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WB条带重复使用检测HIV抗体的探索
[目的]在确保检测质量的前提下,探索蛋白印迹(WB)确认实验阴性对照和阴性样本条带重复使用的可能性,以降低使用HIV抗体确认试剂的成本.[方法]严格按照<全国艾滋病检测技术规范>(2004年版)的要求和Genelabs公司生产的H1V1+2型(HIV BLOT 2.2)抗体免疫印迹试剂盒提供的使用说明进行试验.用新试剂和已使用过的阴性对照和阴性样本的WB条带分别对8份阴性样本、12份卫生部艾滋病参比实验室提供的HIV抗体阳性样本和20份HIV抗体阳性样本进行HIV抗体确认试验,用该试剂盒提供的弱阳性质控样品对试验样本进行5次重复比对实验.[结果]使用过的WB条带与未使用过的WB条带进行HIV抗体确认试验,结果是一致的.[结论]该方法一旦在全国近200家HIV抗体确认实验室推广使用,假设每个实验室每周进行1次确认实验,每年将可以为国家节约HIV抗体确认试剂费近200万元人民币.
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蛋白印迹法检测梅毒IgG抗体
目的 探讨蛋白印迹法(Western Blot,WB)检测梅毒IgG抗体的意义.方法 采用蛋白印迹法检测梅毒孕妇新生儿血清标本24例,并与甲苯胺红不加热血清试验(TRUST)、梅毒螺旋体被动明胶颗粒凝集试验(TPPA)结果相比较.结果 24例梅毒孕妇新生儿血清标本TRUST18例阳性,TPPA和WB24例均为阳性,WB24例均检测出针对15Kda(千道尔顿)、17Kda、45Kda和47Kda多肽抗原抗体.结论 蛋白印迹法是一种理想的梅毒确认实验,适用于临床广泛开展.
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艾滋病病例因眼部症状首诊眼科3例临床分析
对1998年收治的以眼部症状首诊眼科的3例艾滋病病人进行临床分析.该3例均经新疆维吾尔自治区艾滋病监测中心用蛋白印迹法,确认为抗-HIV阳性的青年.均为男性.有反复发热、消瘦史,2例抗-HCV阳性,2例胸部CT片示有类似结核病变,尿检蛋白阳性.
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热休克蛋白70 mRNA表达及蛋白水平对职业性锰接触者的神经保护作用
目的 研究热休克蛋白70(HSPs70)mRNA表达及蛋白水平对职业性锰接触者的神经保护作用.方法 于2008—2009年,采用横断面研究设计,应用分层随机抽样方法,在山东省某机车车辆厂选择接触锰浓度稳定、作业位置相对固定、工作1年以上的专职电焊作业人员作为暴露组,共180名;采用上述方法选择与暴露组民族、性别、年龄、出生地相似,近3年内无锰职业接触的同机车车辆厂非电焊工人员作为对照组,共100名.以SYBR Green I嵌合Real-time PCR检测HSPs70 mRNA含量表达;应用Western blot法检测HSPs70的蛋白含量;并应用火焰原子吸收法测定锰职业接触工人的空气锰个体接触剂量.用8 h时间加权平均浓度(8h-TWA)表示锰个体接触浓度,根据空气锰工作场所职业接触限值(8h-TWA=0.15 mg/m3) ,将暴露组分为高暴露组(>0.15 mg/m3)和低暴露组(<0.15 mg/m3)结果 暴露组个体锰接触剂量为(0.25±0.31)mg/m3,高于对照组[(0.06±0.02)mg/m3](t=6.15,P=0.001);高暴露组个体锰接触剂量为(0.42±0.34)mg/m3,高于低暴露组[(0.09±0.07)mg/m3](t=9.80,P=0.001).暴露组HSPs70 mRNA及蛋白表达量分别为5.65 ± 0.21、3.26 ± 0.15,均高于对照组(0.41±0.03和1.32±0.12)(t值分别为18.91、8.68,P值均为0.001);高暴露组的HSPs70 mRNA及蛋白表达水平分别为6.48 ± 0.37、3.67 ± 0.26,亦均高于低暴露组(5.15 ± 0.23和3.02 ± 0.19)(t值分别为3.24、2.04,P值分别为0.003、0.043).结论 锰接触者外周血淋巴细胞HSPs70水平及HSPs70 mRNA表达的增高与保护神经细胞免受锰刺激引起的脂质过氧化等损伤有关.
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桂枝汤有效部位A对下丘脑热休克蛋白含量的影响
目的:研究桂枝汤有效部位A(Fr.A)在双向调节体温的同时对下丘脑热休克蛋白(HSP)的影响.方法:取高、低体温大鼠下丘脑组织,应用蛋白印迹法测定热休克蛋白含量.结果:Fr.A在双向调节体温的同时,可明显拮抗安痛定性低体温大鼠下丘脑HSP70含量的降低,对酵母性高体温大鼠下丘脑HSP70含量具有一定的降低作用.结论:Fr.A对高、低体温大鼠下丘脑HSP70含量的调节作用是其双向调节体温的机理之一.
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麻疹病毒血凝素基因原核表达与抗原性鉴定
目的 利用大肠杆菌表达系统表达麻疹病毒血凝素(Hemagglutinin,H)基因,并将表达产物应用于麻疹病毒抗体的检测.方法 从麻疹病毒株MVi/Zhejiang.CHN/7.05/4中提取核糖核酸,用逆转录-聚合酶链反应(ReverseTranscription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)扩增H基因,并克隆到大肠杆菌表达载体pET28a(+);用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导重组质粒在大肠杆菌BL21(DB3)中进行表达;利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE)和蛋白印迹法(Western Blotting)分析重组蛋白表达情况和抗原性:通过Ni-NTA亲和层析获得的高纯度目的 蛋白用于酶联免疫吸附试验.结果 RT-PCR获得的H基因外段约长1700bp,经测序确证无突变.转化的大肠杆菌表达产物在SDS-PAGE中出现与目的 蛋白分子量相一致的条带,且重组蛋白主要以包涵体形式存在;蛋白印迹(Western Blot)显示,表达产物具有良好的抗原性.结论 构建麻疹病毒H基因的原核表达体系,纯化的重组蛋白可用作麻疹病毒检测的抗原.
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Wnt2信号通路重要成员在胶质瘤中的表达及其意义
近来发现Wnt信号通路对个体发育和肿瘤生成具有重要作用[1-2].为进一步探讨Wnt通路在胶质瘤中是否存在表达异常及其在胶质瘤生成中的作用,我们采用RT-PcR、组织芯片免疫组织化学染色以及蛋白印迹法,对人脑胶质瘤Wnt2通路相关因子的表达变化及其意义进行了分析.
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变性乙型肝炎病毒表面s抗原抗体的制备和应用
在新型乙型肝炎基因工程疫苗(s+pre s1,ss1)的研制中,对s抗原的免疫学鉴定至关重要,但我国现有的乙型肝炎病毒表面抗体不能有效地用于蛋白印迹法(Western blot)鉴定变性乙型肝炎病毒表面s抗原.常规的从SDS-PAGE凝胶上回收变性抗原多肽免疫动物,可诱导免疫应答,产生抗体,但从凝胶上回收的变性抗原量很少,无法用来大量制备抗血清;电泳结束后,切下含特异多肽的凝胶条,制成凝胶碎末,或凝胶转至硝基纤维素滤膜,剪下相应部分,溶于二甲基亚砜,再加佐剂免疫动物,整个方法操作步骤多、耗时长、切割相应多肽部位难以掌握精确[1].我们建立了一种新的抗变性乙型肝炎病毒(HBV)s抗原抗血清的制备方法,并把该方法制备的抗血清成功地应用于HBV s抗原的Western blot鉴定工作中.
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JDP2与胰腺癌侵袭及转移的相关性
目的: 探讨JDP2蛋白在胰腺癌组织中的表达及其与胰腺癌临床病理特征的关系.方法: 利用Western blot检测36例胰腺癌手术切除标本与对应的癌旁胰腺组织中JDP2蛋白的表达.用Log-rank检验分析JDP2蛋白表达与预后的关系.结果: JDP2在胰腺癌中的表达与对应癌旁胰腺组织相比显著下降(0.287±0.052 vs 0.517±0.172, P<0.05).JDP2在胰腺癌中的表达与肿瘤大小、病理分级、肿瘤累及范围、淋巴结转移、远处转移和临床分期有明显差异(P<0.05), 胰腺癌中JDP2的表达水平下降时,术后生存时间明显缩短(P<0.01).结论: JDP2可能与胰腺癌的增殖、侵袭、转移及预后密切相关.
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错配修复基因hMLH1和hMSH2在胃癌组织中的表达及意义
目的:探讨错配修复基因hMLH1和hMSH2在胃癌发生中的作用.方法:收集青岛大学医学院附属医院普外科手术切除的胃癌组织40例, 经病理诊断腺癌33例, 黏液腺癌7例, 患者术前均未接受放化疗和免疫治疗, 每例均取相应癌旁组织. 胃镜活检20例慢性胃炎黏膜组织(慢性浅表性胃炎10例, 慢性萎缩性胃炎10例). 采用Western blot法检测hMLH1和hMSH2蛋白在胃癌组织、癌旁组织及胃炎组织中的表达.结果:胃癌组织中hMSH2蛋白的表达显著高于癌旁组织和胃炎组织(0.28±0.10 vs 0.23±0.07, 0.11±0.10, 均P <0.01); hMLH1蛋白在胃炎组织和癌旁组织中的表达显著高于胃癌组织(0.28±0.07, 0.26±0.06 vs 0.22±0.06, 均P <0.01); hMLH1和hMSH2在胃癌中的表达与年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤大小、浸润深度、组织学类型、分化程度、淋巴结转移、远处转移等无关, 差异均无显著性.结论:hMSH2高表达可能是胃癌发生的标志之一, 而hMLH1则可能是胃癌预警组织的一种标志物.
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低浓度一氧化碳在防止大鼠小肠脂多糖诱导损伤中的保护作用
目的:观察低浓度一氧化碳(CO)吸入和腹腔给予在防止脂多糖(LPS)诱导大鼠小肠损伤中的作用,探讨其可能的信号转导机制.方法:6组SD大鼠ip 5 mg/kg体质量LPS或等容量生理盐水1 h后,对照组(A)吸入室内空气,CO组(B)吸入体积分数为2.5×10-4CO,CO腹腔组(C)腹腔通入体积分数为2.5×10-4CO,LPS组(D)吸入室内空气,LPS+CO组(E)吸入体积分数为2.5×10-4CO,LPS+CO腹腔组(F)腹腔通入体积分数为2.5×10-4CO.观察3 h放血处死,取小肠,酶联免疫吸附法测定血小板活化因子(PAF)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)水平;化学比色法测定丙二醛(MDA)含量及髓过氧化物酶(MPO)活性;流式细胞仪测定细胞凋亡率;半定量逆转录聚合酶链反应测定血红素氧合酶-1(HO-1)mRNA,蛋白印迹法测定磷酸化p38 MAPK表达;光镜观察形态学变化.结果:E和F组PAF、ICAM-1、MDA、MPO的表达(0.87±0.18 ng/g,0.82±0.16 ng/g vs 1.15±0.21 ng/g;2.96±0.39 ng/g,2.69±0.23ng/g vs 3.48±0.36 ng/g;1.74±0.17 mmol/g,1.71±0.24 mmol/g vs 2.75±0.76 mmol/g;35.34±14.67μkat/g,33.01±12.84μkat/g vs 68.01±18.67μkat/g;P＜0.05)以及细胞凋亡率均明显低于D组(30.56%±6.33%,34.45%±5.77% vs 41.52%±3.36%;P＜0.05),而HO-1mRNA及磷酸化p38 MAPK的表达显著高于D组(6.29±1.56,7.21±1.78 vs 3.97±1.16,14219±1724,13774±1886 vs 10227±1312;P＜0.05),E和F组小肠损伤较D组减轻,组间比较,差异无统计学意义.结论:低浓度CO吸入和腹腔给予通过抗氧化、抗炎、抑制细胞凋亡及上调HO-1表达,在防止大鼠小肠避免LPS诱导损伤中的保护作用;p38 MAPK可能参与CO保护作用的信号转导.
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香烟烟雾增加支气管哮喘大鼠气道平滑肌细胞的增殖表达
吸烟是影响支气管哮喘(简称哮喘)发生、发展的重要危险因素,它可以增加哮喘发生频率和症状的严重程度[1];香烟烟雾(CS)可使多种细胞蛋白激酶C(PKC)活化[2],但机制尚未明确.我们的实验通过CS及PKC激动剂:12-肉豆蔻酰-13-乙酸佛波酯(PMA)、抑制剂:马来酰亚胺甲磺酸盐(Ro-31-8220)干预哮喘大鼠气道平滑肌细胞(ASMCs),用四甲基偶氮唑盐(MTT)和氚标-胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TdR)掺入法观察ASMCs增殖,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹法检测ASMCs PKC-α的表达.探讨CS及PKC在哮喘大鼠ASMCs增殖中的作用,为明确CS影响哮喘的病理生理机制提供一些实验资料.
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尾加压素Ⅱ与支气管哮喘患者的相关性研究
我们采用蛋白印迹法测定正常人及支气管哮喘患者血清尾加压素Ⅱ水平,探讨血清尾加压素Ⅱ与支气管哮喘(简称哮喘)的相关性.
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胃癌组织中水通道1蛋白和mRNA的表达及其临床意义
水通道1(aquaporin-1,AQP1)是一类存在于细胞膜上的水通透性蛋白,与消化道肿瘤的侵袭和转移有密切关系[1-2].本研究采用免疫组化法、蛋白印迹法和RT-PCR技术检测胃癌组织中AQP1蛋白和mRNA的表达,旨在探讨AQP-1在胃癌侵袭和转移中的作用.
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橄榄苦苷的抗结肠癌作用机制
【据《Nutr Cancer》2013年1月报道】题：一种来源于橄榄树的裂环烯醚萜-橄榄苦苷通过下调HIF-1α抑制结直肠癌细胞增殖（作者Cárdeno A等）
橄榄苦苷是橄榄树果实中主要的酚类化合物，尽管其显示出有效的抗癌活性，但大部分作用机制尚不清楚。西班牙塞维利亚大学药学院的研究人员评估了橄榄苦苷和其水解产物羟基酪醇对人结肠癌细胞HT-29的影响，并且阐明了橄榄苦苷抗癌的相关分子机制。研究人员通过细胞活力测定以明确HT-29细胞增殖，流式细胞术评估其细胞周期与细胞凋亡，并且利用蛋白印迹法观察了丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联蛋白表达变化及低氧诱导因子1α（HIF-1α）、抑癌基因p53、过氧化物酶体增殖蛋白激活性受体γ（PPARγ）和核因子κ（NF-κB）信号通路的变化。 -
非小细胞肺癌TCF21基因表达及其启动子区甲基化的研究
目的 探讨非小细胞肺癌(NSCLC)中TCF21基因mRNA和蛋白的表达水平及其启动子区甲基化状态的意义.方法 运用RT-PCR、蛋白印迹法(Western-blot)和焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术检测97例非小细胞肺癌组织和21例支气管扩张或肺大疱等手术切除的良性肺组织中TCF21基因mRNA、蛋白表达及启动子区甲基化状态.结果 97例NSCLC癌组织和21例良性肺组织中分别检测出TCF21基因mRNA阳性表达23例(23.71％)和14例(66.67％);NSCLC癌组织中TCF21蛋白平均表达量灰度值为0.49±1.78,良性肺组织中其平均表达量灰度值为1.48±1.58; NSCLC癌组织和良性肺组织中TCF21基因启动子区均有不同程度的甲基化,且癌组织和良性肺组织中各个位点甲基化频率均有统计学意义,在NSCLC癌组织中第1、5位点平均甲基化频率较高为49.04％和51.37％.结论 TCF21基因mRNA及蛋白表达在NSCLC癌组织和良性肺组织中均有统计学意义,TCF21基因启动子区平均甲基化频率明显高于良性肺组织细胞.
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子宫内膜异位症模型大鼠输卵管中特络细胞超微结构损伤的研究
子宫内膜异位症（内异症）是1种引起育龄期妇女不孕的常见的内分泌疾病，其引起不孕的机制复杂，涉及盆腔微环境改变、免疫功能异常及盆腔粘连等因素。近发现，内异症中可出现输卵管蠕动功能异常[1]，慢性输卵管炎、积水等病理改变[2-3]，均提示输卵管因素是内异症性不孕的重要病因之一。近年，特络细胞（telocyte，TC）作为1种新型的间质细胞被发现，其在正常人体的心、肺、肾、子宫及输卵管中广泛存在[4-8]，特征是极其细长的细胞突起，称为端支或远足（telopode）[9]。目前认为，TC参与信号传导、免疫调节、干细胞介导的组织修复、机械支持、内环境稳定、神经传递等功能，但在疾病中的改变以及作用仍未知。因此，本研究通过建立SD大鼠输卵管内异症模型，采用透射电镜观察输卵管内TC的超微结构改变，并采用蛋白印迹法（western blot）定量检测炎症因子--环氧合酶2(COX-2)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达，旨在探讨TC损伤对输卵管结构及生殖功能的影响，以及其在输卵管性不孕症中的潜在作用。
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前列腺癌组织Vitronectin表达临床意义研究
目的:观察玻连蛋白(vitronectin,VTN)在前列腺癌组织及患者血清中的表达,并探讨其临床意义及与前列腺癌转移的相关性.方法:应用免疫组织化学法检测2010-01-01-2012-12-31新疆医科大学附属肿瘤医院泌尿外科34例前列腺癌转移(prostate cancer metastasis,PCaM)患者、32例前列腺癌未转移(prostate cancer,PCa)患者及29例良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia,BPH)患者组织中VTN表达,通过x2检验比较各组组织中VTN的表达差异,分析前列腺癌组织中VTN表达与临床病理因素的相关性;同时用蛋白印迹法检测相应患者血清中VTN表达,通过方差分析及SNK法检验各组血清中VTN的表达差异.结果:BPH组、PCa组及PCaM组组织样本中VTN的阳性表达率分别为82.76％(24/29)、59.38％(19/32)及32.35％(11/34),VTN在BPH组组织中的表达水平高于PCa组,PCa组高于PCaM组,x2 =16.34,P＜0.001;前列腺癌组织中VTN表达与患者初诊血清PSA(P=0.004)、肿瘤临床分期(P=0.025)及Gleason评分(P=0.004)存在相关性;VTN在BPH组血清样本中的光密度比值为0.83±0.07,高于PCa组0.65±0.06,PCa组高于PCaM组0.35±0.08,P＜0.001.结论:VTN与前列腺癌的发生和转移可能相关,并可能在前列腺癌的进展中起重要作用,借助测定血清VTN的表达可能可以协助前列腺癌的诊断和疾病进展评估.
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17AAG-cypate聚合物胶束对肺癌A549细胞放射敏感性影响
目的 研究17AAG-cypate胶束对人非小细胞肺癌A549细胞的放射增敏作用,并简析其可能机制.方法 单击多靶模型拟合实验方程分析17AAG-M和17AAG-cypate-M的放射增敏作用.MTT实验检测17AAG-cypate-M在激光和X射线照射下对A549细胞存活率的影响.β-半乳糖苷酶染色实验观察药物对细胞衰老产生的影响.γ-H2AX免疫荧光染色实验分析不同处理条件对DNA损伤修复的影响.蛋白印迹法实验检测p-Erk1/2和p-Akt蛋白的表达情况.配对t检验差异.结果 与单纯X射线照射组相比D0下降,SER>1,说明17AAG-cypate-M具有放射增敏作用.与17AAG-M组相比,17AAG-cypate-M组对A549细胞活力抑制程度升高(P=0.0012),且引发了更明显的DNA损伤修复延迟(P=0.0017).同时,17AAG-cypate-M对p-Erk1/2和p-Akt表达水平的抑制程度高于17AAG-M.结论 与17AAG-M相比,17AAG-cypate-M对A549细胞的放射增敏作用更加明显,其放射增敏机制可能为引发细胞的衰老,延迟DNA损伤修复,抑制p-Erk1/2和p-Akt表达等.
关键词： 17AAG-cypate胶束 放射增敏 DNA损伤修复 蛋白印迹法 A549细胞 -
HIV-1抗体蛋白印迹法在性病门诊中的应用
目的 探讨艾滋病病毒Ⅰ型(HIV-1)抗体蛋白印迹法(WB)在性病门诊就诊者中的应用情况.方法 用第3代HIV酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂筛查11 558份性病门诊就诊者血浆样本,ELISA阳性样本和ELISA阴性但反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法阳性样本,用WB确证;RT-PCR法检测筛查结果阴性样本、WB结果可疑和阴性样本、以及部分WB阳性样本,进行RT-PCR检测.结果 18份WB阳性样本中,17份RNA阳性,1份RNA阴性;14份WB可疑样本中,13份RNA阴性,1份RNA阳性;32份WB阴性样本中,4份RNA阳性,28份RNA阴性.结论 (1) HIV WB存在生物学假阳性.(2)检测可疑者样本中HIV RNA,减少随访负担.(3)WB存在窗口期,不能检出HIV感染急性期样本.
