值.方法:选择2001-02/2003-06解放军总医院骨科收治的髋关节疾患行全髋关节置换术患者85例.髋臼发育不良55例,外伤后畸形愈合18例,其他12例.其中66例既往有患髋手术史.所有患者均进行患髋X射线及螺旋CT薄层容积扫描,术前均采用Hispeed NX/I双层螺旋CT机(GE)行螺旋CT三维重建检查,相应数据指导制定手术方案.全髋关节置换术后髋关节功能评价采用Harris评分标准[包括疼痛(0～44分,分值高表示疼痛减轻)、功能、关节活动度及畸形4方面,得分90～100分为优,80～89分为良,70～79分为中,70分以下为差].结果:纳入患者85例,平均随访15个月,均进入结果分析.①患者髋关节三维CT重建图像:85例检查均取得清晰立体图像,且可消除某一骨性结构,单独观察髋臼、股骨头及其周围毗邻情况,还可消除扫描图像的置入物的金属放射状伪影.②患者髋关节手术前后关节功能:85例患者术前髋关节功能Harris评分平均为46.3分,术后平均为90.4分,术后优良率达95.3%(81/85).疼痛分数从术前平均17.5分,提高到术后平均42.5分.③患者髋关节手术并发症:随访病例中有1例术后出现足下垂,术后2个月完全恢复.3例在打入扩髓锉时出现股骨颈或股骨距部分裂隙骨折,骨折线均未到达小转子以下,属于Vancouver A型骨折,未给予特殊处理,术后3个月允许完全负重,均愈合,随访时无疼痛.2例患者术后有大腿疼痛,但是在四五个月后疼痛消失.结论:螺旋CT三维重建检查为复杂的全髋关节置换手术治疗提供合理的手术方式选择,减少了术中坐骨神经损伤等并发症的发生,提高了手术的安全性,使患者术后下肢功能恢复良好.

播种秋天

认识秋天,缘于我小学时的启蒙课文."大豆儿摇铃了,谷穗儿弯腰了,高粱儿脸儿了,向日葵也咧嘴儿笑了,康拜因又开始了日夜不停地轰鸣吼叫……"

髋关节X射线放射治疗对强直性脊柱炎髋关节病变改善效应的3年随访

目的:比较单纯药物治疗与药物联合髋关节X射线放射治疗对强直性脊柱炎髋关节病变的疗效,以评价放射疗法对强直性脊柱炎髋关节病变的有效性及安全性.方法:①选择1999-01/2001-12在上海第二医科大学附属宝钢医院和第二军医大学长海医院风湿免疫科住院治疗且有髋关节病变的强直性脊柱炎患者137例.从药物治疗联合髋关节放射疗法(放疗)治疗72例中随机选择52例为放疗组,从单纯药物治疗者65例中选择与放疗组年龄、性别、病程和病情相匹配的52例为对照组.均签署知情同意书.②两组均选择一种非甾体类抗炎药联合柳氮磺胺吡啶和甲氨蝶呤治疗,放疗组在药物治疗基础上对受累髋关节采用电子直线加速器X线放疗,每个受累髋关节进行1个疗程总照射剂量为10～20 Gy的放疗,平均(15.4±3.5)Gy,分6～15次照射.③病情评估采用巴氏脊柱炎活动指数(无为0分,严重为10分,晨僵2 h为10分)和巴氏脊柱炎功能指数(容易完成为0分,无法完成为10分).髋关节功能参照中华外科学会1993年北戴河标准进行评分,该标准为100分制,临床检查结果为4项(疼痛、生活能力、关节活动度、行走距离),每项分为6级,每级均有对应的分值.1级差,6级好.按4项合计总分记录.④采用陈海松等髋关节病变CT分期标准评估髋关节病变CT分期(Ⅰ期:有强直性脊柱炎髋关节病变的临床症状,CT出现髋臼囊变或/和股骨头的囊变,无关节间隙变窄;Ⅱ期:髋臼囊变合并出现关节间隙变窄;Ⅲ期:髋臼囊变,关节间隙消失,髋关节纤维性或骨性强直).⑤血沉和血浆C反应蛋白分别采用魏氏法和免疫比浊法测定.⑥两组患者出院后继续原药物治疗,并随访3年的临床资料,包括症状、体征、巴氏脊柱炎活动指数和功能指数、髋关节功能评分、髋关节病变CT分期、炎性指标等实验室检查及不良反应.⑦计数和计量结果比较分别采用卡方检验或t检验.结果:①放疗组:第1,2,3年随访47,40,32例,对照组分别为46,38,31例.②髋关节功能评分:两组患者出院时明显高于入院时(P＜0.05).随访第1,2年,放疗组明显高于对照组(P＜0.05);两组明显高于入院时(P＜0.05).随访第3年,放疗组与对照组相近;两组明显高于入院时(P＜0.05).③下腰痛、腰背晨僵时间:两组患者出院时、随访第1,2,3年下腰痛发生率明显低于入院时,晨僵时间明显短于入院时(P＜0.05).两组间各时间段下腰痛发生率和晨僵时间相近.④巴氏脊柱炎活动指数和功能指数:两组患者出院时、随访第1,2,3年明显低于入院时(P＜0.05),两组间各时间段相近.⑤炎性指标的比较:两组患者出院时、随访第1,2,3年明显低于入院时(P＜0.05);两组间各时间段相近.⑥髋关节病变CT分期改变:两组患者随访第1,2,3年髋关节病变CTⅠ期和Ⅱ期改变发生情况相近,且均与入院时差异不明显.放疗组患者随访第3年与入院时比较Ⅱ期改变增加了6.1%,而对照组增加了10%,两组比较差异明显(P＜0.05).⑦不良事件和副反应:髋关节局部X线放疗不良反应以胃肠道反应、血象降低、肝酶升高为主,与对照组差异不明显.结论:①放疗联合药物治疗改善强直性脊柱炎患者髋关节功能效果优于单纯药物治疗,且该功能改善主要集中在放疗后2年内,因此2年可作为一个有效放疗周期.②单纯药物和放疗联合药物治疗都不能阻止髋关节病变病情的进展,放疗联合药物治疗有延缓髋关节病变病情进展的趋势.③药物治疗可控制病情活动和显著改善血沉和血浆C反应蛋白,而髋关节放疗由于是局部作用,因而对全身病情活动和炎性指标无显著影响.④髋关节局部放疗和单纯药物的不良反应发生情况差异不明显.

运动疗法对原发性S型脊柱侧凸患者的治疗效果随访半年胸段及腰段Cobb角评估

目的:通过评估S型脊柱侧凸患者应用运动疗法半年后Cobb角的变化情况,探讨运动疗法对S型脊柱侧凸患者的干预作用.方法:选择2000-01/2004-06在南京医科大学第一附属医院康复医学科就诊的原发性S型脊柱侧凸患者80例,均自愿参加本观察.随机分为两组,对照组和运动疗法组各40例.对照组患者先应用脊柱侧弯矫正治疗仪行侧方体表电刺激治疗,刺激时间逐步延长,直至达到8 h/d.其次进行牵引治疗,T9以上侧弯显著者行枕颌牵引,T9以下侧弯显著者行骨盆牵引治疗,牵引持续时间30 min/次,2次/d.在以上治疗的同时两组患者均行针对性的姿势训练,要求患者保持姿势的挺拔和对称.运动疗法组患者在以上治疗的基础上再增加针对原发性S型脊柱侧凸的矫正体操,通常在卧位或匍匐位进行,1次/d.Cobb角为反映侧凸角度为常用的指标,测量方法为沿侧凸弧位置高或低的点,向凸侧或凹侧斜度显著的端椎上缘或下缘作切线,此两切线各自垂线的交角即为Cobb角.分别于治疗前及治疗半年后评定两组患者胸段及腰段Cobb角的变化情况.结果:80例患者全部进入结果分析,无脱落.两组患者治疗前后Cobb角的变化:治疗半年后两组患者脊柱胸、腰段Cobb角的角度均较治疗前显著减小[(18±9,16±8;10±7,9±5)°;(25±13,23±11,26±12,24±10)°(t=4.11～6.02,P＜0.01)],但运动疗法组患者脊柱胸、腰段的Cobb角显著小于对照组(t=3.01,3.24,P＜0.01).结论:运动疗法对原发性S型脊柱侧凸的治疗效果非常显著,其优点是简便、无痛苦且依从性较高,但该疗法的动作必须正确、充分、长期、持续地进行.

应用Moss Miami椎弓根钉系统治疗胸腰椎爆裂骨折改善脊柱活动度及神经功能的评估

背景:胸腰椎爆裂骨折的治疗,尤其是关于实施前、后路手术及减压范围,内固定装置的选择仍存在较大的争议.目的:探讨Moss Miami系统治疗胸腰椎爆裂骨折,改善患者脊髓功能、脊柱活动度及下肢疼痛的效果.设计:前后对照分析.对象:选择广州市第一人民医院骨科脊柱外科2001-01/2003-06收治的胸腰椎爆裂骨折行Moss Miami椎弓根钉系统固定患者27例.患者均签署知情同意书.男17例,女10例;年龄19～65岁,平均32.8岁.损伤部位:L114例,T12 6例,T12,L14例,L1,L2 2例,L1,L2,L3 1例;其中有脊髓损伤11例,Frankel分级为A级1例,B级2例,C级8例.术前CT显示椎管狭窄率(43±13.5)%.干预:19例进行MossMiami椎弓根钉内固定加椎板间植骨融合术,8例经后外侧减压、半椎板切除,Moss Miami椎弓根钉内固定加后外侧横突间植骨融合术.脊髓功能恢复按Frankel分级评定(分为5级,A级为严重障碍,E级为正常);术后疗效评价根据神经功能、脊柱活动、腰背痛及下肢疼痛恢复情况评估(分为改善、无变化、加重).主要观察指标:①患者应用Moss Miami椎弓根钉内固定术后疗效评价.②手术前后和随访时患者伤椎椎体前后高度及椎管狭窄率.③手术前后患者脊髓功能恢复情况.结果:随访时间6个月,27例患者均进入结果分析.①Moss Miami椎弓根钉内固定术后疗效评价结果:神经功能改善10例,无变化1例;脊柱活动改善26例,无变化1例;下肢疼痛改善10例,无变化17例;腰背痛改善23例,无变化3例,加重1例.②手术前后和随访时患者伤椎椎体前后高度及椎管狭窄率结果:随访时伤椎前后高度及椎管狭窄率均较手术前有显著改善[伤椎前高度:93.5%比44.2%;伤椎后高度:90.7%比79.3%;椎管狭窄率:(8.2±6.6)%比(43.0±13.5)%,P＜0.01].手术后和随访时比较无明显差异(P＞0.05).③术后脊髓功能Frankel分级评定结果:11例脊髓损伤患者中,10例分别提高1～3级,1例A级无变化.结论:Moss Miami系统治疗胸腰椎爆裂骨折,能明显改善患者脊髓功能,恢复椎体高度,操作简单,复位固定效果满意.

髋关节软组织松解术缓解强直性脊柱炎疼痛症状的疗效评估

目的:运用髋关节软组织松解术缓解强直性脊柱炎患者的疼痛并观察其疗效.方法:选择2003-04/2004-04华中科技大学同济医学院附属协和医院风湿免疫科门诊或住院收治的强直性脊柱炎患者232例,随机将患者分为观察组118例和对照组114例.观察组采用髋关节软组织松解术,在股骨头高点上1.0～2.0 cm处,皮下注射100mg/L葡萄糖溶液40～60mL加正清风痛宁50mg.注射1次/周,连续6次.对照组采用常规药物治疗,口服正清风痛宁缓释片25～50 mg,3次/d,柳氮磺吡啶0.5 g,2次/d,服用3个月.治疗前及治疗后3个月时进行下列指标评估.①疼痛采用目测类比评分(VAS法,0分表示无痛,10分极痛).②Schober试验:取患者直立时髂后上棘连线中点向上延伸10 cm,向下延伸5 cm各作标记,令患者尽力前屈,记录上下标记之间延伸距离.≥20 cm为正常,＜20cm为异常.③扩胸度:患者端坐,记录其第4肋间水平胸廓周径在深吸气及深呼气时之差.④枕壁试验:令患者直立,背靠于墙,头尽力靠墙,记录枕骨隆突距墙壁的垂直距离,正常为0.⑤15 m步行时间:患者尽快走完15 m距离所需时间.结果:按意向处理分析,232例患者均进入结果分析.治疗3个月后,观察组患者疼痛和晨僵时间较治疗前明显改善[(3.0±1.5)比(9.0±1.6)分,(27.1±8.2)比(86.3±24.4)s,P＜0.05],在疼痛、Schober试验、枕壁试验、15 m步行时间及晨僵时间指标均显著好于对照组(3.0±1.5)比(6.2±1.9)分,(5.1±1.8)比(3.8±0.8)cm,(1.5±0.9)比(2.7±1.8)cm,(31.5±17.8)比(50.2±16.5)s,(27.1±8.2)比(45.2±9.8)s,t=1.594～1.958,P＜0.01].结论:对强直性脊柱炎患者实行髋关节软组织松解术,针对性强,显效快,可明显缓解患者的疼痛,增强关节活动度,患者易接受.

Cervifix内固定系统对陈旧性寰枢椎脱位的修复稳定应用

目的:评价应用Cervifix内固定系统治疗,改善脊髓功能的作用.方法:选择1999-10/2003-04解放军广州军区广州总医院骨科采用Cervifix内固定系统治疗陈旧性寰枢椎前脱位伴高位颈髓压迫症患者25例.陈旧性齿突骨折脱位12例,先天性畸形10例,类风湿性关节炎3例,均为寰枢椎前脱位.根据患者的病情分别采取不同方法,经口咽前路和后路一期减压及后路内固定6例,后路减压内固定12例,后路减压内固定后二期行前路减压7例.减压后全部病例均行Cervifix枕颈内固定,取髂骨植骨,术后佩带颈围3个月.采用日本骨科协会评分法(JOA17分,0分为严重障碍,分值越高表示功能越好)评价脊髓功能改善率.改善率=[(术后评分-术前评分)/17]×100%.采用自拟的公式评价脊髓受压改善率,改善率=[(术后矢径-术前矢径)/(拟正常矢径-术前矢径)]×100%.结果:按意向处理分析,25例均进入结果分析.①随访结果:平均随访22个月.患者枕颈不适消失,四肢麻木基本消失,感觉和肌力均有不同程度的恢复;术后日本骨科协会评分平均为14.2分,平均较术前提高6.4分,术后脊髓功能改善率为68.4%;术后脊髓减压改善率为70.2%;术后三四个月均骨性融合,无骨不连发生.②不良事件及副反应:25例无一例发生内固定折断及松脱现象.但随访时间超过2年的病例中,有6例患者发现其颈椎固定节段与未固定节段的界面出现明显的成角和轴线异常的影像学变化.术后被固定融合的枕颈及颈椎节段的活动功能均丧失,仅靠下颈椎的代偿,颈椎活动度明显受限,仅为正常活动度的1/3左右.1例发生椎动脉损伤,为先天性畸形患者,术中给予及时处理.结论:Cervifix颈椎后路内固定系统装配合理,提供螺丝钉佳装配位置;留有植骨空间利于植骨融合;其纯钛/TAN合金材质不影响术后MRI检查,能量化术后的脊髓减压改善情况,优于枕颈CD环等内固定.但其固定节段多,影响颈椎活动度;并可加速下位颈椎的退行性变.

一期前后联合手术治疗改善严重颈椎后纵韧带骨化症患者的神经功能:3个月效果评估

背景:后纵韧带骨化症所致脊髓压迫采用何种手术入路或方法进行减压为宜?20世纪90年代末期国外有人采用一期前后联合手术治疗此病取得了较好的效果.目的:评价一期前后联合手术治疗严重颈椎后纵韧带骨化症的疗效和可行性.设计:自身前后对照观察.单位:宁波市第六医院骨科.对象:选择1999-09/2002-12宁波市第六医院骨科收治的严重颈椎后纵韧带骨化症12例.其中连续型6例,节段型2例,混合型4例.合并发育性椎管狭窄10例,后纵韧带骨化症累及节段为2～5节,平均3.5节.方法:采用一期前后联合手术内固定治疗颈椎后纵韧带骨化症12例,前路采用Orion带锁钢板6例,Zephir带锁钢板6例,前路减压后采用自体骨移植5例,采用钛网加自体骨移值7例,后路均采用Axis钛板螺钉,其中采用侧块螺钉4例,颈椎椎弓根螺钉8例.术后不用颈围固定,两三天后即可活动.术后1周及3个月按照日本骨科协会评分标准(JOA17分法,包括上肢功能、下肢功能、感觉和膀胱功能,共17分,0分为严重障碍,分值越高表示功能越好)评价神经功能.术后改善率=[(术后评分-术前评分)/17]×100%.主要观察指标:①患者术后神经功能评价结果.②患者手术前后影像学检查结果.③不良事件及副反应.结果:按意向处理分析,12例患者均进入结果分析.①患者术后神经功能评价结果:12例患者中,10例患者术后第2天诉双上肢痛感明显好转,手握力增加,术后1周四肢肌力和肌张力均有不同程度改善,膝踝阵挛明显减轻,日本骨科协会评分平均提高3～6分.脊髓功能平均改善率为55.6%,术后3个月,脊髓功能平均改善率为75.6%.②患者手术前后影像学检查结果:部分患者术后做了MRI检查,显示颈椎管截面积显著扩大,脊髓或硬膜前、后方均得到充分减压.③不良事件及副反应:1例术后出现双上肢肌力减弱,3周后肌力增强并超过手术前水平;1例术后出现右上肢C5-6神经不全瘫,随访2年恢复;2例术后伤口感染,经2次清创换药愈合.经椎弓根螺钉固定者术后经斜位及CT检查发现有1例C7椎弓根螺钉位置稍差,但无神经血管并发症.12例患者无钢板松动、植骨块脱出并发症.结论:一期前后联合手术减压融合内固定治疗颈椎后纵韧带骨化症,可提供坚强的固定和充分的减压,可有效的防止前路内固定的失败,术后不需外固定,稳定性好,可明显提高和改善患者运动功能.

干细胞的临床研究

重组人骨形态发生蛋白-2与卵磷脂复合材料修复兔长骨节段性骨缺损

目的:观察重组人骨形态发生蛋白-2与卵磷脂复合材料修复兔长骨节段性骨缺损的能力,检验重组人骨形态发生蛋白-2的诱导成骨活性及卵磷脂作为重组人骨形态发生蛋白-2载体材料的可行性.方法:实验于2003-12/2004-02在解放军第四军医大学西京医院骨科研究所完成.实验动物由第四军医大学动物研究中心提供,材料由华东基因技术研究所提供.设实验组和对照组两组,24只大耳白兔随机分为两组,每组12只.手术造成桡骨中上段15 mm骨缺损,实验组植入重组人骨形态发生蛋白-2与卵磷脂复合材料片,其中重组人骨形态发生蛋白-2的含量为1.0 mg,对照组植入单纯卵磷脂片.术后通过影像学、组织学观察及骨密度测定,评价重组人骨形态发生蛋白-2与卵磷脂复合材料对兔长骨节段性骨缺损的修复效果.结果:各组12只兔均纳入后分析.①骨缺损修复的影像学表现:实验组术后4周时缺损区有大量新生骨痂形成,术后8周时新生骨痂将缺损区桥接,术后12周时达到皮质骨连接;对照组无骨痂形成.②骨缺损修复的组织学表现:实验组术后4周时的骨痂为编织骨,术后8周时骨痂外层为板层骨,中央为编织骨,内有骨髓组织,术后12周时骨痂外层为皮质骨,中央为髓腔组织;对照组缺损区为结缔组织和肌组织充填.③骨密度值比较:实验组术后12周时骨痂密度达到正常值的76%.结论:重组人骨形态发生蛋白-2与卵磷脂复合材料对兔桡骨节段骨缺损具有很好的修复效果,重组人骨形态发生蛋白-2具有良好的成骨活性,卵磷脂可以作为重组人骨形态发生蛋白-2的一种新的载体材料.

联合应用骨保护素和阿伦膦酸钠对破骨前体细胞分化的影响

目的:探讨联合应用重组人骨保护素活性片断和阿伦膦酸钠对破骨细胞前体细胞(RAW264.7)分化的抑制效果,并探讨二者是否具有抑制破骨细胞前体细胞(RAW264.7)分化的协同作用.方法:实验于2004-06/12在解放军总医院骨科研究所完成.酶消化法获取新生小鼠颅骨成骨细胞,与破骨细胞前体细胞(RAW264.7)按照4:1比例混合,培养于96孔板中和6孔板骨磨片体系中.分别使用1×10-5g/L重组人骨保护素活性片断、10 mol/L阿伦膦酸钠、1×10-5g/L重组人骨保护素活性片断+10 mol/L阿伦膦酸钠作用于96孔板和6孔板混合细胞体系,并设空白对照.9 d后,观察破骨细胞数目和形态,计算单位面积内重酒石酸盐抗酸性磷酸酶染色阳性细胞个数,并行骨磨片吸收陷窝计数.统计学分析评价其抑制破骨细胞分化效果.结果:①破骨细胞常规形态及重酒石酸盐抗酸性磷酸酶染色阳性细胞计数:小鼠成骨细胞与RAW264.7混合培养并加入药物后9 d,空白列照组出现大量多核成熟破骨细胞,重酒石酸盐抗酸性磷酸酶染色证实为成熟破骨细胞.②骨磨片吸收陷窝形态及计数:与空白对照组相比,其余各组破骨细胞重酒石酸盐抗酸性磷酸酶染色阳性细胞个数,骨磨片吸收陷窝计数均明显减少,以1×10-5g/L重组人骨保护素活性片断+10mol/L阿伦膦酸钠组减少为显著.③重组人骨保护素活性片断组与阿伦膦酸钠组析因设计的方差分析:加药后9 d重组人骨保护素活性片断与阿伦膦酸钠存在交互作用(F=19.878,623.57;P＜0.05).结论:联合应用重组人骨保护素活性片断和阿伦膦酸钠可以发挥交互协同作用,更有效地抑制RAW264.7向成熟破骨细胞的分化.

强骨抗萎方对模拟失重条件下体外培养成骨细胞的影响

背景:航天环境中,失重对骨质代谢的影响被认为是对人体严重的危害之一.目的:探讨复方强骨抗萎方对模拟失重条件下体外培养的成骨细胞的影响,拟揭示该方对抗骨丢失的分子生物学作用.设计:随机对照观察.单位:航天医学工程研究所.材料:实验于1997-04/12在北京航天医学工程研究所完成.选择SD乳鼠.药物:强骨抗萎方(熟地、骨碎补、龟板、怀牛膝等).方法:乳鼠15只,随机分为5组,每组3只.分离乳鼠颅骨成骨细胞,体外培养后,分为正常对照、失重模型、强骨抗萎方大(2.0%)、中(1.0%)、小(0.5%)剂量5组.置回旋器,30 r/min,连续回旋60 h模拟失重,观察该方对回旋12,30,60 h时大鼠成骨细胞碱性磷酸酶和骨钙素生成及碱性磷酸酶基因转录水平(mRNA)的影响.主要观察指标:强骨抗萎方对体外模拟失重条件下成骨细胞培养液中碱性磷酸酶活性、骨钙素含量及碱性磷酸酶mRNA表达的影响.结果:纳入的15只乳鼠均进入结果分析,实验中无脱失.①与正常对照组比较,模型组成骨细胞在回旋12,36,60 h不同时间点的细胞培养液中的碱性磷酸酶活性均明显降低,其中12,60 h时差异显著[(45.01±12.50),(96.18±12.34);(13.17±5.33),(137.36±137.86)nkat/L,P＜0.05],碱性磷酸酶mRNA表达低微;骨钙素活性均减低,60h时差异显著[(30.3±2.75),(42.0±10.0)μg/L,＜0.05].②与模型组比较,中药复方不同剂量组于回旋不同时间点细胞培养液中的碱性磷酸酶活性均有不同程度升高[其中60 h的小、中、大剂量组分别为(143.70±123.86),(54.51±13.17);(156.53±133.69)nkat/L,P＜0.05];碱性磷酸酶mRNA表达活性也较高;但骨钙素活性无明显变化.结论:该方能改善模拟失重条件下成骨细胞的功能,缓解其分化抑制状态,促进骨基质的形成和成熟.

自体微小颗粒骨复合牛骨形态发生蛋白修复骨缺损

目的:观察自体微小颗粒骨复合牛骨形态发生蛋白的成骨效果.方法:实验于2002-10/2003-05在哈尔滨医科大学附属第二医院动物实验中心完成.将30只新西兰白兔两侧桡骨干中段造成1.5 cm长骨缺损模型,随机分为实验组21只,空白对照组9只.其中实验组左侧植入颗粒骨+骨形态发生蛋白,右侧植入颗粒骨;空白对照组双侧植入明胶海绵.分别于术后2,4,12周实验组各取7只、空白对照组各取3只对兔桡骨植入物进行大体形态、放射学检查及组织学检查,12周进行生物力学试验.结果:纳入兔30只,均进入结果分析.①兔桡骨植入物大体、X射线与组织学检查结果:术后12周实验组两种方法均可以修复节段性骨缺损,但左侧无论从成骨时间及成骨效果上都要优于右侧,空白对照组无骨愈合现象.②兔桡骨植入物生物力学测试结果:证明实验组左侧在大应力方面要优于右侧[(101.03±12.49),(73.71±9.75)N,P＜0.05];在弹性模量上二者无显著性差异.结论:自体微小颗粒骨可较好的修复骨缺损,但复合骨形态发生蛋白后在成骨时间和成骨质量上更优.

骨形态发生蛋白复合带血供肌瓣修复骨缺损成骨过程中骨骼肌的转归

背景:局部软组织条件不好的难治性骨缺损修复是临床的重大难题和亟待解决的问题.目的:探讨带血供肌瓣作为骨形态发生蛋白载体修复骨缺损成骨过程中骨骼肌的变化.设计:观察对比实验.单位:南方医科大学南方医院实验动物中心.对象:重组人骨形态发生蛋白2;清洁级健康新西兰大白兔20只,1.5～2.5 kg,雌雄不拘.方法:实验于2000-01/2002-08在南方医科大学南方医院实验动物中心完成.取10只兔,制作兔桡骨下段15 mm骨缺损,将指深屈肌肌瓣去神经后,转位至缺损区,将纤维蛋白与重组人骨形态发生蛋白2复合物植入肌瓣中.分别于1,2,4,6,8周麻醉状态下各处死4只兔,进行骨缺损区肌瓣大体观察、组织学、原位末端标记及超微结构观察.主要观察指标:兔桡骨缺损区肌瓣大体观察、组织学检查、原位末端标记法染色结果及超微结构.结果:20只兔均进入结果分析.①兔桡骨缺损区肌瓣大体观察结果:骨骼肌逐渐发生萎缩,8周时肌纤维几乎完全消失,新生骨组织呈条索状桥接两断端.②兔桡骨缺损区肌瓣组织学检查结果:组织学显示骨骼肌萎缩的同时,部分细胞核出现崩解,并有凋亡小体出现.③兔桡骨缺损区肌瓣细胞凋亡情况:原位末端标记法染色萎缩的骨骼肌纤维内大量显色阳性的细胞核或核碎片.④兔桡骨缺损区肌瓣超微结构:骨骼肌肌丝随时间延长逐渐消失,细胞核出现染色质边集、固缩、碎裂,呈典型的凋亡改变.结论:带血供肌瓣复合骨形态发生蛋白修复骨缺损成骨过程中,肌纤维逐渐发生萎缩、凋亡,终被骨组织所替代.

透明质酸钠预防骨关节炎时Ⅱ型胶原抗体水平的动态变化

背景:研究表明透明质酸钠可作用于机体免疫系统,调节免疫细胞分泌细胞因子变化,从而抑制炎症,对治疗早期骨关节炎具有一定疗效.目的:观察关节腔内注射透明质酸钠预防膝骨关节炎过程中对Ⅱ型胶原抗体水平的影响及其动态变化.设计:随机对照观察.单位:广州市红十字会医院创伤外科研究所.材料:实验于2002-03/08在广州市创伤外科研究所动物及免疫室完成.选用成年新西兰大白兔12只.方法:取12只成年新西兰兔制备Hulth膝骨关节炎动物模型,随机等分为两组,透明质酸钠组和生理盐水对照组.透明质酸钠组术后当时及每2周关节内注射10g/L透明质酸钠1 mL至12周;对照组注射生理盐水1 mL为对照.各组术前及术后每隔2周收集血清,建立间接夹心酶联免疫吸附法,检测Ⅱ型胶原抗体水平.主要观察指标:对比分析不同时期实验组与生理盐水对照组预防兔膝骨关节炎血清Ⅱ型胶原抗体水平的动态变化及两组组内各时期Ⅱ型胶原水平与术前的比较.结果:所有实验数据均来自12只新西兰大白兔实验结果统计数据.透明质酸钠组术后第6,10,12周Ⅱ型胶原抗体水平与术前比较均显著提高(P＜0.05);生理盐水对照组Ⅱ型胶原抗体水平第10周显著高于术前(P＜0.05);透明质酸钠组与生理盐水对照组同期比较Ⅱ型胶原抗体水平均无显著差异.结论:骨关节炎使机体产生自身免疫,引起自身Ⅱ型胶原抗体水平增加.透明质酸钠能促进体液免疫应答,导致抗体水平进一步升高.提示注射透明质酸钠治疗膝骨关节炎时,应考虑其免疫调节作用.但值得一提的是,透明质酸钠为糖胺多糖本身不具备产生特异性Ⅱ型胶原抗体的免疫原性,它究竟通过何种途径调节体液免疫应答有待于进一步深入观察.

碱性成纤维细胞生长因子影响成骨细胞黏附与增殖的实验

目的:观察碱性成纤维细胞生长因子对成骨细胞黏附性与成骨细胞DNA合成的影响.方法:实验于2004-08/12在广州军区广州总医院中心实验室完成.取2只健康新西兰大白兔骨髓基质细胞来源的成骨细胞体外培养.①光镜下观察成骨细胞形态.②进行不同浓度碱性成纤维细胞生长因子(0.1,1,10,100mg/L)诱导成骨细胞,设空白对照,于1,2,4,8 h共4个时间点采用体视学计量黏附细胞数量.③流式细胞仪进行细胞DNA含量分析.结果:①成骨细胞特性观察:光镜下成骨细胞呈多角形或梭形表达出高碱性磷酸酶活性.②碱性成纤维细胞生长因子对成骨细胞黏附性的影响:碱性成纤维细胞生长因子浓度为1.0～10 mg/L时细胞黏附数呈剂量依赖性,达到100mg/L时,细胞黏附数反而下降,时间到8 h后,与对照组间无明显差异.③碱性成纤维细胞生长因子对成骨细胞DNA合成的影响:增殖指数显示碱性成纤维细胞生长因子浓度为1.0～10 mg/L时呈剂量依赖性,到100mg/L时,指数略有下降,但仍显著高于对照组.结论:①碱性成纤维细胞生长因子浓度在1.0～10 mg/L时可提高成骨细胞的黏附性.②碱性成纤维细胞生长因子浓度在1.0～10 mg/L时可促进成骨细胞DNA合成,到100mg/L作用减弱.③碱性成纤维细胞生长因子可调节成骨细胞的黏附与增殖.

低强度超声波结合组织工程修复长骨节段性骨缺损

目的:观察低强度超声波结合组织工程技术对长骨节段性缺损的修复效果.方法:实验于2003-05/2004-10在青岛大学医学院附属医院创伤外科完成.取健康成年大白兔48只,建立兔桡骨1.5 cm节段性骨-骨膜缺损模型,于骨缺损处植入磷酸钙人工骨和骨髓基质干细胞复合物后随机分为两组,每组24只,实验组局部接受低强度超声波刺激1次/d,15 min/次,对照组未给予超声波刺激.于术后4,8,12周麻醉状态下处死动物获取标本.通过生物力学测定、组织学染色分析、X射线摄片及骨密度测量等手段观察新骨形成和材料降解情况.结果:48只兔均进入结果分析.①兔血清碱性磷酸酶含量:术后随着时间的延长,两组动物血清中碱性磷酸酶浓度逐渐升高,实验组6周时达到高水平(2 284 nkat/L),对照组8周达到高水平(1 834 nkat/L),实验组总体水平高于对照组.②兔桡骨缺损区骨密度测量结果:12周时实验组新骨密度明显高于对照组(0.217,0.153 g/cm2,P＜0.01).③兔桡骨生物力学测定结果:12周时实验组的桡骨大扭转强度明显大于对照组(0.675,0.298 Nm,P＜0.01).④兔桡骨缺损区X射线检查:实验组8周时材料体积变小,12周时新骨大量形成并钙化,可见到连续性骨膜骨痂,骨缺损范围变小;对照组12周时骨端新骨形成,长入材料,但材料体积无明显减少.⑤兔桡骨缺损区组织形态学观察结果:实验组12周时新骨多为板层骨,长入材料并与之相互分割包裹;对照组12周时新骨继续增生,边缘处材料被降解成较小的颗粒.结论:低强度超声波不仅有效地促进了新骨的形成,同时也加速了新骨的钙化,明显地促进组织工程对骨缺损的修复作用.

聚乙烯醇/羟基磷灰石复合水凝胶移植修复兔膝关节软骨缺损

背景:目前临床治疗由创伤、骨关节炎等引起的关节软骨病损的方法不能使受损的软骨在形态学、生化和生物力学方面恢复至正常,修复组织不能达到良好的远期疗效,常在短期内发生退行性变.目的:探讨聚乙烯醇/羟基磷灰石复合水凝胶移植修复兔膝关节软骨缺损的疗效及了解其组织相容性.设计:随机对照动物实验.单位:中山大学附属第三医院动物实验中心.材料:实验于2003-10/2004-04在中山大学附属第三医院动物实验中心完成.成年健康新西兰白兔20只,雄性12只,雌性8只,体质量2.1～3.0 kg,由中山大学动物实验中心提供.饲养环境温度20℃,相对湿度40%.将兔子随机分成空白对照组(n=6)和实验组(n=14).方法:采用溶胶凝胶法原位复合制备聚乙烯醇/羟基磷灰石水凝胶,通过体外力学性能测试,采用日本岛津公司生产的AG-1型万能电子拉力试验机对材料的拉伸性能进行测试,拉伸速度为500 mm/min.空白对照组不作任何处理,实验组于软骨缺损处植入圆柱形聚乙烯醇/羟基磷灰石复合水凝胶,嵌压固定.术后动物单笼关养,所有术肢不予固定,任其自由活动,常规用青、链霉素抗感染治疗.术后第4,8,12周空气栓塞法每批处死6～7只兔子,取患膝关节作大体、光镜观察.主要观察指标:主要结局:两组家兔膝关节软骨缺损的大体和组织学改变.次要结局:聚乙烯醇/羟基磷灰石复合水凝胶的体外拉伸强度与浸泡时间的关系.结果:①两组家兔膝关节软骨缺损的大体和组织学改变:术后4周,实验组的缺损由聚乙烯醇/羟基磷灰石充填,材料与软骨下骨连接无间隙,术后12周,植入材料与软骨交界面有大量的软骨细胞增殖,未见软骨退变,植入材料与软骨下骨连接紧密,有骨样组织长入;空白对照组缺损主要由纤维肉芽组织修复.②聚乙烯醇/羟基磷灰石复合水凝胶的体外拉伸强度与浸泡时间的关系:聚乙烯醇/羟基磷灰石复合水凝胶的力学性能在浸泡初期出现上升,随后有所下降,此后比较平稳,但均比初始强度高.结论:聚乙烯醇/羟基磷灰石复合水凝胶与软骨下骨结合良好,没有炎性细胞浸润,无免疫排斥反应发生,说明组织相容性良好,植入后周围软骨细胞无退行性改变,说明具有一定的力学作用,可以作为良好的人工关节软骨替代材料.本实验采用溶胶凝胶法原位复合制备聚乙烯醇/羟基磷灰石水凝胶,避免了涂层材料的降解与剥脱,并能较长时间保持良好的力学特性.

人骨膜细胞体外培养的实验

目的:观察体外培养的人骨膜细胞的形态学特征.方法:实验于2001-01/2003-10广东省粤北人民医院骨科和医学动物实验室完成.采用常规细胞培养法进行人骨膜细胞体外培养,并采用倒置显微镜和电子显微镜观察骨膜细胞生长情况、形态特征及超微结构.结果:①人骨膜培养活细胞光镜下形态:早期新生细胞呈梭形,饱满透明,立体感强;分裂期呈立方形或短柱状;后期由长梭形逐渐变成宽梭和不规则形,分泌功能旺盛.②人骨膜细胞电镜下超微结构:胞体呈梭形,膜面有少量微绒毛状突起,粗面内质网丰富,有大量异噬体等次级溶酶体,线粒体体积较小、基质致密有少量嵴.具有原代细胞生物形态学特征. 结论:人骨膜成骨细胞可经体外培养大量增殖,且细胞传代进化后,其形态学结构与原代细胞无明显差异,可用于细胞移植.

脉冲电磁场在成骨细胞-破骨细胞共育培养体系中的生物学作用

目的:探讨脉冲电磁场在成骨细胞-破骨细胞共育培养体系中对成骨细胞的影响.方法:实验于2004-03/09在江西博士生物制品公司细胞生物实验室完成.体外分离、培养1 d龄SD乳鼠颅骨成骨细胞和四肢骨破骨细胞,利用共育培养板将二者培育在同一环境中;分处理组、空白对照组、阳性对照组3组.处理组共育培养体系施加50Hz,8 Gs的脉冲电磁场,1 h/d;空白对照组置于同样线圈下而不通以电流;阳性对照组加入成骨细胞促增殖剂氟化钠(1×10-5mol/L);处理7 d后观察各组成骨细胞增殖、凋亡、碱性磷酸酶活性变化,处理15 d后进行矿化结节测定.结果:①各组成骨细胞增殖情况:合成后期+合成期细胞比率处理组和阳性对照组明显高于空白对照组[(12.34±1.85)%,(14.10±1.40)%,(9.57±1.05)%,x2=4.25,P＜0.01];而处理组和阳性对照组之间差别不显著(P＞0.05).②细胞凋亡情况:处理组和阳性对照组明显低于空白对照组(0.027 6±0.005 9)%,(0.285 3±0.013 3)%,(0.038 6±0.003 1)%,x2=3.86,P＜0.01);而处理组和阳性组之间亦无显著差别(P＞0.05).③碱性磷酸酶活性:经脉冲电磁场作用以后,处理组培养上清碱性磷酸酶活性与空白对照组相比,有一定的升高[(3 174±533),(3 019±583)nkat/L,t=5.63,P＜0.01],而与阳性组之间的差异无显著性意义(P＞0.05).④钙化结节结果:各组每40倍视野下矿化结节平均数量和单个结节平均面积亦均有显著的差异(x2=3.45,t=6.33,P＜0.01),其大小排序为:处理组＞阳性组＞空白对照组.结论:一定频率和强度的脉冲电磁场对体外共育培养的成骨细胞具有明显的促增殖、促分化及促矿化功能.①经脉冲电磁场作用以后,成骨细胞周期发生了改变,DNA合成和细胞分裂增加,促进了复合培养体系中成骨细胞的自然增殖,减少了成骨细胞的自然凋亡,其促增殖及降低细胞自然凋亡的效应同成骨细胞增殖促进剂氟化钠相当.②脉冲电磁场在促进成骨细胞由幼稚细胞向成熟分泌型细胞分化方面,有明显的促进作用.③经脉冲电磁场作用15 d后,共育体系成骨细胞室矿化率增加,成骨细胞矿化功能得以提高,同其经脉冲电磁场作用以后分化加速相适应.

不同内固定材料对兔胫骨骨折局部转化生长因子β1信使RNA表达的影响

背景:转化生长因子β是一族多功能的蛋白多肽,在骨折愈合过程中起作用的主要为转化生长因子β1.不同的内固定材料对骨折愈合的影响不同,其影响程度如何是判定内固定材料优劣的一个重要评定指标.目的:通过不同内固定材料固定后骨折愈合不同阶段转化生长因子β1mRNA的表达,了解转化生长因子β1mRNA的细胞内定位,借此探讨不同内固定材料对骨折愈合过程中骨折局部转化生长因子β1mRNA的表达的影响.设计:随机对照观察. 单位:解放军第二军医大学长海医院骨科、病理科.材料:实验于2000-03/2001-07在第二军医大学实验动物中心和骨科实验室完成.选用新西兰兔42只,所有动物均随机抽取,雌雄不限,按内固定物分成两组:矩形髓内钉组;不锈钢接骨板组,每组动物21只.方法:以矩形髓内钉与不锈钢接骨板固定兔胫骨制作骨折内固定模型,骨折内固定部位为兔左胫腓骨交界下2mm处.手术前后用市售动物颗粒饲料分笼喂养,饮用自来水,自由活动,不用外固定.每组动物于内固定手术后1,3,7,14,21,28 d分别处死3只,取骨折端骨痂及周围组织标本,进行组织切片和原位杂交处理.主要观察指标:观测并记录组织切片中不同细胞内的转化生长因子β1mRNA染色阳性强度和阳性面积比,显示兔骨折愈合过程中骨痂中转化生长因子β1mRNA的分布和含量.结果:共用实验动物42只,腹泻死亡3只,伤口局部感染骨外露3只,共6只未纳入结果分析,矩形髓内钉组和不锈钢接骨板组各3只,进入结果分析动物数36只.①在骨折早期,矩形髓内钉组和不锈钢接骨板组局部的细胞和间质中转化生长因子β1mRNA均无表达;7 d后间充质细胞、成骨细胞、成软骨细胞中有转化生长因子β1mRNA阳性表达.②矩形髓内钉组和不锈钢接骨板组转化生长因子β1mRNA阳性染色强度、阳性面积比及阳性指数术后14 d高(12.36±0.58,0.19±0.05,2.35±0.20;10.24±0.65,0.13±0.03,1.33±0.10),28 d低(4.24±0.57,0.06±0.02,0.25±0.08;3.31±0.27,0.03±0.01,0.10±0.02),同期比较除术后7 d阳性面积比外,其余矩形髓内钉组均高于不锈钢接骨板组,组间差异显著(P＜0.05,P＜0.01).结论:矩形髓内钉较不锈钢接骨板更能促进细胞分泌转化生长因子β1,有利于骨折愈合.

动静态浸泡体系对聚乙交酯丙交酯体外降解产物的影响

目的:了解动静态浸泡体系对聚乙交酯丙交酯体外降解产物乳酸和乙醇酸生成的影响.方法:实验于2002-09/12在上海第二医科大学附属第九人民医院口腔材料科,上海市生物材料研究测试中心实验室进行.取2 cm×2 cm大小的聚乙交酯丙交酯材料片,浸泡介质为磷酸盐缓冲液(pH=7.4),分别在37℃恒温静态和动态(往返振荡速率为160次/min)条件下浸泡.于0周(浸泡前)以及浸泡后2,3,4,6,8和10周通过气相色谱法测定材料的水溶性降解产物乳酸及乙醇酸的质量,每时间点5片.在整个浸泡过程中,浸泡体系的浸泡介质不进行更换.推算标准品乙醇酸的衍生化标准曲线为:yc=a1x+b1;标准品乳酸的衍生化标准曲线为:yL=a2x+b2.由气相色谱图可计算出乙醇酸与苯甲酸的峰面积比值x1,再带入上述公式计算出乙醇酸和乳酸生成量.结果:动静态浸泡体系中聚乙交酯丙交酯降解产物乳酸和乙醇酸的质量生成情况:经过第0周(浸泡前),2,3,4,6,8和10周浸泡后,浸泡液中降解产物乳酸和乙醇酸的质量是增加的.在动态系统中生成的降解产物乳酸和乙醇酸均显著高于静态体系中生成的质量[(4.21±1.49),(3.76±1.52)mg,t=3.798,P＜0.01;(23.30±6.73),(20.00±5.86)mg,t=3.865,＜0.01].结论:动态体系可以促进降解产物乳酸和乙醇酸的质量生成,使材料降解速度加快.

壳聚糖纳米载体材料性能对抗乙肝免疫核糖核酸免疫活性的影响

背景:近年来抗乙肝免疫核糖核酸作为一种免疫治疗剂,对慢性肝炎的治疗作用备受重视,但临床应用效果不稳定,因此构建一个能有效保护免疫核糖核酸并能被组织更好吸收的免疫核糖核酸运载体系具有重要意义.壳聚糖作为一种新辅料取得了良好的效果.目的:制备抗乙肝免疫核糖核酸的壳聚糖纳米载体,观察其免疫活性.方法:实验于2003-12/04-12在华中科技大学同济医学院环境医学研究所完成.①制备壳聚糖-免疫核糖核酸纳米粒采用复凝聚方法.②壳聚糖-免疫核糖核酸纳米粒形态、粒径和表面电位测定采用扫描电镜、原子力显微镜、Zeta电位/粒度分析仪观察.③壳聚糖对包裹的免疫核糖核酸的保护作用观察采用核糖核酸酶保护试验.④壳聚糖-免疫核糖核酸纳米粒免疫活性采用白细胞黏附抑制试验测定.体内白细胞黏附抑制指数测定:取小白鼠30只,随机分4组,生理盐水组5只、壳聚糖组5只、壳聚糖-免疫核糖核酸纳米粒组10只和免疫核糖核酸组10只.腋下和腹股沟皮下分别多点注射生理盐水、壳聚糖、壳聚糖-免疫核糖核酸纳米粒和免疫核糖核酸溶液后,无菌取出小鼠脾脏,制成单细胞悬液,加入乙肝疫苗和小牛血清1640液及实验试剂,单纯脾细胞悬液作为对照,根据公式[(对照孔A值-实验孔A值)/对照孔]×100%计算黏附抑制指数.体外白细胞黏附抑制指数测定:取健康小鼠1只,制备脾细胞悬液,于培养孔板中加入健康小鼠脾细胞悬液、乙肝疫苗、壳聚糖-免疫核糖核酸纳米粒或免疫核糖核酸溶液或壳聚糖,对照孔不加乙肝疫苗,测定方法同上.结果:①壳聚糖-免疫核糖核酸纳米粒的物理特性:新鲜制备的壳聚糖-免疫核糖核酸纳米粒多呈球形,放置时间在48 h以内形态较稳定,但粒径略有增大,放置时间超过72 h以后肉眼可见液体中有絮状物析出.Zeta电位/粒度分析仪测定放置3,24,48,72 h的壳聚糖-免疫核糖核酸纳米粒的平均粒径分别为132.60,138.46,167.28,486.24 nm,平均表面电位为+12.8,+12.5,+10.59,+3.86 mV.②壳聚糖-免疫核糖核酸纳米粒的酶保护试验结果:由于壳聚糖与免疫核糖核酸形成了复合物,免疫核糖核酸未被核糖核酸酶降解.当减少壳聚糖-免疫核糖核酸纳米粒量而加大核糖核酸酶量,免疫核糖核酸部分得到保护,部分被核糖核酸酶降解.③壳聚糖-免疫核糖核酸纳米粒免疫活性:体内白细胞黏附抑制试验结果纳米粒组显著高于其他3组(34.51±13.25,-5.50±8.78,5.87±2.06,12.39±6.51,P＜0.01),免疫核糖核酸组显著高于壳聚糖和生理盐水组(P＜0.05).体外白细胞黏附抑制试验壳聚糖-免疫核糖核酸纳米粒白细胞黏附抑制率高于免疫核糖核酸和壳聚糖的黏附抑制指数(31.00%,6.55%,7.12%)结论:壳聚糖纳米粒可以有效的保护免疫核糖核酸,提高抗乙肝免疫核糖核酸的利用率和免疫活性,其保护作用与核糖核酸酶呈剂量效应关系.

生物膜处理神经吻合口促进神经再生的实验

目的:观察生物膜防止神经粘连的作用并与静脉、己丁糖、强的松龙以及单纯缝合进行对比,探索促进神经再生的方法.方法:实验于2002-04/07在解放军总医院骨科实验室完成.将新西兰大白兔随机分为5组:生物膜组、己丁糖组、强的松龙组、静脉组及单纯缝合组,每组12只.①模型制作:采用250 g/L乌拉坦静脉麻醉,显露兔的双侧坐骨神经,并在胫骨外髁上方1 cm处切断胫神经,双侧作同样处理.在手术显微镜下,将胫神经端端吻合,并将吻合口周围肌肉作适当损伤以形成瘢痕.②分组处理:生物膜组:生物膜片包裹神经吻合口,并将两端缝合成管状,生物膜管两端各与神经外膜固定1针.己丁糖组:在吻合口周围涂抹0.5 mL己丁糖.强的松龙组:在吻合口周围注射0.5 mL强的松龙.静脉组:取一段兔颈外静脉,长约2 cm,分为两段,分别套在双侧胫神经上,两端各固定1针.单纯缝合组:直接吻合后放入肌间隙,吻合口不作特殊处理.③指标测试:于术后2,4,10和16周用肉眼观察足底溃疡及愈合情况,神经吻合口的粘连程度;取各时间段神经吻合口上下5 mm神经,光镜观察再生神经通过吻合口情况及结缔组织增生情况;取吻合口近远端各2 mm长神经,用伪彩色图像分析行轴突数目分析;对16周组,用诱发电位仪检测其神经传导速度、诱发电位波幅及潜伏期;在透射电镜下观察其超微结构特征.结果:每组12只新西兰白兔均纳入结果分析.①大体观察:单纯缝合组修复段神经2周时为瘢痕组织包裹压迫固定,4和10周时粘连加重,神经无活动度.静脉包裹组修复段神经2周时与周围界限清楚,4,10和16周时与周围粘连固定,无活动度.生物膜组、己丁糖组及强的松龙组各时间段神经活动不受限.②组织学检查:生物膜组、己丁糖组和强的松龙组再生纤维通过吻合口较直,神经内无明显结缔组织增生.单纯缝合组神经外膜较厚,吻合口处结缔组织增生明显,神经再生纤维通过障碍.静脉包裹组神经外膜与分界短期内基本清楚,但长期组有静脉壁坏死的表现,吻合口周围有较多结缔组织增生.③电生理检测结果:静脉组及单纯缝合组的神经传导速度和潜伏期的恢复程度低于生物膜组、己丁糖组和强的松龙组(P＜0.01);诱发电位波幅恢复率各组间无显著性差异.④轴突图像分析结果:术后16周,单纯缝合组及静脉组与其他3组比较有髓纤维再生率明显较低(P＜0.01).⑤透射电镜观察结果:16周时吻合口远端单纯缝合组有髓纤维髓鞘较薄,轴突直径较细,但各组神经远端轴突及髓鞘均较成熟,可见大量再生无髓纤维.结论:术中使用生物膜、己丁糖、强的松龙处理神经吻合口,能有效地防止周围神经粘连,促进周围神经再生,大限度地恢复周围神经的功能.

明胶管桥接修复坐骨神经缺损

背景:生物材料在周围神经缺损的治疗中不仅有望代替神经移植,还可能改善神经修复吻合口处的选择性再生.目的:观察明胶管在修复周围神经缺损中的作用.设计:随机分组实验观察.单位:华中科技大学同济医学院附属协和医院手外科.方法:实验于2002-10/2003-03在华中科技大学同济医学院附属协和医院手外科实验室完成.选取2月龄雄性Wistar大鼠20只,随机分为实验组和对照组,每组10只.明胶管(1.0 cm,内径1.0 mm的导管)套接修复大鼠右侧坐骨神经缺损6.0 mm,用同样规格的硅胶管套接作对照组大鼠.术后3个月进行电生理学、免疫组织化学、辣根过氧化物酶示踪等检查.主要观察指标:①体外观察术后足趾溃烂及愈合和抓笼动作,直接观察导管内神经再生情况.②肌湿重.③电生理学检测运动神经传导速度.④S-100免疫组织化学观察髓神经纤维直径和有髓神经纤维数.结果:20只大鼠在实验过程中无死亡,全部进入结果分析.明胶管内有较多的再生神经纤维.明胶管套接侧胫前肌肌湿重明显高于对照组,差异有显著性意义[(318.77±13.61)mg,(293.90±14.27)mg,t=3.590,P＜0.01].实验组右侧运动神经传导速度明显高于对照组,差异有显著性[(29.45±2.15),(27.01±3.77)m/s t=1.583,P＜0.05].实验组有髓神经纤维直径大于对照组,差异有显著性意义[(3.514±0.161),(3.335±0.173)μm,t=3.003,P＜0.01].结论:作为一种新材料,明胶管能有效桥接坐骨神经缺损.

柠檬酸化半水硫酸钙作为骨移植替代材料的安全性及生物相容性评价

目的:以二水硫酸钙为原料,制备出高纯度柠檬酸化半水硫酸钙,并对其生物相容性进行评价.方法:实验于2004-09/2005-01在解放军总医院骨科研究所完成.柠檬酸化半水硫酸钙粉沫是粉状的二水硫酸钙经特殊处理制得.根据文献对实验材料进行生物相容性及安全性评价实验.①红细胞溶解性:材料粉末制备的浸提液加入抗凝兔血内恒温水浴60 min、离心取上清液,分光光度计测定上清液吸光度.计算红细胞溶血率(%)=(实验组吸光度-阴性对照组吸光度)/(阳性对照组吸光度-阴性对照组吸光度)×100%、标准:≤5%为正常.②细胞毒性试验:采用四甲基偶氮唑盐比色法.兔骨髓基质干细胞经复苏、传代、培养24 h后进行更换含材料浸提液的培养基继续培养、酶标仪测定1,3,5,7 d吸光度.计算细胞相对增值率=实验组吸光度/对照组吸光度.③细胞材料表面贴附:骨髓基质干细胞细胞悬液滴在材料表面,培养3 d后,倒置显微镜下观察材料边缘细胞生长情况.乙醇固定后用环境扫描电镜镜下观察材料表面的细胞贴附情况.④热源性:自体温试验筛选合格新西兰家兔的耳缘静脉注入材料浸提液后,定时测兔体温.标准:每只体温升高在0.6℃以下,3只体温升高总度数小于1.4℃.⑤皮肤刺激性:健康新西兰家兔脊柱两侧选点注射材料花生油及DMEM浸提液,每个点注射0.2 mL.观察注射部位皮肤反应.⑥致敏性:将浸提液与完全氟氏佐剂完全乳化制成相应剂型试剂,以豚鼠为观察对象,观察腹部激发部位皮肤反应.结果:①材料特性:制备材料2 h固化抗压缩强度达到26 MPa,初凝时间5 min,终凝时间20min.扫描电镜观察为晶体形态均一、为规则的六面体结构.②细胞粘附与生长形态:骨髓基质干细胞在材料周围生长,环境扫描电镜观察细胞贴附材料表面生长,呈不规则的梭形、多角形,胞体伸出伪足长短不等.③红细胞溶解实验:红细胞溶血率为0.34%,远小于阳性标准,说明材料植入体内后不会引起机体本身的溶血反应.④热源反应:家兔平均体温升高为0.1℃,符合医用材料的热源反应要求,说明本材料本身不具有致热源作用.⑤皮内注射:两组浸提液皮内注射后均未引起家兔实验区的红斑及水肿反应,提示材料对动物机体没有刺激性.⑥致敏实验:致敏率为0,与阴性对照没有差别,说明材料没有致敏性.⑦细胞毒性实验的检测结果提示实验组细胞相对增值率和对照组无显著性差别,评分为0～1级,说明材料本身不具有细胞毒性.结论:生物安全性评价结果初步显示制备的材料具有良好的生物相容性,符合医用生物材料的基本要求.

大鼠骨髓间充质干细胞在特定培养液条件下向软骨细胞表型定向分化的实验

背景:组织工程化软骨的构建为软骨缺损的修复开辟了全新的途径,克服了传统治疗方法的不足.目的:探讨分离骨髓间充质干细胞,在特定培养液条件下诱导其向软骨细胞表型转化的体外培养方法.设计:完全随机实验.单位:广西医科大学第一附属医院创伤骨科、手外科及广西医科大学组织学与胚胎学教研室.方法:实验于2002-08/2003-04在广西医科大学完成.实验动物选择新生断奶SD大鼠20只.抽取大鼠四肢骨髓,Percoll梯度分离液离心分离结合贴壁筛选法得到间充质干细胞,在含体积分数0.15的胎牛血清的低糖DMEM培养液中,置于37℃,体积分数为0.05的CO2培养箱内培养10～14 d.传代后以体积分数0.15的胎牛血清的高糖DMEM培养液(含转化生长因子β110μg/L,地塞米松10-7mol/L,维生素C 50 mg/L)对其进行诱导培养.主要观察指标:观测在体外特定培养条件下间充质干细胞的形态、生长特点和诱导培养后软骨特异性基质的表达情况.结果:所有20只SD大鼠全部进行分析观察,无一例脱失.①分离获取了较高纯度的骨髓间充质干细胞,保持了细胞的活性.②骨髓间充质干细胞原代培养呈均匀分布的集落样生长,呈长梭形;传代培养中形态特性无明显变化,细胞增殖周期缩短,细胞均质性明显提高.③诱导后的细胞由梭形向多角形转变,Ⅱ型胶原免疫组化阳性.④诱导培养后软骨特异性基质Ⅱ型胶原免疫组化阳性.结论:①采用Percoll梯度分离液离心分离结合贴壁筛选法可获得较高纯度和活性的骨髓间充质干细胞.②间充质干细胞在体外特定培养条件下能大量增殖,实现数量扩增.③间充质干细胞在特定培养液的诱导下能向软骨细胞表型转化,并能分泌软骨特异性基质,可成为软骨组织工程理想的种子细胞.

碱性成纤维细胞因子和骨形成蛋白联合应用对骨髓干细胞的生物学效应

目的:观察不同剂量的碱性成纤维细胞因子和重组人骨形成蛋白2单独或交互作用对成人骨髓干细胞增殖、碱性磷酸酶和总蛋白含量合成的影响.方法:实验于1999-09/2002-07在解放军总医院口腔科实验室完成.取在解放军总医院体检的一名健康自愿者骨髓组织,将培养的骨髓干细胞暴露于不同浓度的碱性成纤维细胞生长因子或(和)重组人骨形成蛋白2中,①检测骨髓干细胞增殖能力,用酶联免疫检测仪490 nm波长测光吸收值.②检测骨髓干细胞碱性磷酸酶活性,用酶联免疫检测仪410 nm波长测光吸收值.③检测骨髓干细胞内蛋白质的含量,用酶联免疫检测仪595 nm波长测光吸收值.结果:①骨髓干细胞增殖能力:浓度为10 μg/L的碱性成纤维细胞生长因子与浓度为100μg/L重组人骨形成蛋白2联合使用时较对照组显著增加(0.28±0.03,0.14±0.02,P＜0.01).②骨髓干细胞碱性磷酸酶活性:浓度为10 μg/L的碱性成纤维细胞生长因子与浓度为100μg/L重组人骨形成蛋白2联合使用时较对照组显著增加(0.70±0.05,0.51±0.02,P＜0.01).③骨髓干细胞内蛋白质的含量:浓度为10μg/L的碱性成纤维细胞生长因子与浓度为100μg/L重组人骨形成蛋白2联合使用时较对照组显著增加(0.37±0.05,0.20±0.01,P＜0.01).结论:碱性成纤维细胞生长因子可明显促进骨髓干细胞的增殖,但却抑制碱性磷酸酶和总蛋白含量;重组人骨形成蛋白2对骨髓干细胞的碱性磷酸酶活性、蛋白质含量均有明显的促进作用,且呈剂量依赖性,重组人骨形成蛋白2对骨髓干细胞的增殖也有一定促进作用;而二者交互联合应用对骨髓干细胞的增殖和分化有协同作用.

人骨保护素基因重组腺病毒载体在大鼠骨髓基质细胞中的表达效率

目的:构建人骨保护素基因的重组腺病毒载体,并观察在大鼠骨髓基质细胞中的转染能力及表达效率.方法:实验于2004-03/2005-04在第三军医大学完成.采用基因工程技术,将人骨保护素基因片段插入到腺病毒载体质粒pAdTrack-巨细胞病毒上,利用PadEasy系统与骨架质粒在大肠杆菌BJ5183胞内进行同源重组,经293细胞包装、扩增,得到携带人骨保护素基因的重组腺病毒,将携带人骨保护素基因重组腺病毒对大鼠骨髓基质细胞进行感染.采用聚合酶链反应方法对重组腺病毒载体进行鉴定,利用绿色荧光报告基因转染结果,以荧光计数法检测重组腺病毒的滴度,应用Western blot及酶联免疫吸附法检测骨保护素在大鼠骨髓基质细胞中的表达.结果:①酶切鉴定及聚合酶链反应结果证明人骨保护素基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度可达2.5×109pfu/mL,具有很强感染能力.②人骨保护素基因重组腺病毒载体转染大鼠骨髓基质细胞后48 h,Western blot及酶联免疫吸附法可检测到人骨保护素的蛋白表达.结论:应用细菌内同源重组法,可成功构建含人骨保护素基因重组腺病毒载体,且能高效转染大鼠骨髓基质细胞.

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为胰岛素阳性细胞的潜能

目的:观察大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为胰岛素阳性细胞能力.方法:①实验于2004-09/2005-01在南京医科大学第一附属医院内分泌及代谢病研究室完成.选用清洁级雄性SD大鼠10只.②取大鼠骨髓,体外分离、培养骨髓间充质干细胞,流式细胞术检测CD45/CD90表达及细胞周期,明确骨髓间充质干细胞特性.③取第3代细胞,随机分为2组,低糖诱导组[先予体积分数0.1胎牛血清低糖Dulbecco改良的Eagle培养液(5.6 mmol/L葡萄糖)]或高糖诱导组[高糖Dulbecco改良的Eagle培养液(25 mmol/L葡萄糖)]培养14 d,换予体积分数0.05胎牛血清低糖Dulbecco改良的Eagle培养液或高糖Dulbecco改良的Eagle培养液+尼克酰胺(10 mmol/L)培养7 d,再加Exendin-4(10 nmol/L)诱导培养7 d.④采用反转录聚合酶链反应法检测胰腺-十二指肠同源盒基因1、胰岛素原和胰岛素基因的表达,激光共聚焦显微镜观察胰岛素蛋白的表达,流式细胞术检测胰岛素阳性细胞数和平均荧光强度,电镜观察诱导后细胞的超微结构.⑤组间计量资料比较采用方差分析.结果:①骨髓间充质干细胞贴壁生长,呈长梭形.流式细胞术检测显示,CD90阳性率为(96.3±1.3)%,CD45阳性率为(0.3±0.4)%,细胞周期静止期-DNA合成前期占(76.8±4.8)%,DNA合成后期-有丝分裂期(11.3±3.7)%,DNA合成期(11.9±5.7)%.②骨髓间充质干细胞诱导培养过程中,细胞形成团簇状分布,少数聚集成团,直径80～200μm,半悬浮于培养瓶中.电镜观察此类细胞胞浆内有较多分泌颗粒.③低糖诱导组和高糖诱导组均表达胰腺-十二指肠同源盒基因1、胰岛素原和胰岛素基因.④流式细胞术检测显示低糖诱导组和高糖诱导组胰岛素阳性细胞数和平均荧光强度均明显高于骨髓间充质干细胞诱导前[(21.9±11.1)%,(19.8±7.8)%,(1.4±1.2)%;21.0±7.6,22.5±14.5,8.7±3.5,P＜0.05].结论:大鼠骨髓间充质干细胞在体外可以诱导分化为胰岛素阳性细胞.

组织型纤溶酶原激活因子构建及其在人脐静脉内皮细胞的表达活性

背景:组织型纤溶酶原激活因子被认为是血管系统内初期血栓清除的关键酶.目的:构建pcDNA3.1(+)组织型纤溶酶原激活因子真核表达载体转染人脐静脉内皮细胞,观察外源性组织型纤溶酶原激活因子的表达情况.设计:随机对照实验.单位:中南大学湘雅二医院及中国医学遗传学国家重点实验室.材料:实验于2002-09/2003-06在中国医学遗传学国家重点实验室完成.脐静脉内皮细胞取自中南大学湘雅二医院健康产妇分娩后胎盘脐带,pcDNA3.1为SmithKline Beecham公司赠送.方法:构建真核表达载体pcDNA3.1(+)组织型纤溶酶原激活因子,并将pcDNA3.1(+)组织型纤溶酶原激活因子转入人脐静脉内皮细胞,用酶联免疫吸附法定量检测转基因后组织型纤溶酶原激活因子蛋白表达情况、发色底物法检测外源性组织型纤溶酶原激活因子活性.以转pcDNA3.1(+)组织型纤溶酶原激活因子基因人脐静脉内皮细胞为观察对象,未转pcDNA3.1(+)组织型纤溶酶原激活因子基因人脐静脉内皮细胞作为对照.主要观察指标:组织型纤溶酶原激活因子蛋白定量及活性测定结果.结果:①组织型纤溶酶原激活因子蛋白定量表达结果为568.6 ng/106细胞/24 h,未转pcDNA3.1(+)组织型纤溶酶原激活因子的人脐静脉内皮细胞测得为17.8 ng/106细胞/24 h.②组织型纤溶酶原激活因子活性为108.8 IU/106细胞/24 h,未转pcDNA3.1(+)组织型纤溶酶原激活因子的人脐静脉内皮细胞测得为5.6IU/106细胞/24 h.结论:pcDNA3.1(+)组织型纤溶酶原激活因子转染人脐静脉内皮细胞后,外源性组织型纤溶酶原激活因子基因获有效表达,为pcDNA3.1(+)组织型纤溶酶原激活因子转入人体细胞确立了有效依据.

慢性颅内静脉压增高状态下脑血管Tie受体表达与血管生成

背景:Tie是血管内皮细胞特异性的酪氨酸激酶受体,慢性颅内静脉压增高状态下Tie1和Tie2表达的变化可能参与硬脑膜动静脉畸形的病变过程.目的:观察慢性颅内静脉压增高状态下脑血管Tie受体表达及血管生成的变化.设计:单因素设计.单位:解放军沈阳军区总医院神经外科.对象:实验于2003-12/2004-10在沈阳军区总医院动物实验中心进行.取雄性Wistar大鼠65只,24只造模成功,随机分为模型组和正常组各12只. 方法:模型组大鼠右侧颈总动脉和颈外静脉端-端吻合,同时结扎上矢状窦,建立慢性颅内静脉压增高的动物模型;正常组仅单纯结扎右侧颈总动脉.两组大鼠均于手术后90d麻醉状态下断头取右侧大脑中动脉供血区的大脑皮质,采用免疫组化方法检测Tie受体表达及微血管密度.主要结局观察:两组大鼠大脑皮质中Tie1及Tie2表达和微血管密度.结果:24只大鼠进入结果分析.①脑组织中Tie1表达:模型组和正常组的吸光度值比较无差异(3.96±0.61,4.35±0.72,P＞0.05).②脑组织中Tie2表达:模型组的吸光度值显著高于对照组(8.16±1.04,1.08±0.45,P＜0.05).③脑组织中微血管密度:模型组显著高于对照组[(10.34±1.05),(2.68±0.29)个/视野],并且越接近上矢状窦处,微血管密度越大结论:慢性静脉压增高状态下脑血管内皮细胞Tie2表达和微血管密度升高,提示脑微血管处于高度增殖状态,而Tie1的相对低表达导致新生血管为病理性的未成熟血管.说明颅内静脉压增高不仅开放了潜在的硬脑膜动静脉吻合和侧支循环,而且启动了病理性血管生成过程,导致硬脑膜动静脉畸形不断发展扩大.

已酮可可碱对血管损伤后血管重构的影响

目的:观察已酮可可碱对球囊成形术后兔血管重塑和基质金属蛋白酶1及其抑制剂表达的影响.方法:①实验于2004-03/09在汕头大学第一附属医院动物实验中心和汕头大学医学院第二附属医院病理科完成.选用新西兰大白兔36只.随机将动物分为2组,对照组(n=18)造成血管球囊损伤模型,不给予其他干预措施;用药组(n=18)行造模并于术前3 d开始腹腔注射已酮可可碱[42 mg/(kg·d)],持续至处死.分别于术后2,4,12周各处死6只.②随机选取对照组6只白兔另一侧未行球囊损伤侧的髂总动脉做为正常组.采用病理图像分析系统H-100进行图像分析,计算血管腔面积和外弹力膜围绕面积(平均动脉面积).计算高倍镜视野下基质金属蛋白酶1和组织型基质金属蛋白酶1抑制剂的阳性细胞率.③计量资料差异比较采用t检验.结果:大白兔36只均进入结果分析.①球囊成形术后4和12周对照组兔髂动脉的管腔面积和外弹力膜围绕面积均明显小于正常组(P＜0.01);而用药组兔髂动脉的管腔面积和外弹力膜围绕面积均明显大于对照组(P＜0.05).②球囊成形术后2和4及12周用药组基质金属蛋白酶1表达与对照组相近(P＞0.05).组织型基质金属蛋白酶1抑制剂表达明显少于对照组(P＜0.01).结论:已酮可可碱可抑制血管损伤后血管负性重构,减轻血管的狭窄,对冠状动脉球囊损伤术后的后期管腔丧失和病理性血管重塑方面有一定作用,可能与抑制组织型基质金属蛋白酶1抑制剂表达,恢复基质金属蛋白酶1与组织型基质金属蛋白酶-1抑制剂的平衡有关.

纤维蛋白胶释放血管内皮生长因子加速损伤动脉血管内皮化

背景:血管去内皮化,血栓形成和内膜增生极大的限制了血管治疗方法的临床效果.目的:利用含血管内皮细胞生长因子的纤维蛋白胶作用于球囊损伤血管内膜来评估其对血管内皮化、细胞增殖和内膜增生的影响.设计:随机对照、重复测量设计.单位:解放军第四军医大学西京医院血管外科及神经外科研究所.材料:实验于2002-10/2004-06在解放军第四军医大学西京医院神经外科研究所完成.15只健康杂种犬(雌雄不限,体质量12.5～18.9 kg)由西京医院动物实验外科提供.方法:损伤犬双侧颈动脉,一侧为纤维蛋白胶/血管内皮细胞生长因子/肝素处理组,另一侧为生理盐水对照组.损伤后10,30和90d观察对比内膜损伤和处理的结果.切片应用Bioquant BQ OS/2计算机形态测量仪测量血管内膜和中层厚度.5-溴脱氧尿苷掺入免疫组化切片用于计算细胞增殖率,40倍光镜下计算5-溴脱氧尿苷阳性细胞数.电镜检查血管腔内表面内皮细胞覆盖率.主要观察指标:内皮细胞覆盖情况、新生内膜和中层厚度及细胞增殖率.结果:所有犬均存活至标本收集时,无脱失值.①内皮细胞覆盖率:在10 d和30 d时,处理侧颈动脉的内皮细胞覆盖率明显高于对照侧[(66.73±30.78)%,(40.8±27.74)%,P=0.04;(96.67±10.29)%,(82.07±22.82)%,P=0.048].②增殖率:10 d时,血管各层细胞增殖达到高峰,90d恢复正常.和对照组相比,处理组在30 d时新生内膜和血管中层内侧半中层及血管中层的细胞增殖率明显增强[(7.41±6.75)%,(3.56±2.72)%;(2.81±2.65)%,(0.83±0.59)%;(2.06±1.81)%,(0.62±0.31)%,P＜0.05].③新生内膜厚度:和对照组相比,处理组在30 d和90 d时双侧近端和中段的内膜厚度/中层厚度比值明显增加(0.18±0.22,0.10±0.06;0.21±0.23,0.14±0.14;0.12±0.08,0.09±0.08;0.29±0.40,0.12±0.12,P＜0.05,P＜0.01),但远端没有变化.结论:纤维蛋白胶能将细胞因子释放入动脉血管壁并保持生物学活性.纤维蛋白胶释放血管内皮细胞生长因子加肝素能有效加速损伤血管内皮化但伴有平滑肌细胞增殖和内膜增生.

生长反应因子1特异的脱氧核酶与大鼠颈动脉损伤后诱生型一氧化氮合酶表达的关系

目的:观察生长反应因子1特异的脱氧核酶ED5对大鼠颈动脉血管损伤后诱生型一氧化氮合酶表达的影响,探讨生长反应因子1特异的脱氧核酶对血管损伤后内膜增生的抑制作用.方法:实验于2004-03/2004-07在中国医科大学实验动物部完成.选用健康雄性Wistar大白鼠96只.随机将动物分为4组:治疗组、稀释液对照组、转染液对照组和假手术组,每组24只,每组分为4个时间点(3,7,14,21 d)进行观察.①血管球囊损伤的动物模型制作:麻醉后,切开鼠颈正中,钝性分离左颈动脉,血管夹暂时阻断左颈总动脉近心、远心端血流,用2 F导管从颈外动脉插入左颈总动脉内,推入0.2 mL生理盐水充盈气囊,反复抽拉球囊3次,造成左颈总动脉内膜损伤.②分组干预:假手术组只进行颈动脉结扎,但不插入导管,即不造成动脉内膜损伤.稀释液对照组、转染液对照组、治疗组均在造成血管球囊损伤模型的同时,局部注射200 μL的1 mmol/L MgCl2液;局部注射含30 μL的FuGENE6 Reagent的MgCl2液200 μL;颈外动脉给予含有异硫氰酸荧光素标记的生长反应因子1特异的脱氧核酶500 μg+转染试剂FuGENE6 30 μL的MgCl2液200 μL.③诱生型一氧化氮合酶mRNA水平检测:采用半定量反转录聚合酶链反应.④诱生型一氧化氮合酶蛋白合成检测:采用免疫印迹法.⑤血管内膜增生情况观察:苏木精-伊红染色,光镜显微镜下观察,应用计算机图像分析软件测定血管内膜和中膜厚度.⑥血管内膜和中膜一氧化氮合酶蛋白表达检测:采用免疫组织化学法.⑦统计学分析:多组间比较采用单因素方差分析,两组间比较采用LSD-t检验.结果:大鼠96只均进入结果分析.①大鼠血管内皮损伤后血管病理形态学改变:内皮损伤后3 d内膜增生不明显,7 d内膜开始增生,14和21 d时内膜增生明显.②血管组织诱生型一氧化氮合酶mRNA的表达及蛋白合成结果:假手术组大鼠颈动脉无诱生型一氧化氮合酶mRNA的表达,球囊损伤后3,7,14,21 d均出现诱生型一氧化氮合酶蛋白表达量的上调.与对照组比较,治疗组在各个时间点的诱生型一氧化氮合酶mRNA水平和蛋白表达量增高更显著(P＜0.05).③术后7,14,21 d血管内中膜厚度:2个对照组和治疗组明显大于假手术组(P＜0.01);治疗组明显小于2个对照组(P＜0.01).④血管组织诱生型一氧化氮合酶蛋白质表达:2个对照组和治疗组明显大于假手术组(P＜0.01);治疗组明显大于2个对照组(P＜0.01).结论:①大鼠颈动脉球囊损伤后诱生型一氧化氮合酶表达略增加,这可能是血管组织的一种代偿反应,同时内膜增生明显.②经生长反应因子1特异的脱氧核酶治疗出现诱生型一氧化氮合酶高表达进一步增加,内膜增生明显减轻,生长反应因子1特异的脱氧核酶通过增加诱生型一氧化氮合酶的表达而达到抑制血管球囊损伤后内膜增生的作用.

腺病毒介导转化生长因子β1基因阻逆兔椎间盘退行性变的实验

目的:观察腺病毒载体搭载的人转化生长因子基因对兔椎间盘退行性变模型的治疗作用.方法:实验于2003-03/2004-09在协和医院骨科实验室进行.取4个月龄健康雌性日本大白兔30只,于协和医院骨科实验室行L4～5,L5～6前外侧纤维环损伤手术以构建椎间盘退行性变模型.术后8周将动物随机分入3组.治疗组14只,注射20μL(10×106pfu)腺病毒载体介导人转化生长因子β1基因;对照组8只,注射20μL(10×106pfu)腺病毒载体介导标志基因(Ad/CMV-LacZ);空白组6只,注射20μL生理盐水.另取2只同类的健康白兔作为正常对照,不予任何手术或治疗.注射后3周取各组椎间盘组织行苏木精-伊红染色、T2加权磁共振成像、蛋白免疫印迹、转化生长因子β1免疫组织化学观察.结果:①兔椎间盘组织切片观察结果:注射3周后,治疗组切口已基本愈合,髓核细胞大量增生;空白组纤维环外侧内2/3部分仍未愈合,部分髓核细胞坏死、凋亡;对照组较空白组改善不明显.②MRI扫描结果:治疗组椎间盘信号较对照组及空白组有所恢复,但并未完全达到正常椎间盘水平.③蛋白质免疫印迹分析结果:治疗组转化生长因子β1含量较对照组和空白组有显著上升(P＜0.01).④转化生长因子β1免疫组织分析结果:治疗组转化生长因子β1为强阳性表达(＞50%),空白组几乎没有转化生长因子β1表达,对照组与空白组相似.治疗组显著高于对照组(x2=20.563,P=0.00).结论:腺病毒载体介导人转化生长因子β1基因转染退行性变的椎间盘细胞能够有效提高髓核细胞内转化生长因子β1含量,阻逆椎间盘退行性变.

兔腰椎间盘内显微注射方法的相关问题及其解剖学特点

目的:测量兔腰椎间盘解剖学数据,并探讨兔腰椎间盘内显微注射方法中的相关问题. 方法:实验于2004-10在中山大学附属第二医院完成.实验动物选择三四月龄的新西兰大白兔10只,麻醉后空气栓塞法处死,取出腰椎间盘观察其解剖结构.并测量椎间盘纤维环前后径长度,测量前部纤维环前后径长度,测量椎间盘前正中点到髓核中心点的长度.取同样10只白兔,麻醉后,右侧卧位,沿左侧12肋末向下至髂嵴做纵切口,切开胸腰筋膜后层,在骶棘肌和腰方肌的外缘与胸腰筋膜前层间钝性分离.推开腰椎间盘前方筋膜和前纵韧带,以椎体前方的纵性骨棘为标志从腰椎间盘前方中心点处垂直进针,以微量注射器注入25μL黑色墨水作为标记.体会显露椎体和椎间盘的入路和手术方式,观察侧方手术入路能否良好显露腰椎间盘,能否较好的完成椎间盘内注射.观察椎间盘内注射的入针点,进针长度,进针角度,注射剂量,注入结果.小心取出注射入墨水的兔脊柱(包含L1～L7范围),共计70个,迅速置入-20℃低温冷冻,2 h后取出,微解冻后以尖刀从中间水平切开椎间盘,观察墨水注入髓核的情况.结果:20只动物实验过程中无死亡,全部进入结果分析.①解剖学观察:兔髂嵴短,平髂嵴高点连线在俯卧位时经过L6棘突,可做为手术操作的体表标志.椎间盘为三明治结构,上下为软骨终板,与上下方椎体相连;由外向内依次为外层纤维环、内层纤维环、移行区、髓核.②手术入路:顺利显露出L3～L6椎间盘,显露操作时间平均为15 min,共计70个椎间盘.③椎间盘内注射方法:选择在嵴状突起于椎间盘水平中线的交点即为进针点,保持进针深度3mm,注射大液体量25 μL.注射效果理想者64个,其中L3～L6椎间盘共计40个,注射效果良好者39个,成功率97.2%.结论:通过对兔腰椎间盘的部分解剖学数据,椎间盘纤维注射的注射方式、手术入路的选择,进针点、进针长度、进针角度的确定、注射液体量的观察及实践,证明以本方法进行腰椎间盘内微量注射操作规范,可取得理想效果.

体外培养不同代次成纤维细胞胶原基因表达及成纤维细胞对表皮细胞生长因子刺激的反应

背景:成纤维细胞是构建组织工程化皮肤的种子细胞,其质量好坏直接影响组织工程化皮肤的质量.其在体外培养过程中胶原基因表达及对表皮细胞生长因子刺激反应,可以反映不同代次成纤维细胞的增殖能力,为皮肤组织工程筛选合适的种子细胞提供依据.目的:观察体外培养不同代次人成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原基因的表达及对表皮细胞生长因子刺激的反应性,为组织工程化皮肤种子细胞的选择提供部分依据和参数.设计:自身对照实验.单位:潍坊医学院整形外科研究所.材料:实验于2000-09/2002-06在潍坊医学院整形外科研究所完成.实验样本来源于在潍坊医学院附属医院普外科行包皮环切术的6～8岁正常男性儿童(n=20)切除的健康包皮组织,均自愿提供.方法:①成纤维细胞培养:取包皮组织,去除皮下疏松结缔组织,分离真皮和表皮,真皮部分用含100 mL/L胎牛血清DMEM培养液终止胰蛋白酶作用,再用200 U/mLⅠ型胶原酶37℃条件下消化30 min,收集细胞悬液,用血细胞计数板做细胞计数,观察细胞活性,接种于培养皿中,细胞培养达到80%汇合时,用混合消化液消化,镜下见胞质回缩终止消化,以1:2接种入新培养皿,进行传代培养.②细胞鉴定:用相差显微镜动态观察细胞形态变化及生长增殖情况、透射电镜及抗vimentin免疫细胞化学染色.③不同代次成纤维细胞胶原基因表达的分析:抽提不同代次(P0,P5,…,P65)成纤维细胞总核糖核酸,获得样本cDNA,进行逆转录聚合酶链反应,所得反应产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳对照分子量标准,分析扩增产物是否为所预期.④氚-胸苷(3H-TdR)掺入量测定对表皮生长因子刺激的反应性:取P10和P60代成纤维细胞,实验组均添加含表皮生长因子的条件培养液,对照组用不加表皮生长因子的条件培养液.细胞培养至80%汇合时,血清饥饿72 h.加入含200 μL/L表皮生长因子无血清DMEM培养液,培养24 h;弃上清,各组均加入含氚-胸苷的培养液37 MBq/L,再培养24 h,收集细胞;用预冷的100g/L三氯乙酸沉淀DNA,再用0.5 mL 1 mol/L NaOH提取,液闪计数仪上测定每分钟放射性脉冲数.主要观察指标:①不同代次成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA含量.②不同代次成纤维细胞对表皮细胞生长因子刺激的反应.结果:①不同代次成纤维细胞胶原基因的表达:随细胞代次的增加,Ⅰ,Ⅲ型胶原mRNA含量逐渐降低.②不同代次成纤维细胞对表皮细胞生长因子刺激的反应:氚-胸苷掺入量在P60细胞(实验组:132.5±23.6,对照组:124.9±16.8)均低于在P10细胞中(实验组:512.8±56.4,对照组:306.4±22.5);对于P60细胞,实验组与对照组间差异无显著性意义(P＞0.05),对于P10细胞,实验组与对照组间的差异有非常显著性意义(P＜0.01).结论:①随成纤维细胞代龄的增加,其合成Ⅰ型和Ⅲ型胶原的量逐渐降低.②P60细胞对表皮细胞生长因子刺激的反应均低于P10细胞,添加表皮细胞生长因子的条件培养液对P60细胞生长增殖无明显调控作用,对P10细胞有非常显著的促增殖作用.提示:随着细胞代次的增加,氚-胸苷掺入量降低,表皮细胞生长因子对衰老成纤维细胞生长增殖的调控能力减弱.③本实验为建立成纤维细胞衰老模型提供了实验依据,同时也为组织工程学、老年学及肿瘤生物学及发展提供科学依据.

脂肪干细胞体外分化为内皮细胞的可行性

目的:以内皮前体细胞为对照,探讨具有多向分化性能的脂肪干细胞的体外培养和分化为内皮细胞的可能性.方法:①实验于2003-10/2004-02在解放军总医院心内科实验室完成.选用雄性壮年和老年新西兰白兔各3只.②抽取兔髂骨骨髓,Percoll密度梯度离心后取单个核细胞,采用贴壁法以内皮细胞专用培养基(添加体积分数0.2胎牛血清,内皮细胞基本培养基2和辅助因子碱性成纤维细胞生长因子,氢化可的松,血管内皮生长因子,表皮生长因子,胰岛素样生长因子1,抗坏血酸,庆大霉素等)培养扩增内皮前体细胞.③取兔腹部皮下脂肪组织,胰蛋白酶消化提取脂肪干细胞,Iscove改良的Dulbecco培养基培养扩增,将第2代脂肪干细胞传代后,分为2份,分别用内皮细胞专用培养基和Iscove改良的Dulbecco培养基培养2～4周,观察细胞的变化.用乙酰化低密度脂蛋白,Ⅰ型荆豆凝集素和鼠抗Ⅷ因子相关抗原单克隆抗体鉴定,观察脂肪干细胞是否分化为内皮细胞.结果:①原代内皮前体细胞接种后48 h才能贴壁,生长非常缓慢,呈集落状生长,一般需要10 d左右才能形成较大的集落,达到传代的目的,传代细胞生长迅速.内皮前体细胞必须使用含有多种刺激因子的培养基才能生长.②脂肪干细胞培养无需刺激因子,原代细胞接种12 h后即开始贴壁,继而迅速进入对数生长期,无集落形成,原代和传代细胞均生长迅速.将脂肪干细胞采用内皮细胞专用培养基培养2周后,细胞形态未见明显变化,但与内皮前体细胞一样,大部分细胞采用乙酰化低密度脂蛋白,Ⅰ型荆豆凝集素和鼠抗Ⅷ因子相关抗原单克隆抗体检测均为阳性;培养3周后细胞的贴壁习性改变,几乎所用细胞均为阳性,而采用Iscove改良的Dulbecco培养基培养的脂肪干细胞采用上述检测均为阴性.③壮年兔骨髓中内皮前体细胞含量较高,培养后能保持旺盛的分裂能力;老年兔骨髓中内皮前体细胞含量明显减少,有的老年动物骨髓甚至难以培养出内皮前体细胞,而且培养时细胞容易老化,表现为细胞体积增大,形态呈扁平状或不规则,细胞浆增多而核变小.壮年兔和老年兔脂肪干细胞在生长速度和细胞形态方面没有明显差别.结论:①脂肪干细胞培养远比内皮前体细胞简单,它不需要多种细胞因子刺激即可生长.②脂肪干细胞在使用内皮细胞专用培养基诱导后可快速分化为内皮细胞.③脂肪组织中有大量的脂肪干细胞,其体外增长和分化能力受年龄影响较小,而骨髓中内皮前体细胞含量和扩增性能受年龄影响较大.

兔坐骨神经电损伤后许旺细胞的增殖变化

目的:观察成年兔坐骨神经受到75 V电压损伤后受损区域许旺细胞的变化.方法:实验于2004-10/2005-01在解放军第四军医大学唐都医院中心实验室完成.选择中国本兔12只,随机分2组:损伤组9只,正常对照组3只,损伤组观察点为损伤后第3天,第7天,第10天,每个时间点3只.建立兔坐骨神经电损伤实验模型,应用双酶消化法分离受损区域神经许旺细胞,应用细胞计数和同位素3H掺入胸腺嘧啶核苷观察许旺细胞的增殖变化情况.结果:12只中国本兔均进入结果分析.与正常对照组的细胞数(1.0±0.15)×104个/mL比较,成年兔在受到损伤后第3天细胞逐渐增多,为(3.2±0.85)×104个/mL,第7天明显增殖,达到(12±2.40)×104个/mL,第10天增殖情况较前下降,为(5.4±0.70)×104个/mL.相应的3H掺入实验结果表现出同样的变化特征.结论:许旺细胞在神经的溃变和再生过程中,大量增殖,在第7天左右达到其生长和增殖的高峰,而后呈下降趋势.证明许旺细胞在受到一定程度的电压损伤后,依然具有分裂增殖的能力,而它的增殖是受损神经结构和功能恢复的基础.

CD34+造血干细胞在"心肌样"微环境中转化为心肌样细胞的可能性

目的:一般认为CD34+细胞只能向血细胞分化,观察CD34+造血干细胞在"心肌样"微环境中转化为心肌样细胞的可能性.方法:实验于2004-01/12在大连医科大学附属第二医院实验中心完成.①选用成年健康SD大鼠30只及出生1～3 d SD大鼠乳鼠.在体外分离、培养CD34+造血干细胞,并将CD34+造血干细胞与分离出的新生乳鼠心肌细胞共培养.②将新生乳鼠心肌细胞的培养环境模拟为在体心肌细胞的生活环境即心肌样微环境.③在细胞培养瓶内加入5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记CD34+细胞.在倒置显微镜下观察CD34+造血干细胞形态学变化,用免疫细胞化学法检测心肌特异性肌钙蛋白T.结果:①CD34+造血干细胞与心肌细胞共培养3 d,CD34+细胞变成长杆状,即呈现较为一致的极性排列,靠近心肌细胞的CD34+细胞形态学改变更早、更明显.②共培养的细胞经免疫细胞化学染色,发现部分5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记的CD34+细胞核在荧光显微镜下呈现红色,同时其细胞浆心肌特异性肌钙蛋白T表现阳性,说明确实有部分CD34+造血干细胞转化成幼稚心肌细胞.结论:将CD34+造血干细胞与心肌细胞共培养,CD34+造血干细胞可以分化为心肌样细胞,从而验证了体外"心肌样"微环境可以促使CD34+造血干细胞向心肌样细胞转化的潜能.

鼠胚神经干细胞增殖对缺氧的反应及当归的保护作用

目的:探讨宫内缺氧对胚胎大鼠神经干细胞增殖的影响及当归注射液对缺氧神经干细胞的保护作用.方法:实验于2003-09/2004-06在四川省泸州医学院动物科将12只孕鼠随机分为对照组、缺氧组和当归组,每组4只(每只孕鼠产胎鼠5～8只).当归组孕鼠经尾静脉注入当归注射液,然后用低张性缺氧模型致胎鼠宫内缺氧;缺氧组用生理盐水代替当归注射液,其余同当归组;对照组不缺氧,其余同缺氧组.然后在麻醉状态下处死孕鼠,快速剖腹取胎鼠,每组随机选取20个胚鼠,将各组胎鼠脑组织作神经巢蛋白免疫组化染色,并进行图像分析.结果:60个胎鼠脑室周围脑组织进入结果分析.①缺氧组胎鼠巢蛋白免疫组化反应阳性细胞的吸光度较对照组强(0.262±0.043,0.173±0.021,P＜0.05);阳性细胞数量较对照组多[(101.4±15.76),(42.7±6.25)个/视野,P＜0.05].②与缺氧组相比较,当归组胎鼠的巢蛋白免疫组化反应阳性细胞的吸光度减弱(0.222±0.035,P＜0.05);阳性细胞数量减少[(58.5±12.53)个/视野,P＜0.05].结论:缺氧后神经干细胞表达巢蛋白增加,当归注射液减弱了缺氧刺激引起的神经干细胞的增殖和分裂,提示当归对缺氧有保护作用.

裴雪涛的意外生日礼物

"我高兴地宣布,这次大会评出的唯一高誉将'佳科学贡献奖'颁发给--"

日本熊本机能病院研修有感

在日本熊本机能病院研修期间,对日本的康复医疗有较深的印象:康复的内容体系完善;以患者为中心,各种康复服务体系健全.从中得到启示:中国需更新医学观念,重视康复医学在社区的发展;积极发展康复医学教育,提高康复队伍各方面的水平;国内的医院可因地制宜,发展相应的康复医学.

绿色荧光蛋白标记的大鼠胶质细胞源性神经营养因子重组腺病毒载体的构建及其表达

目的:构建大鼠胶质细胞源性神经营养因子基因的重组腺病毒并观察其在神经干细胞上的表达,探索胶质细胞源性神经营养因子作为基因治疗神经病变的价值.方法:实验于2004-8/12在四川大学华西医院眼疾病分子遗传实验室进行.以新生SD大鼠大脑皮层细胞RNA为模板,反转录聚合酶链反应扩增出全长的胶质细胞源性神经营养因子基因,经测序验证后,亚克隆至穿梭质粒pAdTrack CMV中,与骨架质粒pAdEasy 1同源重组为腺病毒载体.线形化后转染293细胞进行包装扩增,利用AdEasy1系统上的绿色荧光蛋白鉴定病毒表达,并用病毒上清转化大鼠神经干细胞,检测胶质细胞源性神经营养因子基因的表达.结果:①胶质细胞源性神经营养因子基因扩增后进行测序显示扩增片段为653 bp个核苷酸,同源性比较该序列正确.②重组腺病毒载体经酶切验证为阳性克隆,转染293细胞包装后的病毒滴度为1x109PFU/mL.③转入胶质细胞源性神经营养因子的重组腺病毒的神经于细胞扩增出653 bp的带.结论:成功构建了胶质细胞源性神经营养因子重组腺病毒并见其在大鼠神经干细胞中进行了表达.

无血清培养法诱导小鼠胚胎干细胞分化为胰岛素分泌细胞的实验条件优化选择

目的:胚胎干细胞能够在体外被定向地诱导分化为胰岛素分泌细胞的影响因素多,诱导过程复杂,诱导时间长,所得细胞数量少、功能低.通过对培养条件进行优化选择,是否可增加胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞定向分化的可控性,以便在短时间内得到数量更多、功能更强、可用于糖尿病治疗的胰岛素分泌细胞.方法:实验于2004-03/2004-10在解放军第三军医大学基础部生理学教研室完成.①小鼠胚胎成纤维细胞饲养层细胞的制备:孕13 d的胎鼠制备成纤维细胞,37℃培养.当成纤维细胞生长完全融合后,用丝裂酶素处理后备用.②胚胎干细胞的培养及扩增:胚胎干细胞接种于小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上,培养于含白血病抑制因子和胎牛血清的Dulbecco改良的Eagle高糖培养基中,37℃培养四五天.③胚胎体向神经前体细胞分化的诱导:扩增培养四五天的胚胎干细胞用胰蛋白酶消化后,于不含白血病抑制因子的培养基中悬浮培养4 d,形成胚胎体.收集胚胎体后接种于无血清的选择性培养基,贴壁培养四五天后,细胞分化为神经前体细胞.④神经前体细胞向胰岛素分泌细胞分化的诱导:神经前体细胞用胰岛素分泌细胞无血清选择性培养基培养4 d,再用葡萄糖刺激,神经前体细胞分化为胰岛素分泌细胞.⑤不同分化阶段的细胞检测:用形态学观察、免疫组织化学染色、碱性磷酸酶染色、双硫腙染色等方法.结果:①胚胎干细胞经四五天的培养扩增后,可形成细胞致密、形态饱满、折光度高、边界限清楚的典型胚胎干细胞集落,集落呈碱性磷酸酶染色阳性,饲养层细胞不着色.②胚胎干细胞脱离饲养层后,在不含白血病抑制因子的培养基中悬浮培养四五天,可形成球形的胚胎体.胚胎体在无血清神经前体细胞选择性培养基中贴壁培养四五天后,存活细胞85%以上分化为巢蛋白阳性的神经前体细胞.③改用胰岛素分泌细胞无血清选择性培养基培养后,多突起的神经前体细胞逐步变圆,成为细小的圆形细胞.圆形细胞逐步聚集成集簇状,经葡萄糖刺激后,这些细胞终分化为具有胰岛素分泌细胞特征的双硫腙染色阳性细胞.结论:用无血清培养法将小鼠胚胎干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞,增加了实验因素的可控性,使其中关键的神经前体细胞的比例达到85%以上,整个诱导过程仅需12～15 d,增加了胚胎干细胞用于糖尿病治疗的临床运用可行性.

兔骨髓基质细胞在条件培养液中向成骨细胞转化的特征

目的:观察不同类型的培养液环境对骨髓基质细胞向成骨细胞转化的诱导作用.方法:实验于2004-04/08在哈尔滨医科大学附属一院实验中心完成.实验动物为日本大耳白兔.制备标准培养液和条件培养液,体外分离兔长骨骨髓基质细胞,标准培养液和条件培养液体外培养骨髓基质原代细胞,3 d后半量换液,其后每两三天换液1次.当细胞融合80%,用25 g/L胰蛋白酶消化,以1:2传代培养.应用倒置相差显微镜逐日观察体外培养的骨髓基质细胞的形态,采用常规24孔培养板计数法测定第3代细胞在标准培养液及条件培养液培养条件下的细胞生长曲线.以5×107L-1细胞接种到96培养板中,培养24 h后,更换标准培养液、条件培养液,继续培养至第5天及第10天,经处理,每孔加100μL碱性磷酸酶底物溶液,37℃孵育40 min,每孔加1 mol/L氢氧化钠50 μL终止反应,在490 nm波长测定各孔吸光度值,以U/L表示细胞碱性磷酸酶相对活性.将传代培养至第10天的标准培养液和条件培养液细胞分作2组,去除培养液,磷酸盐缓冲液pH 7.3清洗,10 g/L多聚甲醛固定1 h,行常规VonKossa染色观察矿化结节形成.实验数据进行配对资料t检验.结果:①骨髓基质细胞在标准培养液中生长良好,细胞接种后1 d少量细胞贴壁,呈圆形,2 d可见贴壁细胞增多,3 d有少量细胞呈纺锤形,6 d后见细胞呈多种形态,且形成分散的集落,其间混有少量圆形透光度较好的细胞.1周后细胞集落迅速增多,且集落中的细胞明显增多,近12～14 d集落融合成片,细胞排列有一定的方向性,呈旋涡状排列,表现为类成纤维样细胞集落生长.②条件培养液有较明显的增加骨髓基质细胞碱性磷酸酶活性的作用,条件培养液组碱性磷酸酶活性在各时间点均显著高于标准培养液组(P＜0.05),条件培养组液随培养时间延长其碱性磷酸酶活性显著增高(P＜0.05),而标准培养液组碱性磷酸酶活性在各时间点无显著差异.③条件培养组VonKossa染色强阳性,细胞间连接处可见大量黑色沉积物,证实有大量矿化结节的存在.而在标准培养液组未见黑色沉积物,VonKossa染色阴性.结论:骨髓基质细胞在体外条件培养液中可明显增强其形成矿化组织的能力

重组人表皮生长因子对面部Ⅱ度烧伤创面修复相关作用的比较

目的:观察外用重组人表皮生长因子对面部Ⅱ度烧伤创面修复过程中的治疗作用和安全性.方法:选择2002-06/2004-06广西医科大学第一附属医院烧伤整形康复中心收治的面部浅Ⅱ度烧伤、深Ⅱ度烧伤各60例.以面部左侧为治疗组,右侧为对照组.伤后第3天,治疗组将2000IU/mL的重组人表皮生长因子直接湿敷于创面上半暴露,换药1次/d,至创面愈合;对照组创面单用等渗盐水纱布覆盖半暴露,换药1次/d,至创面愈合.7和14 d观察两组患者创面愈合率、愈合时间、疼痛及瘢痕情况及不良反应.采用目测类比评分法(VAS)评估疼痛情况(0分为无痛,10分为极痛);采用改良温哥华瘢痕测量法测定深Ⅱ度创面瘢痕增生情况(瘢痕指数).结果:120例患者均进入结果分析.两组患者创面愈合率、愈合时间、疼痛及瘢痕情况的比较:浅Ⅱ度烧伤创面,治疗组7 d愈合率显著高于对照组[(72.15±13.26)%,(59.28±11.35)%,t=5.711 5,P＜0.01],愈合时间较对照组明显缩短[(9.62±2.38),(11.27±2.95)d,t=3.3719,P＜0.01];深Ⅱ度烧伤创面,治疗组14 d愈合率显著高于对照组[(75.03±21.32)%,(61.24±18.29)%,t=3.8026,P＜0.01],愈合时间较对照组明显缩短[(17.62±3.49),(20.86±3.97)d,t=4.777 2,P＜0.01],瘢痕指数低于对照组[(7.32±1.67),(8.78±1.95),t=4.254 1,P＜0.01];两组患者两种创面疼痛评分无明显差别.治疗组治疗过程未见明显毒副作用及不良反应.结论:外用重组人表皮生长因子能显著加快面部Ⅱ度烧伤创面的愈合速度,缩短愈合时间,提高愈合质量,减少瘢痕的形成,无明显不良反应,安全性好.

后肢固定大鼠股骨内生长激素及胰岛素样生长因子Ⅰ和生长抑素水平的改变

背景:骨组织内,骨形成和吸收之间的平衡主要与全身和局部的激素和生长因子活性有关,肢体固定能导致骨吸收增加及骨形成减少,从而诱发骨质疏松,但生长因子与骨质疏松之间的关系有待进一步认识.目的:通过大鼠后肢固定模型,观察大鼠股骨组织内的生长激素、胰岛素样生长因子Ⅰ和生长抑素的浓度变化.设计:随机对照观察实验.材料:6月龄清洁级健康雄性SD大鼠50只,体质量290～320 g,随机分为固定组40只和对照组10只.方法:实验于2002-02/2003-01在青岛大学医学院附属医院创伤外科完成.固定组大鼠右后肢用胶布固定于腹部,随机分为4组,每组10只,分别于1,2,4和8周腹腔内麻醉后处死大鼠.对照组大鼠于8周处死,除未进行固定外,其他处理方法与固定组一致.主要观察指标:对照组大鼠和固定1,2,4和8周大鼠股骨组织提取液中生长激素、胰岛素样生长因子Ⅰ和生长抑素的浓度.结果:50只大鼠均进入结果分析.生长激素水平在固定第8周组比对照组明显升高[(41.80±8.39),(19.86±4.21)μg/g,P＜0.05];而股骨内的胰岛素样生长因子Ⅰ在第2周出现高峰,明显高于对照组[(758.23±23.12),(499.60±18.76)μg/g,P＜0.05],但在第4周恢复到对照组水平,在第8周明显减少[(258.65±5.76)μg/g,P＜0.05].生长抑素在固定的第8周明显高于对照组[(51.69±2.36),(34.63±8.85)μg/g,P＜0.05].结论:生长激素和胰岛素样生长因子Ⅰ不仅和骨形成有关,且在固定增加骨吸收的情况下,可以引起这些肽类的浓度升高,可能与骨吸收有关.

表皮生长因子受体在溃疡性结肠炎结肠黏膜修复中的作用

目的:观察表皮生长因子受体在活动性和非活动性溃疡性结肠炎患者结肠黏膜的表达,以探讨表皮生长因子受体表达的临床意义.方法:于2001-05/2005-05选择南京医科大学第一附属医院消化科住院的溃疡性结肠炎患者32例作为观察对象.根据改良Williams疾病活动指数将之分为活动性溃疡性结肠炎组(n=22)和非活动性溃疡性结肠炎组(n=10).对照组10例为同期门诊健康体检者或肠易激综合征患者.所有参与者均同意结肠镜检查及结肠黏膜活检.溃疡性结肠炎组取至炎症明显处,对照组在直乙交界处取黏膜组织.采用免疫组化SP法检测参与者结肠黏膜表皮生长因子受体及增殖细胞核抗原的表达.阳性反应物呈棕黄色颗粒,表皮生长因子受体免疫阳性反应位于胞浆及胞膜,增殖细胞核抗原免疫阳性反应位于胞核.每张切片随机选取5个高倍视野观察,计数阳性反应的上皮细胞.评估标准:①表皮生长因子受体阳性反应细胞数/所有上皮细胞数＜5%时记为0,＜50%为1,＞50%为2,根据染色强度记为不着色0,黄色为1,棕黄色为2;两者相加:0为阴性(-),1为弱阳性(1+),2～3为阳性(2+),4为强阳性(3+).②增殖细胞核抗原阳性核染色细胞数/所有上皮细胞数＜25%时为Ⅰ级,26%～50%为Ⅱ级,51%～75%为Ⅲ级,＞76%为Ⅳ级,Ⅲ级和Ⅳ级为增殖细胞核抗原过表达.结果:所有参与者均完成各项检查,无脱落者,全部进入结果分析.对照组表皮生长因子受体阳性表达频率为4/10,增殖活性低,7例增殖细胞核抗原表达为Ⅰ级;活动性溃疡性结肠炎组表皮生长因子受体阳性表达频率为19/22,增殖活性亦增强,增殖细胞核抗原过表达频率为5/22;非活动性溃疡性结肠炎组表皮生长因子受体全部表达为阳性,增殖细胞核抗原过表达频率为9/10.对照组、活动性溃疡性结肠炎组、非活动性溃疡性结肠炎组表皮生长因子受体阳性表达率、增殖细胞核抗原过表达率依次上升,组间比较差异显著(25%,86%,100%,P＜0.01);(10%,23%,90%,P＜0.01).结论:非活动性溃疡性结肠炎患者结肠黏膜表皮生长因子受体表达明显增加,细胞增殖活跃,表皮生长因子受体在溃疡性结肠炎结肠黏膜炎症修复过程中起一定作用,适当的表皮生长因子受体表达在损伤修复中起中关键作用,过度不恰当的表达可能在细胞的恶性转化中起作用,促进溃疡性结肠炎相关性结直肠癌的发生.

烫伤后红细胞对白细胞介素-8结合能力的调控

目的:观察白细胞介素-8自烧伤创面释放入血后与红细胞的结合情况,以及对血浆白细胞介素-8浓度的影响.方法:实验于2004-12/2005-01在第三军医大学西南医院烧伤研究所1004实验室完成.选取清洁级SD大鼠36只,按随机数字表法将大鼠分为烫伤组(按烫伤后2,6,12,24,48 h分为5个区组)和假烫伤对照组,6只/组.烫伤组95℃持续18 s造成Ⅲ度烫伤,假烫伤对照组30℃持续18 s假烫伤.两组处理完毕后分别于2,6,12,24,48 h无菌采血,测定不同时相点全血中红细胞数量变化,血浆中及红细胞膜上白细胞介素-8浓度变化采用夹心酶联免疫吸附法.结果:实验纳入大鼠36只,全部进入结果分析.①各组烫伤后红细胞数量、红细胞表面及血浆内白细胞介素-8浓度的变化:与假烫伤对照组比较,烫伤组红细胞数量在烫伤后2,6,12,24 h呈逐渐上升趋势[(6.088 3±0.318 77),(7.980 0±0.386 16),(8.108 3±0.214 24),(8.326 7±0.174 20),(8.540 0±0.478 44)×1012/L,P＜0.05];烫伤组红细胞表面白细胞介素-8浓度在烫伤后2,6,12,24h均明显下降[(232.98±32.03),(151.75±34.275),(134.59±28.34),(171.67±46.00),(213.85±85.48)ng/L,P＜0.05];烫伤组血浆内白细胞介素-8浓度在烫伤后2,6,12,24 h均明显升高[(85.01±17.22),(133.96±23.70),(121.54±25.29),(118.77±23.88),(113.69±23.34)ng/L,P＜0.05].②各组烫伤后红细胞表面及血浆中自细胞介素-8浓度的比较:烫伤6h内,当红细胞结合白细胞介素-8的能力较低时,血浆中白细胞介素-8浓度较高;6 h后,随着红细胞表面结合白细胞介素-8能力逐渐恢复,血浆中白细胞介素-8的浓度逐渐降低.两者成反比关系.结论:大鼠烫伤后6 h内红细胞结合白细胞介素-8的能力是下降的,并引起白细胞介素-8自红细胞表面释放,这可能是血浆内白细胞介素-8早期升高的原因之一;但伤后48h红细胞结合白细胞介素-8异常增高,或许是导致此时血浆内白细胞介素-8回落的原因之一.提示烫伤后红细胞结合白细胞介素-8的能力对血浆白细胞介素-8的水平具有调控作用.

组织工程活性皮肤在供皮区创面的应用效果

目的:组织工程活性皮肤应用于供皮区创面的有效性及安全性检测.方法:选取西安铁路中心医院烧伤整形科2003/2004需植皮患者16例,供皮区部分创面采用组织工程全层皮肤覆盖,选取邻近创面作为对照,对照区采用凡士林油纱布覆盖.治疗期间观察创面有无炎症反应、有无渗出及疼痛的轻重情况;随访1个月,对患者创面进行有效性及安全性评估:观察创面的愈合情况及不良反应,以能否揭出纱布为愈合指标,计算应用部位与对照的愈合时间.结果:按实际处理分析,纳入患者20例,进入结果分析16例.①创面愈合情况:患者术后病情平稳,创面无明显炎性反应及渗出,可见组织工程皮肤在创面存活,创面愈合时间与对照相比明显缩短2～4 d.愈后未发现任何副作用.②平均愈合时间:应用区域短于对照区域[(7.51±1.68),(9.24±2.84)d,P＜0.05].结论:应用组织工程皮肤可促进供皮区的愈合,更快的治愈供皮区创面,明显缩短平均愈合时间,降低患者的疼痛、水疱形成等不良反应的发生率;为组织工程皮肤的临床应用提供了切实可行的方法.