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Cry1Ie基因大肠杆菌表达蛋白对小鼠血液生化和肠道菌群的影响
为检测大肠杆菌表达的Cry1Ie蛋白为模式蛋白对小鼠血液生化和肠道菌群的影响,提供Cry1Ie基因的食用安全依据.将72只ICR小鼠分为Cry1Ie基因表达蛋白组(以833μg/kg BW d-1剂量喂饲小鼠30 d)、小牛血清白蛋白对照组和空载体大肠杆菌菌液对照组,观察小鼠体重、测定血液生化指标(谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总蛋白、血清白蛋白、尿素氮、肌苷、甘油三酯、胆固醇、血糖)和肠道菌群数量(肠杆菌、肠球菌、双歧杆菌、乳酸杆菌).Cry1Ie基因表达蛋白组与大肠杆菌菌液对照组、小牛血清白蛋白对照组比较,小鼠体重、血液生化指标和肠道菌群各指标的影响均未发现差异有显著性.实验结果显示在本实验条件下,Cry1Ie基因表达蛋白未对动物健康产生影响.
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用蛋白质羰基含量评价抗氧化保健食品的研究
为建立以蛋白质羰基含量为检测指标评价抗氧化保健食品的方法,用2,4-二硝基苯肼比色法测定幼龄和老龄小鼠不同组织蛋白质羰基含量,用3种具有抗氧化功能的保健食品饲喂小鼠,观察其对脑蛋白羰基含量的影响.发现随着年龄的增加,小鼠各组织中蛋白质羰基增量为脑>肝>心>血清.因此脑组织是实验的灵敏材料.利用本实验方法能够将抗氧化保健食品对蛋白质的保护功能反映出来.检测结果得出的结论与用卫生部<保健食品功能学评价程序和检测方法>所判定的结论相吻合.采用本方法可为评价抗氧化保健食品的功能提供有力的证据.
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甲醛值滴定法快速测定牛奶中蛋白质含量
目的 建立牛奶中蛋白质的快速检验方法-甲醛值滴定法.方法利用氨基酸的两性特性,加入甲醛溶液并用标准碱溶液滴定,通过测定牛奶中蛋白质的游离氨基酸含量,计算求得牛奶中蛋白质含量.结果牛奶中蛋白质含量与游离氨基酸含量呈良好的正相关,RSD%2.63～3.40,本法与国标法两种方法测定结果的绝对差值与其算术平均值之比小于5%,测定时阃由约3 h缩短为3～5 min.结论本方法有效地解决了非蛋白质类的含氮物质对牛奶中蛋白质测定结果的干扰问题,适用于牛奶与奶粉中蛋白质的快速定量检验.
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离子色谱法测定原料乳中蛋白质含量
目的 建立测定原料乳中蛋白质的离子色谱法.方法 用15%三氯乙酸沉淀原料乳中蛋白并抽滤得滤液,用硫酸-双氧水体系分别消解原料乳及滤液,用20 mmol/L的甲烷磺酸作淋洗液,Ionpac CS12A色谱柱,DS-6电导检测器测定原料乳及滤液中的NH4+-N含量,两者之差乘以转换系数即为蛋白质含量.结果 蛋白质(以NH4+-N计)在0.2～10 mg/L范围内线性良好,该方法的定量限为0.038 g/100 g,加标回收率为90.0%～105.0%,相对标准偏差(RSD)为1.06%～5.38%.结论 本法简便、快速、准确,灵敏度及精密度高,适用于原料乳中蛋白质含量的测定.
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ERCC1反义RNA降低肺癌细胞对苯并(a)芘所致DNA损伤的修复能力
目的探讨核苷酸切除修复基因ERCC1在肺癌细胞修复苯并(a)芘所致DNA损伤中的作用.方法构建表达ERCC1反义RNA的重组质粒,Lipofectin转染肺癌A549细胞,潮霉素筛选出稳定转染的细胞克隆;噻唑蓝法检测24 h细胞生存力;Northern Blot分析细胞ERCC1基因mRNA表达水平;单细胞凝胶电泳技术检测DNA损伤程度,每组计算50个细胞损伤情况.结果筛选出表达ERCC1反义RNA的7个阳性克隆,其生长特性与亲本细胞差别无显著性;内源性mRNA表达水平不同程度降低,为亲本细胞的12%～86%;DNA损伤修复速度减慢,10μmol/L苯并(a)芘作用24 h后再孵育24 h,修复程度为亲本细胞的29%～71%;相关分析表明DNA损伤修复程度与ERCC1mRNA水平显著相关.结论ERCC1反义RNA降低肺癌细胞对苯并(a)芘所致DNA损伤的修复能力.
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汽油对皮肤细胞DNA、蛋白质及皮脂合成能力的影响
目的研究溶剂汽油对皮肤细胞的损害作用机制.方法采用皮肤角蛋白细胞和成纤维细胞原代培养技术,以及3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)、3H-脯氨酸(3H-Pro)、3H-亮氨酸(3H-Leu)和14C-亚油酸掺入实验方法,观测溶剂汽油对皮肤细胞DNA、蛋白质及皮脂合成能力的影响.结果接触0.01%的溶剂汽油后,角蛋白细胞的3H-TdR、成纤维细胞的3H-TdR和3H-Pro的掺入受到明显抑制,抑制率分别为68.5%、45.1%和40.6%;而在接触0.001%溶剂汽油时,角蛋白细胞的3H-Leu和14C-亚油酸的掺入就已表现出显著性降低,抑制率分别为20.2%和41.2%.皮肤细胞的掺入抑制率与接触溶剂汽油的剂量有关.结论溶剂汽油对皮肤细胞具有一定的毒效应,可干扰皮肤细胞的正常生理代谢过程,影响其DNA、蛋白质及脂质合成能力,使皮肤各项生理功能受到影响,这可能是溶剂汽油造成皮肤损害的机制之一.与成纤维细胞相比,角蛋白细胞更易受到溶剂汽油的影响.
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热休克蛋白70 mRNA表达及蛋白水平对职业性锰接触者的神经保护作用
目的 研究热休克蛋白70(HSPs70)mRNA表达及蛋白水平对职业性锰接触者的神经保护作用.方法 于2008—2009年,采用横断面研究设计,应用分层随机抽样方法,在山东省某机车车辆厂选择接触锰浓度稳定、作业位置相对固定、工作1年以上的专职电焊作业人员作为暴露组,共180名;采用上述方法选择与暴露组民族、性别、年龄、出生地相似,近3年内无锰职业接触的同机车车辆厂非电焊工人员作为对照组,共100名.以SYBR Green I嵌合Real-time PCR检测HSPs70 mRNA含量表达;应用Western blot法检测HSPs70的蛋白含量;并应用火焰原子吸收法测定锰职业接触工人的空气锰个体接触剂量.用8 h时间加权平均浓度(8h-TWA)表示锰个体接触浓度,根据空气锰工作场所职业接触限值(8h-TWA=0.15 mg/m3) ,将暴露组分为高暴露组(>0.15 mg/m3)和低暴露组(<0.15 mg/m3)结果 暴露组个体锰接触剂量为(0.25±0.31)mg/m3,高于对照组[(0.06±0.02)mg/m3](t=6.15,P=0.001);高暴露组个体锰接触剂量为(0.42±0.34)mg/m3,高于低暴露组[(0.09±0.07)mg/m3](t=9.80,P=0.001).暴露组HSPs70 mRNA及蛋白表达量分别为5.65 ± 0.21、3.26 ± 0.15,均高于对照组(0.41±0.03和1.32±0.12)(t值分别为18.91、8.68,P值均为0.001);高暴露组的HSPs70 mRNA及蛋白表达水平分别为6.48 ± 0.37、3.67 ± 0.26,亦均高于低暴露组(5.15 ± 0.23和3.02 ± 0.19)(t值分别为3.24、2.04,P值分别为0.003、0.043).结论 锰接触者外周血淋巴细胞HSPs70水平及HSPs70 mRNA表达的增高与保护神经细胞免受锰刺激引起的脂质过氧化等损伤有关.
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衣原体噬菌体衣壳蛋白3的结构、免疫原性及临床价值研究
分析衣原体微病毒Vp3蛋白在分子重组、分子进化及病毒野生株筛查的作用并挖掘生物信息,揭示其临床研究价值.以ProteinBlast的Multriple alignment程序比对各株衣原体微病毒衣壳蛋白Vp3序列;以Distance tree(ProteinBlast)程序完成种系发生树.以比对获得的高保守区的氨基酸序列为目标,应用Karplus-schu1z法进行柔性区域分析;通过Gamier-robson法和Chou-fasman法分析该序列的二级结构;使用Emini法完成表位的表面可及性分析,并用Kyte-Doolittle法和Hopp-woods法完成蛋白亲水性研究;应用Jameson-WoH法完成表位的抗原指数分析.6株衣原体微病毒Vp3蛋白序列高度保守,差异主要在Chp1与其他5株微病毒的Vp3蛋白之间.各株微病毒的Vp3蛋白均有以a螺旋为主的结构,蛋白序列高保守区存在多个细胞表位.Vp3蛋白结构性质保守,也是衣原体噬菌体衣壳的重要组分.其蛋白分子结构复杂,高保守区有较强的免疫原性,在分子重组、沙眼衣原体微病毒野生株筛查研究中有实际研究价值.
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血清瘦素水平变化对围绝经期妇女脂类代谢的影响
探讨瘦素与围绝经期妇女肥胖及脂类代谢的关系.本文分别测量了110例围绝经期妇女(疾病组)血清瘦素(Leptin)、胰岛素(INS)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、载脂蛋白A1(apoA1)、载脂蛋白B(apoB)、垂体促性腺激素(LH、FSH)、雌二醇(E2)、睾酮(T)、孕酮(P)及体重和身高.与60名正常育龄妇女(对照组)进行比较分析.结果表明围绝经期肥胖组、非肥胖组血清Leptin、INS水平增高与对照组比较其差异有显著意义(P＜0.01).肥胖组LDL-C 5.01mmol/L、TG 2.21mmol/L、apoB 0.89g/L与非肥胖组及对照组相比,其差异有显著意义(P＜0.01).研究组内LH、FSH、E2和T值,差异无显著意义(P＞0.05),但与对照组比较,差异有显著意义(P＜0.01).相关分析显示:围绝经期妇女Leptin与BMI、INS、LDL-C、apoB高度相关(r=0.762,P=0.002;r=0.382,P=0.01,r=0.430,P=0.002;r=0.545,P=0.001; r=0.454,P=0.001),且LDL-C与apoB同步升高在明显相关(r=0.796,P=0.001).围绝经期瘦素水平与HDL-C、apoA1分析未见相关(r=-0.222～-0.190,P＞0.05).围绝经期Leptin水平与脂类代谢异常相关,肥胖、Leptin增高围绝经期妇女更应重视脂类代谢异常.
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HIV-1gp41蛋白的表达及其免疫反应性
目的 高效表达HIV-1 gp41基因片段,满足生产HIV体外检测试剂的需要.方法 以含HIV-1 gp41基因的质粒X1为模板,采用PCR方法扩增出gp41基因,克隆入E1载体构建重组表达质粒E1-1,转化E.coli BL21DE3感受态细胞,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,使用镍螯合琼脂糖亲和层析柱(Ni-NTA Agaros)纯化重组蛋白,通过ELISA法检测重组蛋白的免疫反应性和特异性.结果 SDS -PAGE鉴定结果表明,重组E1-1蛋白获得了正确的表达;纯化的重组E1-1蛋白纯度＞95％; ELISA检测结果表明,重组E1-1蛋白具有较优的免疫反应性和特异性.结论 成功表达出具有较高免疫反应性的重组E1-1蛋白,可应用于HIV体外检测试剂.
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肝细胞癌中与转录激活因子3相互结合的蛋白质的筛选及验证
目的 筛选及验证肝癌细胞中与转录激活因子3(ATF3)相互结合的蛋白质,初步探讨在肝癌发生发展中协助ATF3发挥生物学功能的相关分子机制.方法 应用免疫沉淀法沉淀出HepG2细胞中与ATF3相互结合的蛋白,经变性聚丙烯凝胶分析,与空载体组比对,挑选出差异性的电泳条带进行蛋白质谱分析,筛选出候选蛋白;再经免疫共沉淀验证二者是否相互结合;应用免疫组织化学及Western blot检测并分析ATF3和候选蛋白在肝癌中的表达模式.结果 过表达ATF3的HepG2实验组呈现出差异性表达的电泳条带;经质谱检测,Mascot软件分析及NCBI数据库检索,得到候选蛋白肽段信息,结合前期实验结果,PubMed文献报道,从中筛选出与ATF3可能相关的蛋白gelsolin(GSN);免疫共沉淀结果验证了ATF3与GSN相互结合的关系,免疫组织化学及Western blot检测出肝癌组织中ATF3与GSN的表达模式一致.结论 ATF3可能通过与GSN蛋白之间的相互作用,在肝癌形成过程中协同发挥抑癌作用.
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共表达HPV16型E6和E7突变基因重组痘苗病毒的构建及其抗肿瘤免疫效果的观察
目的构建用于子宫颈癌治疗的HPV16型E6和E7重组痘苗病毒实验性疫苗株,并对其抗肿瘤免疫效果进行初步评价.方法以痘苗病毒为载体、利用同源重组技术构建共表达HPV16 E6和E7基因的重组痘苗病毒.该病毒免疫C57BL/6小鼠后,检测其免疫原性和抗移植瘤生长情况.结果 PCR结果显示,重组病毒VmE6E7的TK基因内插入了分别由痘苗病毒早晚期启动子H6和7.5 K表达的ME6和ME7-1基因.动物实验结果表明, rVmE6E7在C57BL/6小鼠体内可诱发E6和E7特异性抗体产生,被免疫小鼠能够抵抗HPV16 E6E7转化的同系肿瘤细胞的攻击.结论获得1株用于宫颈癌治疗的HPV16型实验疫苗株,为进一步研制人用HPV16型疫苗株奠定了基础.
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H1N1亚型流感病毒M1和NA基因在昆虫杆状病毒系统中的共表达
目的 构建共表达H1N1亚型流感病毒M1和NA基因的重组杆状病毒.方法 以PCR扩增H1N1亚型流感病毒A/PR/8/34毒株M1和NA基因,构建含有M1、NA双基因的重组转移载体pFBD-M1-NA,将其转化DH10Bac,获得重组Bacmid-M1-NA穿梭载体.将Bacmid-M1-NA转染sf9昆虫细胞,在细胞内包装出重组杆状病毒rBac-M1-NA,空斑实验测定病毒滴度,PCR方法鉴定外源基因插入情况.间接免疫荧光(IFA)检测M1、NA基因的表达情况.结果 获得的重组杆状病毒滴度为1×107pfu/ml;PCR检测结果证实M1、NA基因成功整合到了重组杆状病毒基因组.IFA结果显示,rBac-M1-NA感染的sf9昆虫细胞成功表达了M1、NA基因.结论 利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功构建了共表达H1N1亚型流感病毒M1和NA基因的重组杆状病毒,为研究流感病毒样颗粒(VLPs)的形成机制以及新型流感疫苗研发奠定了基础.
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非酒精性脂肪肝患者肝脏固醇调节元件结合蛋白1c的表达及意义
目的 观察非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)患者肝组织固醇调节元件结合蛋白(SREBP1c)的表达变化,探讨其在NAFLD病理变化形成中的作用.方法 研究对象为NAFLD患者20例,20例年龄性别匹配的同期住院行肝活检无活动肝病组织学证据且肝脂肪变＜5％的慢性HBV携带者(ASC)设为对照组.免疫组织化学染色检测两组患者肝组织SREBP1c的表达,并比较血脂(TG、CHO)、空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)和血清肝脏酶谱(AST、ALT、GGT)等的组间差异.结果 与对照组患者比较,NAFLD组肝组织呈不同程度的弥漫性肝细胞脂肪变性,肝组织SREBP1c表达明显升高(P＜0.05),与此一致,血清ALT、AST、TG、CHO、FBG、FINS水平升高(P均＜0.05).结论 NAFLD患者肝组织SREBP1 c表达增高,在人NAFLD脂肪变形成过程中起重要作用.
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逆转录病毒载体介导人类G6PD基因在人红白血病细胞中的表达
目的探讨逆转录病毒载体介导人类G6PD基因在人白血病细胞中的表达.方法构建G6PD cDNA的逆转录病毒表达载体pLG6PDSN,转染包装细胞PA317,病毒上清感染人红白血病细胞K562,以PCR方法检测病毒载体是否整合于细胞基因组,定量法测定G6PD表达.t检验比较转染组与对照组间的表达差异.结果酶切鉴定表明,G6PD cDNA准确插入pLXSN相应位点,载体构建成功.转染后PCR扩增NeoR基因,证明细胞DNA整合有逆转录病毒载体.转染组与对照组酶活性测定差异有显著性(P<0.01).结论本试验所构建的重组载体pLG6PDSN为严重G6PD缺陷症的基因治疗提供了表达载体.
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改良Lowry法测定Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗蛋白质含量的研究
目的 建立Sabin株脊髓灰质病毒灭活疫苗(Sabin strain inactivated poliovims vaccine,SabinIPV)中微量蛋白质含量测定的方法.方法 采用lowry法结合三氯乙酸沉淀法测定试样中的蛋白质含量,摸索并优化各个实验条件.结果 该方法能够排除Sabin IPV疫苗样品中游离氨基酸、多肽和酚红指示剂等的干扰,线性范围为2.5-40μg/ml,r=0.9998;加标平均同收率为95.32%,批内和批间变异系数均小于10%.结论 三氯乙酸沉淀法结合Lowry法的改良方法可以用于测定生物制品中微量蛋白含量.
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人tau蛋白外显子2和外显子3特异性抗体的制备
目的 制备人微管相关蛋白tau N端的外显子2和外显子3特异性多克隆抗体.方法 从人外周血DNA中获得tau蛋白外显子2及外显子3序列并连接至原核表达载体pGEX-2T,表达纯化重组融合蛋白GST-E2、GST-E3;以此融合蛋白免疫家兔及小鼠制备抗血清,通过ProteinG/A、偶联GST蛋白的溴化氰(CNBr)活化柱对抗血清进行亲和纯化;用Western Blot及ELISA方法确定所制备抗体的特异性和敏感性.结果 在大肠埃希菌中表达纯化出人tau外显子2和外显子3重组融合蛋白GST-E2和GST-E3,相对分子质量为29×103.免疫实验动物后获得抗血清,经系列纯化后Western Blot和ELISA检测显示,制备的抗人tau蛋白外显子2和外显子3抗体具有良好的特异性和免疫反应效价.结论 成功制备了4种人tau外显子2和外显子3特异性抗体,为进行tau蛋白在神经退行性疾病中的作用研究提供了基础.
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前S1蛋白与乙肝病毒复制的关系
乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的一种世界性疾病,我国是乙型肝炎的高流行区.1988年,姚光弼等研究证实,前S1和前S2蛋白可以作为表达病毒活动性复制的新标志,并提示两者可能均涉及到病毒对肝细胞的附着过程[1].
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重组人促红细胞生成素对颅脑创伤患者血清NSE、S-100β及IL-10的影响
目的 探讨重组人促红细胞生成素(R-huEPO)对颅脑创伤患者血清NSE、S-100β、IL-10 的影响.方法 纳入40 例颅脑创伤患者,随机分为治疗组和对照组各20 例,均给予常规颅脑创伤治疗,治疗组在此基础给予R-huEPO 皮下注射治疗,比较两组治疗后的外周血清NSE、S-100β、IL-10含量及格拉斯哥昏迷(GCS)评分.结果 治疗组GCS 评分较治疗前显著升高(P ＜0.01)并高于对照组(P ＜0.05);治疗组血清NSE、S-100β含量显著降低且低于对照组(P ＜0.05),血清IL-10 含量降低而程度小于对照组(P ＜0.05);外周血清NSE、S-100β含量与GCS 评分呈负相关.结论 NSE、S-100β及IL-10 与颅脑创伤患者的神经损害密切相关.R-huEPO 可抑制过度炎症反应,减轻颅脑创伤患者继发病理损伤,具有神经保护作用.
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三种人胚胎许旺细胞培养方法的比较
目的 比较三种不同培养方法对许旺细胞纯度影响.方法 应用三种不同的培养方法对10 份人胚胎样本的坐骨神经分别采用植块培养法、差速贴壁法、分次消化法进行培养观察.并采用S100 免疫荧光化学方法鉴定许旺细胞,Hoechst 染色标记细胞核,统计许旺细胞纯度.结果 三种培养方法其获得的细胞纯度分别为:分次消化培养法为90%,差速贴壁法为75%,植块培养法为67%,分次消化培养法获得的细胞纯度明显高于其他两组(P <0.05).结论 分次消化培养法较差速贴壁法、植块培养法更易获得高纯度许旺细胞.
