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CYP1A1基因cDNA全长的T载体克隆及序列分析
目的构建含KpnI、XhoI双酶切位点的人细胞色素(CYP1A1)基因cDNA全长的pGEM-T载体,为以后的亚克隆和毒理学研究提供实验材料.方法从培养的人乳腺癌细胞(MCF-7)中抽提总RNA,RT-PCR扩增CYP1A1基因cDNA全长,与pGEM-T载体连接后转化DH5α,筛选阳性克隆,抽提重组质粒并进行PCR及酶切鉴定,再行测序分析.结果重组质粒pGEM-T-1A1 PCR后获得了1 568 bp产物,酶切鉴定证实目的片段成功插入至pGEM-T,测序分析也进一步证明了目的片段与GeneBank中CYP1A1mRNA的序列同源性为99.9%.结论成功地构建了含CYP1A1基因cDNA全长区域的T载体.
关键词: 细胞色素P450(CYP1A1) T-载体 测序分析 -
P4501A1基因Thr461→Asn461及Ile462→Val462突变载体的构建
目的 构建P4501A1基因cDNA Thr461→Asn461及Ile462→Val462突变载体,为进一步研究CYP1A1的功能和致癌机制奠定基础.方法 根据人CYP1A1基因(GeneBank NM-000499)cDNA序列设计通用引物Pm3/Pm4和突变引物Pt15/Pt16;Pt17/Pt18,内含酶切位点和突变位点,先用Pm3/Pt16,Pm3/Pt18组成两对引物,以pGEM-T-CYP1A1质粒为模板进行第一轮扩增,获得上游1397bp片断,再用Pt15/Pm4,Pt17/Pm4组成两对引物以10ng pGEM-T-CYP1A1质粒为模板进行第二轮扩增,得到下游177bp片断.然后用Pm3/Pm4做引物以第一、第二轮扩增产物为模板进行第三轮扩增,获得的1.5kb扩增产物用1%琼脂糖凝胶分离并回收纯化,将纯化的PCR产物与pMD-T载体连接后转化大肠埃希菌DHα5感受态细胞,挑单克隆扩增、质粒抽提后进行酶切和测序鉴定.结果 三轮PCR扩增得到的1.5kb片断,经内切酶BamHⅠ和SalⅠ消化和T7p和SP6通用引物进行双向测序,证实克隆的目的片段与GeneBank中人CYP1A1基因cDNA的序列同源性为99.9%,且包含两个设计的突变位点Asn461、Val462.结论 本实验成功地构建了含突变位点Asn461、Val462的CYP1A1基因cDNA的片断.
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我国四株狂犬病毒M和P基因序列分析和所编码蛋白的分析
为了解我国狂犬病毒M、P基因序列和结构特点,用RT-PCR方法获得目的基因片段,测定核苷酸序列后,计算机分析核苷酸和氨基酸序列及其功能区位点结构.结果显示四株病毒M基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为83.9%~99.5%和93.1%~99%,四株狂犬病毒M蛋白上调节病毒RNA转录和复制功能的第58位氨基酸残基均为谷氨酰胺残基(E),与特异性细胞蛋白WW区域作用的PPxY结构序列均为PPEY保守序列;四株病毒P基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为83.6%~99.8%和87.2%~99%,P蛋白与胞浆动力蛋白轻链LC8相互作用的序列位于143~148位氨基酸残基,均为DKSTQT,四株病毒P基因与L蛋白、N蛋白作用位点序列显示未发生影响其生物学功能的变异.研究结果证实了这两种蛋白结构在病毒致病性中起重要作用的推论.
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采用基因芯片检出一例丙型肝炎病毒3b基因亚型的报告
研究表明,感染HCV的严重性与所感染的HCV基因型有一定的关系,并且不同的HCV基因型对干扰素治疗有不同的影响.HCV的基因分型目前缺乏统一的分类和命名方法.Chan等对5′NCR进行基因树分析,将HCV分为1、2、3三个主要的基因型[1],随后通过对C、NS3、NS5区段的分析指出,每种基因型均由两到三种基因亚型组成,并将其命名为1a、1b、2a等[2,3].Simmonds等[4]分离出HCV的基因型4,并发展了Chan的命名方法[5].同时Houghton等[6]将1a和1b分别命名为基因型Ⅰ和Ⅱ;Enomoto等[7]将2a和2b命名为基因型Ⅲ; Cha等[8]将3命名为基因型Ⅳ,并将以前在南非发现的一组HCV命名为基因型V.Okamoto等[9]和Mori等[10]将基因型2分为基因型Ⅲ和Ⅳ,基因型3分为基因型Ⅴ和Ⅵ.为了避免混淆,本文中采用Chan和Simmonds的命名方法.HCV的基因分型方法主要包括基因组或基因组的部分序列测序分析,型特异性引物PCR扩增(type-specific primers PCR)[9],限制性内切酶长度多态性分析(restriction fragment length polymorphism,RFLP)[4],线性探针法(line probe assay,LiPA)[7,11],以及Livache等[12]和Bidan等[13]采用的吡咯阵列传感器芯片的HCV基因分型方法.
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2009~2011年安徽省甲型H1N1流感病毒血凝素基因特征分析
目的 分析2009~2011年安徽省甲型H1N1流感病毒血凝素基因HA基因演化特征及分子流行病学特点.方法 选定2009~2011年安徽省分离的56株甲型H1N1流感毒株,对HA基因进行测序和比对分析.结果 对比A/California/07/2009 (H1N1),56株H1N1流感病毒的同源性为98.8%~99.7%,HA1蛋白178、187、193、202、207、220、222位发生氨基酸改变.2011年初流行的甲型H1N1毒株全部带有S202T突变.结论 基因进化分析显示安徽省流行的甲型H1N1流感HA高度同源,但某些氨基酸位点发生了突变.HA1的202位氨基酸残基突变可能是引发2011年甲型H1N1流感流行的原因之一.
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罕见输入性卵形疟原虫wallikeri亚种的PCR鉴定和测序分析
目的 应用PCR技术对与间日疟原虫形态相识的卵形疟原虫亚种wallikeri进行鉴定. 方法 采集1例镜检可疑间日疟输入性疟疾患者滤纸血,采用PCR扩增18核糖体小亚单位RNA(18 Small Subunit ribosomal RNA,18SSurRNA)片段,并进行测序分析. 结果 采用5对引物(rFAL1、rFAL2,rVIV1、rVIV2,rMAL1、rMAL2,rOVA1、rOVA2,rOVA1v、rOVA2v)进行PCR扩增,其中rOVA1v、rOVA2v引物扩增阳性,PCR产物大小为760 bp;测序分析该基因片段(GenBank accession number KJ786425)与GenBank数据库中Plasomdium ovale wallikeri克隆RSH10 18SrRNA基因部分序列(KF219561.1)及卵形疟ssrRNA基因(AJ001527.1)的序列一致性都为100%. 结论 卵形疟与间日疟原虫形态相似,可采用PCR技术确认.本例患者感染的疟原虫经PCR鉴定和测序分析确定为卵形疟原虫变形P.ovale wallikeri变形亚种.
关键词: 输入性疟疾 卵形疟原虫wallikeri亚种 PCR 测序分析 -
HLA-B新等位基因B*3936的确认和测序分析
本研究确认HLA新等位基因HLA-B*3936并分析其序列.先证者为脐血造血干细胞捐献者,样本DNA抽提采用PEL-FREEZ抽提试剂盒,利用单链特异性引物PCR方法扩增先证者HLA-B基因的第2-4外显子,对PCR产物直接进行第2、3、4外显予双向测序分析.结果显示:先证者样本中存在2个HLA-B等位基因,其中1个等位基因为HLA-B*4002,另1个经Blast验证确定为新的等位基因,新的等位基因序列已递交GenBank(DQ242650,DQ242651,DQ242652).与接近的B*3901等位基因比较,新的等位基因在第3外显子上有4个核苷酸的差异,其中第527位T→A、第538位C→T、第539位T→G、第544位A→G,这引起氨基酸第152位缬氨酸(Val)→谷氨酸(Glu)、第156位异亮氨酸(Ⅱe)→色氨酸(Trp)、第158位苏氨酸(Thr)→丙氨酸(Ala).实验结果提示该等位基因为新的HLA-B等位基因,已被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLA-B*3936.
关键词: HLA-B等位基因 HLA-B*3936 测序分析 -
一例HLA-A新等位基因A*2459的测序分析
本研究探讨HLA新等位基因HLA-A*2459的分子机制.样本DNA抽提采用PEL-FREEZ抽提试剂盒,利用单链特异性引物PCR方法扩增先证者HLA-A基因的第2-4外显子,PCR产物直接进行第2,3、4外显子双向测序分析.结果显示:先证者样本中存在2个HLA-A等位基因,其中1个等位基因为HLA-A*1101,另1个经B1ast验证其为新的等位基因,新的等位基因序列已递交GenBank(DQ313255,DQ313256,DQ313257).与接近的HLA-A*24020101等位基因序列相比,新的等位基因仅在第3外显子上有1个核苷酸不同,即第527位T→C;这导致氨基酸第152位Val→Ala.结论:该等位基因为新的HLA-A等位基因,被世界卫生组织HJ-A因子命名委员会正式命名为HLA-A*2459.
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HLA-B新等位基因B*9534的测序分析及其单链扩增技术的建立
目的 分析HLA-B新等位基因HLA-B*9534的核苷酸序列,并建立HLA-B * 9534单链扩增技术.方法 采用商品化快速抽提试剂盒抽提标本基因组DNA,采用PCR技术扩增先证者HLA-B基因的第1~8外显子序列,PCR产物经双酶切后直接测序分析第2、3、4外显子.应用序列特异性引物PCR建立HLA-B*9534单链扩增技术,获得HLA-B*9534等位基因的单链产物,并对单链产物进行第2、3、4外显子测序分析.结果 先证者标本存在2个HLA-B等位基因,直接测序结果经软件分析显示与接近的HLA-B*1518和B*4601组合存在1个碱基不匹配,即第593位A/G杂合.单链扩增技术将先证者等位基因分离后,测序得到两个等位基因为HLA-B*4601和HLA-B*9534.与接近的HLA-B*1518的第2~4外显子序列相比,HLA-B*9534仅在第3外显子存在一个碱基的不同,即第593位A→G的改变,导致第174位氨基酸天冬酰胺改变为丝氨酸,该等位基因序列已递交GenBank(EU046491),并经世界卫生组织HLA命名委员会正式命名为HLA-B*9534.结论 发现一个新的HLA-B*9534等位基因,建立的HLA-B*9534单链扩增技术是可行的.
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产超广谱β-内酰胺酶和质粒AmpC酶肺炎克雷伯菌的耐药性及基因型检测
通过PCR基因测序分析两种酶的基因类型,用接合转移试验了解肺炎克雷伯菌耐药基因转移方式,并用纸片扩散试验和微量稀释法测定细菌对17种抗生素的敏感性,现报道如下.
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聚合酶链反应直接测序法检测细胞色素b5还原酶基因突变
在DNA突变检测方法中,DNA测序能精确判断突变部位和性质,是具决定性的一步.聚合酶链反应(PCR)产物经直接测序分析而不预先克隆到测序载体上,使序列分析的效率极大提高.我们从遗传性高铁血红蛋白血症患者外周血白细胞提取总RNA,经逆转录(RT)合成cDNA,用半巢式PCR方法扩增其NADH-细胞色素b5还原酶编码基因,并进行了PCR产物直接序列分析,取得满意的结果.证明逆转录PCR产物直接测序法是检测基因错义突变的迅速有效的方法.
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上海肝炎患者输血传播病毒 (TTV)感染的研究
为了解上海地区肝炎病人中TTV的感染状况,以期发现TTV感染与肝脏损害的因果关系,进一步探讨其传播途径,我们选择了上海地区肝炎病人162例进行TTV感染的流行病学调查研究,并以健康献血员(ALT正常)作为对照,对分离出的6株TTV部分基因进行测序分析,现报告如下.
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诱导型一氧化氮合酶基因启动子-969G→C多态性的功能
目的:探讨诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因启动子-969G→C多态性的功能意义.方法:采用聚合酶链反应(PCR)扩增已知的iNOS基因启动子-969G→C多态性的GC和GG基因型启动子DNA序列,再采用基因重组技术将获得的启动子与PGVB-2-E荧光素酶载体质粒连接,构建新的重组质粒pPGV-iNOSmt和pPGV-iNOSwt,并进行酶切图谱分析和测序分析.然后将重组质粒分别在脂质体的介导下转染HepG2细胞,检测荧光素酶的表达水平,分析不同基因型启动子的活性差异.结果:成功构建iNOS基因-969G→C多态性的GC和GG基因型启动子荧光素酶载体重组质粒pPGV-iNOSmt和pPGV-iNOSwt,发现iNOSmt启动子的活性比对照启动子的活性显著升高,升高132.1%,差异有显著性(P<0.05),iNOSwt启动子的活性比对照启动子的活性升高14.3%,差异无显著性(P>0.05).iNOSmt启动子活性升高的百分率是iNOSwt启动子的9倍.结论:iNOS基因启动子-969G→C的多态性改变导致该启动子的活性增强.
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hMSH2在胃癌组织中的表达及其与DNA甲基化之间的关系
目的:分析胃癌组织中DNA甲基化酶Dnmtl和hMSH2表达情况的相关性及与肿瘤生物学行为之间的关系.方法:以real-time RT PCR法检测28例胃癌组织中Dnmtl和hMSH2 mRNA的表达,亚硫酸氢钠变性后测序分析hMSH2启动子区甲基化状态.结果:在28例胃癌组织中有9例(32%)DNMT1 mRNA的高表达,10例hMSH2(35.7%)的低表达,在hMSH2低表达的胃癌组织中有2例存在DNA启动子区的高甲基化.两个基因mRNA的表达与胃癌生物学行为包括肿瘤大小、淋巴结转移、组织学类型均无明显相关性.结论:胃癌组织中存在Dnmtl的高表达,DNA甲基化在一定程度上参与了hMSH2基因表达的缺失.
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HBV PreS2S/Fc融合基因真核表达载体的构建及表达
目的:构建含HBV PreS2S和Fc融合基因的真核表达载体pcDNA3 S2S/Fc并在真核细胞中进行表达.方法:应用重叠延伸剪切技术(splicing by overlappingextension,简称SOE)经两次PCR获得嵌合基因片段S2S/Fc,回收后克隆到pGEM-T Easy TA克隆载体,获得合适的酶切位点,再采用双粘端连接法转克隆入真核表达载体pcDNA3中,得到真核重组载体pcDNA3 S2S/Fc.然后用脂质体法转染SP2/0细胞.结果:对重组载体进行了限制性酶切鉴定及测序分析,证明连接正确;经间接免疫荧光检测正实该重组载体能在真核细胞中表达插入的外源性基因编码的融合蛋白.结论:真核表达载体pcDNA3 S2S/Fc的成功构建及在SP2/0细胞中的有效表达,为进一步探讨HBV感染的特异性生免疫治疗提供了实验依据.
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人骨肉瘤组织血管特异性亲和肽的筛选和测序分析
噬菌体呈现技术是一种高效的筛选体系.本研究旨在以人骨肉瘤组织血管为靶,对噬菌体随机肽库进行淘筛,阳性克隆经过测序分析,得到保守短肽序列,为骨肉瘤的靶向化疗打下基础.
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利用干血斑样品对1例HIV-1感染者进行辅助确认
天津市津南区卫生防病站送检一份血样,经初筛和复检均为艾滋病病毒Ⅰ型(HIV-1)抗体阳性,而病毒载量测定结果低于检测水平,CD4淋巴细胞计数处于正常值范围,高度怀疑为HIV-1感染者.
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北京大学发布肝癌无创早期诊断新技术
本刊讯 近日,北京大学生命科学学院生物动态光学成像中心与首都医科大学附属北京世纪坛医院肝胆胰外科合作,研发了一种肝癌的无创早期诊断新技术——甲基化CpG短串联扩增与测序(MCTA-Seq).该技术通过对患者血浆游离DNA中异常高甲基化CpG岛进行全面测序分析,实现对肝癌的早期诊断,是癌症诊断方法上的一个突破.研究结果在线发表于《细胞研究》上.
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严重急性呼吸综合征实验室诊断研究进展
严重急性呼吸综合征(SARS)是21世纪首次出现的全新传染病,病情严重,传播力强.世界卫生组织(WHO)于2003年3月12日发布全球疫情警报:3月17日组织9个国家顶级实验室组成多中心合作研究网络,主攻SARS的病原和特异性诊断,4月16日WHO向全世界宣布:SARS的病原是一种人类未曾见过的冠状病毒科成员,命名为SARS相关冠状病毒(SARS-CoV).经测序分析,病毒基因组全长29727个核苷酸,有11个开放阅读框架,基因组结构与其他冠状病毒相似.但系统发育分析和序列比较表明,与已鉴定的有任何冠状病毒无密切关联,是一种新的冠状病毒[1].实验室检测技术包括SARS-CoV病原的检测、SARS-CoV核酸检测、血清学抗体检测等方面[2],为SARS临床诊治提供越来越多的新的有用信息.现将国内外有关这方面的研究进展综述如下.
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105例肺癌患者KRAS基因突变特征分析
目的:研究肺癌患者组织中KRAS基因突变情况,探讨KRAS基因突变与肺癌发生的关系.方法:选取某三级甲等医院病理科2013—2016年病理活检确诊的肺癌患者105例,应用PCR试剂盒分别扩增KRAS基因第2外显子并通过测序判定突变情况,分析基因突变与患者临床病理特征的关系.结果:本组患者标本中KRAS基因突变率为40.95%,KRAS基因突变类型共有8种,基因突变率在不同年龄组、不同分化程度组之间的差异具有统计学意义.结论:KRAS基因突变主要以KRAS基因外显子2第12密码子G12V、G12R突变为主,第14密码子V14G突变为主,K R A S基因突变率与性别、淋巴结有无转移相关,为致癌机理的进一步研究及肺癌的早期预防提供了参考依据.