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2015—2017年上海市浦东新区H3N2亚型流感病毒流行特征与基因变异分析
目的 了解2015—2017年上海市浦东新区甲型H3N2亚型流感病毒流行特征及血凝素(HA)基因变异情况. 方法 收集2015年1月至2017年7月5 436份在上海市浦东新区两所国家级流感监测哨点医院采集符合流感样病例(ILI)定义的鼻咽拭子标本,使用荧光定量PCR进行常见流感亚型检测,核酸阳性样本进行MDCK细胞培养.选取275株甲型H3N2亚型病毒分离株进行HA基因测序,对比同期中国香港流行代表株和世界卫生组织(WHO)推荐疫苗株基因序列,分析关键氨基酸位点替换情况. 结果 流感病毒检出率为22.9%(1 245/5 436),其中54.5%(678/1 245)为甲型H3N2亚型.275株甲型H3N2亚型有效测序毒株HA基因分成3C.2a和3C.3a等2个主分枝,96.0%(264/275)毒株位于3C.2a分枝上,其中62株位于3C.2a1新分枝上;氨基酸替换位点主要为N121K,替换率为10.5%(29/275),在3C.2a1亚分枝中携带N121K替换位点的2017年毒株高达94.1%.结论 甲型H3N2亚型是上海市浦东新区2015—2017年流行的主要流感亚型,其HA基因位点改变带来的基因漂移是造成流行高峰的主要原因.
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1990～2004年上海市甲型流感病毒基因特性的研究
目的研究1990～2004年上海市甲型流感病毒流行株血凝素(HA)基因的特性,探讨流感病毒基因的变异与流感流行的关系.方法采用鸡胚和MDCK细胞两种方法分离甲型流感病毒.提取病毒RNA进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增产物纯化,核苷酸序列测定,并用MegAlign软件进行基因种系发生树分析.结果2000年以来上海市流行的甲3亚型与A/Sydney/5/1997(H3N2),A/Wuhan/359/1995(H3N2)相比,HA1区的核苷酸同源性为95.7%～98.6%和96.8%～98.6%.与90年代流行甲3亚型同源性为88.4%～92.8%,氨基酸的替换发生在抗原决定簇A、B、E、D区和受体结合位点(RBS)的左臂.甲1亚型与A/HongKong/1131/1998(H1N1)、A/Shanghai/7/1999(H1N1)相比,核苷酸同源性为97.8%～99.3%,与90年代流行的甲1亚型同源性为96.8%～97.8%.基因种系发生树表明近几年甲型流感病毒与90年代流行株存在基因特性不同的分支.结论2000年以来上海市H1N1亚型的抗原性未发生明显的变异,H3N2亚型流感病毒的基因发生变异使抗原性发生漂移,是近年引起局部地区流感暴发的主要因素.
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2010-2011年广东省东莞市甲型H1N1流行性感冒病毒血凝素基因变异特征研究
目的 了解2010-2011年广东省东莞市甲型H1N1流行性感冒(流感)病毒血凝素(HA)基因的特征及变化.方法 反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、基因扩增、测序得到标本HA基因的核酸序列,利用生物信息软件对序列的特征及变化情况进行分析.结果 通过测序得到各标本HA基因1701bp长度的核苷酸序列,566个氨基酸.2年间有24个氨基酸位点发生变异,但其中有12个位点的改变只出现在单个毒株上.发生明显变化趋势的位点只有145、202、391、468,其中202位点属于Sb抗原决定簇区.受体结合位点、潜在糖基化位点及二硫键比较稳定,2年间没有发生变化.结论 主要功能区域比较保守,无变化.序列中发生明显变化趋势的位点只有4个,其中1个位于抗原决定簇区,属于流感病毒抗原漂移过程中突变的累积.
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2009年宁波市甲3亚型流感流行特征与HA1基因特性的分析
目的 了解2009年宁波市甲3亚型流感病毒的流行特征及血凝素基因HA1区域的变异情况.方法 全年度每周从流感监测哨点医院收集流感样病例标本进行病毒分离,获得的甲3亚型流感毒株按不同时间、地点进行血凝素基因HA1区核苷酸序列测定并推导出其氨基酸序列,然后进行基因特性分析.结果 所选取的15株甲3亚型流感病毒HA1区域核苷酸序列长度均为987 bp,编码329个氨基酸;2009年上半年的流行株与2008年秋季的流行株在该区域有7个氨基酸位点存在差异,2009年下半年的流行株与2009上半年又存在10个氨基酸位点的差异.上半年与下半年的流行株在种系发生树上形成两个分支,为不同性状的流行株.结论 2009年上半年及下半年宁波市甲3亚型流感流行株与2008年相比,在血凝素基因HA1区域都发生了较为明显的改变,且上半年与下半年的2个流行株之间血凝素基因的差异也较大.说明2009年宁波市流行的甲3亚型流感病毒变异较为频繁.
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2005-2007年吉林省乙型流行性感冒病毒HA1基因序列分析
目的 了解2005-2007年吉林省乙型流行性感冒(流感)病毒HA1基因的演变特征.方法 采用MDCK分离培养流感病毒,提取病毒RNA,经反转录和聚合酶链式反应扩增后测序.结果 2005-2007年吉林省同时流行着乙型Victoria系和Yamagata系流感毒株.与B/Shanghai/361/02相比,2005年流行的乙型Yamagata系病毒有8个氨基酸位点发生改变;2007年流行的乙型Yamagata系病毒有10个氨基酸变化位点;2007年流行的乙型Victoria系毒株与B/Malaysia/2506/04相比,只有3个氨基酸位点发生替换.结论 2005-2007年吉林省流行的乙型Yamagata系病毒与B/Shanghai/361/02相比已经发生变化;吉林省2007年Victoria系毒株与疫苗代表株B/Malaysia/2506/04比较接近.
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贵州省2014-2017年H7N9禽流感病毒HA和NA基因特征分析
目的 分析2014-2017年贵州省H7N9禽流感病毒HA和NA基因的分子特征和感染风险.方法 对2014-2017年贵州省获取的18例确诊人感染H7N9病例和6份环境样本分离的H7N9病毒株的HA和NA基因进行扩增,运用生物信息学软件解析其变异和遗传进化.结果 2014-2015年贵州省2株毒株与WHO推荐的A/Shanghai/2/2013和A/Anhui/1/2013疫苗株HA和NA基因的同源性高,分别为98.8％ ～ 99.2％和99.2％;2016年2株和2017年14株与A/Hunan/02650/2016疫苗株同源性高,分别为98.2％～ 99.3％和97.6％～ 98.8％;2017年其余6株与A/Guangdong/17SF003/2016疫苗株同源性高,为99.1％～99.4％和98.9％～99.3％.所有毒株均属于长江三角洲分支,但主要聚集为3个次分支.2017年贵州省西部有6株毒株(含2例人感染病例毒株)裂解位点存在插入突变为PEVPKRKRTAR ↓ GLF,具备高致病性禽流感病毒的分子特征;受体结合关键位点存在A134V、G186V和Q226L突变,NA蛋白颈区“QISNT”均缺失,毒株A/Guizhou-Danzhai/18980/2017发生耐药突变R294K,9株毒株NA蛋白糖基化位点发生NCS42NCT突变.结论 2014-2017年贵州省H7N9禽流感病毒HA和NA基因存在遗传差异,关键位点的变异增强了病毒对人体的易感性和毒力,部分毒株发生耐药突变,其感染与致病风险增加.
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北京市1998-2004年婴幼儿A3型流感病毒分离株HA1基因序列分析
目的了解1998-2004年北京地区婴幼儿中流行的A3(H3N2)亚型流感病毒血凝素基因HA1区的基因变异特点.方法提取该期间采集的呼吸道标本中H3N2亚型流感病毒的RNA,经逆转录-多聚酶链反应扩增得到HA1区基因片段.通过目的基因的克隆、测序或PCR产物直接测序,进行序列分析.结果1998-2004年间北京地区婴幼儿中流行的H3N2亚型流感病毒血凝素HA1区基因均为987 bp,编码一个含329个氨基酸的蛋白质.这些H3N2亚型流感病毒血凝素HA1区的核苷酸和氨基酸同源性分别在95.5%～100.0%和93.0%～100.0%之间,分离年份越近同源性越高.在HA1区有7个糖基化位点非常保守,分别位于8、22、38、63、126、165和285位氨基酸.与1997年以前的毒株相比,1997年以后的毒株均在122和133位增加了一个糖基化位点.自1999年以后的毒株均在144位增加了一个糖基化位点.每年流行的毒株都较前一年的毒株出现了位于不同抗原决定簇或者受体结合位点的氨基酸替换.进化分析显示,每年分离的毒株均与以前的毒株出现了不同程度的变化,不断出现新的进化分支.结论1998-2004年间北京地区婴幼儿中流行的H3N2亚型流感病毒持续不断地发生着点突变,导致抗原性不断发生漂移.加强监测和密切关注其变异动向对防控流感流行有极其重要的意义.
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两株H9N2亚型禽流行性感冒病毒HA基因序列分析
禽流感(AI)是由A型流行性感冒(流感)病毒引起的一种严重危害禽类健康的传染性疾病.禽类感染禽流感病毒(AIV)后,症状可表现为非显性感染,亚临诊感染,或轻度呼吸道疾病,产蛋量降低,直至急性全身致死性疾病等多种形式.
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河北省甲型H1N1流行性感冒病毒血凝素基因特征研究
目的 掌握河北省甲型H1N1流行性感冒(甲流)病毒的流行情况；对分离到的甲流病毒株血凝素(Hemagglutinin,HA)基因序列进行测定比较,分析HA重链区(HA1)第222位氨基酸位点的突变情况.此位点编码的天冬氨酸(Aspartic Acid,N)突变为甘氨酸(Glycine,G)(D222G),可能会使病毒更容易结合下呼吸道受体,为流感大流行的预防控制提供参考.方法 采集流感样病例的鼻咽拭子,用狗肾传代细胞分离流感病毒,经血凝抑制试验鉴定分型.选取不同时间、地域的10株甲流病毒进行HA基因全序列分析,167株病毒测HA区379～1204片段,用DNA(脱氧核糖核酸,Deoxyribonucleic Acid) Star软件比较分析同源性、变异趋势.结果 10株甲流病毒毒株HA基因与疫苗株A(甲)/California(加利福尼亚)/07/2009相比高度同源,核苷酸同源性为98.9％～99.5％,氨基酸同源性为98.4％～99.3％,有3个位点氨基酸发生同样的替换(脯氨酸,Proline)100S(丝氨酸,Serine),S220T(苏氨酸,Threonine),E(谷氨酸,Glutamic Acid)391K(赖氨酸,Lysine).从采集于2010年12月标本分离的2株甲流病毒A/河北桥东/SWL (Swine-like) 178/2010和A/河北裕华/SWL1261/2010,在202、214、468三个氨基酸位点与其他毒株不同.所有167株甲流病毒的HA1第222位氨基酸均未发生D222G突变.结论 河北省甲流病毒HA基因与疫苗株A/California/07/2009高度同源,与疫苗株及各毒株之间核苷酸同源性均≥98.9％,尚未发现D222G变异.
关键词： 甲型H1N1流行性感冒 血凝素基因 抗原变异 种系进化分析 -
浙江省近几年甲3型流行性感冒病毒株HA1基因特性分析
为了研究近几年浙江省甲3型流行性感冒(流感)流行株血凝素(HA)基因的特性,阐明HA基因的变异与流感流行的关系.对浙江省1998～2002年流感流行期间分离的甲3型代表性毒株,提取病毒核糖核酸(RNA),采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增病毒HA1基因,纯化产物进行核苷酸序列测定,并用DNAMAN和BioEdit软件作分析处理.结果显示:浙江省近几年流感流行期间分离到的甲3型流感病毒中的8株代表毒株,其在HA1区域的核苷酸长度均为987bp,由此推导的氨基酸数为329个.A/浙江/25/98与当时世界卫生组织(WHO)推荐的流感疫苗株A/武汉/359/95株在HA1区域的核苷酸同源性为97.4%,氨基酸同源性仅为94.8%;HA1区的抗原性已发生了一定的变异.A/浙江/11/02株与同期WHO推荐的流感疫苗株A/莫斯科/10/99相比,两者的氨基酸同源性仅为96.1%;且氨基酸的改变发生在抗原决定簇A区和B区的有4个位点,与1998年的流行株A/浙江/25/98的氨基酸同源性也只有96.1%.说明A/浙江/11/02株与A/莫斯科/10/99和A/浙江/25/98株相比,其HA1区的抗原性也发生了变化,在基因进化树上远离A/莫斯科/10/99株和A/浙江/25/98株.表明由于甲3型流感病毒HA1区域的抗原漂移导致浙江省近年的2次流感流行.
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麻疹病毒血凝素基因原核表达与抗原性鉴定
目的 利用大肠杆菌表达系统表达麻疹病毒血凝素(Hemagglutinin,H)基因,并将表达产物应用于麻疹病毒抗体的检测.方法 从麻疹病毒株MVi/Zhejiang.CHN/7.05/4中提取核糖核酸,用逆转录-聚合酶链反应(ReverseTranscription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)扩增H基因,并克隆到大肠杆菌表达载体pET28a(+);用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导重组质粒在大肠杆菌BL21(DB3)中进行表达;利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE)和蛋白印迹法(Western Blotting)分析重组蛋白表达情况和抗原性:通过Ni-NTA亲和层析获得的高纯度目的 蛋白用于酶联免疫吸附试验.结果 RT-PCR获得的H基因外段约长1700bp,经测序确证无突变.转化的大肠杆菌表达产物在SDS-PAGE中出现与目的 蛋白分子量相一致的条带,且重组蛋白主要以包涵体形式存在;蛋白印迹(Western Blot)显示,表达产物具有良好的抗原性.结论 构建麻疹病毒H基因的原核表达体系,纯化的重组蛋白可用作麻疹病毒检测的抗原.
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2009～2011年安徽省甲型H1N1流感病毒血凝素基因特征分析
目的 分析2009～2011年安徽省甲型H1N1流感病毒血凝素基因HA基因演化特征及分子流行病学特点.方法 选定2009～2011年安徽省分离的56株甲型H1N1流感毒株,对HA基因进行测序和比对分析.结果 对比A/California/07/2009 (H1N1),56株H1N1流感病毒的同源性为98.8％～99.7％,HA1蛋白178、187、193、202、207、220、222位发生氨基酸改变.2011年初流行的甲型H1N1毒株全部带有S202T突变.结论 基因进化分析显示安徽省流行的甲型H1N1流感HA高度同源,但某些氨基酸位点发生了突变.HA1的202位氨基酸残基突变可能是引发2011年甲型H1N1流感流行的原因之一.
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2009-2011年广东省甲型H1N1流感病毒血凝素基因的进化特征
目的 了解2009-2011年广东甲型H1N1流感病毒血凝素基因的HA1进化特征。方法 选取广东甲型H1N1流感病毒83株，提取病毒RNA，经RT-PCR反应扩增HA1并测序，测定的序列用生物信息软件分析，与GenBank中相关序列比较，并对推导的编码氨基酸序列进行进化分析。结果 2009-2011年广东甲型H1N1流感病毒HA1基因的进化速率是5.2× 10-3,高于人季节性H1N1病毒；变异氨基酸多数位于HA蛋白表面，其中部分位于抗原决定簇；在两例死亡病例分离株HA1的第222位氨基酸发生D222G/D222N变异。结论 遗传进化分析表明，甲型H1N1流感病毒发生了一定程度的变异，造成2011年初在广东的再次流行。HA1的第222位氨基酸变异可能与疾病的严重程度有关。
关键词： 甲型H1N1流感病毒 血凝素基因 测序 进化 -
2015—2017年贵州省威宁9株H5亚型禽流感病毒HA基因遗传特征分析
目的 了解贵州省威宁H5亚型禽流感病毒的分子遗传特征,为禽流感病毒的研究与防控提供依据.方法 对选取的9 株 H5 亚型禽流感毒株标本进行基因组的提取、血凝素基因(hemagglutinin, HA)的扩增和测序,运用生物信息学软件分析HA基因的同源性、遗传进化、致病相关位点、受体结合关键位点和糖基化位点变异情况.结果 贵州省威宁2015—2017年9株H5亚型AIV的HA基因核苷酸和氨基酸同源性分别为96. 1% ～99. 9%和95. 7% ～100% ,分属于H5-1 和H5-2两大分支. H5-1 分支中5 株毒株裂解位点均为 PLREKRRKR↓GLF,H5-2 分支中4 株均为PQRERRRKR↓GLF,全部属于高致病性毒株.受体结合关键位点H5-1分支中5 株均为QSG,H5-2分支中4株均为 QRG,仍全部为禽流感病毒特异性受体结合区. 9 株毒株受体结合区均发生了138Q、139G和53K的突变,其中H5-1分支中5株毒株均存在129K、189T、140K和282V的突变,H5-2分支中4株均存在189N、140M和282I的突变. 9株毒株6个糖基化位点较稳定,但2017年H5-2分支中的2株毒株存在一个糖基化位点124NHT的增加.结论 贵州省威宁2015—2017年H5亚型禽流感病毒可能存在两种型别的流行,均属于高致病性禽流感病毒,虽不具有人源流感病毒特异性受体结合区,但病毒存在持续不断地变异,且糖基化位点有增多趋势,存在毒力增强和感染人的风险,故应加强监测与研究.
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禽流感病毒分离株HA基因的克隆及序列分析研究
目的 对禽流感病毒番鸭分离株进行HA 全基因克隆及序列分析比较,以了解其HA 基因的分子生物学性状及进化情况.方法 提取及扩增分离株病毒RNA ,对其PCR 产物进行克隆及测序,对阳性重组质粒进行电泳鉴定及测序.结果 番鸭流感病毒分离株与欧亚种系代表株及北美种系代表株作同源率比较分析,同源率低.与GD/96比较,基因亲缘关系极为密切,且具有相似的生物学特性.分离株HA 基因裂解位点的氨基酸序列符合AIV 强毒株HA 基因裂解位点的分子模式.结论 该分离株的HA 基因裂解位点的氨基酸序列符合AIV 强毒株基因裂解位点的分子模式.本试验为H5 亚型HPAIV 和LPAIV 的分子生物学诊断和基因工程疫苗的研究奠定了基础.
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中国甲型流感病毒血凝素基因进化分析
目的 探索甲型流感的暴发规律及毒株血凝素(hemagglutinin,HA)基因的进化.方法 通过分析中国采集并公布的甲型流感病毒基因数据,对中国大陆所有宿主为人、禽类和哺乳动物的HA基因氨基酸序列进行多序列比对,并用于构建HA的系统发育树,同时对中国香港地区的HA基因蛋白序列同样处理;分析不同宿主的HA基因的受选择压力.结果 选择中国大陆1 252个HA基因和香港485个HA基因,对其分析发现,自2002年以来,禽流感的暴发次数和频率多于历史记录;系统发育树结果显示中国大陆和香港地的HA基因邻接树的拓扑结构一致;宿主为人的HA基因受选择大于禽类宿主的HA基因.结论 不同宿主的HA基因受选择有差异,提示HA基因的快速进化可能会对人类健康产生潜在威胁.
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浙江省流行性感冒病毒分离株HA1基因分析
目的研究浙江省近2年新分离的甲3型流行性感冒(流感)病毒株血凝素HA1基因特性,以了解浙江省流感病毒变异情况和WHO推荐疫苗株对人体的保护情况.方法采集浙江省近2年类流感病人的咽拭子和含漱液标本进行流感病毒的分离,对分离到的甲3型流感病毒进行核酸的提取,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增病毒基因后进行核苷酸序列测定,用DNA MAN和BioEdit生物软件对测序结果进行分析处理,并与WHO推荐疫苗株进行比对.结果近2年新分离到的甲3型流感病毒株HA1区域的核苷酸序列长度均为987bp,未发现核苷酸的丢失和插入,相应的点突变率为0.8%～1.3%,推导的氨基酸序列长度均为329个.2003年分离的毒株与同期WHO推荐使用的疫苗株A/Moscow/10/99比较,核苷酸同源性只有95.6%～95.9%,氨基酸总变异达20个,发生在抗原决定簇A、B区的有6个位点.2004年分离的毒株与同期WHO推荐使用的疫苗株A/fujian/411/2002(A/Kumamoto/102/2002,A Wyoming/3/2003)比较,核苷酸同源性达98.6%～99.1%,仅发生3～6个氨基酸的变异.基因进化树上,浙江省2003,2004年新分离的毒株均属于同一类性状的毒株,与2004年WHO推荐疫苗株接近,已远离2003年推荐疫苗株.结论浙江省甲3型流感病毒的抗原性已发生漂移,与我省流感的流行密切相关.2003年WHO推荐使用的甲3型流感疫苗对我省甲3型流感的预防效果不够理想,2004年推荐使用的疫苗对我省甲3型流感的预防效果较好.
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用两种聚合酶链反应方法检测流感病毒
目的建立特异敏感的快速检测流感病毒的分子生物学方法.方法用多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应扩增甲1、甲3和乙型流感病毒的HA基因的HA1片段.根据扩增产物的大小检测流感病毒.结果以流感病毒的HA基因为模板设计的3对引物能特异性地扩增出942bp、1117bp和751bp的核酸片段,它们分别和甲1,甲3和乙型流感病毒有稳定对应关系.根据扩增产物的大小可以检测流感病毒.用这个方法能检测病毒浓度为0.1TCID\{50\}的样品.结论多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应是检测流感病毒的特异敏感的方法.
关键词： 流感病毒 血凝素基因 多重逆转录聚合酶链反应 半巢式多重聚合酶链反应 -
2007-2008年吉林省H3 N2亚型流感病毒HA1基因序列分析
目的 了解2007-2008年间吉林省H3N2亚型流感病毒HA1基因的演变特征.方法 采用MDCK细胞分离培养流感病毒,提取病毒RNA,经逆转录和聚合酶链式反应扩增后测序.结果 ①2007-2008年吉林省流行的H3N2亚型流感毒株核苷酸同源性为98.9%～100%,与同期WHO推荐的疫苗株A/Wisconsin/67/05相比有10～14个氨基酸位点发生变化,并且在122位增加了一个糖基化位点;②长春市11月与12月分离的病毒株在进化树上处于不同的两个侧枝;③在同一流行高峰吉林省8个市州分离的流感病毒株在进化树上形成不同的两簇.结论 2007-2008年吉林省流行的H3N2亚型流感毒株与WHO推荐的疫苗株A/Wisconsin/67/05相比已经发生一定变化;不同时间及市州流行的病毒株也有差异.
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麻疹病毒血凝素基因在大肠杆菌中的原核表达
目的 构建麻疹病毒(measles virus)血凝素蛋白(H蛋白)基因的重组质粒,使其在大肠杆菌中大量表达H蛋白,为制备重组蛋白用于免疫检测奠定基础.方法 提取麻疹病毒Leningrad-4株总RNA,RT-PCR法扩增其血凝素基因.克隆入pGEM-Teasy载体,双向测序,测序正确后将Ha基因用BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切后亚克隆至pET28a(+)载体,转化BL21(DE3).培养后用IPTG诱导表达.SDS-PAGE分离大肠杆菌蛋白,分析H基因表达情况.HisLink树脂纯化目的蛋白用于建立酶联免疫吸附反应,进行血清抗体水平检测.结果 扩增了麻疹血凝素基因,与麻疹Leningrad-4株血凝素基因同源性达99.8％,构建了重组血凝素基因的原核表达质粒并进行了诱导表达和SDS-PAGE凝胶电泳,在66 kD处有表达的重组血凝素蛋白条带.结论 成功构建了麻疹血凝素基因的表达载体并在大肠杆菌中进行了诱导表达,建立了利用重组血凝素蛋白检测IgG的ELISA方法.
