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成人肺癌切除组织和支气管切缘p53基因突变及端粒酶活性表达的研究
目的探讨肺癌切除组织和支气管p53基因突变及端粒酶活性表达,并对肺癌切除后的效果进行了评价.方法用PCR-SSCP方法,检测60例肺癌和10例肺良性肿瘤手术切除标本的支气管切缘(切缘病理切片无癌细胞残留)的p53基因突变及端粒酶活性的表达.结果在60例肺癌中有16例(26.7%)肺癌支气管切缘和30例(50.0%)肺癌组织存在p53基因突变及端粒酶活性阳性表达.肺癌切除组织基因突变及端粒酶活性表达为小细胞癌(100%)高,次为鳞癌(70%)、腺鳞癌(60%)、腺癌(40%).p53基因突变及端粒酶活性表达与TNM分期有关.Ⅲ期(72.7%)高,其次为Ⅱ期(58.3%),Ⅰ期(25.5%).术后随访3～8个月支气管切缘p53基因突变及端粒酶活性表达,10例(62.5%)发生支气管残端复发转移.而p53及端粒酶阴性者术后无残端癌复发.肺癌组织p53及端粒酶阳者中有20例(66.7%)在随访中发现癌复发转移,而p53及端粒酶阴性者中未发现癌复发转移.结论检测支气管切缘p53基因突变及端粒酶活性表达,作为肺癌切除后的"分子边界",可作为早期预测肺癌术后残端复发重要依据.
关键词： 肺肿瘤 支气管切缘p53基因 端粒 末端转移酶 -
茶多酚、茶色素对人肝癌细胞株HepG2端粒酶活性的影响
目的利用人肝癌细胞株HepG2观察茶多酚和茶色素对端粒酶活性的影响.方法采用TRAP-PCR-ELISA方法对HepG2细胞端粒酶活性进行定性和定量检测.结果 TRAP-PCR定性分析表明空白对照组、茶多酚组和茶色素组均端粒酶阳性;ELISA定量结果显示,50 mg/L和100 mg/L茶多酚组端粒酶活性(A450～690值)分别为1.56和1.46;50 mg/L和100 mg/L茶色素处理组为1.55和1.49,与空白对照组(A450～690值为2.11)相比,茶多酚和茶色素处理后HepG2细胞端粒酶活性有统计学意义.结论茶多酚和茶色素显著抑制HepG2细胞端粒酶活性,端粒酶活性可能是癌症化学预防研究的一个有用的生物标志物.
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温石棉诱发人胚肺细胞恶性转化中端粒酶的作用
目的研究端粒酶在石棉诱发人胚肺成纤维细胞恶性转化中的作用.方法将端粒酶基因功能片段(hTERT)导入人胚肺成纤维细胞(HELF)中.选用2.5 μg/cm2温石棉粉尘分别对导入和未导入hTERT的HELF进行染毒,分离转化灶,观察细胞生物性状,测定细胞生长曲线、端粒酶活性和端粒长度,进行软琼脂集落形成实验,判定转化性质.结果将hTERT成功导入HELF,建立了导入端粒酶功能片段的人胚肺成纤维细胞系(HELF-T+).HELF和HELF-T+被石棉刺激后均发生了恶性转化,HELF-T+恶性转化率为(2.08±1.08)转化灶/皿,显著高于HELF染毒组的恶性转化率[(1.08±0.10)转化灶/皿].恶性转化的细胞和HELF-T+均具有较高的端粒酶活性和较长的端粒长度.结论端粒酶活性较高、端粒长度较长的细胞,经石棉刺激后恶性转化率也较高,表明端粒酶在石棉诱导细胞发生恶性转化的过程中发挥了重要作用.
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端粒酶逆转录酶基因多态性与中国人群肝细胞肝癌遗传易感性的关系
目的 探讨端粒酶逆转录酶(TERT)基因多态性与中国人群乙型肝炎病毒阳性肝细胞肝癌(HCC)易感性的关联.方法 采用病例-对照研究设计,以经确诊的1300例乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阳性HCC患者作为病例组,同时选取1344例HBsAg阳性人群作为对照组.选取TERT基因rs2736098和rs2736100为研究位点,应用TaqMan探针法进行多态性检测,并用logistic回归计算OR值(95%CI),比较不同基因型与HCC发病风险的关系.结果 rs2736098 位点3种基因型GG、AG及AA在病例组分布频率分别为39.3% (500/1273)、44.2% (563/1273)及16.5%(210/1273);在对照组中分别为39.6% (526/1328)、45.5% (604/1328)及14.9% (198/1328).rs2736100位点3种基因型AA、AC及CC在病例组分布频率分别为33.7% (428/1269)、49.9% (633/1269)及16.4% (208/1269),在对照组中分别为34.0% (449/1322)、49.2% (651/1322)及16.8% (222/1322).多因素logistic回归分析显示,在调整年龄、性别、吸烟和饮酒因素后,携带至少1个rs2736098位点突变等位基因A的个体与携带GG基因型的个体相比,HCC发病风险差异无统计学意义[AA+AG对GG:调整OR=1.00(95%CI:0.86～1.18)];与携带AA基因型个体比较,携带至少1个rs2736100位点突变等位基因C的个体HCC发病风险差异无统计学意义[AC+CC对AA:调整OR=1.03(95%CI:0.87～1.22)].结论 TERT基因rs2736098和rs2736100多态改变可能不是中国人群HCC易感性标志物.
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SYBR Green染色法检测肺癌及癌旁组织端粒酶活性
目的研究TRAP-SYBR Green染色法定性检测端粒酶活性的方法及端粒酶活性在肺癌及癌旁组织中的表达,并探讨端粒酶的表达与P53之间可能的关系.方法采用TRAP-SYBR Green染色法检测36例肺癌、36例癌旁组织、8例肺部良性病变组织和A549肺腺癌细胞株端粒酶活性的表达,并利用免疫组化技术检测肺癌组织P53蛋白表达水平.结果 TRAP-SYBR Green染色法可检测出5个A549肺腺癌细胞所表达端粒酶活性.83.3%(30/36)的肺癌组织,3/8肺部良性病变组织,19.4%(7/36)的癌旁组织表达端粒酶活性.端粒酶活性的表达与肺癌组织的病理类型、肿瘤大小、临床分期无相关性.在30例表达端粒酶活性的肺癌组织中P53呈现过度表达的占80%(24/30),端粒酶活性与P53蛋白表达水平之间具有相关关系.结论 TRAP-SYBR Green染色法是一种较为灵敏、快速、简便的定性检测端粒酶活性的方法;端粒酶活性的定性检测可作为肺部恶性肿瘤诊断的辅助指标之一;端粒酶与P53之间的关系有待进一步阐明.
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稀土暴露对人外周血单个核细胞端粒酶及细胞凋亡的影响
目的探讨稀土暴露对正常人外周血单个核细胞的端粒酶活性及细胞凋亡的影响.方法选取我国大的离子吸附型稀土矿江西省寻乌县稀土矿区矿工(一线作业8年以上)30名健康成人为调查对象,同时选取地质结构和社会经济特征基本相同的离矿区35 km外的寻乌县另一村居民30名健康成人作为对照.运用电感耦合等离子体-质谱法对随机选取的暴露组和对照组进行血稀土含量测定.端粒酶重复扩增法和流式细胞仪检测稀土暴露和正常人群的单个核细胞端粒酶活性和细胞凋亡以及细胞周期变化.结果血稀土含量镧(La)暴露组为(1.268 5±1.070 5)μg/L,对照组(0.171 7±0.206 1)μg/L.暴露组与对照组比较La、铈(Ce)、镝(Dy)、钇(Y)、镨(Pr)、钕(Nd)、钐(Sm)、钆(Gd)、镱(Yb)具有统计学意义;暴露组的总血稀土含量与对照组相比有统计学意义.端粒酶活性检测结果阳性率暴露组为37.0%(11/30),对照组为16.7%(5/30),两组比较有统计学意义.暴露组平均年龄为(38.69±8.02)岁,对照组平均年龄为(40.45±9.02)岁,两组年龄无统计学意义.端粒酶活性与血总稀土含量有高度相关性.暴露组和对照组外周血单核细胞的凋亡率比较,没有统计学意义,但在细胞周期分析中,暴露组与对照组相比S期和G2-M期细胞明显增多.结论可观察到在暴露水平下的接触人群稀土暴露能提高外周血单个核细胞端粒酶活性,对细胞凋亡没有影响,能促进二倍体DNA的复制及蛋白质合成,使进入S期和G2/M期细胞比例增加.
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口腔鳞癌中人端粒酶反转录酶、p53和MIB-1的表达及其临床意义
目的 探讨人端粒酶反转录酶(hTERT)、p53和MIB-1蛋白在口腔鳞癌组织中的表达及临床意义.方法 采用Envision免疫组织化学染色方法(IHC)检测20例口腔黏膜普通型增生、35例非典型增生(轻度10例、中度10例和重度15例)以及50例不同分化程度(高分化15例,中分化20例,低分化15例)的口腔鳞状细胞癌(OSCC)中hTERT、p53和MIB-1的表达.结果 hTERT、p53和MIB-1在口腔黏膜普通型增生、非典型增生及不同分化程度的OSCC均有不同程度表达.OSCC表达阳性率[中分化鳞癌hTERT:60％( 12/20)]高于普通型增生[hTERT:10％(2/20)]及非典型增生[中度非典型增生hTERT:30％(3/10)].分化程度低的OSCC表达阳性率[hTERT:66.7％(10/15)]显著高于分化程度高者[hTERT:46.7％(7/15)].结论 hTERT、p53和MIB-1在口腔OSCC发生、发展过程中起重要作用,并与OSCC的分化程度密切有关,可能是OSCC的较好预后指标.
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端粒酶逆转录酶和c-myc基因在子宫内膜样癌及子宫内膜增生中的表达
目的探讨端粒酶逆转录酶(hTERT)及c-myc基因在子宫内膜增生及癌变过程中的作用、意义及二者相关性.方法所用标本包括14例子宫内膜单纯增生,8例复合增生,10例不典型增生,42例内膜样癌,用原位杂交法检测hTERT和c-myc mRNA表达.结果 (1) hTERT在子宫内膜单纯、复合、不典型增生病变和内膜样癌中阳性结果分别2/14、4/8、8/10和92.9% (39/42),前两组均为弱阳性表达,后两组多为中度和强阳性,统计分析表明不典型增生病变和内膜样癌中hTERT表达高于单纯和复合增生(P<0.05).c-myc在子宫内膜单纯、复合、不典型增生病变和内膜样癌中阳性结果分别3/14、1/8、5/10和54.8%(23/42),后两组c-myc阳性率显著高于前两组 (P<0.05);不典型增生病变的c-myc阳性水平高于单纯及复合增生(P<0.05) . (2) hTERT阳性水平与内膜样癌分化相关(P<0.15);c-myc阳性率随内膜样癌浸润深度增加而递增 (P<0.05).(3)子宫内膜增生和内膜样癌各组中 hTERT与c-myc表达均不相关(P>0.05).结论 hTERT及c-myc 基因过表达与子宫内膜不典型增生及恶性转化相关,并与内膜样癌演进以及不良预后有关,但其两者表达之间无相关性.
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端粒酶转录酶及其调节相关蛋白与增殖细胞核抗原在卵巢上皮性肿瘤中的表达及临床意义
目的探讨端粒酶转录酶(hTERT)及端粒酶调节相关蛋白(TRAP)与增殖细胞核抗原(PCNA)在卵巢上皮性肿瘤中的表达和临床意义.方法收集106例卵巢上皮性肿瘤(恶性54例,交界性33例,良性19例)的临床资料,行hTERT、TRAP和PCNA 3种抗体的免疫组织化学标记链霉素卵白素生物素(LSAB)法染色.对87例恶性和交界性患者进行了随访,45例获结果,随访时间为2～60个月.结果 hTERT蛋白的表达在良性(4/19)和交界性(90.9%,30/33)以及良性和恶性(94.4%,51/54)间的差异均有显著性(P均<0.001),TRAP蛋白的表达在良性(4/15)和恶性(77.8%,28/36)间的差异有显著性(P<0.001);hTERT和TRAP蛋白的表达在卵巢癌Ⅰ、Ⅱ期和Ⅲ、Ⅳ期两组病例中的差异均无显著性(P>0.05,P>0.3).PCNA的表达在良性(6.9±5.9)%和交界性(26.4±17.8)%、良性和恶性(51.8±22.1)%以及交界性和恶性间的差异均有显著性(P<0.01,P<0.001,P<0.05).33例交界性患者全部存活,54例恶性患者中35例(64.8%)有转移(包括5例淋巴结转移),4例(7.4%)死亡.结论 hTERT和TRAP蛋白的表达与卵巢上皮性肿瘤的良恶性有关, 但与其临床分期无关;hTERT和TRAP蛋白的表达相似,推测TRAP可能是一个新发现的肿瘤相关基因.端粒酶活性与PCNA呈正相关.
关键词： 卵巢肿瘤 端粒 末端转移酶 RNA指导的DNA聚合酶 增殖细胞核抗原 -
胶质瘤细胞ING1、人端粒酶逆转录酶及人端粒酶相关蛋白1基因表达的研究
目的探讨胶质瘤细胞ING1、人端粒酶逆转录酶(hTERT)和人端粒酶相关蛋白1(hTP1)基因表达的意义.方法用mRNA原位杂交及免疫组织化学染色方法观察了70例不同级别的人胶质瘤组织.结果 hTERT mRNA和蛋白的阳性表达率分别为88.6%和82.9%,hTP1 mRNA和蛋白的阳性表达率均为100%,这4种阳性肿瘤细胞的密度彼此间均呈正相关(r=0.758～0.882, P<0.000 5),并均随肿瘤级别升高而相应增加(P<0.05～0.01).ING1 mRNA和蛋白的阳性表达率分别为94.3%和88.6%,两种阳性肿瘤细胞密度间也呈正相关(r=0.831, P<0.000 5),但两者均随肿瘤级别升高而相应减少(P<0.01),并均分别与hTERT mRNA和蛋白及hTP1 mRNA和蛋白的阳性肿瘤细胞密度呈负相关(r=-0.211～-0.384,P<0.05～0.001).结论胶质瘤细胞中hTERT和 hTP1基因表达异常增加可能是抑制其ING1基因表达的重要因素,这3种基因的表达异常可能在胶质瘤发生及恶性进展过程中起重要作用.
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云南个旧、宣威地区肺癌端粒酶hTR检测分析
目的探讨云南个旧、宣威地区肺癌端粒酶hTR的表达及与其发病机理的关系.方法用原位杂交方法检测端粒酶hTR在上述两地肺癌中的表达情况.其中个旧矿工肺癌24例,宣威农民肺癌36例,其他地区肺癌21例.结果 81例肺癌中hTR阳性率为65.4%(53/81),其中个旧矿工肺癌66.7%(16/24),宣威农民肺癌58.3%(21/36),其他地区肺癌76.2%(16/21).癌旁正常支气管上皮和肺泡上皮中未检出hTR,而在部分病例(12.3%,10/81)的癌旁增生肺泡Ⅱ型上皮中检测出hTR.3个地区hTR的表达阳性率未见显著性差异(P＞0.05).hTR的表达与性别、年龄及组织分化程度无关(P＞0.05),与组织学类型及淋巴结转移有关(P＜0.05).结论端粒酶hTR的表达在3个地区肺癌中具有普遍性,可作为肺癌标志物.
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鼻咽上皮癌变过程中端粒酶活性和端粒酶RNA的表达
目的研究二亚硝基哌嗪（DNP）诱发大鼠鼻咽癌变过程中端粒酶的表达规律。方法以DNP诱导大鼠鼻咽癌；用PCR-ELISA 和Nested RT-PCR检测DNP诱导大鼠鼻咽癌变不同阶段端粒酶活性和端粒酶RNA的表达，同时作病理形态学检测。结果 DNP诱导大鼠鼻咽癌变过程中，端粒酶活性不断升高，端粒酶的变化与鼻咽癌变呈正相关，而且端粒酶中RNA表达先于端粒酶的表达。在大鼠鼻咽上皮细胞异型增生阶段即出现端粒酶的激活和端粒酶RNA的表达。结论化学致癌物DNP诱导细胞癌变端粒酶的激活，且端粒酶的激活和端粒酶RNA的表达是鼻咽上皮癌变的早发事件，与鼻咽癌的发生、发展有关。
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端粒酶基因在乳腺导管不典型增生中的表达
目的探讨端粒酶基因与乳腺导管不典型增生恶性转化的关系及其作用.方法应用原位杂交方法检测端粒酶基因hTR和hTRT在50例乳腺导管增生组织(其中单纯性增生6例,轻度不典型增生9例,中度不典型增生12例、重度不典型增生23例)及26例乳腺癌中的表达.结果在乳腺导管单纯性增生组织中hTR、hTRT mRNA 呈弱表达(1/6)和阴性.在乳腺导管轻、中度不典型增生组织中hTR、hTRT mRNA呈弱表达(2/9、1/9;4/12、3/12),在乳腺导管重度不典型增生组织中hTR、hTRT mRNA表达增强(14/23,60.9%,12/23,52.1%),在乳腺癌组织中端粒酶基因hTR、hTRT mRNA呈较强阳性表达(23/26,88.5%;21/25,80.8%).乳腺导管重度不典型增生组织中的端粒酶基因表达与在轻、中度不典型增生、浸润性导管癌组织中的表达比较差异有显著性意义(P＜0.05),但与导管内癌表达差异无显著性意义(P＞0.05).结论端粒酶基因hTR、hTRT的表达与乳腺导管不典型增生细胞的恶性转化密切相关,端粒酶的重新激活可能在乳腺癌的组织发生中起关键性作用.
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弥漫浸润性胶质肿瘤中TERT和IDH突变联合分析的预后价值
目的 探讨弥漫浸润性胶质肿瘤中端粒酶逆转录酶(TERT)及异柠檬酸脱氢酶(IDH)基因热点突变情况及二者结合的预后价值.方法 采用Sanger测序法检测四川大学华西医院2012至2014年手术的236例胶质瘤标本(WHOⅠ～Ⅳ级肿瘤分别为16、89、72和59例)中TERT基因启动子区(228位点和250位点)、IDH1(132密码子)和IDH2(172密码子)突变情况,分析这些突变与患者预后的关系.结果 WHOⅠ级16例毛细胞型星形细胞瘤中均未检出IDH和TERT基因突变.WHOⅡ～Ⅳ级的220例弥漫浸润性胶质肿瘤中,年龄≥40岁患者TERT突变比例(60.8％,93/153)明显高于<40岁患者(32.8％,22/67;P<0.01),少突胶质瘤中TERT突变率(87.5％,56/64)明显高于星形细胞瘤(37.8％,59/156;P<0.01).年龄<40岁、IDH1突变和少突胶质瘤为弥漫浸润性胶质肿瘤预后好的因素.TERT突变不能单独提示胶质瘤预后.TERT和IDH1突变联合检测可将弥漫浸润性胶质瘤分为4个分子亚组:IDH(+)/TERT(+)组、IDH(+)/TERT(-)组、IDH(-)/TERT(-)组和IDH(-)/TERT(+)组,4组间具有明显预后差异,IDH(+)/TERT(+)组患者预后好,IDH(-)/TERT(+)组患者预后差.结论 IDH和TERT基因突变状态可细化胶质瘤患者预后分组,特别是可将IDH1野生型的病例进一步进行预后亚组划分,具有较好的临床应用价值.
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胃癌细胞凋亡与巨噬细胞浸润的关系及其意义
有研究表明细胞凋亡与肿瘤发生、发展及治疗有关,有资料证实多种基因参与了细胞凋亡调控[1,2].我们应用原位DNA末端转移酶标记法(TUNEL)和免疫组织化学技术,就细胞凋亡与巨噬细胞浸润的关系进行研究,为胃癌治疗和预后预测提供帮助.
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叠氮胸苷对人胶质母细胞瘤细胞株端粒酶活性、增殖和凋亡的影响
目的 探讨叠氮胸苷(AZT)对TJ905 人胶质母细胞瘤细胞株端粒酶活性、增殖和凋亡的影响及其机制.方法 体外培养TJ905细胞分别经50、100及200 μmol/L叠氮胸苷处理24 h后,用端粒重复扩增法检测端粒酶活性及集落形成效率;继续培养并维持相应叠氮胸苷浓度,取第1、3和6代细胞,利用Western blot检测cyclin A表达水平,用流式细胞术检测细胞周期分布并结合单细胞凝胶电泳检测细胞凋亡,用Ki-67免疫细胞化学染色检测细胞增殖活性.结果 叠氮胸苷可抑制TJ905细胞的端粒酶活性.50和100 μmol/L组cyclin A表达水平均显著低于对照组(P<0.01),并均呈时间和剂量依赖性降低.三个用药组的Go/G1期细胞均显著少于对照组(P<0.05～0.01),S期细胞均显著多于对照组(P<0.05～0.01);在各用药组第1代GO/G1期细胞减少和S期细胞增加均呈剂量依赖性;各用药组S期细胞增加均呈显著的时间依赖性,而Go/G1期细胞减少仅在50 μmol/L组呈时间依赖性.各用药组第1和6代的凋亡细胞数均显著多于对照组(P<0.05～0.01);各用药组第6代的凋亡细胞数随用药浓度升高而相应增加(P<0.05～0.01),且均多于同浓度组的第1和第3代(P<0.05～0.01).各用药组集落形成效率及Ki-67阳性细胞数均显著低于对照组(P<0.01),二者还随用药浓度增加和(或)作用时间延长相应减少.对照组各代间以上各指标的差异均无统计学意义(P>0.05).结论 叠氮胸苷可通过抑制端粒酶活性抑制TJ905细胞cyclin A表达,阻止该细胞从S期向G2期过渡,发挥其抑制增殖和诱导凋亡的作用.
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抗人端粒酶蛋白亚基单域抗体制备和鉴定
目的研制抗人端粒酶逆转录酶(hTERT)蛋白亚基单域重组抗体.方法以重组His-tag h TERT融合蛋白为抗原免疫小鼠,以逆转录-聚合酶链反应( RT-PCR)扩增小鼠脾细胞重链可变区;经克隆噬菌粒载体pCANTAB 5E及转染大肠杆菌建立噬菌体抗体展示文库, 经过亲和性富集选择阳性克隆,并于大肠杆菌(E.coli.HB2151)中表达为可溶性单域抗体; Western blot确定单域抗体结合特性.结果以RT-PCR扩增His-tag hTERT 免疫小鼠脾细胞RNA,得到35 0 bp小鼠重链可变区DNA片段;通过克隆及转染制备出噬菌体展示抗体文库, 文库大小是 8×104; 经过抗原-抗体亲和性筛选,得到4个克隆,并表达为可溶性单域抗体 (相对分子质量16 000) ;Western Blot分析显示:其中2个克隆的可溶性单域抗体可特异性结合His-tag hTERT融合蛋白(相对分子质量16 700),与His -tag无关;与人癌细胞表达的天然hTERT蛋白(相对分子质量127 000)分析亦显示其特异性结合能力.DNA序列分析证实可溶性单域抗体为小鼠抗体重链可变区VH基因编码.结论利用噬菌体展示技术已初步制备出小鼠重链可变区编码的抗hTERT蛋白的特异单域抗体,为进一步探索其抑制端粒酶活性及抗肿瘤作用奠定了基础 .
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人端粒酶hTERT抗体制备、鉴定及在肿瘤检测中的应用
目的人端粒酶蛋白亚基(hTERT)单克隆抗体制备及肿瘤检测应用.方法利用多肽固相合成法(Fmoc法)合成hTERT抗原多肽,免疫BALB/c小鼠,以杂交瘤法制备单克隆抗体.应用ELISA,Western blot和免疫组织化学ABC法进行鉴定和肿瘤检测.结果经合成得到hTERT抗原多肽hTERT9,免疫小鼠及细胞融合后得到抗hTERT9杂交瘤细胞;经3次有限稀释法及ELISA筛选获得抗hTERT9单克隆抗体的杂交瘤细胞H4、G8和A11;H4、G8为IgM类,而A11为IgG1.半抗原竞争性抑制实验证明为hTERT9特异性单克隆抗体;相对亲和力实验发现G8株亲和力较H4株和A11株强.用H4及G8 株单克隆抗体检测HeLa、293细胞,免疫印迹有特异相对分子质量≈123 000 hTERT条带,免疫组织化学显示为细胞核着色,而正常细胞2BS无阳性反应.免疫组织化学方法检测人癌组织、癌前病变、良性病变hTERT表达发现:人肿瘤组织细胞阳性率为80.31%(102/127),且大多为中度阳性和强阳性;癌前病变中,hTERT有17.5%(7/40)弱阳性;良性肿瘤均为阴性.统计学分析表明:hTERT在癌组织的表达显著高于癌前及良性病变(P<0.01).结论通过固相合成hTERT抗原多肽和杂交瘤技术成功制备抗人端粒酶蛋白亚基hTERT单克隆抗体,并能运用于免疫印迹、免疫组织化学对癌细胞及组织的hTERT表达检测.
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DNA损伤剂诱导端粒酶调节相关hALP基因表达及作用研究
目的确定端粒酶调节相关hALP基因对细胞DNA损伤的反应和作用.方法以DNA损伤剂H2O2和顺铂处理人HeLa、Hep2细胞,运用定量逆转录-聚合酶链反应和免疫荧光观察hALP 基因表达的改变,并以荧光素酶报告基因法测定hALP基因启动子活性变化. 通过四甲基偶氮唑盐(MTT)法分析不同hALP基因表达状态下DNA损伤剂对细胞生长的影响.结果 0.2～1.6 mmol/L H2O2可诱导hALP mRNA水平升高,当浓度为0.4 mmol/L时,hALP mRNA水平高;以0.4 mmol/L H2O2处理细胞6 h即可观察到hALP mRNA水平显著升高,并在36 h内保持高水平.顺铂处理细胞也可以上调hALP的mRNA表达,并呈一定的剂量和时间依赖性.免疫荧光检测发现:在0.2或0.4 mmol/L H2O2、0.2或0.5 μmol/L 顺铂处理细胞12 h后,hALP的表达水平升高,并且多聚集于细胞核.H2O2和顺铂处理细胞时可通过hALP基因启动子-705 ～ +20 nt区域的序列上调其启动子转录活性.H2O2(0.4 mmol/L)或顺铂(0.5 μmol/L)处理HeLa细胞时,表达正义hALP基因的细胞生长仍活跃,而表达反义hALP基因和对照组细胞则生长相对缓慢.结论 DNA损伤可通过激活hALP基因启动子转录活性而上调其表达,hALP基因的表达可以增强细胞对H2O2和顺铂损伤的抵抗性.
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丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3对端粒酶活性的影响
目的研究丙型肝炎病毒非结构区3(HCV NS3)蛋白对端粒酶活性的影响,以探讨HCV NS3蛋白在HCV致癌中的作用,并观察端粒酶活性原位检测法的应用价值.方法利用HCV NS3真核细胞表达质粒pRcHCNS3-5′(表达HCV NS3 N端多肽),pRcHCNS3-3′(表达HCV NS3C端多肽)和空白质粒pRcCMV转染NIH3T3细胞,分别获得11、11和8个阳性克隆;采用链霉素抗生物素-过氧化物酶法(SP)免疫组织化学方法检测转染的NIH3T3细胞中HCV NS3蛋白表达,并通过端粒酶活性原位检测法和端粒酶聚合酶链反应(PCR)酶联免疫吸附反应(ELISA)技术分别检测转染前后NIH3T3细胞端粒酶活性的定位和定量变化.结果 HCV NS3表达质粒pRcHCNS3-5′或pRcHCNS3-3′转染的NIH3T3细胞均表达HCV NS3蛋白,HCV NS3蛋白阳性信号均位于细胞质中,并以前者表达的阳性信号为强(χ2=6.667,P<0.05),各组细胞端粒酶活性存在显著差异(F=143.083,P<0.01),其中质粒pRcHCNS3-5′转染的NIH3T3细胞端粒酶活性强,11个克隆均呈阳性,质粒pRcHCNS3-3′转染的细胞次之(P<0.05),空白质粒pRcCMV转染细胞和未转染NIH3T3细胞弱;HCV NS3蛋白的表达水平和端粒酶活性强度之间具有显著相关性(rs=0.808 4,P<0.01);采用端粒酶活性原位检测方法和端粒酶PCR ELISA技术检测结果具有较好的一致性(rs=0.501 96,P<0.01).结论 (1) HCV NS3蛋白可能是通过内源性机制激活细胞端粒酶导致宿主细胞恶性转化;(2) HCV NS3蛋白 N端多肽对宿主细胞端粒酶的激活作用强于C端多肽;(3) 进一步证实端粒酶活性原位检测法是一种适合于病理形态与功能研究的技术.
