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传染性法氏囊病病毒VP3抗原表位的鉴定
利用肽扫描技术对4株IBDV VP3的单克隆抗体(HRB-3F、HRB-7B、HRB-7C和HRB-10E)的抗原表位进行了研究.通过Western blot和ELISA鉴定,将HRB-3F和HRB-7B的抗原表位定位于VP3 109～119 aa(位于IB-DV聚合蛋白的864～874 aa),HRB-7C和HRB-10E的抗原表位定位于VP3 177～190 aa(位于IBDV聚合蛋白的932～945 aa).进一步检测其反应原性及免疫原性,结果表明,这两个表位均能与抗IBDV阳性血清反应.将这两个表位短肽免疫BALB/c小鼠,其血清可以和IBDV反应,具有较好的免疫原性.与D6948、HK46和UK661等多株IBDV相应区域的同源性进行了比较,结果显示,这两个表位在多种毒株中同源性为100%.通过IBDV VP3抗原表位的研究,筛出两个新的保守线性表位并进行精确定位,对进一步分析IBDV结构与功能以及建立以表位为基础的抗原抗体诊断方法具有重要的意义.
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乳腺癌易感基因BRCA1的BRCT结构域的融合表达及纯化
乳腺癌易感基因BRCA1在乳腺癌发生、发展中起着重要作用.在其C-末段有两个串联重复的BRCT(BRCT1和BRCT2)结构域.它们与BRCA1的重要功能密切相关,BRCT结构域还存在于其它50多种蛋白中.本文用PCR方法扩增了BRCT1和BRCT2结构域编码序列,并将其以正确相位与pGEX-2T载体中的GST编码序列融合,构建成重组质粒pGST-BRCT1和pGST-BRCT2.将这两种重组质粒分别转化E.coli DH5α后,分别表达了GST-BRCT1和GST-BRCT2两种融合蛋白.Western blot检测结果表明,两种融合蛋白均能与GST抗体反应.表达的GST-BRCT1和GST-BRCT2经GST-Sepharose 4B亲和层析获得了纯化的融合蛋白,为BRCT结构域及其相关蛋白功能研究提供了有用的材料.
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人FL在大肠杆菌中的表达及表达产物的纯化和生物学活性测定
建立人FL(human flt3 ligand, hFL)在大肠杆菌中的高效表达系统,分离纯化重组hFL为其功能和应用研究打下基础.根据大肠杆菌偏爱密码子人工合成hFL基因膜外区DNA片段,由PCR方法获得的hFL基因膜外区DNA片段,经测序证明序列正确.构建表达载体pET30a-Trx-hFL并转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,hFL融合蛋白的表达占菌体总蛋白的60%以上,并以包涵体形式存在.融合蛋白经离子交换层析、分子筛层析纯化,并用FXa切割,切割效率＞80%.切割产物经亲和层析纯化.纯化产物进行Western blot鉴定.纯化的rhFL(recombinant hFL)与GM-CSF及TNFα联合作用,具有良好的刺激DC增殖活性,其增殖能力是GM-CSF+TNFα的2.5倍左右.本文以大肠杆菌为宿主,成功地表达了融合蛋白Trx-hFL.经纯化的rhFL在体外与GM-CSF及TNFα联合使用能有效地刺激人DC的增殖.
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埃及伊蚊唾液腺激肽Sialokinin I基因的克隆
唾液腺激肽是埃及伊蚊唾液中的舒血管物质,不仅在蚊虫吸血过程中有重要作用,还可能具有调节宿主细胞免疫的功能.本研究用PCR方法从基因组DNA扩增出唾液腺激肽的基因并进行了克隆测序,发现与报道的埃及伊蚊相应基因序列有几个碱基的差异,同源性97.8%,但成熟肽部分序列未发现差异,这一部分基因序列人工合成克隆入硫氧还蛋白融合表达载体进行了融合表达,为进一步的研究打下基础.
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弓形虫ROP2基因的克隆及在大肠杆菌中的表达
目的:构建弓形虫棒状体蛋白(ROP2)基因重组质粒并在大肠杆菌中表达,用于筛选弓形虫新的诊断抗原和疫苗分子.方法:根据ROP2基因已知序列,设计合成一对引物,用PCR方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出ROP2基因片段,再克隆到pGEX-4T-1质粒,重组质粒经酶切及PCR鉴定,而后进行测序;重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中进行ITPG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE及Western Blot分析.结果:ROP2基因PCR产物大小与预期相符,约1 043bp,重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子,测序结果与已知序列基本吻合;SDS-PAGE及免疫印迹显示ROP2融合蛋白表观分子量约为55kDa,表达产物约占菌体总蛋白17%,具有一定的免疫反应性.结论:克隆并表达了弓形虫ROP2基因,为下一步弓形虫诊断及疫苗研究奠定了基础.
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间日疟原虫MSP1C端基因亚克隆及在肠埃希菌中的融合表达
目的在大肠埃希菌中融合表达间日疟原虫MSP1 C端编码基因,以获得能作为检测抗原的重组蛋白GST-PvMSP1 C. 方法以限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ双酶切质粒pMD/PvMSP1C,获得间日疟原虫MSP1 C端编码基因片段,柱纯化后,插入表达质粒载体的多克隆位点,构建重组体pGEX-4T-2/PvMSP1C,并转化大肠埃希菌BL21(DE3),阳性克隆以限制性酶切分析鉴定后,以IPTG进行诱导表达,表达产物以SDS-PAGE电泳与免疫印迹分析. 结果双酶切质粒pMD/PvMSP1C,获得1 119 bp的 PvMSP1 C编码基因片段,与预期片段大小相符;所构建的pGEX-4T-2/PvMSP1C重组体阳性克隆经双酶切鉴定与预期结果一致;SDS-PAGE电泳显示,GST-PvMSP1C融合表达蛋白的大小约63 ku,且能够分别被GST抗体与间日疟患者的血清所识别. 结论成功亚克隆并构建了间日疟原虫MSP1 C 端编码基因pGEX-4T-2/PvMSP1C表达质粒,诱导表达了GST-PvMSP1C融合蛋白,表达蛋白具有一定免疫活性.
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杂合抗菌肽MLH在大肠埃希菌中的融合表达及其抑菌活性研究
目的 设计合成杂合肽MLH基因并在大肠埃希菌(Escherichia coli)表达系统中高效融合表达,获得具有抑菌活性的重组蛋白. 方法 以家蝇抗菌肽Md-Cec、人源抗菌肽LL-37和幽门螺杆菌肽Hp为母体肽,通过生物信息学分析筛选出一条具有抗菌潜力的新型杂合抗菌肽MLH并根据E.coli密码子的偏好性编码基因.采用重叠延伸基因扩增(SOE-PCR)技术,通过设计合成3条互补引物合成所需的目的基因,与表达载体pET-3 2a(+)连接后转化至E.coli表达菌株BL21 (DE3),构建基因工程菌pET-32a-MLH/BL21(DE3),用含氨苄青霉素(Amp)的抗性平板筛选阳性菌株,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后采用SDS-PAGE电泳和Western blot检测目的蛋白的表达.对发酵条件进行优化以获得融合蛋白的大量表达,采用Ni2+亲和层析柱纯化和透析复性的方法 将表达的融合蛋白进行纯化和复性,获取具有活性的融合蛋白,采用琼脂孔穴扩散法测定其抑菌活性. 结果 成功合成基因MLH并与表达载体连接形成重组质粒pET-32a-MLH,构建重组基因工程菌株pET-32a-MLH/BL21(DE3),经IPTG诱导表达相对分子质量单位(Mr)约25×103的重组蛋白且主要以包涵体形式存在.对发酵条件进行优化,确定优发酵条件为:IPTG终浓度为1.0 mmol/L;诱导时间为4h;诱导温度为37℃.通过纯化以及复性处理得到重组蛋白对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均有抑制作用.结论 杂合抗菌肽MLH可在大肠埃希菌中融合表达且有一定抑菌活性.
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两种血吸虫病疫苗候选分子在原核细胞的融合表达
目的在原核细胞中表达SjGST和Sj14-3-3的融合蛋白. 方法 RT-PCR法从日本血吸虫成虫总RNA中扩增出Sj14-3-3基因,亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,并转化E. coli BL21,IPTG诱导表达,Western-blot鉴定表达产物. 结果扩增产物约为765 bp,重组质粒经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后可得到一与PCR产物大小相同的DNA片段,经IPTG诱导后在55 ku附近出现一新增蛋白条带,Western-blot结果显示,表达产物可被兔抗鼠14-3-3ε多克隆抗体识别. 结论在原核细胞融合表达SjGST和Sj14-3-3成功.
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人干细胞生长因子cDNA克隆、表达和纯化及其造血种属特异性
人干细胞生长因子(human stem ceil growthfactor,hSCGF)是一种早期造血调控因子.已知人干细胞生长因子具有两种形式,包括全长分子hSCGF以及在Ca2+依赖糖识别结构域(caldum-dependent carbohydraterecognition domain,CRD)内缺失78氨基酸的截短型分子hSCGFβ.hSCGFβ的造血刺激活性具有严格的种属特异性.本研究目的在于探讨hSCGF能否协同刺激小鼠粒/单系祖细胞增殖.为克服hSCGF的cDNA GC含量较高的困难,本研究以两步PCR的方法从人胎肝cDNA文库(Clontech)中成功克隆hSCGF cDNA,进而将hSCGF成熟肽编码序列亚克隆于原核表达载体pGEX4T-2中,融合表达.研究结果表明,通过低温诱导(28℃),重组表达产物主要以可溶蛋白的形式存在于裂解上清中,利用亲和层析纯化融合表达蛋白.对重组蛋白的造血刺激活性分析表明,不同于截短型分子hSCGFβ,全长分子hSCGF能够刺激小鼠骨髓粒/单系造血祖细胞增殖.结论:hSCGFCRD不直接结合受体,可能具有其他生物学功能.
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融合表达对人工重组多表位蛋白M.RCAg-1构象及免疫效能影响的研究
目的 研究载体融合肽段对人工重组多表位蛋白M.RCAg-1构象、免疫原性及体外保护性的影响.方法 将人工多表位抗原M.RCAg-1基因通过不同的酶切位点克隆到原核表达载体pDS-ex上,从而获得带有不同载体融合标签或没有标签的蛋白,表达产物经纯化得到P312-1、P312-2、P312-3这3种多表位蛋白,利用生物信息学和色谱技术对制备的3种蛋白的二级及三级结构进行了分析,并将这3种纯度大于95％的重组蛋白与弗氏佐剂乳化后分别免疫接种小鼠和新西兰白兔,免疫后血清按常规进行ELISA间接法检测抗体滴度,采用酶联免疫斑点试验(ELISPOT)检测分泌细胞因子的特异性淋巴细胞克隆数,同时进行了间接免疫荧光分析(IFA)以及对体外培养的恶性疟原虫的生长抑制试验(GLA).结果 P312-1、P312-2、P312-3这3种多表位蛋白在动物模型体内诱导的抗体滴度水平并无差异(P＞0.05),但蛋白免疫小鼠后却诱导了不同类型的T细胞反应,而且3种蛋白免疫血清IgG体外生长抑制率出现明显差异(分别为93.9％、14.7％、54.3％).利用生物信息学和色谱技术分析,发现从不同表达载体制备的重组蛋白在二级和三级结构上出现极大差异,预测蛋白质分子的空间构象发生了改变,而且一些表位在分子中的位置也有明显的改变.结论 不同的载体肽融合表达对多表位蛋白M.RCAg-1结构及免疫活性的影响会产生不同的作用,直接影响多表位蛋白的构象,进而会增强或抑制多表位蛋白的免疫效应.
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FKBP12/BAX双聚体诱导细胞凋亡模型的建立
目的建立FKBP12/BAX双聚体可诱导细胞凋亡生物效应的细胞模型,并利用阳性药物对其进行鉴定.方法RT-PCR扩增鼠源性BAX全长基因,插入pUC18载体进行测序鉴定.将鉴定正确的mBAX插入载体pC4FV1E中,构建pC4FV1E/BAX表达质粒.将表达质粒与pcDNA3.1共转染HEK293细胞,建立pC4FV1E/BAX-neo和neo基因稳定表达的细胞模型.利用形态学方法、流式细胞术等对化学药物诱导FKBP12/BAX双聚体介导的细胞凋亡进行定性及定量的分析.结果RT-PCR、Western blot法分别从mRNA及蛋白水平检测到FKBP12-mBAX融合基因的整合及表达;阳性化合物AP20187作用4～6 h后,Giemsa染色可见明显的凋亡小体;钙依赖核酸内切酶亦被激活,出现典型的"DNA ladder";天然产物FK506可竞争性地抑制这种阳性药物诱导的细胞凋亡.结论FKBP12/BAX双聚体可诱导细胞凋亡生物效应的细胞模型的建立,为FK506类小分子化合药物的高通量筛选提供可应用的技术平台.
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CD4拮抗类肽分子和非肽类小分子化合物筛选的细胞模型的建立
目的建立基于CD4分子和MHC Ⅱ类分子相互作用的细胞黏附模型. 方法 RT-PCR扩增人源性CD4胞浆缺陷型基因,克隆入绿色荧光表达载体pEGFP-N1中.将pEGFP-N1/CD4转染HEK293细胞,G418筛选稳定克隆.利用Western blot方法及激光共聚焦显微技术检测和观察细胞中CD4分子的表达及定位. 结果 RT-PCR、Western blot法分别从mRNA及蛋白水平检测到细胞中CD4分子的整合及表达;激光共聚焦显微镜观察到CD4分子于细胞核外周尤其是胞膜分布.HEK293/CD4稳定细胞克隆与Raji细胞孵育1*!h后,可见玫瑰花环的形成(rosette formation),而CD4抗体能够明显抑制这种玫瑰花环的形成. 结论 HEK293/CD4-Raji细胞黏附模型的建立,为CD4拮抗类肽分子和非肽类小分子化合物的筛选提供了一个可应用的技术平台.
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VEGF受体结合抑制肽的重组表达与活性分析
通过阻断肿瘤血管新生的相关因子与受体的结合抑制肿瘤血管的形成,已成为近年肿瘤治疗的重要研究策略.VEGF和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是促进血管内皮细胞生长重要的因子.本研究前期工作中已通过筛选噬菌体随机肽库,获得阳性克隆之一7P419(所带肽序列为GWYYDAX,X代表一特定氨基酸),该短肽具有明显的抑制VEGF的活性.本文将7P419与硫氧还蛋白Trx融合表达,检测该融合蛋白的抑制效果,并与人工合成肽7P419比较.
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金黄葡萄球菌蛋白A与SUMO标签的融合表达及应用研究
目的 从金黄葡萄球菌菌株(ATCC6538)中克隆得到蛋白A的全长基因并对其结构及应用进行研究.方法 从该菌株的基因组DNA中克隆得到全长的葡萄球菌蛋白A基因,对其基因结构分析之后,将该基因的成熟区全长片段和抗体结合功能区片段重组到pHisSUMO原核分泌表达载体上与SUMO标签融合表达,通过ELISA的方法来鉴定融合蛋白的抗体结合活性及其稳定性,并将抗体结合功能区片段耦联到CNBr活化的琼脂糖凝胶上进行抗体的纯化.结果 首次获得了此株菌的全长蛋白A基因并发布于GenBank中,登录号为EU695225.蛋白A全长蛋白和功能区蛋白在pHisSUMO载体上得到正确高效表达,通过ELISA鉴定SUMO标签的存在,没有影响全长蛋白和功能区蛋白的抗体结合活性并有效提高了功能区蛋白的稳定性.在抗体纯化实验中,应用表达的蛋白A能够得到浓度和纯度较高的抗体并具有较好的效价.结论 克隆得到一个新的葡萄球菌蛋白A全长基因.蛋白A功能区蛋白与SUMO标签融合表达,在保持抗体结合活性的基础上提高了稳定性,并成功应用于抗体的纯化.
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新生隐球菌荚膜基因CAP60与荧光蛋白融合表达系统的构建
荚膜是新生隐球菌的主要毒性因子,目前Chang等已克隆了4种荚膜基因:CAP59、CAP64、CAP60及CAP10.已知这4种基因对新生隐球菌的荚膜形成都是必须的,缺失任何一个基因都会使新生隐球菌变成无荚膜表型.搞清荚膜形成的任何一个生理、生化机制都将在新生隐球菌的临床诊断和治疗上带来突破性的进展.我们建立荧光蛋白作为标记与荚膜基因CAP60融合表达,为进一步的研究创造条件.
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小鼠Dectin-1胞外区的融合表达及其识别白念珠菌β-葡聚糖的研究
目的 克隆、表达并纯化小鼠腹腔巨噬细胞Dectin-1基因胞外区,探讨其识别并结合真菌β-葡聚糖的能力.方法 应用RT-PCR方法从小鼠腹腔巨噬细胞RNA中扩增Dectin-1基因胞外区,构建原核重组表达载体pET28-CRD,进行融合表达、纯化和复性.将融合蛋白与白念珠菌酵母相共同孵育,检测其识别、结合白念珠菌细胞壁β-葡聚糖的功能.结果 成功克隆并构建原核重组表达质粒pET28-CRD,表达并纯化了融合蛋白,该蛋白能识别、结合白念珠菌酵母细胞壁β-葡聚糖.结论 构建的原核重组表达载体能够在原核细胞内表达,表达产物有识别、结合真菌胞壁β-葡聚糖的功能,为进一步研究相应的真菌检测方法奠定了基础.
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梅毒螺旋体抗原基因的克隆、表达及其在临床检验中的应用
目的 克隆、表达并纯化梅毒螺旋体相对分子质量为47×103抗原,并检测梅毒患者的血清标本.方法 应用基因扩增技术分离此蛋白的全长基因,采用基因工程的方法,应用融合表达载体pGEX-2T,重组、克隆得到带有梅毒螺旋体47×103特异性抗原基因的重组菌株,经大肠杆菌表达系统获得重组融合蛋白.再经亲和层析获得纯品,并联合应用ELISA检测梅毒患者的血清标本30份,同时检测非梅毒患者的血清标本30份.结果 纯化后获得了梅毒螺旋体相对分子质量为47×103的特异性抗原.ELISA检测梅毒患者血清结果均阳性.非梅毒患者血清均阴性,无非特异性交叉反应.结论 此项方法具有操作简便、准确的特点,为临床检测梅毒开辟了新的领域.
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ASGPR单链抗体-蜂毒肽融合蛋白的构建及其溶红细胞效应
去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor,ASGPR)是一种异源低聚物的内吞受体,定位于肝脏实质细胞朝向窦状隙一侧的细胞膜表面,在介导肝脏疾病靶向治疗方面具有潜在应用价值.我们在获得抗ASGPR单链抗体C1的基础上[1],将C1作为靶向分子,与编码蜂毒肽(melittin)的寡核苷酸基因连接,并克隆至原核表达载体,在大肠杆菌中融合表达,并探讨了融合蛋白(C1M)的体外溶红细胞效应.
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人内皮抑素endostatin基因的融合表达纯化及活性测定
目的:获得有活性的人内皮抑素(endostatin)融合蛋白.方法:从人胎肝组织中提取总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出endostatin基因,定向克隆重组入pTRX表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,纯化,MTT法测定endostatin蛋白对人脐带静脉血管内皮细胞的抑制活性.结果:RT-PCR获得endostatin基因,扩增产物在10g/L琼脂糖凝胶上显示为1条扩增条带,约573 bp,与预计大小一致.将PCR产物连入PGEM-T载体,转化大肠杆菌DH5α,阳性克隆经KpnI,NotI酶切鉴定、测序验证.构建pTRX-endo表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达,经SDS-PAGE分析,出现特异性蛋白质条带,大小与预期相符合.重组蛋白经纯化,MTT法测定重组人内皮抑素蛋白具有生物学活性.人脐静脉血管内皮细胞(ECV304)受到明显抑制,具有剂量依赖抑制关系,ED50=550μg/L.结论:人内皮抑素基因在原核细胞表达载体pTRX中获得成功表达,表达蛋白能够抑制人脐静脉血管内皮细胞(ECV304)的增殖.
关键词： 人内皮抑素基因 融合表达 活性 逆转录-聚合酶链反应 MTT法 -
融合表达HBsAg/HBcAg的重组质粒诱导的小鼠免疫应答
目的:探讨融合表达HBsAg/ABcAg的重组质粒的免疫诱生效果方法:从乙肝患者的血清中提取HBV DNA,采用pCR技术扩增HBV的S和C基因并拼接成SC片段.构建融合表达质粒pcDNA3.1-SC,以100μg肌肉接种BALB/c小鼠,2,4 wk后各加强1次.采用ELISA法检测小鼠血清抗-HBs和抗-HBc,LDH释放法检测体外CTL活性.结果:接种后3,5,8,12 wk,小鼠血清抗-HBs阳性率分别达到50%,75%,100%和50%,抗-HBs滴度在第8 wk达到峰值.而抗-HBc阳转率低于25%,抗体高滴度低于1:5.小鼠接种后5 wk时的特异性CTL活性为46.9±1.8%(效/靶比100:1).结论:融合表达质粒pcDNA3.1-SC能够同时诱生针对HBsAg/HBcAg的特异性细胞免疫和体液免疫应答,提示研制乙肝的免疫预防和治疗性基因疫苗的可能性.
