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Cox7a2荧光载体构建及其对小鼠支持细胞细胞色素C氧化酶活性的影响
目的 构建pEYFP-C1-Cox7a2表达载体,研究其在小鼠睾丸支持细胞(TM4)中的表达及对细胞色素C氧化酶(COX)活性的影响.方法 应用RT-PCR方法从TM4细胞克隆Cox7a2,利用BamH I和EcoR I酶切位点将Cox7a2克隆到pEYFP-C1载体,经酶切、测序及蛋白印迹等技术进行鉴定,并将重组质粒pEYFP-C1-Cox7a2转染TM4细胞后6、12、24、48 h,采用分光光度计测定COX活性.结果从TM4细胞克隆到Cox7a2基因完整的编码序列,大小为252 bp.构建pEYFP-C1-Cox7a2表达载体,经酶切、测序鉴定证实克隆正确,转染TM4细胞的效率达70%,融合蛋白表达产物相对分子质量为37 000.重组质粒转染后6、12、24、48 h时COX活性分别为(0.642±0.051)、(0.542±0.049)、(0.311±0.021)和(0.216±0.010)U/mg,不转染组和转染空载体组分别为(0.714±0.064)、(0.653±0.031)U/mg.与不转染组相比,重组质粒转染后12、24、48 h组COX活性显著降低(P＜0.05).结论重组质粒pEYFP-C1-Cox7a2 载体成功构建.Cox7a2基因对TM4细胞COX活性具有抑制作用,可能对调控COX活性发挥重要作用.
关键词： 电子传递复合物Ⅳ Cox7a2 pEYFP-C1载体 TM4支持细胞 COX活性 -
小分子干扰RNA抑制高氧暴露下人肺腺癌A549细胞中的硫氧还蛋白-2对还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚单位1、细胞色素C氧化酶工表达的影响
目的 探讨小分子干扰RNA(small interference RNA,SiRNA)抑制高氧暴露下人肺腺癌A549细胞中硫氧还蛋白-2(thioredoxin-2,Trx-2)对还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamideadenine dinucleotide,NADH)脱氢酶亚单位1(NADH dehydrogenase subunit 1,ND1)及细胞色素C氧化酶Ⅰ(cytochrome C oxidase Ⅰ,COX Ⅰ)表达的影响. 方法 体外传代培养A549细胞系,将Trx-2序列特异性的SiRNA转染A549细胞,随机分为无干扰空气组、无干扰高氧组、干扰后空气组与干扰后高氧组.分别于高氧或空气暴露12、24、48 h提取A549细胞总RNA和蛋白.采用逆转录.聚合酶链反应技术测定Trx-2、ND1和COX Ⅰ mRNA水平的表达,Western印迹技术检测Trx-2蛋白的表达. 结果 (1)序列特异性SiRNA可显著抑制Trx-2表达.(2)无干扰高氧组24 h Trx-2mRNA水平为0.7799-4-0.1249,显著高于无干扰空气组(0.4424±0.1140)(P<0.05).干扰后高氧组24 h Trx-2 mRNA水平为0.2774±0.0174、48 h为0.2587±0.0069,均显著低于干扰后空气组和无干扰高氧组(P
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硒蛋白-P在线粒体疾病患者不整红边纤维中的特异表达及相关作用
目的研究硒蛋白-P与琥珀酸脱氢酶、细胞色素C氧化酶的关系及它们在线粒体疾病患者不整红边纤维(ragged redfiber,RRF)中的表现和作用.方法(1)研究对象:线粒体疾病患者14例,其中Kearns-Sayre综合征患者1例,线粒体脑肌病、乳酸酸中毒伴卒中样症状者4例,肌阵挛癫癎伴RRF 1例,慢性进行性眼外肌麻痹6例,肢带型线粒体病2例;5例对照,其中多发性肌炎2例,其他神经肌病3例.全部患者均经临床、病理、分子生物学DNA分析确诊.(2)开放式肌肉活检.(3)连续切片,经组织化学、免疫组织化学染色分析.结果患者RRF的肌浆中硒蛋白-P显著表达,琥珀酸脱氢酶活性增强,细胞色素C氧化酶活性增强、减弱或缺陷.结论硒蛋白-P在对抗线粒体氧化损伤、保护线粒体机能方面可能充当了重要角色,可以作为病理学评价线粒体机能和诊断RRF的指标.
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miR-181c对缺氧预处理大鼠卒中的脑保护作用机制
目的 探讨miR-181c对缺氧预处理大鼠的神经保护作用及其作用机制.方法 将39只雄性SD大鼠按随机数字表法分成5组,分别为正常对照组、假手术组、单纯缺血组、缺氧预处理组、缺氧预处理缺血组.术后测定神经功能缺失体征评分、脑梗死面积；实时荧光定量PCR检测皮质中miR-181c的表达；蛋白质印迹检测皮质中线粒体细胞色素c氧化合酶1亚基(mt-cox1)蛋白的表达.结果 缺氧预处理缺血组大鼠的神经功能缺失体征较单纯缺血组大鼠有明显改善,同时梗死面积由22.50％±2.96％减小到16.40％ ±3.13％(t=5.26,P＜0.01).缺氧预处理缺血组miR-181c的表达较单纯缺血组表达明显降低(1.89±0.14与3.05±0.26,t=6.10,P＜0.01),其mt-cox1蛋白的表达也明显降低(0.54±0.07与0.93±0.04,t =8.01,P＜0.01).结论 缺氧预处理可能通过下调miR-181c基因表达使其靶蛋白mt-cox1表达增加,有效缓解SD大鼠的缺血损伤.
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细胞色素C氧化酶1基因T6253C点突变致线粒体脑肌病伴有高乳酸血症和卒中样发作综合征一例
目的 报道1例33岁男性,头痛后继以卒中样发作,影像学提示基底节区和颞枕叶缺血性改变,肌肉活检证实线粒体结构和功能异常的患者的基因突变.方法 我们应用基因分析未发现常见致病性突变,因此应用DNA芯片扫描线粒体基因全序列,寻找可能的致病突变.通过DNA芯片扫描线粒体基因全序列,应用直接测序法证实突变.结果 在线粒体DNA共发现了3个新突变,其中T6253C突变导致细胞色素C氧化酶1第117位保守的蛋氨酸被苏氨酸取代,患者的母亲也携带相同的突变,而98名健康个体无人携带此突变,我们认为T6253C是导致该患者发病的致病突变.结论 这是首例关于细胞色素C氧化酶1基因点突变导致线粒体脑肌病伴有高乳酸血症和卒中样发作综合征的报道.
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线粒体细胞色素氧化酶3基因mRNA表达与支气管哮喘母系遗传的关系
目的 探讨线粒体细胞色素氧化酶基因亚基Ⅲ(COX3) mRNA表达水平与支气管哮喘母系遗传的关系.方法 入选2009年1至12月于昆明医学院第一附属医院重症呼吸科及儿科住院的220例支气管哮喘患者作为哮喘组；其近亲家属(其父母或子女)162名作为近亲组,同期行健康体检的健康人群260名为对照组.测定所有入选者肺功能及血清IgE水平,通过实时荧光定量-PCR技术,检测外周血线粒体COX3 mRNA表达水平并进行对比分析.结果 哮喘组、近亲组、对照组年龄、性别差异均无统计学意义(均P＞0.05)；3组第1秒用力呼气量(FEV1)/用力肺活量(FVC)分别为90.6±6.2、92.3 ±2.3、102.3±2.3,FEV1占预计值的百分比分别为(82.9±10.8)％、(94.8±5.4)％、(98.3±8.6)％,组间差异均无统计学意义(均P ＞0.05)；3组血液中线粒体COX3 mRNA的表达水平分别为0.357±0.217、0.637±0.473和0.975±0.260,组间差异均有统计学意义(F=21.45,P=0.012)；哮喘组、近亲组IgE水平均显著高于对照组[(283.6±62.4)、(116.4±57.5)比(52.3±13.7) μg/L,均P＜O.05]；3组血液中COX3 mRNA表达与IgE水平均呈负相关(r=-0.73、-0.56、-0.61,P=0.013、0.035、0.028).结论 哮喘患者线粒体COX3基因mRNA表达下调,可能通过影响机体IgE水平,参与了哮喘过敏性炎症反应,与哮喘母系遗传有关.
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地氟烷对大鼠脑缺血再灌注时线粒体呼吸链复合体活性的影响
目的 评价地氟烷对大鼠脑缺血再灌注时线粒体呼吸链复合体活性的影响,以探讨其脑保护作用的机制.方法 雄性Wistar大鼠40只,体重250～300 g,随机分为4组(n=10):假手术组(S组)、缺血再灌注组(I/R组)、1.0 MAC地氟烷组(D1.0组)和1.5 MAC地氟烷组(D1.5组).采用前脑缺血再灌注损伤模型,D1.0组和D1.5组缺血前分别吸入1.0 MAC和1.5 MAC地氟烷40 min.再灌注4 h时,迅速断头取前脑,密度梯度离心,分离线粒体,分光光度计法测定线粒体呼吸链复合体Ⅰ+Ⅲ、Ⅱ+Ⅲ和Ⅳ的活性,透射电子显微镜观察线粒体病理学结果.结果 与S组比较,I/R组复合体Ⅰ+Ⅲ和Ⅳ的活性降低(P＜0.05);与I/R组比较,D1.0组和D1.5组复合体Ⅰ+Ⅲ和Ⅳ的活性升高(P＜0.05);各组复合体Ⅱ+Ⅲ、D1.0组及D1.5组复合体Ⅰ+Ⅲ和Ⅳ的活性差异均无统计学意义(P＞0.05).前脑缺血再灌注后,线粒体体积增大、基质电子密度降低、嵴间隙增宽、破裂、膜崩解;D1.0组和D1.5组线粒体超微结构改变不明显.结论 地氟烷可减轻大鼠脑缺血再灌注损伤,机制与提高线粒体呼吸链复合体Ⅰ+Ⅲ和Ⅳ的活性有关.
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四君子汤修复脾虚大鼠线粒体细胞色素氧化酶的作用及机制
目的:运用灌服耗气破气中药联合饥饱失节复合因素建立脾虚大鼠模型,观察四君子汤对脾虚大鼠线粒体细胞色素含量及其氧化酶活性的影响.方法:实验于2004-04/2005-02在广州中医药大学第一附属医院内科实验室和广州中医药大学基础医学实验室完成.①选取清洁级1月龄SD大鼠40只,随机数字表法分成4组:正常组、脾虚模型组、自然复健组、四君子汤治疗组,10只/组.②除正常组以普通饲料进行常规喂养外,其余3组均建立脾虚模型.脾虚模型组隔日喂食,并以小承气汤(厚朴、枳实、大黄比例为3∶3∶2,制成100%水煎剂)灌胃,每次3 mL/只,隔日1次,共30周.自然复健组前26周同脾虚模型组,后4周同正常组.四君子汤治疗组前26周同脾虚模型组,后4周以四君子汤(党参、白术、茯苓、甘草按1∶1∶1∶1制成100%水煎剂)灌胃,每次4 mL/只.③检测各组大鼠骨骼肌、心肌、肝脏、胃黏膜4种不同组织线粒体细胞色素a,b,c,c1含量及细胞色素氧化酶水平,提取线粒体DNA,进行细胞色素氧化酶亚基COXⅠ、COXⅡ和COXⅢ序列分析.结果:40只SD大鼠全部进入结果分析.①不同组织线粒体各种细胞色素含量检测结果:实验第30周,脾虚模型组骨骼肌、心肌、肝脏、胃黏膜部位的线粒体细胞色素a,b,c,c1均显著低于正常组(P＜0.05);自然复健组均有所升高,接近正常组(P＞0.05);四君子汤治疗组显著升高,超过正常组水平(P＜0.05).②不同组织线粒体细胞色素氧化酶含量检测结果:四君子汤治疗组骨骼肌、心肌、肝脏、胃黏膜部位的细胞色素氧化酶含量均高于脾虚模型组、自然复健组(P＜0.01或0.05),与正常组基本相似(P＞0.05).③线粒体细胞色素氧化酶基因序列分析:脾虚模型组和自然复健组COXⅠ a,COXⅡ,COXⅢ存在突变现象,正常组和四君子汤组未见COX亚基突变.结论:四君子汤能够修复脾虚所导致的mtDNA编码COX亚基损伤,提高细胞色素含量及其氧化酶的活性.
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脑室内移植嗅成鞘细胞改善大鼠阿尔茨海默病的症状
目的 探讨嗅成鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)脑室内注射对大鼠阿尔茨海默病的影响.方法 SD大鼠双侧海马注射Aβ1-40,建立AD大鼠模型,实验动物分为四组:正常对照组、AD模型组、OECs移植组、MCSF注射组,每组10只.体外原代培养嗅成鞘细胞并将其移植至AD大鼠侧脑室.运用行为学测试、组织化学、原位杂交结合图像分析以及电镜等技术,观察、比较各组大鼠学习记忆能力、海马CA1区线粒体细胞色素氧化酶(cytochrome oxidase,COX)活性、细胞色素氧化酶Ⅱ型亚基(COⅡ)mRNA表达、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)阳性神经元数,以及CA1区神经元线粒体超微结构等指标的变化.结果 与正常对照组比较,AD模型组大鼠空间学习记忆能力、海马CA1区线粒体COX活性及COⅡ mRNA表达、NOS阳性神经元数明显降低或减少(P＜0.05),线粒体数量减少,结构不清、肿胀、空泡样变、嵴断裂;嗅成鞘细胞移植明显上调上述指标(P＜0.05),并对神经元线粒体超微结构有明显的保护作用.结论 嗅成鞘细胞移植通过改善AD大鼠学习记忆能力、提高海马COX活性和COⅡ mRNA、NOS阳性神经元表达以及保护神终元线粒体等作用,对大鼠阿尔茨海默病具有明显的治疗作用.
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线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ和ⅡmRNA的表达与精子活动力的相关性研究
目的 比较线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(COX Ⅰ)和Ⅱ(COX Ⅱ)在正常精子和弱精子症患者精子中的表达差异.方法 对48份精液进行常规检查,收集活动力正常的精子和(a+b)级≤40%的弱精子症患者的精子,提取精子总RNA,采用反转录.聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测COX Ⅰ,COX Ⅱ亚型mRNA的表达水平.结果 与活动力正常的精子比较,COX Ⅰ和COX ⅡmRNA在弱精子症患者精子中表达水平显著降低(P<0.05);精子密度与COX Ⅰ和COX ⅡmRNA表达水平无相关性(r1=0.268,r2=0.042,P均>0.05).结论 人精子线粒体COX Ⅰ,COX Ⅱ mRNA表达减少可能是精子活动力低下的原因之一.
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输入性疖肿型皮肤蝇蛆病一例及致病瘤蝇COI基因序列分析
报道1例输入性疖肿型皮肤蝇蛆病,并对致病瘤蝇的线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因序列进行分析.患者女,33岁.患者于1个月前去非洲加纳和喀麦隆两地,期间未采取任何防蚊措施,且有室外晾晒衣物经历.皮肤科检查:左上臂内侧和左侧胸部外侧各见一疖性隆起,直径1 ～2cm,鲜红色,边缘不规则,触之较硬,皮损表面中央有小孔.形态学观察显示皮损处挤出的虫体疑似为蝇蛆.PCR扩增虫体COⅠ基因片段获得650 bp左右的产物,测序后经BLAST比对分析显示,该产物与喀麦隆2010年分离的嗜人瘤蝇COⅠ基因FR719158.1亲缘关系近,序列相似性为99.84％,在系统进化树上聚集在一起.综合患者的临床特征、旅行史和致病瘤蝇的序列分析结果,确认该病例为嗜人瘤蝇导致的输人性疖肿型皮肤蝇蛆病.
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吗啡延迟预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤细胞色素C氧化酶的影响
[目的]探讨吗啡延迟预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护机制.[方法]40只大鼠随机分成4组:假手术组(C组)、缺血再灌注组(I/R组)、吗啡预处理组(M组),吗啡预处理+阿片类受体阻断剂组(N组),每组10只.C组仅行左冠脉套线而不阻断150 min;I/R组行左冠脉阻断30 min,再灌注120 min;M组静注吗啡0.3mg/kg,24 h后处理同I/R组;N组在静注吗啡前10 min,静注阿片类受体阻断剂纳洛酮6mg/kg,其余处理同I/R组.再灌注120min后,免疫印记法测心肌细胞色素C氧化酶(cytochrome c oxidase,CcO)表达水平,同时测心梗面积.[结果]与C组相比,I/R组、M组和N组CcO表达水平均降低;与I/R组比,M组CcO表达水平增高,心肌梗死面积减少,且差异有显著性(P＜0.05).[结论]吗啡延迟预处理对心肌缺血再灌注损伤的保护作用可能与促进心肌CcO表达有关.
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嗅成鞘细胞海马内注射对阿尔茨海默病模型大鼠的作用
目的 探讨嗅成鞘细胞(OECs)海马内注射对阿尔茨海默病模型大鼠的作用.方法 SD大鼠双侧海马注射Aβ1-40,建立AD大鼠模型.实验动物分为4组:健康对照组、AD模型组、OECs移植组、人工脑脊液注射组,每组10只.体外原代培养嗅成鞘细胞并将其移植至AD大鼠海马内.运用行为学测试、组织化学、原位杂交,结合图像分析以及电镜等技术,观察、比较各组大鼠学习记忆能力、海马CA1区线粒体细胞色素氧化酶(COX)活性、细胞色素氧化酶Ⅱ型亚基(COⅡ)mRNA表达、一氧化氮合酶(NOS)阳性神经元数,以及CA1区神经元线粒体超微结构等指标的变化.结果 与健康对照组比较,AD模型组大鼠空间学习记忆能力、海马CA1区线粒体COX活性及COⅡmRNA表达、NOS阳性神经元数明显降低或减少(P<0.05),线粒体数量减少、结构不清、肿胀、空泡样变、嵴断裂;OECs移植明显上调上述指标(P<0.05),并对神经元线粒体超微结构有明显的保护作用.结论 OECs移植通过改善AD大鼠学习记忆能力、提高海马COX活性和COⅡmRNA、NOS阳性神经元表达以及保护神经元线粒体等作用,对大鼠阿尔茨海默病具有明显的治疗作用.
