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端粒酶基因反义核酸促进顺铂诱导白血病细胞凋亡
目的探讨人类端粒酶逆转录酶(hTERT)基因反义寡核苷酸(ASODN)对顺铂诱导原代培养的急性髓细胞白血病(AML-M2)、慢性髓细胞白血病(CML)细胞凋亡的影响.方法采用锥虫蓝拒染法观察hTERT ASODN与顺铂联合对AML、CML细胞生存的影响.琼脂糖凝胶电泳分析细胞凋亡的DNA断裂;通过流式细胞仪对细胞凋亡峰进行定量分析.结果hTERT基因ASODN作用于AML、CML细胞24 h再加入顾铂对AML、CML细胞的生存均具有很明显的抑制作用,分别同正义寡核苷酸(SODN)联合顺铂组、单用顺铂组进行比较,差异有显著性(P＜0.01).hTERT ASODN作用于AML、CML细胞24 h再加入顺铂,经琼脂糖凝胶电泳即可见到DNA梯形条带,并且凋亡细胞百分率(42.68%,35.72%)分别与SODN联合顺铂组(29.02%,23.84%)、单用顺铂组(27.53%,21.02%)进行比较,差异有显著性(P＜0.01).结论hTERT基因反义寡核苷酸可促进顺铂诱导AML、CML细胞凋亡.
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多发性骨髓瘤中端粒酶的动态研究
目的研究端粒酶在多发性骨髓瘤(MM)发生发展中所起的作用及探讨端粒酶与细胞周期的相关性.方法将38例不同阶段的MM患者分为癌前组(MGUS)、活动组(初治和复发难治)与稳定组(缓解并达到平台期),10例缺铁性贫血患者设为对照组.用流式细胞术(FCM)提纯CD+138的MM细胞后,以荧光素标记的端粒重复序列扩增法检测端粒酶的表达,并通过FCM测定细胞周期.结果 (1)MM活动组端粒酶阳性率为90.5%,显著高于对照组(10.0%)(P<0.01).其中初治MM(84.6%)与复发难治MM(100.0%)之间差异无统计学意义(P>0.05).MM稳定组端粒酶阳性率为13.3%,与对照组相比差异无统计学意义 (P>0.05),与活动组差异有统计学意义(P<0.01).癌前组2例MGUS端粒酶表达均为阳性;(2)细胞周期测定显示端粒酶表达阳性的MM细胞S期比例为(18.78±8.02)%,阴性为(5.64±4.03)%,两者差异有统计学意义(P<0.05).结论 (1)端粒酶对MM的发生发展具有重要意义,可作为监测病情发展、评价疗效及预测预后的指标;(2)端粒酶阳性的细胞更多处于增殖期,端粒酶和细胞周期调控存在相关性.
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脐血造血干/祖细胞人类端粒酶逆转录酶基因的表达及意义
目的探讨人类端粒酶逆转录酶(hTERT)基因在脐血造血干/祖细胞中的表达及意义.方法采用核酸原位杂交法对不同培养时间和不同培养条件下脐血CD+34细胞中hTERT基因的表达进行了测定.结果新鲜分离的脐血中CD+34细胞低表达hTERT,阳性率为13%,体外培养5～7 dhTERT表达增高,以干细胞因子、白细胞介素-3(IL-3)、IL-6和Flt-3配体组合条件下增高显著,阳性率为48%,转化生长因子-β-和全反式维甲酸可抑制hTERT表达.结论hTERT基因在脐血CD+34细胞中低水平表达,在体外扩增体系中,优化细胞因子组合能显著上调hTERT基因,负调控因子和诱导分化剂则下调hTERT基因.
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化学治疗药物对大肠癌细胞端粒酶活性的影响
目的研究常用化学药物对大肠癌细胞HT-29端粒酶活性的影响.方法利用端粒酶重复扩增实验(TRAP)结合非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染法,测定HT-29细胞经过几种化学药物(顺铂、阿霉素、吡柔比星、丝裂霉素、5-FU)不同浓度和时间作用后端粒酶活性的变化.结果当各种药物大剂量处理细胞4 h后再祛除药物培养20 h,顺铂对酶的活性完全抑制,丝裂霉素,吡柔比星,阿霉素和5-FU无明显抑制作用;而未经20 h再培养则无作用;小剂量药物处理细胞6 d,其结果同大剂量相似.结论顺铂对大肠癌HT-29细胞端粒酶活性有明显抑制作用,而其他几种化学药物没有明显的抑制作用.
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T7RNA聚合酶催化的荧光扩增技术检测结直肠癌循环肿瘤细胞hTERT
目的 T7 RNA聚合酶催化的荧光扩增技术(Cellular FACTT)检测人循环肿瘤细胞中hTERT表达.方法 以亲和素作为连接分子,连接生物素化的检测抗体和生物素化的DNA,加入T7 RNA聚合酶进行转录扩增反应,对生成的RNA产物进行荧光检测,并同时用酶联免疫方法检测hTERT及CEA作为比对.结果 64例结直肠癌患者血清hTERT阳性率是 45.3%(29/64),血清CEA阳性率是 57.8%(37/64);Cellular FACTT方法检测循环肿瘤细胞的hTERT检出率为81.3%(52/64).其检测的灵敏度与酶联免疫检测方法有显著差异P<0.01.结论 T7 RNA聚合酶催化的荧光扩增技术较酶联免疫检测方法具有更高的敏感性,有可能作为一种新的检测方法用于临床的诊断.
关键词： 结直肠肿瘤 指导DNA的RNA聚合酶类 肿瘤循环细胞 端粒 末端转移酶 -
端粒酶与大鼠脊髓损伤后髓内瘢痕相关性的实验研究
目的 探讨端粒酶在大鼠脊髓胶质瘢痕中的表达及其与脊髓胶质瘢痕形成的关系.方法 将SD大鼠120只随机分为端粒酶未干扰组(未干扰组)、端粒酶干扰组(干扰组)及对照组,每组各40只.未干扰组、干扰组为脊髓损伤组,采用改良Allen's重物坠落法造模；对照组只打开椎板,暴露脊髓,不造成脊髓损伤.每组于损伤后l、3、5、7、14、28、42、56 d取损伤区域标本,用PCR-ELISA、Western blot法检测胶质瘢痕中端粒酶、胶质酸性纤维蛋白(GFAP)的表达,并分析其相关性；免疫荧光观察胶质瘢痕的形成.结果 未干扰组端粒酶在各时间点的表达量(0.180±0.004～ 1.217±0.072)明显高于干扰组(0.028±0.007 ～0.092±0.004,x2=28.753 ～ 37.518,P＜0.05)和对照组(0.072±0.007 ～0.075±0.004,x2=18.618～ 41.093,P＜0.05),差异有统计学意义.未干扰组GFAP在各时间点的表达量(1.98±0.15～19.40±0.55)明显高于干扰组(1.10±0.13 ～ 16.64±1.02,x2=14.538 ～37.366,P ＜0.05)和对照组(0.44±0.05～0.48 ±0.04,x2=16.733～ 34.041,P＜0.05),且差异有统计学意义.未干扰组端粒酶的表达与GFAP表达呈相关线性关系且有统计学差异(r=0.755,P＜0.01).干扰组和对照组端粒酶均呈阴性表达.免疫荧光观察未干扰组胶质瘢痕重于干扰组,对照组未见胶质瘢痕形成.结论 端粒酶在脊髓胶质瘢痕中呈动态表达并与衡量胶质瘢痕程度的GFAP呈正相关线性关系,可能是促进胶质瘢痕形成的重要因素.
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大肠癌患者粪便标本的端粒酶活性研究
目的探讨通过粪便途径筛查大肠癌的可行性和新方法. 方法应用聚合酶链端粒重复扩增(PCR-TRAP)银染技术,研究了43例大肠癌患者粪便中脱落细胞的端粒酶活性表达. 结果 62.8%的大肠癌患者粪便标本中有端粒酶阳性表达.患者粪便标本中端粒酶阳性表达与其大肠癌Dukes分期、淋巴结转移和癌肿部位均未见显著相关(P＞0.05).1例结肠腺瘤患者粪便标本端粒酶表达阳性,其腺瘤组织也存在端粒酶活性表达.粪便端粒酶检测的敏感性、特异性和阳性预测值分别为62.8%、95.7%和96.4%. 结论 PCR-TRAP银染检测大肠癌患者粪便脱落细胞的端粒酶活性表达为改善大肠癌筛查方法和大肠癌诊断作了新的尝试.
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人端粒酶逆转录酶启动子驱动重组腺病毒治疗人前列腺癌的动物实验研究
目的 探讨带有人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子驱动单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSV-tk)基因的重组腺病毒Ad-hTERT-HSV-tk结合无毒的环氧鸟苷(GCV)对人前列腺癌的治疗作用.方法 建立人前列腺癌裸鼠移植瘤模型,肿瘤局部注射1.0×109pfu/ml重组腺病毒0.1 ml后,腹腔注射GCV 100 mg/kg,观察肿瘤体积、瘤重、肿瘤抑制率、肿瘤体积-时间曲线以及裸鼠生存期.取肿瘤组织应用TUNEL法及透射电镜检查检测肿瘤细胞凋亡,免疫组化染色检测增殖细胞核抗原,测定增殖指数.结果 Ad-hTERT-HSV-tk对裸鼠移植瘤具有明显抑制作用,Ad-hTERT-HSV-tk/GCV治疗组的移植瘤体积、重量都明显小于对照组(P＜0.05),也明显小于Ad-hTERT-HSV-tk和GCV治疗组(P＜0.05);TUNEL法测定该系统所致的凋亡率明显高于对照组,而增殖指数明显低于对照组.结论 Ad-hTERT-HSV-tk联合GCV对前列腺癌具有明确的抑制肿瘤生长作用,为前列腺癌的基因治疗提供了一个新的思路.
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端粒酶RNA反义核酸联合其催化亚单位反义核酸对子宫颈癌Hela细胞生长的抑制作用
目的探讨端粒酶RNA反义核酸(反义hTR)联合端粒酶RNA催化亚单位反义核酸(反义hTERT),对宫颈癌Hela细胞生长的抑制作用及作用机理.方法实验分为空白对照、脂质体对照、正义hTR 、正义hTERT、反义hTR、反义hTERT及反义hTR+反义hTERT组.分别采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、PCR-端粒重复序列扩增(TRAP)-酶联免疫吸附实验(ELISA)、吖啶橙染色法、流式细胞术检测宫颈癌Hela细胞转染反义hTR和反义hTERT后细胞的增殖、端粒酶活性及细胞形态学、细胞凋亡和细胞周期阻滞的变化.结果宫颈癌Hela细胞转染端粒酶反义核酸后,出现明显的细胞增殖抑制、端粒酶活性下降、细胞凋亡形态学改变、细胞凋亡率升高及细胞周期阻滞.反义hTR、反义hTERT组与空白对照、脂质体对照及正义hTR、正义hTERT组比较,差异有统计学意义(P< 0.01) .Hela细胞转染反义核酸(0.2 μmol/L)3 d 后,反义hTR+反义hTERT组,细胞增殖抑制率、相对端粒酶活性(相对于空白对照组)、细胞凋亡率分别为69.3%、19.6%、28.6%,与反义hTR组和反义hTERT组比较,差异均有统计学意义( P< 0. 01),Q值分别为0.867、0.919、1.075.反义hTR+反义hTERT组 G0/G1期细胞比例增加.结论端粒酶反义核酸能通过特异性抑制端粒酶活性、诱导细胞凋亡及增强细胞周期阻滞等途径抑制宫颈癌Hela细胞生长,端粒酶反义hTERT和反义hTR联合应用有协同作用.
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子宫颈癌及其癌前病变组织端粒酶活性的研究
目的研究宫颈癌及其癌前病变组织中端粒酶激活的意义.方法应用端粒酶重复序列扩增-酶联免疫吸附法(TRAP-ELISA)及电泳-银染法,对36例宫颈浸润癌及16例宫颈上皮内瘤变(CIN)组织进行端粒酶活性测定,以吸光度(A)值判断端粒酶活性.同时测定11例正常宫颈、6例慢性宫颈炎症及8例癌旁组织端粒酶活性作为对照.结果 CIN、宫颈癌及对照组端粒酶活性A值分别为0.398±0.293、1.580±0.819和0.050±0.012,3组比较,差异有极显著性(P＜0.01).端粒酶活性高低与肿瘤分化程度呈负相关,与淋巴结转移呈正相关;与组织学类型、分期、体积大小无关.结论端粒酶的激活发生在宫颈癌病变的早期,可能成为宫颈癌及癌前病变早期诊断和鉴别诊断的指标.
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人端粒酶逆转录酶在子宫颈癌组织中的表达变化及其意义
目的研究端粒酶在宫颈癌及其癌前病变组织中的表达,探讨人端粒酶逆转录酶(hTERT)作为宫颈癌早期诊断标志物的可能性.方法采用RT-PCR方法测定端粒酶mRNA在3株宫颈癌细胞、2株正常的人二倍体细胞、38例宫颈癌、16例宫颈上皮内瘤变(CIN)和20例正常宫颈组织中的表达水平;端粒重复序列扩增-酶联免疫吸附法测定端粒酶活性;免疫组化链酶菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP)连接法检测3株宫颈癌细胞、2株正常的人二倍体细胞、21例正常宫颈组织、25例CIN和55例宫颈癌切片中hTERT蛋白的表达水平.结果 hTERT mRNA在3株宫颈癌细胞中均表达,而在2株正常的人二倍体细胞中无表达,宫颈癌组织中的阳性表达率为81.6%,高于CIN的37.5%和正常宫颈组织的5.0%,差异有统计学意义(P<0.05);hTERT mRNA的阳性表达率与端粒酶活性有相关性(P<0.01);hTERT蛋白在3株宫颈癌细胞中有表达,2株正常的人二倍体细胞中无表达,正常宫颈组织中阳性表达率为4.8%、CIN为28.0%,均低于宫颈癌组织的65.5%,差异有统计学意义(P<0.05).结论宫颈癌组织和细胞中hTERT mRNA和蛋白阳性表达率均高于正常宫颈组织,其有可能作为宫颈癌早期诊断的标志物.
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人端粒酶逆转录酶启动子调控下胞嘧啶脱氨酶-胸苷激酶融合基因治疗卵巢癌的体外研究
目的探讨人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子调控下的融合双自杀基因--胞嘧啶脱氨酶-胸苷激酶/5-氟胞嘧啶+更昔洛韦(CD-TK/5-FC+GCV)系统对人卵巢癌细胞及正常细胞的体外杀伤作用.方法应用脂质体转染法将hTERT核心启动子报告质粒pBTdel-279转染人卵巢癌细胞系3AO、正常卵巢上皮细胞(NOEC)和人胚肺成纤维细胞株HELF,用荧光素酶分析检测hTERT启动子活性;应用RT-PCR技术检测hTERT mRNA的表达水平.应用基因克隆技术分别构建hTERT启动子和巨细胞病毒(CMV)启动子调控下的 CD-TK基因真核表达载体pBTdel-279-CD-TK和pcDNA3-CD-TK,以及hTERT启动子调控下的TK基因表达载体pBTdel-279-TK.用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法和流式细胞术检测pBTdel-279-CD-TK/5-FC+GCV系统和pcDNA3-CD-TK/5-FC+GCV系统对上述3 种细胞不同的杀伤作用;应用RT-PCR技术检测pBTdel-279-CD-TK 和 pcDNA3-CD-TK转染前后3AO和NOEC细胞中CD和TK基因的表达情况.用扫描电子显微镜观察pBTdel-279-CD-TK/5-FC+GCV作用后3AO细胞的形态变化.结果卵巢癌细胞系3AO中hTERT启动子活性增高,为24.1%, RT-PCR 检测hTERT mRNA为阳性,而在正常细胞NOEC和HELF中,hTERT启动子活性仅为0.3%和0.7%,hTERT mRNA为阴性.与pBTdel-279-TK/GCV系统作用相比,pBTdel-279-CD-TK/5-FC+GCV系统对端粒酶阳性的卵巢癌细胞系3AO的杀伤作用显著增强,5-FC 浓度为2 ol/L、GCV 浓度为10 mg/L时,细胞杀伤率为74.5%,而对端粒酶阴性的正常细胞NOEC和HELF则无杀伤作用;hTERT启动子系统诱导卵巢癌细胞系的细胞凋亡效能与CMV启动子系统相似,差异无显著性 (P>0.05). pcDNA3-CD-TK转染后,3种细胞中均可检测到CD和TK基因;而pBTdel-279-TK转染后,3种细胞中只有3AO可检测到CD和TK基因,正常细胞中则呈阴性;扫描电子显微镜观察pBTdel-279-CD-TK/5-FC+GCV系统所致3AO细胞的死亡形式以细胞凋亡为主.结论 hTERT启动子调控下的融合双自杀基因治疗是一种高效、靶向的卵巢癌基因治疗策略.
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黄素化颗粒细胞端粒酶的表达及与卵巢功能关系的初步研究
目的了解端粒酶在人卵巢黄素化颗粒细胞的表达,及与卵巢生殖功能的关系.方法收集22例行体外受精-胚胎移植或卵胞浆单精子显微注射患者的卵巢黄素化颗粒细胞,采用原位杂交法及端粒末端重复序列扩增法,分别检测人端粒酶催化亚单位(hTERT) mRNA及端粒酶活性.结果黄素化颗粒细胞普遍表达hTERT mRNA,但其表达强弱不一.22份卵巢黄素化颗粒细胞标本中,16份(73%)有端粒酶活性,与血清基础促卵泡激素水平呈负相关(P<0.01),且随年龄增长呈下降趋势.结论端粒酶可能对维持卵巢功能起重要作用,卵巢功能下降可能与卵巢颗粒细胞端粒酶活性降低有关.
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含hTERT基因核心启动子和canstatin基因重组腺病毒载体的构建及其对卵巢上皮性癌的抑制作用
目的 构建含hTERT基因核心启动子和canstatin基因的重组腺病毒载体AdhTERT-Can,探讨其对卵巢上皮性癌(卵巢癌)的抑制作用.方法 应用分子克隆技术构建重组腺病毒载体AdhTERT-Can,并采用酶切、电泳、测序方法进行鉴定.体外实验:卵巢癌细胞株HO8910PM细胞经脂质体介导转染AdhTERT-Can后,荧光显微镜观察HO8910PM细胞的转染情况,RT-PCR技术检测HO8910PM细胞中eanstatin mRNA的表达.体内实验:建立卵巢癌裸鼠异体移植瘤动物模型,随机分为3组,AdhTERT-Can组(尾静脉注射含canstatin基因的重组腺病毒载体AdhTERT-Can上清液)、Ad-Can组(尾静脉注射Ad-Can上清液)和空白对照组(尾静脉注射磷酸盐缓冲液),比较各组裸鼠治疗后的肿瘤体积.结果成功构建重组腺病毒载体AdhTERT-Can,并经相关鉴定证实.体外实验显示,AdhTERT-Can质粒转染HO8910PM细胞后,在荧光显微镜下观察可见约60%卵巢癌细胞发出绿色荧光;RT-PCR技术检测显示,HO8910PM细胞中有canstatin mRNA的表达.体内实验显示,自治疗后8 d开始,各组肿瘤生长出现明显筹异,AdhTERT-Can组肿瘤体积明显小于Ad-Can、空白对照组(P<0.01),且随着治疗时间的延长差异越来越明显;而Ad-Can组与空白对照组比较,差异则无统计学意义(P>0.05).治疗30 d后,各组均可见肿瘤破溃和囊性变,但以AdhTERT-Can组为明显,Ad-Can组次之;病理检查可见,各组肿瘤细胞均可见液化和坏死,尤其以AdhTERT-Can组为明显.结论本研究成功构建了重组腺病毒载体AdhTERT-Can,且其转染卵巢癌细胞的能力较强;AdhTERT-Can质粒通过尾静脉注射能明显抑制裸鼠体内卵巢癌的生长,显示r肿瘤基因治疗的靶向性.
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人端粒酶逆转录酶启动子-二步转录增强系统调控下的活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的构建及其对卵巢上皮性癌的治疗作用
目的 构建含人端粒酶逆转录酶启动子-二步转录增强系统(hTERTp-TSTA)调控下的活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(rev-caspase-3)的重组腺病毒AdHTVP2G5-rev-casp3,并检测其对卵巢上皮性癌(卵巢癌)的治疗作用.方法 采用基因重组法构建AdHTVP2G5-rev-casp3,经DNA测序鉴定并证实其序列正确.实验分为4组:分别以AdHTVP2G5-rev-casp3(AdHTVP2G5-rev-casp3组)、含hTERTp调控下的rev-caspase-3的重组腺病毒AdHT-rev-casp3(AdHT-rev-casp3组)和含人巨细胞病毒启动子(CMVp)调控下的rev-caspase-3的重组腺病毒Ad-rev-casp3(Ad-rev-casp3组)转染人卵巢癌细胞系AO细胞及正常人脐静脉内皮细胞系HUVEC细胞,以含hTERTp-TSTA调控下的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的重组腺病毒AdHTVP2G5-EGFP(AdHTVP2G5-EGFP组)为阴性对照.采用蛋白印迹法(western blot)、细胞计数法(CCK-8)、流式细胞术分别检测各组AO和HUVEC细胞中caspase3的活性单位p17蛋白及其底物聚腺苷二磷酸-核糖多聚酶的裂解片段p85蛋白的表达强度、细胞存活率、细胞凋亡率和细胞周期的变化;western blot法检测各组裸鼠移植瘤及肝脏组织中p17蛋白的表达强度,检测各组裸鼠生存率、肿瘤体积、体内肝酶水平及各器官组织的病理检查结果.结果 AO细胞中p17蛋白表达强度,AdHTVP2G5-rev-casp3组明显高于Ad-rev-casp3和AdHT-rev-casp3组;而HUVEC细胞中AdHTVP2G5-rev-casp3组则明显低于Ad-rev-casp3,与AdHT-rev-casp3组相似.当病毒感染复数(MOI)为70时,AO细胞的存活率和凋亡率,AdHTVP2G5-rev-casp3组(分别为17.8%和40.2%)与AdHT-rev-casp3组(分别为75.2%和16.1%)比较,差异有统计学意义(P＜0.01);而HUVEC细胞的存活率和凋亡率,AdHTVP2G5-rev-casp3组(分别为97.7%和2.1%)与AdHT-rev-casp3组(分别为98.5%和1.7%)比较,差异则无统计学意义(P＞0.05).荷瘤裸鼠肿瘤组织中p17蛋白的表达强度,AdHTVP2G5-rev-casp3组高,Ad-rev-casp3组次之,AdHT-rev-casp3组弱;而其肝脏组织中p17蛋白的表达强度,Ad-rev-casp3组高(与其在肿瘤组织中相似),其他各组几乎无p17蛋白表达.荷瘤裸鼠的生存时间,AdHTVP2G5-rev-casp3和Ad-rev-casp3组分别为(259±14)和(213±16)d,明显长于AdHT-rev-casp3和AdHTVP2G5-EGFP组的(177±12)和(109±7)d(P＜0.01).荷瘤裸鼠的肿瘤体积,用药53 d后AdHTVP2G5-rev-casp3组(为406 mm3)明显小于AdHT-rev-casp3、Ad-rev-casp3和AdHTVP2G5-EGFP组(分别为990、645、1728 mm3;P＜0.01).荷瘤裸鼠体内的肝酶水平,Ad-rev-casp3组明显高于其他各组(P＜0.01).各组荷瘤裸鼠的肝脏及其他器官组织经HE染色显示均无明显变化.结论 hTERTp-TSTA系统调控下的rev-caspase-3致细胞凋亡的能力明显强于hTERTp,并同时保证了被作用肿瘤的靶向性,在明显抑制卵巢癌移植瘤的生长并延长荷瘤裸鼠生存时间的同时降低了凋亡基因对肝脏的毒性作用.
关键词： 卵巢肿瘤 端粒 末端转移酶 启动区(遗传学) 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 -
应用TERC基因检测子宫颈病变的临床研究
目的 探讨TERC基因作为宫颈病变筛查指标的临床意义.方法 选取在北京大学人民医院和北京大学深圳医院妇科门诊进行官颈病变筛杳的715例患者为研究对象,对其宫颈脱落细胞行液基细胞学榆查,并行第2代杂交捕获试验(HC-II)检测高危型人乳头状瘤病毒(HPV),必要时行阴道镜活榆及病理检查.荧光原位杂交(FISH)技术检测细胞内TERC基因的异常扩增情况.以病理检查结果为"金标准",将TERC基因异常扩增结果与液基细胞学检查和高危型HPV检测结果进行比较.结果 在宫颈液基细胞学检查结果为正常、未明确诊断意义的不典型鳞状上皮细胞(ASCUS)、不除外高度病变的不典型鳞状上皮细胞(ASC-H)、低度鳞状上皮内病变(LSIL)、高度鳞状上皮内病变(HSIL)和不典型腺细胞(AGC)中,TERC基因异常扩增率分别为5.8%、22.2%、30.8%、27.8%、86.4%和1/1,正常、ASCUS、ASC-H和LSIL者均明显低于HSIL者(P<0.01).在病理检查结果为官颈上皮内瘤变(CIN)I、CIN Ⅱ～Ⅲ和浸润癌中,TERC基冈异常扩增率分别为9.3%、77.8%和96.7%,CIN I明显低于后两者(P<0.01).HPV检测结果为阳性患者的TERC基因扩增阳性率明显高于HPV阴性者(分别为33.5%和5.2%,P<0.01).TERC基因异常扩增诊断CIN Ⅱ及以上病变的敏感度为81.88%,明显高于细胞学检查的36.96%(P<0.01);其特异度(93.32%)明显高于HPV 检测的33.93%(P<0.01);阳性预测值(81.29%)与细胞学检查(86.44%)相似(P>0.05);而阴性预测值(93.56%)低于HPV检测(97.06%,P<0.05).结论 随着宫颈病变程度的加重,TERC基因异常扩增率增加,且其扩增与HPV感染有关.应用FISH技术检测TERC基因异常扩增作为分子遗传学指标,可以辅助细胞学榆查和HPV检测,协助筛出CIN Ⅱ及以上的高度病变和宫颈癌.
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子宫颈上皮内瘤变端粒酶活性的研究
目的探讨端粒酶激活在宫颈癌变过程中的意义及其作为病情监测方法和预测宫颈上皮内瘤变(CIN)结局的可能性.方法采用端粒重复序列扩增-聚合酶链反应(PCR-TRAP)方法检测了64例CIN患者、21例宫颈癌患者、20例慢性宫颈炎患者及15例正常宫颈妇女宫颈脱落细胞、宫颈活组织检查(活检)组织的端粒酶活性.结果正常宫颈、慢性宫颈炎、CIN Ⅰ级(CINⅠ)、CINⅡ级(CINⅡ)、CINⅢ级(CINⅢ)及宫颈癌患者的宫颈脱落细胞端粒酶的阳性表达率分别为20.0%、25.0%、62.5%、60.0%、82.4%及61.9%;对应的活检组织端粒酶的阳性表达率分别为26.7%、30.0%、50.0%、45.0%、96.4%及95.2%;随着宫颈病变的进展,端粒酶阳性表达率呈逐渐增高趋势(X2细胞=16.28、X2组织=36.98,P均＜0.05).CINⅠ、CINⅡ端粒酶阳性表达率比较,差异无显著性(P细胞=0.24、P组织=0.25);CINⅢ端粒酶阳性表达率高于CINⅠ、CINⅡ(P细胞=0.03、P组织=0.000 012);CINⅢ与宫颈癌活检组织端粒酶阳性表达率比较,差异无显著性(P=0.05);宫颈脱落细胞与宫颈活检组织的端粒酶检测结果的对应性良好(X2=46.4,P＜0.05).结论端粒酶激活与宫颈癌变的进程有关,宫颈脱落细胞端粒酶活性检测可以作为CIN病情检测、处理及预后估计的辅助指标.
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人端粒酶催化亚基基因反义寡核苷酸对卵巢癌细胞端粒酶活性及细胞生长的影响
目的探讨人端粒酶催化亚基(hEST2基因)反义寡核苷酸(AODN)对卵巢癌细胞系SKOV3、COC1细胞端粒酶活性及细胞生长的影响.方法分别采用逆转录聚合酶链反应技术、端粒重复扩增法、四甲基偶氮唑蓝法、绘制细胞生长曲线的方法检测hEST2基因AODN转染前后SKOV3、COC1细胞hEST2 mRNA表达、端粒酶活性的变化,以及对细胞增殖能力及细胞生长的影响.结果hEST2基因AODN能够下调SKOV3、COC1细胞hEST2 mRNA的表达,降低端粒酶活性,抑制细胞的生长,作用具有明显的时效性.以浓度为30 μmol/L的AODN治疗48 h时作用显著,SKOV3、COC1细胞hEST2 mRNA的表达分别下降54.6%、44.6%, 对两株细胞的端粒酶活性抑制率分别达到47.9%、42.7%,与相同浓度的随机寡核苷酸(RODN)、正义寡核苷酸(SODN)相比,差异有显著性( P <0.05). 结论 hEST2基因的反义治疗能够抑制卵巢癌细胞的增殖能力, 该基因有望成为卵巢癌治疗的新方向.
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5溴脱氧尿苷和端粒酶逆转录酶标记肺干细胞在新生鼠高氧肺损伤中的作用
目的探讨5溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine,Brdu)和端粒酶逆转录酶(tolomerase reversetranscriptase,TERT)标记肺干细胞特点及其在肺发育和损伤修复中的作用.方法95%左右氧气7 d制备新生鼠高氧肺损伤模型;将Brdu自腹腔注入模型鼠,免疫组化法检测Brdu和TERT阳性显色细胞,并和表面蛋白C(surfactant protein C,SPC)抗体免疫双染.结果(1)Brdu阳性显色部位主要在各级支气管黏膜下和肺间隔,支气管黏膜上皮及肺泡壁有散在分布,阳性细胞数量较少,多呈立方形、核大;TERT阳性显色在外周肺组织,肺间隔和肺泡壁部位,数量明显少于Brdu,且阳性显色呈不对称性,即多集中在某一肺叶;(2)SPC阳性显色细胞在肺间隔和肺泡壁,分别和Brdu、TERT双染,可见少量阳性细胞;(3)Brdu、TERT和SPC表达积分在高氧组与正常氧组差异无统计学意义(P>0.05).Brdu表达积分无论在高氧组(1.61±0.83)还是正常氧组(1.43±0.85),均高于TERT(分别为0.83±0.84和0.62±0.55,P<0.05).结论Brdu和TERT作为肺干细胞标记,两者各有其特征;肺损伤时Brdu和TERT标记阳性细胞量可提示肺干细胞增殖分化及肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤修复情况.至于Brdu和TERT哪一个指标更具特异性,是否Brdu同时标记了已从干细胞增殖分化但尚保留干细胞特征的短暂扩增细胞,或TERT更能反映干细胞特征尚待深入研究.
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5溴脱氧尿苷和端粒酶逆转录酶标记肺干细胞在新生鼠高氧肺损伤中的作用
目的探讨5溴脱氧尿苷(Brdu)和端粒酶逆转录酶(TERT)标记肺干细胞特点及其增殖、分化在肺发育和高氧肺损伤修复中的作用.方法(1)3 d新生鼠分为高氧组(95%左右氧气7 d)、高氧组siRNA干预组(高氧同时TGF-β1 siRNA经腹腔注入,隔日1次,共3次)和正常对照组,处死前自腹腔注入Brdu.(2)免疫组化法检测Brdu和TERT阳性显色细胞,并分别使用碱性磷酸酶和辣根过氧化氢酶两种显色系统作Brdu/TERT和SPC抗体免疫双染.(3)分离新处死肺细胞,立即涂片,做Brdu和TERT免疫标记,计数阳性细胞百分比.结果(1)高氧组可见肺泡壁较薄、结构简单化、肺泡大小不均,有些肺泡融合、体积增加,肺泡腔有较多脱落的AECII.(2)肺组织Brdu阳性显色部位主要在各级支气管黏膜下和肺间隔,支气管黏膜上皮及肺泡壁有散在分布,阳性细胞数量较少,多呈立方形、核大;TERT阳性显色在外周肺组织肺间隔和肺泡壁部位,数量明显少于Brdu[表达积分(1.61±0.83)vs.(0.62±0.55),P＜0.05],且阳性显色呈不对称性,即多集中在肺某一区域;高氧肺组织Brdu和TERT阳性标记细胞稍高于正常对照组[(1.43±0.85)vs.(1.61±0.83);(0.62±0.55)vs.(0.83±0.84),P＞0.05].(3)SPC分别和Brdu、TERT双染,可见少量阳性细胞.(4)肺细胞SPC免疫显色部位在胞浆,呈棕褐色,阳性细胞大小不一,高氧组和正常组显色细胞数无明显区别,阳性细胞百分比分别为80.3%、78.6%.(5)肺细胞Brdu阳性显色细胞明显少于SPC阳性细胞,体积明显大于未显色细胞,核形态主要为致密圆形,个别呈杆状;高氧组阳性细胞数略多于正常组,阳性细胞百分比分别为28.5%、21.4%.(6)TERT阳性显色细胞更为少见,阳性细胞体积多较小,核呈多种形态包括致密圆形、疏松圆形、杆状、分叶状;正常组和高氧组阳性细胞百分比分别为1.5%、2.3%.结论(1)Brdu和TERT可作为不同分化能力的肺干细胞标记,其中TERT更能反映肺干细胞特征或是或体肺干细胞标记更特异性的指标,Brdu标记从干细胞增殖分化尚保留干细胞特征的TAC.(2)高氧肺损伤时肺干细胞出现有限增殖分化.
