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CGRP减轻高氧诱导的早产鼠肺泡Ⅱ型细胞损伤及对Gli1表达的影响
目的 探讨降钙素基因相关肽(CGRP)对高氧致早产鼠肺泡Ⅱ型细胞(AECⅡ)损伤的保护作用及对Sonichedgehog(Shh)通路Gli1蛋白表达的影响和意义.方法 分离纯化早产鼠AECⅡ,分为空气、空气+CGRP、空气+CGRP+ CGRP拮抗剂(CGRP8-37)、高氧(95％O2)、高氧+CGRP及高氧+CGRP+ CGRP8-37组.培养24h后观察AECⅡ形态,流式细胞术检测凋亡率,荧光分子探针法检测细胞内活性氧(ROS),分光光度法检测丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)；RT-qPCR检测表面活性蛋白C(SPC) mRNA,Western blot检测Gli1蛋白表达.结果 95％ O2诱导24 h后,AECⅡ凋亡率比空气对照增加3.6倍,ROS水平增加1.5倍,MDA增加65％,SOD降低近一半,SPC mRNA和Gli1蛋白表达显著降低(均P＜0.05)；CGRP干预后可显著减轻上述变化(P＜0.05).结论 CGRP可减轻高氧诱导的AECⅡ损伤,其机制可能与Shh信号通路的激活有关.
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缺氧、高氧对肝星形细胞基质金属蛋白酶Ⅱ表达及活性的影响
目的研究缺氧、高氧对肝星形细胞基质金属蛋白酶Ⅱ(MMP-2)表达及其活性影响.方法分离大鼠肝星形细胞,在缺氧或高氧条件下培养,以免疫细胞化学标记链霉素卵白素生物素(LSAB)法及酶联免疫吸附(ELISA)法分别检测细胞内MMP-2、基质金属蛋白酶组织抑制因子Ⅱ(TIMP-2)、膜型基质金属蛋白酶Ⅰ(MT1-MMP)的表达,和培养上清中MMP-2、TIMP-2的相对含量,并以酶谱法测培养上清MMP-2活力.结果 (1)缺氧培养12 h,MMP-2表达增高(缺氧组阳性指数:5.7±2.0; 对照组: 3.2±1.0, ; P<0.01),TIMP-2表达则降低(缺氧组阳性指数:2.5±0.7; 对照组: 3.6±1.0; P<0.05);培养上清中MMP-2酶活性明显降低(缺氧组总吸光度值:7.334±1.922; 对照组: 17.277±7.424; P<0.01).缺氧不同时段(6 、12 、24 h)比较,变化以6 h段明显.(2)高氧培养12 h,上清中MMP-2、TIMP-2蛋白相对含量均高于对照组,TIMP-2更明显(高氧组A450:0.050±0.014; 对照组:0.022±0.010; P<0.01),酶活性亦高于对照组(高氧组总吸光度值:5.252±0.771; 对照组: 4.304±1.083; P<0.05),高氧组MT1-MMP表达增强.结论肝星形细胞对氧敏感.缺氧使肝星形细胞 MMP-2表达增加,该影响在早期较明显;高氧主要使酶活性增强.
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红霉素在早产鼠高氧肺损伤中对白细胞介素6、8及γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶表达的影响
目的 探讨红霉素在早产鼠高氧肺损伤中对白细胞介素6 (IL-6),IL-8及γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)的干预作用.方法 96只早产新生SD大鼠生后1d分为四组:Ⅰ组空气暴露+生理盐水、Ⅱ组空气暴露+红霉素、Ⅲ组高氧暴露+生理盐水、Ⅳ组高氧暴露+红霉素,每组各24只.四组分别于高氧或空气暴露后1、7、14d处死取肺组织做病理学检查.采取双抗体夹心酶联免疫吸附试验分析肺组织匀浆细胞因子IL-6、IL-8和γ-GCS的水平,并采取半定量逆转录聚合酶链反应测定γ-GCS mRNA的表达.结果 Ⅰ、Ⅱ组肺组织无明显病理改变,Ⅲ组肺泡炎性改变及水肿较Ⅳ组更为明显.Ⅳ组γ-GCS水平在7、14 d较Ⅲ组降低,但是γ-GCS mRNA表达较γ-GCS mRNA均明显增强(P均＜0.05).Ⅲ组1、7、14 d IL-6及IL-8水平较Ⅰ组均显著增强(P均＜0.05).Ⅳ组IL-6水平在1、7、14d与Ⅲ组比较,差异均有统计学意义(P均＜0.05),而IL-8水平仅在7、14d较Ⅲ组明显下降(P均＜0.05).结论 氧化爆发诱导的炎症介质IL-6及IL-8参与高氧肺损伤发病过程,红霉素可抑制其释放,影响γ-GCS活性从而提高谷胱甘肽抗氧化能力.
关键词： 红霉素 高氧症 肺损伤 白细胞介素类 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶 -
骨桥蛋白在高氧所致急性肺损伤中的作用及机制的初步探讨
目的探讨骨桥蛋白(OPN)在高氧所致小鼠急性肺损伤(ALI)发病过程中的作用及其机制.方法将72只OPN基因野生型(OPN+/+)小鼠随机分为正常对照组(WN组)、高氧24h组(WO1组)、高氧48 h组(WO2组)、高氧72 h组(WO3组),每组18只;将72只OPN基因缺失型(OPN-/-)小鼠随机分为正常对照组(DN组)、高氧24 h组(DO1组)、高氧48 h组(DO2组)、高氧72h组(DO3组),每组18只.正常对照小鼠呼吸室内空气,高氧小鼠置于密闭的氧气室(氧浓度＞95%).行支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞计数及分类,评价小鼠肺损伤程度;将OPN-/-、OPN+/+小鼠各20只暴露于高氧下纪录生存时间;明胶酶谱分析基质金属蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9的释放及活性;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测OPN、MMP-2、MMP-9、金属蛋白酶1组织抑制剂(TIMP-1)和TIMP-2 mRNA的表达.结果 DO3组小鼠肺损伤较WO3组更严重.OPN-/-小鼠生存期显著缩短(χ2=23.91、P＜0.01).DO3组小鼠BALF细胞总数[(72.2±22.3)×104/L]显著高于WO3组[(39.7±10.4)×104/L,P＜0.05],其中中性粒细胞数增加近8倍[(207.54±36.45)×103/L,(25.33±6.43)×103/L,P＜0.01].明胶酶谱分析显示,DO3组小鼠BALF活化的MMP-9表达[(4.36±0.65)×104]显著高于WO3组[(2.84±0.44)×104,P＜0.01].RT-PCR显示,WO2、WO3组小鼠肺组织OPN mRNA表达(0.87±0.08、0.92±0.07)显著高于WN组(0.69±0.04,P均＜0.05);WO3组小鼠TIMP-1表达(1.09±0.12)显著高于DO3组(0.62±0.09,P＜0.05);WO2、WO3组小鼠肺组织TIMP-2 mRNA表达(1.05±0.23、0.99±0.13)分别与DO2、DO3组比较差异均有统计学意义(0.59±0.11、0.75±0.16,P＜0.01、＜0.05).结论 OPN通过促进TIMP的表达而抑制MMP的释放和激活,从而减轻高氧所致的ALI.
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血管内皮生长因子和血管生成素在新生鼠高氧肺损伤中的表达及其对肺发育的影响
目的 研究高浓度氧暴露致新生大鼠急性肺损伤时血管内皮生长因子(VEGF)和血管生成素(Ang)的表达及其对肺发育的影响,为临床防治支气管肺发育不良提供理论依据.方法 生后2～3日龄的新生SD大鼠共48只随机分为正常组、高氧组各24只,分别置于空气及常压高浓度氧气(体积分数95％以上)喂养,采用荧光定量PCR和Western Blot方法检测实验第1天、第3天、第7天时两组鼠肺组织VEGF和Ang的mRNA和蛋白水平的表达,苏木精-伊红染色对照动态观察新生大鼠肺组织形态结构变化.结果 高氧组肺组织VEGF和Ang mRNA表达水平第1天(0.86±0.3)、(0.63±0.3),第3天(0.54±0.26)、(0.91±0.3),第7天(0.32±0.20)、(0.42±0.1),均明显低于正常组第1天(1.00±0.28)、(1.00 ±0.24),第3天(0.92±0.34)、(1.32±0.18),第7天(0.61±0.12)、(0.72±0.32),差异均有统计学意义(P＜0.05);高氧组肺组织VEG和Ang蛋白表达水平第1天(0.78±0.3)、(0.65±0.16),第3天(0.60±0.08)、(0.65±0.16),第7天(0.34±0.12)、(0.32±0.14),均明显低于正常组第1天(1.00±0.16)、(1.00±0.37),第3天(0.85±0.27)、(1.40±0.25),第7天(0.56±0.18)、(0.65±0.36),差异均有统计学意义(P＜0.05).与正常组相比,高氧组肺组织病理形态分析,肺组织显著发育不良,肺泡结构简单化,肺泡数目减少和肺微血管发育受阻.结论 VEGF和Ang对肺发育起着重要作用,且VEGF和Ang在肺发育的过程中可能起着相互协同和制约的作用.
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高氧暴露对新生 SD 大鼠肺泡内白细胞介素-8及肿瘤坏死因子-α含量的影响
目的：探讨新生 SD 大鼠高氧暴露后肺泡内白细胞介素(IL)-8及肿瘤坏死因子(TNF)-α的含量变化。方法选择100只生后24 h 的足月、健康 SD 大鼠为研究对象,按照随机数字表法,将其分为高氧组(n=50)及空气组(n=50)。高氧组大鼠持续吸入浓度≥95%的氧气,空气组大鼠置于空气中,并于给氧后第1、3、6、10、14天,每组每次各取10只大鼠进行肺泡灌洗,应用双抗体夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测肺泡灌洗液中 IL-8及 TNF-α含量。统计学比较两组新生 SD大鼠肺泡灌洗液中 IL-8及 TNF-α含量差异,以及高氧组大鼠上述不同时间点 IL-8及 TNF-α含量差异。两组大鼠性别构成比及出生体重比较,差异无统计学意义(P >0.05)。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。结果①高氧组大鼠在高氧暴露第14天出现生长迟缓,呆滞,体重不增,呼吸浅快,口唇发绀等不良表现。②高氧组新生 SD 大鼠第3、6、10、14天肺泡灌洗液中 IL-8含量较空气组高[(262.4±12.5)×10-15 g/L vs (94.0±12.5)×10-15 g/L,(374.1±14.8)×10-15 g/L vs (94.8±7.2)×10-15 g/L,(345.7±17.5)×10-15 g/L vs (94.5±4.3)×10-15 g/L,(295.5±26.6)×10-15 g/L vs (95.6±7.5)×10-15 g/L],且差异有统计学意义(t =36.909、58.033、43.981、22.878, P <0.05)；高氧组新生 SD 大鼠第1、3、6、10、14天肺泡灌洗液中 TNF-α含量较空气组高[(43.0±4.5)×10-15 g/L vs (29.9±1.7)×10-15 g/L,(59.3±7.0)×10-15 g/L vs (33.3±4.1)×10-15 g/L,(55.1±7.7)×10-15 g/L vs (31.1±2.5)×10-15 g/L,(43.2±5.1)×10-15 g/L vs (31.2±3.4)×10-15 g/L,(34.4±3.8)×10-15 g/L vs (30.7±2.8)×10-15 g/L],且差异有统计学意义(t=-6.287、-10.190、-7.358、-2.508、-4.516,P <0.05)。③高氧组新生 SD 大鼠肺泡灌洗液中 IL-8含量于第6天均分别较第1、3、10、14天高(t=-50.812、-18.265、-3.910、-8.170,P <0.05),第10天较第14天高(t=-4.987,P <0.05),且差异均有统计学意义；高氧组新生 SD 大鼠肺泡灌洗液中TNF-α含量于第3天均分别较第1、6、10、14天高(t =-6.209、-3.719、-5.900、-9.974,P <0.05),第6天及第10天分别较第14天高(t=-4.416、4.732,P <0.05),且差异均有统计学意义。结论 IL-8和 TNF-α可能参与新生 SD 大鼠高氧肺损伤的早期炎症反应。
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苦杏仁甙对高氧暴露早产鼠肺泡Ⅱ型细胞表面活性物质蛋白A、B、C mRNA表达的影响
目的探讨高氧暴露对体外培养的早产鼠肺泡Ⅱ型细胞(AECⅡ)表面活性物质蛋白(surfactant associated protein,SP)A、B、C mRNA表达的影响及苦杏仁甙的作用. 方法分离、培养19 d早产鼠AEC Ⅱ,经贴壁纯化后随机分为四组:空气组(Ⅰ组)、高氧组(Ⅱ组)、空气+苦杏仁甙组(Ⅲ组)、高氧+苦杏仁甙组(Ⅳ组).Ⅱ、Ⅳ组在更换培养液后按3 L/min通入95%氧、5 %二氧化碳高纯混合气,10 min后密封.Ⅲ、Ⅳ组在更换培养液时加入200 μmol/L苦杏仁甙,培养24 h后,收获各组细胞,Trizol一步法提取细胞总RNA,RT-PCR半定量分析各组培养细胞中SP-A、SP-B、SP-C mRNA表达强度. 结果Ⅱ组SP-A、SP-B、SP-C mRNA表达强度均较Ⅰ组弱(P<0.01),Ⅲ组与Ⅰ组比较差异无显著性(P>0.05),Ⅳ组较Ⅱ组表达强度明显增加(P<0.05). 结论高氧暴露导致早产鼠AECⅡSP-A、SP-B、SP-C mRNA表达降低,这种改变参与了高氧肺损伤的发病过程,苦杏仁甙可抑制这种变化,提示苦杏仁甙对高氧肺损伤起一定的保护作用.
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角化细胞生长因子在地塞米松干预高氧新生鼠肺组织的表达
目的探讨角化细胞生长因子(keratinocyte growth factor,KGF)在高氧新生鼠以及地塞米松干预肺组织的表达与作用.方法将3 d SD新生鼠随机分为高氧组(95%氧)、高氧+地塞米松(简称地塞米松组)和正常组;HE染色观察肺组织形态结构,做辐射状肺泡计数;免疫组化检测KGF表达.结果 (1)高氧组可见肺泡壁较薄、结构简单化、肺泡大小不均,有些肺泡融合、体积增加,地塞米松组除具有上述高氧组特征外,肺组织结构明显紊乱,部分肺泡壁及间隔破坏;高氧组(9.50±1.05)和地塞米松组(10.03±3.26)辐射状肺泡计数值较正常组(13.00±1.79)减少(P均＜0.05).(2)KGF阳性细胞显色部位在胞浆,显色细胞呈圆形,阳性细胞分布在肺间隔,肺泡周围呈散在分布,靠近支气管处阳性细胞较为集中,有些密集分布.各级支气管及小血管部位未见阳性显色.高氧组和地塞米松组肺组织除了较厚肺间隔偶见散在数个细胞显色外,整个肺组织几乎见不到阳性细胞.结论新生鼠3～10 d暴露于高氧环境(95%),可导致肺泡化停滞,肺组织KGF表达被抑制,地塞米松可加重肺部病理改变,KGF表达抑制可能是导致高氧肺发育阻滞的重要因素.
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小分子干扰RNA抑制高氧暴露下人肺腺癌A549细胞中的硫氧还蛋白-2对还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚单位1、细胞色素C氧化酶工表达的影响
目的 探讨小分子干扰RNA(small interference RNA,SiRNA)抑制高氧暴露下人肺腺癌A549细胞中硫氧还蛋白-2(thioredoxin-2,Trx-2)对还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamideadenine dinucleotide,NADH)脱氢酶亚单位1(NADH dehydrogenase subunit 1,ND1)及细胞色素C氧化酶Ⅰ(cytochrome C oxidase Ⅰ,COX Ⅰ)表达的影响. 方法 体外传代培养A549细胞系,将Trx-2序列特异性的SiRNA转染A549细胞,随机分为无干扰空气组、无干扰高氧组、干扰后空气组与干扰后高氧组.分别于高氧或空气暴露12、24、48 h提取A549细胞总RNA和蛋白.采用逆转录.聚合酶链反应技术测定Trx-2、ND1和COX Ⅰ mRNA水平的表达,Western印迹技术检测Trx-2蛋白的表达. 结果 (1)序列特异性SiRNA可显著抑制Trx-2表达.(2)无干扰高氧组24 h Trx-2mRNA水平为0.7799-4-0.1249,显著高于无干扰空气组(0.4424±0.1140)(P<0.05).干扰后高氧组24 h Trx-2 mRNA水平为0.2774±0.0174、48 h为0.2587±0.0069,均显著低于干扰后空气组和无干扰高氧组(P
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地塞米松治疗高氧肺损伤作用机制探讨
目的探讨地塞米松治疗高氧肺损伤的作用机制. 方法支气管肺泡灌洗术获取鼠肺泡巨噬细胞(alveolar macrophages,AM),经贴壁纯化后,随机分为4组:Ⅰ. 高氧组,Ⅱ. 高氧+脂多糖(lipopolysacchide, LPS)组,Ⅲ. 高氧+地塞米松组,Ⅳ. 高氧+LPS+地塞米松组.每组样本量均为7只.培养48 h后,收集培养上清液,并检测上清液中白细胞介素-8(IL-8)、过氧化氢(H2O2)的含量和乳酸脱氢酶(LDH)活性. 结果 (1)培养48 h后,高氧组和高氧+LPS组IL-8含量分别为(46±15)pg/ml、(145±27)pg/ml,高氧+地塞米松组和高氧+LPS+地塞米松组IL-8含量分别为(29±4)pg/ml、(39±8)pg/ml,IL-8含量分别较前两组明显降低(P分别<0.05, 0.01);(2)培养48 h后,高氧组和高氧+LPS组H2O2含量分别为(2.29±0.29)U/ml、(18.81±15.43)U/ml,高氧+地塞米松组和高氧+LPS+地塞米松组H2O2含量分别为(4.04±0.98)U/ml、(35.83±6.59)U/ml,H2O2的释放分别较前两组明显增加(P分别<0.01, 0.05). 结论地塞米松抑制体外高氧培养的AM分泌IL-8并增加其H2O2的释放,该作用可能为地塞米松在高氧肺损伤中发挥治疗作用的机制之一.
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Notch信号在新生鼠高氧肺损伤中的表达
目的观察Notch信号在高氧暴露下新生大鼠肺组织中的表达,探讨其在新生大鼠高氧肺损伤发生、发展中的可能作用. 方法将足月SD新生大鼠48只随机分为对照组(24只,正常空气中) 和高氧组(24只,暴露于常压高氧舱中,氧浓度>85%).高氧组高氧暴露1、7、14、21 d行肺组织病理学检查,采用免疫组化法检测Notch1-3及其配体Jagged在肺组织中的表达;RT-PCR半定量分析各组肺组织Notch1-3及Jagged mRNA表达强度. 结果与对照组比较,高氧组肺组织明显水肿、出血和肺发育滞后.高氧组各时间点肺组织Notch1,2和 Jagged蛋白的表达均低于对照组(P<0.05、P<0.01),Notch3则表达上调,表达主要分布于气道上皮细胞、肺泡上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞.高氧组Notch mRNA表达及活性均较对照组呈动态下降(P<0.01). 结论高氧暴露导致新生大鼠的Notch受体/配体异常表达,参与了高氧肺损伤.长期暴露于85%的氧中,Notch1基因表达的向下调节可能是机体的一种保护性应激反应,是促进肺泡Ⅱ型细胞分化增殖的主要机制之一.Notch3活性上调可能是高氧导致新生大鼠肺发育阻滞的重要因素.
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5溴脱氧尿苷和端粒酶逆转录酶标记肺干细胞在新生鼠高氧肺损伤中的作用
目的探讨5溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine,Brdu)和端粒酶逆转录酶(tolomerase reversetranscriptase,TERT)标记肺干细胞特点及其在肺发育和损伤修复中的作用.方法95%左右氧气7 d制备新生鼠高氧肺损伤模型;将Brdu自腹腔注入模型鼠,免疫组化法检测Brdu和TERT阳性显色细胞,并和表面蛋白C(surfactant protein C,SPC)抗体免疫双染.结果(1)Brdu阳性显色部位主要在各级支气管黏膜下和肺间隔,支气管黏膜上皮及肺泡壁有散在分布,阳性细胞数量较少,多呈立方形、核大;TERT阳性显色在外周肺组织,肺间隔和肺泡壁部位,数量明显少于Brdu,且阳性显色呈不对称性,即多集中在某一肺叶;(2)SPC阳性显色细胞在肺间隔和肺泡壁,分别和Brdu、TERT双染,可见少量阳性细胞;(3)Brdu、TERT和SPC表达积分在高氧组与正常氧组差异无统计学意义(P>0.05).Brdu表达积分无论在高氧组(1.61±0.83)还是正常氧组(1.43±0.85),均高于TERT(分别为0.83±0.84和0.62±0.55,P<0.05).结论Brdu和TERT作为肺干细胞标记,两者各有其特征;肺损伤时Brdu和TERT标记阳性细胞量可提示肺干细胞增殖分化及肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤修复情况.至于Brdu和TERT哪一个指标更具特异性,是否Brdu同时标记了已从干细胞增殖分化但尚保留干细胞特征的短暂扩增细胞,或TERT更能反映干细胞特征尚待深入研究.
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二十二碳六烯酸对高氧复苏新生大鼠氧化水平的影响
目的 探讨母鼠孕期和哺乳期补充二十二碳六烯酸(DHA)对高氧或空气复苏的窒息新生大鼠体内氧化和抗氧化水平的影响.方法 孕鼠从妊娠第1天起随机给予不同饮食,从而分为普食组和DHA组(除普通饮食外每日给予100 mg DHA).新生鼠出生24 h内进行缺氧实验2 h,然后随机进入高氧复苏组和空气复苏组.实验共分4组:普食+高氧复苏组、普食+空气复苏组、DHA+高氧复苏组和DHA+空气复苏组.用分光光度法分别检测窒息后即刻、高氧1 d、3 d和7 d时新生鼠血浆中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平.结果 DHA+高氧复苏组新生鼠在高氧1 d、3 d和7 d时的s0D水平分别为(93.7±16.8)U/ml、(128.2±11.5)U/ml和(170.9±9.0)U/ml,显著高于DHA+空气复苏组[(73.7±21.5)U/ml、(112.2±19.9)U/ml和(124.2±24.6)U/ml],差异均有统计学意义(P均<0.05).DHA+高氧复苏组新生鼠的MDA含量在高氧3 d和7 d时分别为(6.0±0.5)nmol/ml和(3.5±0.9)nmol/ml,均显著低于普食+高氧复苏组[分别为(7.5±1.1)nmol/ml和(4.0±0.5)nmol/ml],差异均有统计学意义(P均<0.05).窒息后即刻、高氧1、3和7 d时各组间GSH-Px水平差异均无统计学意义(P>0.05).结论 DHA可能通过提高体内抗氧化酶水平和减少氧化代谢产物,从而对新生鼠窒息后复苏时的高氧性损伤产生一定的保护作用.
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高氧对胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞生长状况的影响
目的 探讨高氧对胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(typeⅡalveolar epithelial cells,AECⅡ)的活力、生长情况、增殖和凋亡的影响. 方法 取孕19d的胎鼠肺组织,利用差速贴壁法进行AECⅡ的原代培养及纯化,将AECⅡ随机分为高氧组及空气组.空气组细胞置于5％CO2孵育箱中培养,高氧组细胞置于5％CO2 ±95％O2的混合气体孵育箱中培养.在培养的2、4、6、8d分别观察细胞的生长情况,检测细胞活力、细胞周期、细胞凋亡情况.时间点与培养组间的交互作用采用析因设计的方差分析.2组资料比较采用独立样本t检验,多组资料比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用Bonferroni方法. 结果 (1)细胞生长状况:高氧组培养2、4、6和8d时细胞数随培养时间延长逐渐减少,分别为(7.29±0.43)×105/ml、(2.68±0.37)×105/ml、(0.23±0.10)×105/ml和(0.00±0.00)×105/ml,低于相应时间点空气组[分别为(10.41±0.24)×l05/ml、(27.90±1.91)×105/ml、(27.12±0.85)×105/ml和(26.29±1.59)×105/ml],差异均有统计学意义(t分别为10.992、38.912、94.166和49.696,P均=0.000).(2)细胞活力:高氧组在2、4、6d时细胞活力逐渐下降,活细胞率分别为(79.00±0.71)％、(52.80±1.14)％和(31.60±1.52)％,均低于相应时间点空气组,分别为(97.00±0.71)％、(97.20±0.84)％和(95.00±0.71)％,差异均有统计学意义(t分别为31.213、70.519和84.722,P均=0.000).(3)细胞周期变化:高氧组G1期和S期细胞百分率在4和6d时与2d时比较均有升高,且高于空气组,差异均有统计学意义(P＜0.05).(4)细胞凋亡变化:高氧组Annexin-V+/PI亚群在4d时所占比例高,为(23.89±0.52)％,高于2d和6d时[(21.32±0.43)％和(1.47±0.61)％]；Annexin-V+/PI+亚群细胞所占比例6d时高,为(53.92±1.64)％,其次是4d时[(45.03±1.01)％],低是2d时[(12.17±0.60)％]；高氧组各时间点Annexin-V+/PI-和Annexin-V+/PI+亚群所占比例与对照组比较,差异均有统计学意义(P＜0.05). 结论 高氧对AECⅡ的生长、活力、增殖能力、细胞周期具有明显的抑制作用,对细胞凋亡有促进作用.
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高氧暴露对早产新生大鼠肺组织凋亡信号调节激酶1表达的影响
目的 研究早产新生大鼠高氧肺损伤肺组织中凋亡信号调节激酶1(apoptosis signalregulating kinase 1,ASK1)及硫氧还蛋白(thioredoxin.Trx)和硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase,TrxR)的表达变化及意义,探讨高氧肺损伤的发病机制和防治措施.方法 早产新生SD大鼠128只,生后1 d随机分为空气组和高氧组,每组64只.两组于生后1,4、7、10、14 d各时间点处死8只大鼠取肺组织,采用HE染色观察肺组织病理学变化;采用逆转录一聚合酶链反应技术测定Trx和TrxR mRNA表达;免疫组织化学方法检测肺组织ASK1蛋白的表达和分布,Western印迹法检测ASK1蛋白表达水平变化.两组间比较采用t检验.结果 (1)肺组织病理学:与对照组比较,高氧组肺组织出现明显肺泡炎性改变和肺发育滞后.(2)肺组织ASK1广泛分布于肺泡上皮细胞和血管内皮细胞胞浆中;高氧暴露1、4 d肺组织ASK1蛋白表达分别为0.4382±0.0227和0.5270±0.0432,高于空气组(0.3458±0.0263和0.3760±0.0058)(P<0.01),7 d时下降为0.4343±0.0254,但仍高于空气组(0.3473±0.0220)(P<0.01).(3)高氧组Trx和TrxR mRNA表达强度均高于空气组,且二者分别于10 d(0.6860±0.0811)和7 d(2.0351±0.1600)时达高峰(P<0.05).(4)Western印迹法检测ASK1蛋白水平变化与免疫组织化学法的结果一致.结论 ASK1可能参与高氧肺损伤的发生发展,而Trx系统可能在其中发挥重要保护作用.
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转化生长因子β1在新生未成熟大鼠高氧损伤肺组织中的表达及意义
目的探讨转化生长因子β1(TGF-β1)在新生未成熟大鼠高氧肺损伤不同时点肺组织中的表达及意义. 方法将99只新生未成熟大鼠随机分为高氧组和空气组,于日龄3、7和14 d随机分批处死并取肺组织HE染色进行病理观察,免疫组化检测TGF-β1在各组中的表达,秩和检验组间THF-β1阳性强度表达差异. 结果高氧各组鼠肺组织TGF-β1的表达较同期空气组广泛,且在肺泡和支气管上皮细胞、肺内间质中的表达强度差别始终强于对照组(u值分别为:3 d时:49.0、14.0、63.0;7 d时:34.0、2.0、45.0;14 d时:32.0、13.5、33.0,P值均<0.05),日龄14 d时,高氧组鼠肺泡巨噬细胞中可见TGF-β1的表达,而空气组鼠肺泡巨噬细胞中未见TGF-β1的表达,两组比较u值为13.0,P<0.05. 结论肺组织中的TGF-β1表达增强以及肺泡巨噬细胞中表达TGF-β1,可能与高氧肺损伤有内在联系.
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60%氧暴露对早产大鼠肺血管内皮生长因子及其受体表达的影响
目的 观察60%氧暴露对早产大鼠肺血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及其受体--胎肝激酶-1受体(fetal liver kinase-1, Flk-1)表达的影响,探讨其与新型支气管肺发育不良发病机制之间的关系.方法 早产鼠生后6 h内随机分为中浓度氧组(简称中氧组)和空气组,空气组置于常压空气中,中氧组置于氧体积分数为60%的氧舱中,两组动物均于生后1、4、7、11和14 d各随机取8只,行HE染色,观察肺组织形态学结构,做辐射状肺泡计数(radial alveolar counts,RAC);采用Western 印迹和RT-PCR技术检测各组肺组织VEGF及其受体Flk-1蛋白及mRNA表达水平.结果 (1)中氧组RAC在7 d时为8.32±0.11,11 d时为8.53±0.08,14 d时为9.03±0.17,明显高于空气组相应时间点的RAC值;(2)中氧组VEGF及其受体Flk-1 mRNA表达水平在第7、11和14天均低于空气组相应时间点,差异有统计学意义 (P＜0.05);(3)中氧组VEGF蛋白表达水平在第11、14天时低于空气组;受体Flk-1蛋白表达水平与其mRNA表达变化规律基本一致.结论 60%氧暴露可引起早产大鼠肺部VEGF及其受体Flk-1表达下降,可能是引起肺微血管发育障碍及肺泡化进程受阻,进而导致新型BPD发生的重要因素.
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RNA干扰抑制高氧暴露下A549细胞中硫氧还蛋白-2表达的研究
目的 研究小分子干扰RNA(small interference RNA,SiRNA)抑制高氧暴露下人肺腺癌A549细胞硫氧还蛋白-2(thioredoxin-2,Trx-2)的表达及其与细胞凋亡的关系,探讨Trx-2对高氧肺损伤线粒体的保护作用. 方法 体外传代培养A549细胞系,将Trx-2序列特异性的SiRNA通过Lipo-fectamine 2000转染A549细胞,随机分为干扰后空气组、无干扰高氧组和干扰后高氧组.三组分别于高氧或空气暴露12、24、48 h后采用RT-PCR技术测定Trx-2和细胞色素c(cytochrome c,Cytc)mRNA的表达;采用流式细胞术检测三组A549细胞凋亡情况. 结果 (1)RT-PCR检测显示序列特异性SiRNA可显著降低Trx-2 mRNA的表达.(2)干扰后高氧组24 h Trx-2 mRNA水平为0.2774±0.0174,48 h为0.2587±0.0069,均低于无干扰高氧组(分别为0.7799±0.1249,0.4050±0.0842)(P均＜0.05).无干扰高氧组24 h Trx-2 mRNA水平高于干扰后空气组(0.4046±0.0161)(P＜0.05).(3)无干扰高氧组24 h Cytc mRNA水平为0.3957±0.0903,48 h为0.3438±0.0092,均低于干扰后高氧组(分别为0.6620±0.0395,0.4806±0.0977)和干扰后空气组(分别为0.5197±0.0377,0.4902±0.1079)(P均＜0.05).(4)干扰后高氧组A549细胞凋亡率明显高于干扰后空气组. 结论 SiRNA能显著下调A549细胞Trx-2 mRNA的表达;高氧暴露诱导SiRNA干扰后A549细胞Trx-2和Cytc mRNA表达的变化表明Trx-2对高氧肺损伤线粒体可能起重要的保护作用.
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维甲酸对高氧暴露早产大鼠胰岛素样生长因子系统表达的影响
目的探讨维甲酸(RA)对高氧暴露下早产大鼠肺组织胰岛素样生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)、Ⅱ型IGF受体(IGF-2R)及IGF结合蛋白2(IGFBP-2)mRNA和多肽表达的影响及其抗损伤机制.方法260只孕21 d剖宫产鼠为早产鼠,生后第2天随机分为四组,Ⅰ组:空气+生理盐水;Ⅱ组:高氧(85%O2)+生理盐水;Ⅲ组:空气+RA;Ⅳ组:高氧+RA.Ⅱ、Ⅳ组持续暴露于85%氧气中,Ⅰ、Ⅲ组置于空气中;Ⅲ、Ⅳ组从生后第3天起每日腹腔注射RA,Ⅰ、Ⅱ组每日注射生理盐水.分别于生后4、7、10、14、21 d记病死率,取肺标本作辐射状肺泡计数(RAC);测IGF-Ⅱ、IGF-2R和IGFBP-2mRNA表达强度(RT-PCR)或多肽表达强度(Western印迹).结果(1)存活率:7 d内四组差异无统计学意义;7 d后各时间点Ⅱ、Ⅳ组明显低于Ⅰ、Ⅲ组(P＜0.05或＜0.01),但Ⅳ组明显高于Ⅱ组(P＜0.01).(2)RAC结果:4 d时,Ⅱ、Ⅳ组RAC值即明显减少(P＜0.01);随后与对应Ⅰ、Ⅲ组比较差异有统计学意义(P＜0.01),但Ⅳ组明显高于Ⅱ组(P＜0.01).(3)RT-PCR结果:IGF-ⅡmRNA表达强度:与Ⅰ、Ⅲ组相比,Ⅱ、Ⅳ组4 d时表达即增强(P＜0.01);14 d时,Ⅱ组较Ⅰ组、Ⅳ组较Ⅲ组表达差异有统计学意义(P＜0.01);其中Ⅳ组表达较Ⅱ组相对降低(P＜0.01);IGF-2 R mRNA表达强度在4和14 d时,Ⅱ、Ⅳ组明显高于Ⅰ、Ⅲ组(P均＜0.01),而Ⅳ组明显低于Ⅱ组(P＜0.01);IGFBP-2mRNA表达强度:Ⅱ、Ⅳ组明显强于相应的Ⅰ、Ⅲ组,但14d时Ⅳ组表达低于Ⅱ组(P＜0.01).肽表达强度结果:IGF-Ⅱ多肽、IGF-2R膜蛋白、IGFBP-2多肽的表达强度与其各自的mRNA表达变化相似.结论RA可部分逆转高氧引发的肺发育阻滞;RA下调高氧暴露下肺组织中IGFBP-2、IGF-Ⅱ和IGF-2R的表达可能是其干预肺损伤的机制之一.
关键词： 维甲酸 胰岛素样生长因子Ⅱ 胰岛素样生长因子结合蛋白质2 高氧症 肺 -
85%高氧暴露对新生大鼠肺组织胎盘生长因子表达的影响
目的：探讨85%高氧暴露对新生大鼠肺组织胎盘生长因子（placental growth factor，PlGF）表达的影响，以及PlGF与支气管肺发育不良的关系。方法将48只新生足月Sprague-Dawley大鼠随机分为空气组和高氧组，各24只。空气组大鼠生后置于通有空气的饲养箱内，高氧组大鼠生后12 h内置于持续通有85%氧气的饲养箱内。分别于空气或高氧环境干预3、5和7 d后处死各组大鼠（每次8只），取大鼠肺组织观察病理表现，并计数肺组织终末空腔数目及肺泡次级间隔数目；采用荧光定量聚合酶链反应技术及Western印迹技术检测肺组织PlGF mRNA和蛋白的表达水平。采用配对t检验进行统计学分析。结果与空气组比较，高氧组大鼠各时间点肺组织病理表现为炎症细胞浸润、肺泡结构简单化、肺泡数目减少、肺泡腔增大、肺泡间隔增厚。高氧组干预3 d后肺组织终末空腔数目和肺泡次级间隔数目与空气组比较差异均无统计学意义（P值均>0.05）；高氧组干预5、7 d后肺组织终末空腔数目分别为（23.6±8.2）、（28.5±9.2）个，均低于空气组[（33.1±6.2）、（38.4±10.1）个]（t值分别为1.91、2.53，P值均<0.05）；肺泡次级间隔数目分别为（56.0±12.2）、（75.4±12.2）个，均低于空气组[（78.3±8.2）、（126.1±10.2）个]（t值分别为2.14、2.72，P值均<0.05）。高氧组干预3、5、7 d后肺组织PlGF mRNA的表达水平分别为1.16±0.17、1.34±0.15、1.65±0.19，均高于空气组（0.65±0.21、0.47±0.11、0.46±0.17）（t值分别为1.93、2.55、2.79，P值均<0.05）。高氧组干预3 d后肺组织PlGF蛋白的表达水平为0.24±0.17，高于空气组（0.09±0.01）（t=2.44，P<0.05），干预5、7 d后肺组织PlGF蛋白的表达水平与空气组比较差异无统计学意义（P值均>0.05）。结论85%氧暴露可以引起新生大鼠肺组织PlGF表达上调，可能与支气管肺发育不良中肺组织血管发育障碍有关。PlGF的高表达可能是支气管肺发育不良的发生机制及代偿。
