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金黄葡萄球菌蛋白A与SUMO标签的融合表达及应用研究
目的 从金黄葡萄球菌菌株(ATCC6538)中克隆得到蛋白A的全长基因并对其结构及应用进行研究.方法 从该菌株的基因组DNA中克隆得到全长的葡萄球菌蛋白A基因,对其基因结构分析之后,将该基因的成熟区全长片段和抗体结合功能区片段重组到pHisSUMO原核分泌表达载体上与SUMO标签融合表达,通过ELISA的方法来鉴定融合蛋白的抗体结合活性及其稳定性,并将抗体结合功能区片段耦联到CNBr活化的琼脂糖凝胶上进行抗体的纯化.结果 首次获得了此株菌的全长蛋白A基因并发布于GenBank中,登录号为EU695225.蛋白A全长蛋白和功能区蛋白在pHisSUMO载体上得到正确高效表达,通过ELISA鉴定SUMO标签的存在,没有影响全长蛋白和功能区蛋白的抗体结合活性并有效提高了功能区蛋白的稳定性.在抗体纯化实验中,应用表达的蛋白A能够得到浓度和纯度较高的抗体并具有较好的效价.结论 克隆得到一个新的葡萄球菌蛋白A全长基因.蛋白A功能区蛋白与SUMO标签融合表达,在保持抗体结合活性的基础上提高了稳定性,并成功应用于抗体的纯化.
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蛋白A免疫吸附治疗群体反应性抗体增高1例
群体反应性抗体(panel reactive antibody,PRA)是接受肾脏移植患者重要的检测指标,PRA升高可引起移植患者的超急、急慢性排异反应,导致移植肾失功.蛋白A免疫吸附(immunoadsorption,IA)是近年来新兴的治疗方法,本文就我院血液净化中心治疗的1例PRA升高患者报告总结如下.
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葡萄球菌蛋白A的纯化新工艺
目的 建立一种高效、简便、实用的分离纯化葡萄球菌蛋白A(SPA)的工艺.方法 采用超声波破菌和IgC-Sepharose 4B亲和层析分离纯化SPA;以Lowry法检测蛋白含量;双向琼脂免疫扩散法测定效价和特异性;用还原和非还原SDS-PAGE法检测纯度和相对分子质量.结果 此法制得的3批SPA的蛋白含量分别为4.7、4.4和5.4 mg/ml,收率分别为2.70、2.64和3.78g/100 g湿菌.对人IgG的免疫双扩散效价均为1:64;与正常人、豚鼠、家兔和小鼠的血清反应均出现一条沉淀线,而与鸡和羊不出现沉淀线.经非还原SDS-PAGE检测只呈现一条蛋白带,相对分子质量约为160 000～180 000;经还原SDS-PAGE检测呈现两条蛋白带,相对分子质量分别约为67 000和34 000.结论 已成功建立了分离纯化SPA的新工艺.
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聚苯乙烯肽亲合标签和葡萄球菌蛋白A免疫球蛋白Fc结合区融合蛋白的克隆表达与应用
目的 应用生物工程技术克隆、表达聚苯乙烯肽(PS)亲和标签(PStag)和葡萄球菌蛋白A(SPA)免疫球蛋白(IgG)-Fc结合区(ZZ)融合蛋白,在大肠埃希菌BL21中进行高效表达并初步纯化,为优化、提升免疫检测方法奠定基础.方法 应用基因合成技术串联SPA-ZZ结构域和PStag基因,构建重组表达质粒pPS-SPA,经酶切和测序确认,将阳性重组质粒转化BL21感受态细菌,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫转印试验(Western blot)鉴定表达和纯化产物;直接酶联免疫吸附试验(ELISA)验证融合表达产物对亲水ELISA板的表面吸附特性和定向结合兔、鼠IgG-Fc区的效果.结果 在合成基因的基础上构建的表达载体经序列分析与限制性酶切证实了串联基因的正确克隆,PAGE结果表明可诱导高表达PStag-SPA,纯化产物对亲水ELISA板的吸附能力较高,表达产物对兔与鼠IgG具有定向吸附能力.结论 重组表达的PStag-SPA具有对ELISA板的黏着能力和定向结合兔、鼠IgG-Fc的应用潜力,为优化酶免疫检测技术提供了技术支持.
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免疫吸附治疗合并血管病变的重症狼疮性肾炎
目的:探讨辅助应用葡萄球菌蛋白A(SPA)免疫吸附(LA)疗法对重症狼疮性肾炎(LN)的临床疗效和安全性. 方法:13例重症LN(女11例、男2例,年龄15-44岁),肾活检病理类型为Ⅳ型(n=10)和Ⅴ+Ⅳ型(n=3),其中11例伴间质血管病变(血栓性微血管病8例,非炎症坏死性血管病3例).92.3%(12/13)患者入院时血清肌酐(SCr)升高[平均(309.4±203.3)μmol/L],其中3例需行肾脏替代治疗.采用IA联合激素和霉酚酸酯(MMF)治疗,观察IA治疗前后疾病活动指数(DAI)、肾功能和免疫学指标变化,随访疗效及不良反应. 结果:(1)临床疗效:IA平均治疗4.5次(3～7次),IA结束时SLE-DAI[(18.6±4.5)分vs(11.5±1.4)分,P<0.01]和SCr[(309.4±203.3)pmol/Lxs(238.7±141.4)pmol/L,P<0.01]均显著下降,3例需肾脏替代治疗的患者中1例LA结束后即摆脱透析,1例在随访中摆脱透析;(2)免疫学指标变化:IA后ANA滴度下降;58.3%(7/12)患者抗-dsDNA抗体转阴,41.7%(5/12)抗-dsDNA抗体滴度下降.补体C3[(0.36±0.18)g/Lvs(0.48±0.11)g/L,P<0.01]和CA[(0.08±0.05)g/Ls(0.16±0.10)g/L,P<0.05]均较治疗前明显升高.IA后CD4+淋巴细胞明显下降[(309±205)个/μlvs(191±102)个/μl,P<0.05];(3)随访结果:2例失访,其余11例随访3～18月[平均(9.8±5.0)月],8例(72.7%)SCr降至正常,其中2例完全缓解,8例部分缓解;(4)不良反应:IA期间2例出现过敏反应,2例合并感染(肺炎和细菌性痢疾各1例). 结论:IA能有效清除LN患者血清多种自身抗体,免疫抑制药物联合IA有助于提高合并血管病变重症LN的临床疗效.
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应用免疫吸附治疗重症系统性红斑狼疮的疗效观察
目的:探讨葡萄球菌蛋白A免疫吸附(immunoadsorption,IA)治疗重症系统性红斑狼疮(SLE)的效果及临床应用价值. 方法:收集重症SLE患者67例,均合并重要器官受损.SLEDAI评分≥12分,SLE发作类型为严重/大发作.在原有常规激素及其他免疫抑制剂治疗的基础上,加用葡萄球菌A蛋白免疫吸附治疗,观察治疗前后免疫球蛋白、补体水平、自身抗体(ANA、Anti-dsDNA、Anti-Sm)、SLEDAI评分及重要器官损害的变化.通过前后对照分析,评价IA治疗重症SLE的疗效. 结果:经IA治疗后,血IsG水平由(21.98±4.43)g/L降为(5.28±1.37)g/L,lgA由(2.16±0.25)g/L降为(1.07 4-0.25)g/L,IgM由(1.82±0.30)g/L降为(0.91±0.21)g/L(均为P<0.01),C3、C4在治疗前后无显著变化.ANA阳性率由100%降争8.96%,Anti-dsDNA阳性率由100%降至4.48%.Anti-Sm阳性率由29.85%降至5.97%(均为P<0.01).IA后SLEDAI由22.70±6.43降至5.52±4.68(P<0.01).IA后12周,67例患者中52例缓解,12例部分缓解,总缓解率95.5%. 结论:A蛋白免疫吸附可有效清除自身抗体、控制狼疮活动,对重症SLE活动,采用A蛋白免疫吸附配合常规激素和免疫抑制剂治疗,可提高疗效.
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免疫吸附治疗ANCA相关血管炎的初步观察
目的:探讨葡萄球菌蛋白A免疫吸附(IA)联合霉酚酸酯(MMF)疗法对抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)相关血管炎血清ANCA水平的影响及临床疗效. 方法:6例ANCA相关血管炎伴活动性肾血管炎患者(男、女各3例,年龄19～60岁)临床均为微型多血管炎,ANCA均为MPO-ANCA,治疗前BVAS评分15～22分,均有肾功能不全[SCr (354.6±296.1) μmol/L,其中需即时透析1例],肾脏病理新月体比例(51.0±27.1)%.采用甲基泼尼松龙静脉冲击联合葡萄球菌蛋白A行IA治疗(IA隔日1次,每次吸附血浆4.5 L,共3～10次).IA结束后口服泼尼松及霉酚酸酯(1.5 g/d).观察IA过程中ANCA水平及病情变化,IA后MMF治疗过程中血管炎活动性(BVAS评分)、肾功能与尿检变化. 结果:首次IA后1例血清ANCA转阴,其余5例ANCA下降37.2%～70.4%[平均(52.6±14.0)%].3次IA后ANCA水平下降67.8%～91.5%[平均(81.8±10.0)%],吸附结束后ANCA下降至基础值(9.6±6.3)%,5例治疗前无需透析患者SCr均降至(206.9±106.1) μmol/L,其中1例降至正常,1例治疗前需透析患者治疗后摆脱透析(SCr由929.1 μmol/L降至363.3 μmol/L).IA后MMF治疗随访3～12月,3例缓解,2例稳定,1例死亡.不良反应:IA治疗过程中1例发生低血压1次,随访中各有1例发生带状疱疹和口角疱疹,1例随访3月并发严重肺部感染死亡. 结论:葡萄球菌蛋白A免疫吸附治疗能快速、有效降低血清ANCA水平,抑制血管炎活动性,改善肾功能,但IA后免疫抑制剂治疗过程中应注意预防感染.
关键词： 免疫吸附 葡萄球菌蛋白A 抗中性粒细胞胞浆抗体相关血管炎 -
葡萄球菌蛋白A免疫吸附的临床应用
免疫吸附(immunoadsorption,IA)是一种新型血液净化技术,是指以抗原-抗体或具有特定的物理化学亲和力的物质作为配基,与固相载体相结合制成吸附柱,选择性或特异性地清除血中致病物质,从而达到净化血液,缓解病情的目的.近年来多种不同的免疫吸附柱被用于多种疾病的临床救治,其中以葡萄球菌蛋白A(staphylococci protein A,SPA)IA为常用,本文将对其临床应用作一综述.
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免疫球蛋白结合结构域的研究进展
Z结构域,又叫免疫球蛋白结合结构域,是由金黄色葡萄球菌蛋白A( Staphylococal Protein A,SPA)中B结构域改构而成.SPA是从金黄色葡萄球菌的细胞壁中发现的能与多种哺乳动物的抗体相结合的天然蛋白,组成SPA的5个结构域中,以B结构域的抗体结合力及稳定性占绝对优势.将B结构域28～29位敏感性残基Asn-Gly定向诱变成为Asn-Ala后,得到的结构域被称为Z结构域,其稳定性更高,可耐受羟铵和溴化氢的处理.首尾相连的两个Z结构域,被命名为ZZ结构域,具有与SPA相类似的抗体结合容量以及更高的稳定性,可以耐受工业纯化中苛刻的环境.ZZ结构域以其独特的反3α螺旋结构、以及特有的抗体结合能力已广泛应用于外源蛋白的可溶表达及免疫检测、抗体纯化等领域.该文将对ZZ与抗体结合的机制研究以及它在各领域的应用研究进行综述.
关键词： 免疫球蛋白结合结构域 ZZ结构域 葡萄球菌蛋白A 亲和层析 -
葡萄球菌蛋白A抗体结合区基因的克隆、表达和纯化
目的 构建表达金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)抗体结合区基因SPA-ZZ的pET-32a-ZZ表达载体,在大肠杆菌BL21中进行高效表达并初步纯化.方法 用PCR从pEZZ18中克隆SPA抗体结合区基因ZZ构建重组表达质粒pET32-ZZ,经酶切和测序确认,将阳性重组质粒转化BL21感受态细菌,IPTG诱导表达,表达产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测(SDS-PAGE),并用Q-Sephrose Fast Flow柱进行初步纯化.结果 得到了高效表达SPA-ZZ的pET32-ZZ表达载体,表达产物经SDS-PAGE检测相对分子质量为41 000,初步纯化后可得到较纯的表达蛋白.结论 SPA抗体结合区蛋白ZZ能在大肠杆菌中高效表达,为SPA-ZZ的应用奠定了一定的基础.
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金黄色葡萄球菌蛋白A的原核表达及生物亲和特性研究
目的 构建金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)基因片段的表达载体,并在大肠杆菌表达系统中进行表达,探讨该重组蛋白与不同来源IgG结合的生物学特性.方法 利用PCR法扩增SPA基因片段,将该段基因克隆到pET30a(+)表达载体,转化感受态BL21大肠杆菌细胞,IPTG诱导表达,利用SDS-PAGE及Westen-blot鉴定目的 蛋白.His亲和层析纯化后分别与人、小鼠、兔、猪及山羊血清反应,分析其与不同来源IgG的亲和关系.结果 构建的pET30a(+)-SPA表达载体在大肠杆菌BL21中可表达SPA蛋白,且发现其与人及小鼠源IgG具有较高亲和性,与兔及猪源ISC亲和性较低.结论 该重组蛋白SPA与人及小鼠源免疫球蛋白IgG具有较高亲和性,为下一步应用于SPA-ELISA打下基础.
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金黄色葡萄球菌胶乳凝集试验及spa基因序列改变与万古霉素耐药关系探讨
目的 研究金黄色葡萄球菌(金葡菌)胶乳凝集试验及spa基因序列改变与万古霉素耐药的关系.方法 检测体外诱导对万古霉素耐药金葡菌过程中的金葡菌胶乳凝集试验结果改变情况,并利用单链构象多态性(SSCP)技术及DNA测序分析金葡菌spa基因序列有无改变.结果 3株对万古霉素产生中介耐药的金葡菌在诱导过程中胶乳凝集试验发生改变,其中2株金葡菌spa基因序列有改变.结论 spa基因碱基序列的改变,可能与金葡菌对万古霉素耐药有一定关联.
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葡萄球菌蛋白A免疫吸附治疗全身型重症肌无力的临床研究
目的 研究葡萄球菌蛋白A免疫吸附治疗全身型重症肌无力(myasthenia gravis,MG)的疗效和安全性.方法 采用蛋白A免疫吸附治疗19例成人全身型MG并进行临床疗效和安全性的判定.结果 所有入选病人均完成2次免疫吸附治疗;第2次治疗后的IgG、IgA、IgM浓度明显下降(P＜0.0001);Osserman分级、改良美国MG基金会(MGFA)评分、MG日常生活量表(ADL)和徒手肌力量表(MMT)均明显改善(P＜0.0001).MG特异性乙酰胆碱受体(AChR)抗体阳性的患者2次治疗后抗体滴度明显下降;治疗后外周血调节性T细胞百分比明显上升.部分病人有轻度不良反应,但总体耐受性良好,各项安全性临床评定指标在治疗前后的变化均无统计学意义.结论 葡萄球菌蛋白A免疫吸附可以迅速改善全身型MG病人的病情.
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动态成像模式下蛋白A胶体金单分子三维构象原子力显微镜研究
目的确定葡萄球菌蛋白A胶体金分子特征性构象.方法应用原子力显微镜扫描生理状态下分布在云母表面的葡萄球菌蛋白A胶体金分子,并进行数据测定建模.结果葡萄球菌蛋白A胶体金分子为48.80 nm×42.13 nm×20.53nm"反C"形链状分子三维结构.结论原子力显微镜可以在生理状态下直观测定生物大分子纳米尺度直观结构;葡萄球菌蛋白A胶体金分子的特征性结构可以作为神经细胞膜表面N-甲基-D-天冬氨酸受体原子力显微镜观测的原位标记物.
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耐甲氧西林金黄色葡萄球菌快速分型方法的研究
目的：基于聚合酶链反应（PCR）-高分辨率熔解（HRM）曲线分析方法和葡萄球菌蛋白A（SPA）分型方法，建立一种适用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的快速分型方法。方法收集临床分离的71株MRSA作为试验菌株，采用基因测序和HRM曲线分析方法对菌株进行 SPA基因分型。结果采用基因测序方法，71株MRSA菌株的 SPA基因分为4个型别，分别是t570、t030、t002和t588，以t570（53例）为主要型别，其次是t030和t002（均为7例）。HRM分析对 S PA基因的分型结果与基因测序方法的结果基本一致。结论 PCR-HRM分析有望成为一种快速、有效的MRSA的 SPA基因分型方法，为医院感染控制提供依据。
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血清FT4固相放免分析
在放射免疫分析中应用固相抗体,可使试剂盒质量更加稳定,也使操作过程更加规范化和简单化,同时使实现自动化成为可能[1].本工作通过葡萄球菌蛋白A(SPA)制备固相抗体,建立血清游离甲状腺素(Free Thyroxin, FT4)固相放免分析法.
