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用16S rRNA探针定量测定普氏立克次体在细胞内的繁殖量
目的 以普氏立克次体为研究对象,建立一种定量测定胞内微生物繁殖的方法.方法 从立克次体感染细胞提取总RNA为样品或用硫氰酸胍裂解感染细胞,以裂解物为样品,用32P标记的16S rRNA特异探针做RNA酶保护分析.根据探针分子结合数,计算出检测到的靶序列分子数,反映胞内微生物的繁殖量.结果 从0.5μl直接裂解物可检测到3.94×104个16S rRNA分子;从6pg的总RNA中可检测到5.82×104个16S rRNA分子.用本法试测立克次体在宿主细胞内的生长曲线,只表现出迟缓期及对数生长期,而无稳定期及衰退期.结论 用特异性探针通过RNA酶保护分析法可以定量测定胞内微生物在宿主细胞内的繁殖量.由本法测定到的普氏立克次体生长曲线表明难以沿用细菌的生长曲线来描述胞内微生物在宿主细胞内的生长过程.
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耐核糖核酸酶病毒样颗粒的构建和表达
目的为耐核糖核酸酶(RNase)的RNA标准品和质控品的表达制备提供1个通用载体平台.方法将MS2噬菌体基因组中成熟酶蛋白和包膜蛋白基因编码序列的1.7 kb cDNA目的片段,用Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ酶切后,用于相同内切酶酶切的表达载体质粒pET28b中,并在T4 DNA连接酶的存在下连接,构建一新的表达载体pI NCCL,再转化BL21-DE3 E.Coli进行原核表达. 结果成功构建出新的表达载体pI NCCL,经原核表达为耐RNase的病毒样颗粒. 结论本研究得到的pI NCCL表达载体及原核表达系统,可作为1个耐RNase的RNA标准品与质控品的构建和制备表达通用载体平台,以促进有关标准品和质控品的研究.
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耐核糖核酸酶内含长片段嵌合体RNA的病毒样颗粒的构建和表达
目的 通过改变原噬菌体ms2包膜蛋白RNA包装位点(19碱基的茎环结构)的数量及亲和力,构建新的原核表达系统,探讨表达内含长片段(达到理论上的1 900 bp)RNA的耐RNase病毒样颗粒的可能性.方法 首先设计含Hind Ⅲ和Not Ⅰ酶切位点的引物,扩增ms2包膜蛋白的编码成熟酶蛋白和衣壳蛋白的1 700 bp序列,并将原来的19mer的包装位点序列改变为C-5变异体(19 bp stem-loop结构中-5位的尿嘧啶改变为胞嘧啶),Hind Ⅲ和Not Ⅰ酶切后,与用同样酶切的表达载体pET-28(b)相连接,得到重组载体pET-ms2-pac.应用重叠PCR扩增3种病毒的5段嵌合体序列(包括3段SARS-CoV基因、一段HCV基因和一段HSN1基因),并在SARS-CoV3和HCV序列之间插入一个19mer的变异体包装位点序列,在设计引物时,使嵌合体两端含有Not Ⅰ酶切位点,与Not Ⅰ酶切的重组载体pET-ms2-pac相连接,构建得到具有2个变异包装位点的表达载体pET-ms2-3V.同时构建3种对照重组表达载体,分别测定N-P3V-pET-P、N-P3V-pET-C、P-3V-pET-P和pET-ms2-3V 4种重组表达质粒表达产物的260 nm吸光度(A260)值,根据公式A160=0.125 mg/ml计算4种表达产物的表达效率.结果 成功构建了4种原核表达载体:pET-ms2-3V、P-3V-pET-P、N-P3V-pET-P和N-P3V-pET-C.pET-ms2-3V和P-3V-pET-P经原核表达后得到含全长为1 891的5段嵌合体RNA的病毒样颗粒;N-P3V-pET-P、N-P3V-pET-C其原核表达产物病毒样颗粒中仅包装了1 200 bp的目的 嵌合体RNA.N-P3V-pET-P、N-P3V-pET-C、P-3V-pET-P和pET-ms2-3V的表达效率分别为0.23、0.35、0.35和0.51 mg/ml.N-P3V-pET-C比N-P3V-pET-P表达效率高52%,而pET-ms2-3V比P-3V-pET-P表达效率高38%.所包装的RNA具有耐RNase和DNase消化的特性以及良好的不同温度条件下的稳定性.结论 通过改变噬菌体ms2 RNA包装位点(19碱基的茎环结构)的数量,可构建能表达内含达到理论上的约1 900 bp外源RNA的耐RNase病毒样颗粒的原核表达载体平台.通过应用包装位点的变异体C-变异体,可以增加病毒样颗粒的表达效率.
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微小核糖核酸调控去乙酰化酶对心肌代谢重构影响的研究进展
心脏需要糖脂代谢产生大量能量维持其高效运转,三磷酸腺苷(ATP)生成障碍可导致心脏功能受损,反之,心脏疾病时糖脂代谢发生重排,因而调控能量平衡极其重要.微小核糖核酸(miRNA)是调控转录后基因表达水平的一类小的非编码RNA,参与多种心血管疾病发生、发展过程,其调控代谢途径的关键环节,参与能量平衡的维持.去乙酰化酶(sirtuin,简称SIRT)利用NAD+作为底物,能够使细胞感受到亚细胞区域的不同能量变化.而且,SIRT表达也由miRNA调控,涉及miRNA功能、乙酰化/去乙酰化重排和代谢改变等一个复杂的调节轴.本文重点介绍miRNA如何调控心肌代谢及miRNA调控SIRT对心肌代谢重构的意义,探讨miRNA作为心肌代谢生物标志物的潜在价值及利用miRNA治疗心血管疾病的相关研究.
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LncRNA-MIAT在肿瘤坏死因子α介导的血管内皮细胞炎症中的表达及作用
目的:体外观察血管内皮细胞(ECs)在肿瘤坏死因子α(TNF-α)刺激下,细胞内长链非编码核糖核酸(LncRNA)心肌梗死相关转录本(LncRNA-MIAT)的表达变化,并探讨LncRNA-MIAT对ECs炎症的调控作用.方法:以TNF-α诱导ECs表达LncRNA-MIAT,采用蛋白质免疫印迹法(Western Blot)、聚合酶链反应(PCR)及实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法分别检测ECs炎症状态下细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和LncRNA-MIAT的表达情况.应用MIAT小干扰核糖核酸(siRNAMIAT)转染ECs细胞,观察LncRNA-MIAT敲低对ICAM-1表达的影响.结果:LncRNA-MIAT随着TNF-α刺激时间的延长与浓度的增高呈上升趋势,刺激24 h、48 h分别与刺激0 h、6 h、12 h比较,LncRNA-MIAT表达量均增多,差异均具有统计学意义(P<0.05);TNF-α刺激浓度为1.000 ng/ml、10.000 ng/ml分别与刺激浓度为0.000 ng/ml、0.125 ng/ml比较,LncRNA-MIAT表达量增多,差异均具有统计学意义(P均<0.05).ECs经siRNAMIAT转染后,TNF-α诱导的ICAM-1蛋白表达被显著抑制(P<0.05).结论:LncRNA-MIAT可能参与血管ECs的炎症反应,并可能起到促炎作用.
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特异性核酸内切酶检测结核分枝杆菌的乙胺丁醇耐药基因突变
目的 探讨Surveyor酶法在结核分枝杆菌耐药基因突变中的应用.方法 采用Surveyor酶法检测结核分枝杆菌临床分离株60株,其中已经测序证实有embB基因突变的乙胺丁醇耐药株45株,无基因突变的敏感株15株.经聚合酶链反应扩增,杂交形成异源双链,Surveyor酶切,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳判断其有无突变存在.结果 15株敏感株均无embB基因突变,45株耐药株均存在embB基因突变热点306位密码子的点突变,其中33株为ATG→GTG,3株为ATG→ATT,5株为ATG→ATA,2株为ATG→ATC,2株为ATG→CTG.经Surveyor酶法测定,45株embB基因突变株均呈现2条带形,15株敏感株均显示1条带形.结论 Surveyor酶法与测序法的结果完全相符.采用Surveyor酶法进行异源双链分析,具有简便、稳定、低耗、灵敏性和特异性高的特点.
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长链非编码RNA PTENP1基因抑制肝癌细胞增殖和迁移
目的：探讨长链非编码RNA（lncRNA）PTEN假基因1（PTENP1）对肝癌细胞增殖和迁移能力的影响及机制。方法合成表达PTENP1的慢病毒载体，分别将LV003-GFP-PTENP1病毒和LV003-GFP空载病毒感染肝癌细胞BEL-7404，构建稳定表达PTENP1肝癌细胞的实验组和对照组。采用CCK-8法和平板克隆实验检测两组肝癌细胞增殖能力和克隆形成能力，划痕实验检测肝癌细胞迁移能力，Western blot法检测p44/42丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、p38 MAPK蛋白表达情况。结果实验组细胞48、72 h的吸光度值A450分别为1.4±0.3、2.3±1.1，明显低于对照组的3.2±1.7、3.4±1.1（t=-5.78，-4.23；P<0.05）。实验组细胞克隆形成数目为（55±12）个，明显低于对照组的（154±45）个（t=-3.98，P<0.05）。实验组划痕实验的细胞迁移率为（21.7±2.6）%，明显低于对照组的（57.7±4.9）%（t=-8.34，P<0.05）。Western blot检测显示，实验组p44/42 MAPK、p38 MAPK蛋白表达较对照组明显下降。结论 lncRNA PTENP1可抑制肝癌细胞的增殖和迁移，其机制可能是通过MAPK信号通路调控。
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siRNA沉默MRP5基因对人肝癌细胞HepG2多药耐药性的影响
目的：探讨siRNA沉默多药耐药相关蛋白（MRP）5基因对人肝癌耐药细胞多药耐药性的影响。方法构建人肝癌耐药细胞HepG2/表柔比星（ADM），合成MRP5-siRNA片段，使用Lipofectamine 2000脂质体转染细胞。实验分3组，siRNA组为HepG2/ADM转染MRP5-siRNA，耐药组为HepG2/ADM细胞，普通组为肝癌细胞HepG2。MTT法检测细胞对化疗药物的敏感性，实时荧光定量RT-PCR检测MRP5基因mRNA相对表达量，Western blot法检测MRP5蛋白表达，流式细胞术检测细胞凋亡情况。多组比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t检验或t检验。结果 siRNA组细胞对ADM、氟尿嘧啶（5-FU）和奥沙利铂（OXA）的半抑制浓度（IC50）分别为（0.180±0.008）、（1.657±0.014）、（0.055±0.007）mg/L，耐药组相应为（0.317±0.035）、（3.785±0.523）、（0.129±0.009）mg/L，普通组相应为（0.022±0.008）、（0.163±0.010）、（0.080±0.012）mg/L，耐药组对3种化疗药物的IC50明显高于普通组（t=14.202，11.993，13.937；P<0.05），siRNA组明显低于耐药组（LSD-t=-6.609，-7.044，-11.257；P<0.05）。siRNA组、耐药组、普通组细胞的MRP5 mRNA相对表达量分别为1.377±0.141、3.858±0.481、1.000±0.374，耐药组较普通组明显升高（LSD-t=9.600， P<0.05），siRNA组较耐药组明显降低（LSD-t=-11.669，P<0.05）。siRNA组、耐药组、普通组细胞MRP5蛋白灰度值分别为816、2245、58，耐药组较普通组明显增强，siRNA组较耐药组明显减弱。siRNA组细胞凋亡率为（25.1±3.7）%，明显高于耐药组的（3.3±0.7）%（t=9.950，P<0.05）。结论MRP5与人肝癌细胞的多药耐药性相关，siRNA沉默MRP5基因可以上调肝癌细胞对化疗药物的敏感性。
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端粒酶特异性核酶抑制宫颈癌细胞的作用
目的:研究端粒酶RNA特异性核酶对宫颈癌细胞活性的影响.方法:通过脂质体将核酶转染至宫颈癌Hela细胞,以G418筛选细胞,经斑点杂交提示转染成功后,检测细胞活力及细胞周期变化,测定细胞端粒酶活性,观察细胞的增殖情况.结果:试验组细胞的活力较对照组明显减弱.转染后细胞受阻于G1期的细胞明显增多,S期细胞比例明显降低,P<0.01.转核酶细胞端粒酶活性较对照组明显减低,转染空载体的细胞端粒酶活性与未转染细胞比较则无明显变化.结论:端粒酶RNA特异性核酶可抑制宫颈癌细胞端粒酶活性,抑制细胞增殖,为核酶用于恶性肿瘤基因治疗提供了试验依据.
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抗端粒酶模板区核酶诱导鼻咽癌细胞凋亡的实验研究
目的:研究端粒酶RNA模板区特异性核酶对人低分化鼻咽癌CNE-2Z细胞增殖、凋亡的影响.方法:用电转染的方法将带有绿色荧光蛋白GFP报道系统的端粒酶核酶基因的真核表达质粒PGFPuro-teloRZ7.1及空载质粒PPAT-GFP导入人低分化鼻咽癌CNE-2Z细胞;检测转染细胞的GFP表达情况、细胞增殖指数及凋亡.结果:CNE-2ZGTR7.1细胞(转染目的基因质粒PGFPuro-teloRZ7.1的CNE-2Z细胞)和CNE-2ZG细胞(转染空载质粒PPAT-GFP的CNE-2Z细胞)有GFP表达,而未转染的CNE-2Z细胞无GFP表达.流式细胞仪检测显示,CNE-2ZGTR7.1细胞增殖指数[(25.100±0.141)%]明显低于CNE-2Z细胞,即未转染的细胞[(53.663±16.981) %]和CNE-2ZG细胞 [(61.575±5.166) %],差异有统计学意义,P<0.01.CNE-2ZGTR7.1细胞传第12代后有凋亡出现,CNE-2Z及CNE-2ZG细胞无凋亡.结论:端粒酶核酶基因的导入使CNE-2Z细胞的增殖能力下降并可诱导CNE-2Z细胞凋亡.端粒酶RNA模板区可以作为鼻咽癌的一个治疗靶点,端粒酶RNA模板区特异性核酶可望成为有效的端粒酶抑制剂,在肿瘤反义核酸治疗的实验研究中发挥作用.
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抗HPV16E6核酶对宫颈癌CaSki细胞顺铂敏感性影响和机制的探讨
目的:研究抗HPV26E6核酶(Ribozyme)对宫颈癌CaSki细胞顺铂敏感性的影响和机制.方法:将抗HPV16E6核酶、空载体质粒分别导入CaSki细胞,命名为CaSki-R、CaSki-P细胞.Northern b1ot、MTT比色法、Annexine/PI双标法、流式细胞术及RT-PCR扩增法分别检测E6基因、顺铂的敏感性、凋亡率、凋亡相关蛋白和基因.结果:CaSki-R表达E6较CaSki-P、CaSki明显降低；与CaSki细胞和CaSki-P细胞比较,CaSkj-R对DDP敏感性分别增加了2.28倍和2.21倍.CaSki、CaSki-P和CaSki-R 3种细胞的凋亡率分别为(18.9±3.5)％、(19.7±4.8)％和(40.4±4.5)％,CaSki-R较CaSki细胞的凋亡率明显增加,P=0.003；DDP作用后CaSki-R细胞的p53蛋白(P=0.000)和Bax蛋白(P=0.002)表达较CaSK细胞明显增加,Bcl-2蛋白(P=0.005)、c-myc蛋白(P=0.005)表达则明显减小；与CaSK细胞比较,CaSki-R细胞表达p53、Bax mRNA明显增加,Bcl-2、c-myc mRNA表达明显减少.结论:转染抗HPV16E6-Ribozyme的CaSki-R细胞对顺铂的敏感性明显增加,p53、Bax蛋白表达增加,Bcl-2和c-myc 蛋白表达减少可能与CaSki-R细胞对顺铂的敏感性增加有关.
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抗肝癌重组免疫毒素对荷人肝癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用
目的:观察二硫键稳定人源化抗肝癌单链抗体(humanized disulfide stabilization single chain antibody, hdsFv)融合牛蛙核糖核酸酶(rana catesbeiana ribonuclease, RC-RNase)重组免疫毒素(hdsFv-RC-RN-ase)对荷人肝癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用.方法:将人肝癌细胞系SMMC-7721细胞接种于裸鼠皮下,建立荷人肝癌裸鼠移植瘤动物模型,随机分为3组,分别经尾静脉注射给予生理盐水、盐酸多柔比星和抗肝癌hdsFv-RC-RNase治疗,疗程为2周.通过测量各实验组裸鼠肿瘤体积及瘤质量变化,绘制肿瘤生长曲线并计算抑瘤率.治疗结束后取各组裸鼠肿瘤组织及重要器官HE染色,光学显微镜下观察.结果:治疗后hdsFv-RC-RNase组与空白对照组相比较,荷人肝癌裸鼠移植瘤生长速度显著减慢,肿瘤体积和瘤质量明显减小,P＜0.01;同样,与盐酸多柔比星组相比较差异有统计学意义,P＜0.01.hdsFv-RC-RNase组和盐酸多柔比星组抑瘤率分别为(78.9±4.1)%和(70.3±6.6)%,P＜0.01.光学显微镜下观察hdsFv-RC-RNase组和盐酸多柔比星组肿瘤组织出现明显坏死,尤以前者更为显著.各实验组裸鼠重要器官未见明显异常.结论:抗肝癌hdsFv-RC-RNase重组免疫毒素对荷人肝癌裸鼠移植瘤生长具有良好的抑制作用.
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人源化抗肝癌scFv融合RC-RNase在大肠埃希菌中的表达及对人肝癌细胞SMMC-7721的体外杀伤作用
目的:在大肠埃希菌中可溶性表达新型重组人源化抗肝癌单链抗体融合RC-RNase(scFv-RC-RNase),观察其对体外培养的人肝癌细胞SMMC-7721的杀伤作用.方法:将原核表达质粒Tih-scFv-RC-RNase以大肠埃希菌E.coli BL21(DE3)为宿主菌,用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达.工程菌经超声碎菌、离心后,上清液用Ni-NTA Agarose亲合层析法进行纯化.四甲基噻唑蓝(MTT)法检测纯化蛋白对体外培养的人肝癌细胞SMMC-7721的体外杀伤作用.结果:IPTG 诱导5 h后,SDS-PAGE显示抗肝癌scFv-RC-RNase在大肠埃希菌 E.coli BL21(DE3) 中主要以可溶性的形式表达,表达量占菌体总蛋白量的10.5%.MTT法提示,纯化后的表达产物对体外培养的人肝癌细胞SMMC-7721具有一定的杀伤作用,其半数致死量(LD50)为0.007 g/L.结论:抗肝癌scFv-RC-RNase融合蛋白有望成为一种具有一定临床应用潜力的抗肝癌导向治疗药物.
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Dicer蛋白的晶体结构及其功能
RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制,为与靶基因的转录产物mRNA存在同源互补序列的内源性或外源性双链RNA(double stranded RNA,dsRNA).
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血管生成素研究进展
血管生成素(angiogenin,ANG)是一种重要的血管生成因子,属于RNase超家族的一员.它的立体结构包含3个功能元件:RNase活性中心、细胞表面受体结合位点和核定位序列.ANG能有效地促进血管新生,并参与调控其他血管生成因子.它还具有RNase活性,故有抑制蛋白合成等作用.ANG促血管生成途径包括:经典的细胞信号转导途径和核转位途径.ANG参与多种生物学过程,特别是肿瘤的增殖与血管新生.
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含轮状病毒NSP3基因病毒样颗粒的构建和表达
目的:通过改变MS2噬菌体衣壳蛋白RNA包装位点的亲和力,构建并表达含轮状病毒NSP3基因耐RNA酶的病毒样颗粒,并探讨其稳定性.方法:设计含Pvu Ⅰ和Kpn Ⅰ酶切位点的上、下游引物,扩增1 049 bp轮状病毒NSP3基因片段,并将包装位点-5位的U替换为C,提高与MS2衣壳蛋白作用的亲和力.用PvuⅠ和Kpn Ⅰ双酶切扩增的目的基因和pACYC-MS2表达载体,连接获得重组载体pACYC-MS2-NSP3,转化TOP10感受态细胞后用PCR验证阳性克隆并测序.阳性克隆转化BL21( DE3)细胞后表达含轮状病毒NSP3基因病毒样颗粒,用超声破碎、纯化获得表达产物,鉴定并讨论其稳定性.结果:成功构建pACYC-MS2-NSP3表达载体并获得了含轮状病毒NSP3基因病毒样颗粒,其可耐受DNA酶和RNA酶的降解,并在-20℃、4℃、室温25℃下10 d保持稳定.结论:通过改变MS2噬菌体衣壳蛋白RNA包装位点的亲和力,可以成功构建耐RNA酶的病毒样颗粒,本研究所构建的病毒样颗粒具有耐RNA酶的特性和良好的稳定性,为轮状病毒实时荧光定量逆转录-PCR的标准品和质控品的研究提供了一个可行的方法.
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CRISPR基因编辑技术在肿瘤研究中的应用
自2013年研究人员第一次展示成簇的规律间隔的短回文重复序列( clustered regularly interspaced short palindromic repeat, CRISPR)基因编辑技术在真核细胞基因编辑方面的巨大潜力之后,近几年在生物研究的各领域产生了革命性影响. 在肿瘤研究方面,从基础研究到临床研究,再到转化医学的应用,CRISPR 基因编辑技术均显示出强大的生命力和广泛的应用前景. 为此,本文对CRISPR 基因编辑技术在肿瘤研究方面的应用进行综述,以期为肿瘤研究者提供资料.
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微小核糖核酸在心肌梗死后的作用及机制研究进展
微小核糖核酸(microRNAs, miRNAs)是一类基因编码长度约22个核苷酸的非编码单链核糖核酸分子,参与调控转录后基因表达。通过与目的基因翻译结合抑制靶基因,从而调控蛋白质的表达,调节生理稳态,并参与包括心脏病、肌营养不良、糖尿病等多种疾病的发生和调节。目前 miRNAs 已成为分子生物学研究热点,通过对13个物种的检测发现14197种 miRNAs 前体,可修饰成熟 miRNAs 的15632种。随着 miRNAs 与缺血性心肌病的关系研究逐渐深入,作为一种常见的缺血性心脏病,心肌梗死后 miRNA 与心肌损伤、心肌保护及修复的作用及其机制成为研究热点。本文将对该领域的研究进展进行综述。
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壳聚糖纳米载体材料性能对抗乙肝免疫核糖核酸免疫活性的影响
背景:近年来抗乙肝免疫核糖核酸作为一种免疫治疗剂,对慢性肝炎的治疗作用备受重视,但临床应用效果不稳定,因此构建一个能有效保护免疫核糖核酸并能被组织更好吸收的免疫核糖核酸运载体系具有重要意义.壳聚糖作为一种新辅料取得了良好的效果.目的:制备抗乙肝免疫核糖核酸的壳聚糖纳米载体,观察其免疫活性.方法:实验于2003-12/04-12在华中科技大学同济医学院环境医学研究所完成.①制备壳聚糖-免疫核糖核酸纳米粒采用复凝聚方法.②壳聚糖-免疫核糖核酸纳米粒形态、粒径和表面电位测定采用扫描电镜、原子力显微镜、Zeta电位/粒度分析仪观察.③壳聚糖对包裹的免疫核糖核酸的保护作用观察采用核糖核酸酶保护试验.④壳聚糖-免疫核糖核酸纳米粒免疫活性采用白细胞黏附抑制试验测定.体内白细胞黏附抑制指数测定:取小白鼠30只,随机分4组,生理盐水组5只、壳聚糖组5只、壳聚糖-免疫核糖核酸纳米粒组10只和免疫核糖核酸组10只.腋下和腹股沟皮下分别多点注射生理盐水、壳聚糖、壳聚糖-免疫核糖核酸纳米粒和免疫核糖核酸溶液后,无菌取出小鼠脾脏,制成单细胞悬液,加入乙肝疫苗和小牛血清1640液及实验试剂,单纯脾细胞悬液作为对照,根据公式[(对照孔A值-实验孔A值)/对照孔]×100%计算黏附抑制指数.体外白细胞黏附抑制指数测定:取健康小鼠1只,制备脾细胞悬液,于培养孔板中加入健康小鼠脾细胞悬液、乙肝疫苗、壳聚糖-免疫核糖核酸纳米粒或免疫核糖核酸溶液或壳聚糖,对照孔不加乙肝疫苗,测定方法同上.结果:①壳聚糖-免疫核糖核酸纳米粒的物理特性:新鲜制备的壳聚糖-免疫核糖核酸纳米粒多呈球形,放置时间在48 h以内形态较稳定,但粒径略有增大,放置时间超过72 h以后肉眼可见液体中有絮状物析出.Zeta电位/粒度分析仪测定放置3,24,48,72 h的壳聚糖-免疫核糖核酸纳米粒的平均粒径分别为132.60,138.46,167.28,486.24 nm,平均表面电位为+12.8,+12.5,+10.59,+3.86 mV.②壳聚糖-免疫核糖核酸纳米粒的酶保护试验结果:由于壳聚糖与免疫核糖核酸形成了复合物,免疫核糖核酸未被核糖核酸酶降解.当减少壳聚糖-免疫核糖核酸纳米粒量而加大核糖核酸酶量,免疫核糖核酸部分得到保护,部分被核糖核酸酶降解.③壳聚糖-免疫核糖核酸纳米粒免疫活性:体内白细胞黏附抑制试验结果纳米粒组显著高于其他3组(34.51±13.25,-5.50±8.78,5.87±2.06,12.39±6.51,P＜0.01),免疫核糖核酸组显著高于壳聚糖和生理盐水组(P＜0.05).体外白细胞黏附抑制试验壳聚糖-免疫核糖核酸纳米粒白细胞黏附抑制率高于免疫核糖核酸和壳聚糖的黏附抑制指数(31.00%,6.55%,7.12%)结论:壳聚糖纳米粒可以有效的保护免疫核糖核酸,提高抗乙肝免疫核糖核酸的利用率和免疫活性,其保护作用与核糖核酸酶呈剂量效应关系.
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食品中金黄色葡萄球菌的PCR检测
目的:建立检测食品中金黄色葡萄球菌的PCR方法并将PCR方法与传统方法进行比较,评价PCR方法的检测效果.方法:采用PCR方法特异性扩增金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶编码基因(nuc基因),分别采用PCR方法和国家标准规定的方法检测180份吉林省各地区的抽检食品样品.结果:所检金黄色葡萄球菌在422 bp处出现nuc基因目的片段;食品样品传统方法检出阳性42份,PCR方法检出45份,PCR检测方法与国标法检出阳性率比较,差异无显著性(P＞0.05).结论:PCR方法检测食品中金黄色葡萄球菌较传统方法更快速和简便,且具有较高的特异性和敏感性,可作为食品中金黄色葡萄球菌快速检测的手段.
