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HFRS患者BLCL的建立及HTNV S基因片段在其内获得长期稳定的表达
虽然对汉坦病毒核蛋白(HV NP)氨基端蛋白的原核表达产物的抗原性及免疫原性已进行了许多研究,并已用于出血热的诊断,但该抗原表位的精确一级结构及其基因定位迄今尚未完全明确.而研究T细胞表位的前提是首先要构造含病原体抗原基因片段的表达载体质粒.要实现CTL效应细胞对靶细胞的有效杀伤,前提条件之一是效靶细胞必须具有相同的HLA型别.通常选用与效应细胞同源即同一供者的PBMC建立靶细胞,本研究采用与HV特异性CTL同源的患者自身的EB病毒转化的B淋巴母细胞系(EBV-transformed B lymphoblastoid cell line,BLCL)建立靶细胞系,将含有不同汉滩病毒(HTNV)S基因片段的重组真核表达载体转染入BLCL,获得长期稳定表达,为下一步进行CTL杀伤试验提供靶细胞系.
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人源性抗HBsAg单链Fab基因在酵母中的表达
抗乙肝表面抗原的人源性抗体(Fab)在临床上有防治乙型肝炎病毒的应用前景,如用于预防新生儿乙型肝炎病毒的垂直传播和治疗性乙肝制剂等.本文将噬菌体抗体库筛选得到的人源性抗HBsAg Fab抗体基因,通过重叠PCR的方法借Linker将Fab的轻链(L链)和重链(H链)融合构建单一的链,即单链Fab(Single chain Fab)基因,并插入到酵母表达载体pPICZαA中.将构建的表达载体质粒pPICZαA-HL线性化,通过LiCl转化法转化毕赤酵母GS115,利用ZeocinTM抗生素筛选重组酵母,并用高剂量的ZeocinTM平板来筛选多拷贝整合有融合L、H链基因的重组酵母.
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诱导型一氧化氮合酶基因启动子-969G→C多态性的功能
目的:探讨诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因启动子-969G→C多态性的功能意义.方法:采用聚合酶链反应(PCR)扩增已知的iNOS基因启动子-969G→C多态性的GC和GG基因型启动子DNA序列,再采用基因重组技术将获得的启动子与PGVB-2-E荧光素酶载体质粒连接,构建新的重组质粒pPGV-iNOSmt和pPGV-iNOSwt,并进行酶切图谱分析和测序分析.然后将重组质粒分别在脂质体的介导下转染HepG2细胞,检测荧光素酶的表达水平,分析不同基因型启动子的活性差异.结果:成功构建iNOS基因-969G→C多态性的GC和GG基因型启动子荧光素酶载体重组质粒pPGV-iNOSmt和pPGV-iNOSwt,发现iNOSmt启动子的活性比对照启动子的活性显著升高,升高132.1%,差异有显著性(P<0.05),iNOSwt启动子的活性比对照启动子的活性升高14.3%,差异无显著性(P>0.05).iNOSmt启动子活性升高的百分率是iNOSwt启动子的9倍.结论:iNOS基因启动子-969G→C的多态性改变导致该启动子的活性增强.
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丙型肝炎病毒核心蛋白结合视黄醇脱氢酶11蛋白
目的:丙型肝炎病毒(HCV)的核心蛋白是HCV基因组编码的一种主要的结构蛋白,研究表明这种病毒的蛋白具有复杂的生物学调节作用.方法:以HCV的核心蛋白作为诱饵(bait),利用酵母双杂交技术,对于肝细胞表达型酵母细胞cDNA文库进行筛选.对于在缺陷型培养基上生长的真阳性酵母集落,进行回交实验,并对于cDNA文库表达载体质粒中插入的基因片段进行序列分析和生物信息学分析.结果:其中一个克隆命名为HCBP12,后来证明为视黄醇脱氢酶ll(retinol dehydrogenase ll,RDHll),或称为雄性激素调节的短链脱氢酶/还原酶l(androgen-regulatedshort-chain dehydrogenase/reductase l,ARSDRl).结论:这是首次发现和证实HCV核心蛋白与视黄醇脱氢酶ll之间存在着相互结合和相互作用,为充分阐明HCV核心蛋白在HCV感染发病机制中的作用,开辟了新的研究方向.
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应用CRISPR-CAS9技术制备miR-155基因敲除小鼠
目的:探讨利用typeⅡbacterial CRISPR/CAS9系统构建miR RNA-155基因敲除小鼠的可行性。
方法:首先,利用软件设计构建识别靶定靶序列的sgRNA,构建致靶基因切割的CRISPR/Cas9载体质粒;然后体外鉴定sgRNA/Cas9的活性检测;设计构建基因敲进的打靶载体;体外转录sgRNA/Cas9 mRNA;小鼠受精卵注射sgRNA/Cas9 mRNA和打靶载体;后miR-155基因敲除F0代C57/BL6小鼠的可遗传性检测,并剪鼠尾提DNA进行鉴定。 -
腺伴随病毒载体介导帕金森病基因治疗的实验研究
一、材料和方法1.腺伴随病毒(adeno-associatedvirus,AAV)载体的制备:酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)质粒[芳香族氨基酸脱羧酶(aromatic amino-acid decarboxlase,AADC)或三磷酸鸟苷环水解酶I(GTP cyclohydrolase I,GCH)质粒]是AAV基因组反向末端重复序列之间依次含巨细胞病毒早期响应启动因子、人类生长激素第1内含子、人源性TH(AADC或GCH)基因、SV40多聚腺苷信号的载体质粒.以磷酸钙沉积法共转染载体质粒、辅助质粒和腺病毒基因质粒于293细胞.3天后回收并以冻融法裂解细胞,经离心所获得上清再经过2次氯化铯(CsCl)梯度密度超离心等精制处理,终得到AAV-TH、AAV-AADC及AAV-GCH载体.以DNA斑点印迹法测定载体滴度为1 012~1 013颗粒/ml.
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腺伴随病毒载体介导帕金森病猴基因治疗的实验研究
我们在以往的研究基础上,进一步探讨多巴胺合成酶基因的三重共转导对帕金森病灵长类模型基因治疗实验结果.材料和方法:(1)腺伴随病毒(AAV)载体的制备:酪氨酸羟化酶(TH)质粒[芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)或三磷酸鸟苷环水解酶I(GCH)质粒]是AAV基因组反向末端重复序列之间依次含巨细胞病毒早期响应启动因子、人类生长激素第一内含子、人源性TH(AADC或GCH)基因、SV40多聚腺苷信号的载体质粒.以磷酸钙沉积法共转染载体质粒、辅助质粒和腺病毒基因质粒于293细胞.3 d后回收并以冻融法裂解细胞,经离心所获得上清再经过2次氯化铯(CsCl)梯度密度超离心等精制处理,终得到AAV-TH、AAV-AADC及AAV-GCH载体.
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Sox9基因转染的人脐带血干细胞复合骨基质明胶/生物蛋白胶 构建组织工程软骨的实验研究
目的 探讨Sox9基因转染的人脐带血干细胞(hUCMSC)复合骨基质明胶/生物蛋白胶体内外构建组织工程软骨的效果.方法 体外分离培养hUCMSC;采用脂质体转染Sox9载体质粒,将转染的细胞在骨基质明胶/生物蛋白胶材料上体外培养8周,行扫描电子显微镜和组织学观察.选择雄性SD大鼠55只,体质量(150±20)g.将体外形成的软骨样组织移植入SD大鼠背部皮下,8周时行组织学检查,观察软骨形成能力,并进行宿主免疫反应监测.结果 体外培养8周后hUCMSC在支架材料上生长良好,分泌大量蛋白多糖和Ⅱ型胶原.移植入大鼠体内8周后,形成软骨样组织,形态学和免疫组织化学染色显示蛋白多糖和Ⅱ型胶原阳性.移植后IgG、IgA、IgM、C3和C4水平与对照组差异无统计学意义[IgG(1.1056±0.0192)μg/mL vs(1.1450±0.0231)μg/mL(术后28 d),IgM(0.2191±0.0343)μg/mL vs(0.3487±0.0303)μg/mL(术后28 d),IgA(0.3507±0.0585)μg/mL vs(0.3677±0.0424)μg/mL(术后28 d),C3(122.65±4.40)μg/mL vs(130.63±2.98)μg/mL(术后28 d),C4(49.89±2.11)μg/mL vs(51.45±3.74)μg/mL(术后28 d)].Sox9基因转染的hUCMSC复合骨基质明胶/生物蛋白胶构建的组织工程软骨移植入体内后未引起明显的宿主免疫反应.结论Sox9基因转染的hUCMSC可作为组织工程软骨的一种良好的种子细胞来源.
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构建大鼠白细胞介素1β基因shRNA腺病毒载体
背景:特异性下调白细胞介素1β蛋白的表达可以有效缓解外周神经损伤后病理性疼痛。与siRNA相比,shRNA可以更加稳定、高效地抑制目的基因的表达,但是单纯的shRNA无法高效地进入靶细胞中发挥对目的基因的下调作用,而腺病毒载体具有宿主范围广、感染效率高以及能够在宿主细胞中稳定表达等特点。
目的:构建大鼠白细胞介素1β基因的shRNA腺病毒载体并检测其对目的基因表达的影响。
方法:根据NCBI查询获得的大鼠白细胞介素1β基因序列设计3条 siRNA 并合成相应的 shRNA,分别为shRNA1、shRNA2、shRNA3。采用3’和5’单链退火得到的shRNA片段与经过BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切的pHBAd/U6/GFP干扰载体连接,构建白细胞介素1βshRNA腺病毒载体穿梭质粒。测序后将穿梭质粒与骨架质粒共转染HEK293细胞,进行白细胞介素1β基因的shRNA腺病毒载体(rAd/shRNAs)的包装与扩增,分别为rAd/shRNA1、rAd/shRNA2、rAd/shRNA3。将rAd/shRNAs感染大鼠H9C2细胞,使用荧光显微镜观察其感染效率,采用Western Blot 检测rAd/shRNAs对目的基因表达的影响。
结果与结论:测序结果显示白细胞介素1β基因的3条shRNA腺病毒载体穿梭质粒中的序列分别与所设计的3条 shRNA 序列相同;并成功构建了大鼠白细胞介素1β基因的 shRNA 腺病毒载体(rAd/shRNA1、rAd/shRNA2、rAd/shRNA3)。rAd/shRNA1、rAd/shRNA2、rAd/shRNA3均可以下调白细胞介素1β的表达,其中rAd/shRNA2的下调效果明显。 -
日本血吸虫22.6kDa重组抗原的高效融合表达及特性鉴定
目的大量获得纯化的日本血吸虫22.6kDa重组抗原.方法用PCR方法将其编码基因序列经改造后亚克隆入载体质粒pGEx-1λT进行表达.结果得到了融合表达的蛋白抗原.此融合蛋白表达量大,用凝血酶酶切后易大量制备纯化的重组22.6kDa抗原.结论以此融合蛋白免疫的小鼠抗血清进行免疫印迹试验,表明Sj22.6/Sj26 GST融合重组蛋白具有与Sj22.6蛋白一样的免疫学活性.
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贝氏柯克斯体实时荧光定量PCR方法的建立
采用新型TaqMan-MGB探针建立贝氏柯克斯体的实时荧光定量PCR检测方法.根据贝氏柯克斯体特异的23S插入序列设计引物和探针,将PCR扩增的插入序列连接到T载体质粒,该重组质粒用作参比模板来建立方法.用建立的实时荧光定量PCR检测倍比稀释的参比模板,其敏感性是套式PCR检测方法的1000倍.用其它立克次体的DNA作对照模板,该定量PCR显示高度贝氏柯克斯体特异性.用建立的实时荧光定量PCR检测感染小鼠脏器样本,在小鼠的脾脏、肝脏样本中检测到贝氏柯克斯体,检测到的贝氏柯克斯体的量与感染的过程有线性关系.本研究建立的贝氏柯克斯体实时荧光定量PCR检测方法具有比普通PCR检测方法更好的特异性和更高的敏感性,其定量检测的特性特别适合对贝氏柯克斯体感染程度的评价,以及对Q热疫苗的免疫保护效果的评价.
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核酸疫苗--未来的疫苗
随着分子免疫学与基因治疗的进一步开展,新一代疫苗也随之涌现.这包括:合成肽疫苗,重组病毒疫苗及核酸疫苗,其中核酸疫苗为引人注目.核酸疫苗是指由编码能引起保护性免疫反应的病原体抗原的基因片段和载体质粒构成的重组质粒,直接导入动物细胞内,从而通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白,诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答,达到免疫的目的.本文对核酸疫苗的构建、作用机制及应用前景作一简要的概述.
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核转录因子-κB小干扰RNA转染对食管癌细胞化疗敏感性的影响
我们通过小分子干扰RNA(siRNA)阻断核转录因子(NF) -κB信号通路,观察其对食管鳞癌细胞增殖及化疗敏感性的影响.一、材料与方法构建NF-κB p65 siRNA载体质粒“p65 siRNA”及无义序列质粒“HK”并转染食管癌Eca109细胞,转染72 h后将细胞分为:(1)对照组:未转染Eca109细胞;(2) HK组:Eca109细胞转染HK;(3) p65siRNA组:Eca109细胞转染p65siRNA.
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腺相关病毒介导人含脑源性神经营养因子基因在体外成纤维细胞中表达的研究
腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)是感染人类的缺陷微小病毒。有研究表明,重组腺相关病毒(recombinant AAV, rAAV)载体能有效转导脑和脊髓神经元细胞,使外源基因持续表达而不产生毒性反应[1]。我们制备含脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)基因的重组腺相关病毒,并进行了体外转染表达的实验,以期为AAV介导转神经营养因子基因治疗中枢神经系统疾病的研究奠定基础,现报道如下。 一、材料和方法 1.重组人BDNF腺相关病毒质粒的构建:重组质粒的构建参照分子克隆有关实验进行。II型腺相关病毒载体质粒为pWAV1,BDNF基因来源于人基因组DNA中BDNF基因的全长编码序列,长760bp。
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Bcl-2基因转染人白血病细胞系(K562)的生物学特性的观察
目的:我们在慢性粒细胞白血病(CML)急变研究中发现CML急变细胞bcl-2基因表达明显高于慢性期,甚至高于其他急性粒细胞白血病(中华血液学杂志,1999,20:27);而CML急变时化疗反应甚差,是目前白血病治疗难题之一.为了进一步阐明Bcl-2基因在CML急变中的作用,我们将bcl-2基因转染人CML细胞系--K562,建立了一株bcl-2基因高表达的细胞株--K562/bcl-2,并对它的生物学特性,特别对抗肿瘤药物的反应进行了研究.方法:Bcl-2cDNA逆转录病毒载体质粒由中国医学科学院肿瘤研究所吴教授惠赠,按常规转染PA317细胞,经筛选、克隆获高病毒滴度细胞--D3.将成对数生长的K562细胞直接加在呈贴壁生长的D3细胞上进行转染,然后取出悬浮细胞在含G418培基中筛选出抗性细胞,即K562/bcl-2细胞.结果:1.BCL-2蛋白表达:K562/bcl-2细胞明显高于未转染的K562细胞,阳性率和阳性指数分别为71%和38%,95和41. 2.细胞形态学:K562/bcl-2细胞有明显聚集成丛现象,核分裂指数低于K562细胞,分别为0.8%和1.4%.3.细胞生长:细胞凋亡率和K562细胞的增殖速度接近,倍增时分别为22 h和22.7 h. 4.FACS检测:K562/bcl-2细胞凋亡率稍低于K562,分别为2.1%和4.8%,细胞周期两者无明显差别.5.核型:均为Ph阳性.6.细胞耐药性观察:通过Ara-C、高三杉脂碱(HHT)和柔红霉素(DNR)对比观察,发现K562/bcl-2细胞对Ara-C和HHT的耐受性明显高于K562细胞,对DNR的耐受性也有所增高.结论:Bcl-2基因转染使K562细胞发生聚集(提示细胞接触性抑制减低),对化疗药物耐受性增加,进一步证明Bcl-2基因高表达与CML急变治疗反应差和预后不良有关,而与细胞增殖周期无明显关系,这就为CML急变的治疗提供了线索.