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rhEPO蛋白亲和层析条件的探索
亲和层析已经广泛应用于生物分子的分离和纯化,对那些分离流程长、难度大、浓度低、杂质多,采用常规方法难以进行分离的生物分子来说,亲和层析显示出其独特的优越性.本文采用亲和层析法对含rhEPO蛋白的细胞上清液进行初步纯化,旨在探索其佳洗脱条件.
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花生过敏患者血清中抗Ara h1的IgG与IgE分离纯化研究
Ara h1是花生的一种主要致敏原蛋白,能够使花生过敏患者产生特异的IgG与IgE,从而导致花生过敏症状.Ara h1与其特异IgG和IgE的结合是导致花生致敏的一个重要原因.本研究利用Protein A亲和层析柱与Ara h1作为配体的亲和层析柱纯化抗Ara h1的IgG与IgE.高纯度的抗Ara h1特异IgG与IgE对探讨研究其与Ara h1之间相互作用具有重要意义.
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结核杆菌H37Rv株重组PstS1蛋白的表达纯化及其免疫反应性分析
目的:表达、纯化结核杆菌H37Rv株重组Psts1(简称rPstS1)蛋白,为结核病血清学诊断价值研究及亚单位疫苗研制提供物质基础.方法:重组质粒pET15b-Pstsl转化大肠埃希菌表达菌株BL21(DE3)plysE,IPTG诱导rPstSI蛋白表达.经SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定后,优化表达条件,用镍离子鳌合亲和层析柱纯化rPstsl蛋白,并用斑点金免疫渗滤法评价纯化蛋白的免疫反应性.结果成功构建了重组质粒pET15b-Psts1,相对分子质量为38×103的rPstSI蛋白约有30%以可溶性蛋白形式表达,经亲和层析后的rPsts1蛋白纯度为94.8%,有较好的免疫反应性.结论:构建的重组质粒pET15b-PstS1能高效表达有免疫反应性的rPstS1蛋白,经亲和层析后可得到高纯度的纯化蛋白.
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离子交换和亲和层析两种方法对糖尿病大鼠糖化血红蛋白检测的比较
探讨离子交换和亲和层析高效液相法对糖尿病大鼠糖化血红蛋白检测的影响及比较.应用离子交换法(使用Bio-Rad的Variant II糖化血红蛋白仪)和亲和层析高效液相法(使用Primus的Ultra2糖化血红蛋白仪)对不同血糖水平的Wistar大鼠进行糖化血红蛋白的检测.亲和层析高效液相法检测的总糖化血红蛋白(GHb)随血糖浓度的升高而升高,血糖浓度从3.6mmol/L开始升高,GHb的值从4.4%到16.1%,与血糖的相关性好.离子交换法测定的HbA1随血糖浓度升高而升高,但与血糖相关性不明显.亲和层析高效液相法测定的GHb能较准确的反映糖尿病大鼠糖化血红蛋白水平,可用来评价糖尿病大鼠的血糖变化.
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人神经蛋白synuclein gamma的原核表达及纯化
synucleins是脊椎动物中高度保守的小分子量蛋白家族,主要在神经元表达,在突触前末梢尤为丰富.SNCG(synuclein gamma; spersyn; breast cancer-specific protein 1)是该家族的第三个成员,在脑中广泛表达,其表达异常与神经退行性病变和细胞恶变都有一定的相关性.它在神经元胞质中广泛分布,可能起到维持神经纤维网络完整性的作用[1].γ-synuclein蛋白的N末端与脑中参与多种信号通路的14-3-3蛋白家族成员有较高的同源性,具有分子伴侣的特性,参与 MAPK途径的调节.为了研究SNCG基因及其表达产物在神经系统中的作用,本研究采用RT-PCR的方法克隆得到SNCG基因的全编码区,在大肠杆菌中表达了全长蛋白,并用亲和层析得到纯化的蛋白.
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人体铜伴侣蛋白Atox1在大肠杆菌中的表达
利用PCR技术扩增出人体转铜伴侣蛋白Atox1的cDNA片段,直接克隆到PCRII载体上,经DNA序列测定后,再插入到谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合表达载体PGEX-6p-2上,构成重组表达质粒PGEA,将此质粒导入大肠杆菌,经IPTG诱导后获得PGEA融合蛋白的表达.表达的融合蛋白经亲和层析、位点特异性蛋白酶切得到纯化的Atox1蛋白.
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家蝇抗菌肽defensin基因的克隆、原核表达纯化及抑菌、抑肿瘤活性鉴定
为研究家蝇防御素融合蛋白对肿瘤细胞K562有抑制作用,在GenBank中检索家蝇defensin基因,设计特异引物,在家蝇幼虫组织中提取RNA,并通过PCR扩增defensin基因成熟肽部分(Mature defensin,MD),将该基因与原核质粒表达载体pGEX-6P-1进行重组,构建家蝇抗菌肽重组蛋白pGEX-6P-1/MD.通过双酶切鉴定证明目的片段已稳定融合到载体pGEX-6P-1中并将其转化至BL21(DE3)感受态细胞中,经25℃ IPTG诱导在大肠杆菌E.coli DH5ɑ中表达.用GST-Sefinose亲和层析纯化蛋白,15% SDS-PAGE分析鉴定,可见相对分子量为约30 kDa的特异性目的条带.运用琼脂孔穴平板扩散法测定表达产物的活性,得知纯化后的重组融合蛋白pGEX-6P-1/MD对大肠杆菌生长有一定的抑制作用,并首次证明家蝇防御素融合蛋白pGEX-6P-1/MD对肿瘤细胞K562有抑制作用.家蝇抗菌肽融合蛋白pGEX-6P-1/MD被成功克隆和表达,证明纯化融合蛋白pGEX-6P-1/MD对肿瘤细胞K562有抑制和损伤作用,这为以后研发蝇防御素抗菌肽药物提供了依据.
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恶性疟原虫顶端膜抗原-1(P.f AMA-1)基因在大肠杆菌中的表达及表达产物的纯化
本文采用PCR方法自 P.f 基因组中扩增了编码AMA-1完整胞外域及其相应结构域的基因片段,定向克隆入原核表达载体pET-16b和pET-30a(+),经测序确证后将重组子转入BL21(DE3)进行诱导表达,用SDS PAGE鉴定,对可溶性和包涵体形式的重组蛋白分别采用天然状态和变性状态下的Ni离子亲和层析进行纯化,变性蛋白再在GSH/GSSG氧化还原条件下经透析重新折叠复性.所得纯化产物为进行有关AMA-1功能和免疫保护特性的研究提供了条件.
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重组蟹金属硫蛋白的分离纯化及其在兔体内的抗氧化作用
并提高其纯度.GST-MT在短期内可增强实验兔体内抗氧化酶活性.
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亲和层析法纯化华支睾吸虫抗原的研究
目的探索华支睾吸虫特异性抗原的纯化方法. 方法从华支睾吸虫病流行区的淡水鱼中分离华支睾吸虫囊蚴,接种动物,收集成虫,制备匀浆液(粗抗原),借助偶联华支睾吸虫病人血清抗体的Sepharose 4B亲和层析柱,提取特异性抗原,用浓度梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳(CG-PAGE)和免疫印迹方法鉴定纯化抗原的纯度和特异性. 结果亲和层析法纯化抗原经CG-PAGE显示5条蛋白带,免疫印迹试验鉴定均有抗原性,强阳性带蛋白分子质量单位为31 ku,各区带蛋白与并殖吸虫、血吸虫血清抗体无交叉反应.粗抗原有16条蛋白带. 结论经亲和层析法纯化的华支睾吸虫抗原特异性高.亲合层析是获取华支睾吸虫诊断用抗原的较佳方法.
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分步洗脱亲和层析法快速纯化纤溶酶-α2抗纤溶酶复合物
为快速地获取高度纯化的纤溶酶-α2抗纤溶酶复合物(plasmin-α2-antiplasmin complex,PAP),对其纯化方法进行了改进.将尿激酶激活的新鲜乏血小板血浆上Lysine-Sepharose 4B亲和层析柱后,以不同成分的洗脱液分步洗脱.结果表明,每100 ml新鲜血浆能获取纯化PAP 3.0 mg,整个纯化过程可在数小时内完成.结论:本方法简单、快速、经济以及得率高.
关键词： 纤溶酶-α2抗纤溶酶复合物 亲和层析 纯化 分步洗脱 -
重组人α干扰素单克隆抗体的研制及其应用
目的研制抗干扰素的单克隆抗体(McAb)及其应用.方法应用杂交瘤技术,获得40株抗重组人α干扰素的单克隆抗体细胞株;用ELISA方法检测腹水滴度,用辛酸法纯化McAb.结果 40株细胞中2E9、4G1能稳定分泌抗重组人α1b干扰素的单克隆抗体,2C9为抗重组新型干扰素,2A7、4G10分泌抗重组人α干扰素(α1b、α2b、α2a、)和重组集成干扰素、重组新型干扰素的单克隆抗体细胞系;体外连续传代6个月,分泌抗体能力不变,特异性专一.5株单克隆抗体均为IgG.采用辛酸方法提纯抗体纯度达到95%以上.粗制的重组人α干扰素经4G10单克隆抗体亲和层析柱提纯后,获得的干扰素纯度95%以上,平均收率93%,残余鼠IgG含量<100 ng/剂量(50 μg).2C9单克隆抗体亲和层析柱适用于纯化新型干扰素. 结论 4G10单克隆抗体亲和层析柱可以应用于大规模重组人α干扰素生产.
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PCR合成的A型肉毒毒素重链C端结合区基因的高效表达与免疫原性分析
目的 A型肉毒毒素重链C-端结合区(BoNT/A Hc-C)的PCR拼接合成、重组表达与免疫原性分析.方法经密码子优化软件对编码基因序列重新优化设计,以16条长片段寡核苷酸引物经重叠PCR合成BoNT/AHc-C基因片段,插入表达载体pET-His,再转化大肠杆菌BL21(DE3)plys S中进行诱导表达,以金属螯合亲和层析法纯化重组蛋白,并进行鉴定和抗原性分析.结果表达工程菌裂解液经SDS-PAGE分析,重组蛋白约占细胞总蛋白的65%,为包涵体形式,经亲和层析一步纯化和柱上复性获得纯度大于95%的可溶性重组蛋白,Western blot和ELISA均证明,该重组蛋白与抗天然BoNT/A马血清抗毒素有特异性结合反应,是BoNT/AHc-C抗原,且免疫小鼠可耐受10个LD50 BoNT/A的攻击.结论所获重组BoNT/AHc-C蛋白具有良好的免疫原性,为研制基因工程疫苗奠定了基础.
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Jo-1抗原的质谱分析
目的 制备纯化的Jo-1抗原,进一步研究Jo-1/抗Jo-1系统的本质.方法 从兔胸腺中提取粗制Jo-1抗原后经亲和层析纯化,采用液相色谱-电喷雾离子阱质谱分析肽谱和各肽段的氨基酸序列,经数据库检索鉴定Jo-1抗原的生化性质.结果 用液相色谱-电喷雾离子阱质谱对Jo-1抗原进行分析,发现得分较高的有谷氨酰-tRNA合成酶和酪氨酰-tRNA合成酶.结论 谷氨酰-tRNA合成酶和酪氨酰-tRNA合成酶有可能是Jo-1抗原的不同亚型.
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尿素氮对糖化血红蛋白检测的影响
目的 探讨血清尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)浓度在两类不同糖化血红蛋白(HbA1c)检测系统中对HbA1c检测结果的影响.方法 选择非糖尿病患者53例,其中包括非肾病BUN升高患者24例(1组)和肾病患者29例(2组),糖尿病肾病患者21例(3组).采用Primus Ultra2亲和层析HPLC系统和Bio-Rad Variant Ⅱ的HPLC离子交换系统检测受检者静脉血HbA1c,对两套系统的检测结果做对比分析.结果 2组和3组离子交换层析检测HbA1c结果较亲和层析检测结果偏高且差异具有统计学意义(P均＜0.05),1组中HbA1c检测结果前者低于后者差异无统计学意义(P＞0.05);各组两类检测系统检测结果均具有较好的相关性;1组中两类检测系统检测结果差值的95%CI为-0.286～0.043,且差异无统计学意义(P＞0.05),其他两组两类检测系统检测结果差值的95%CI下限分别为0.284、0.337,且差异均有统计学意义(P均＜0.01);3组中两类系统检测结果的差值与BUN浓度有较好的相关性(P＜0.05),其余两组两类系统检测结果的差值与BUN浓度无相关性(P均＞0.05).结论 对于BUN升高的肾病患者,使用亲和层析检测方法,更能准确有效反映HbA1c的真实结果.
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中国人金属基质蛋白酶组织抑制因子-1基因的克隆与表达
目的:克隆和表达中国人金属基质蛋白酶组织抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinases-1;ⅡMP-1)基因,获得具有抗原性的人TIMP-1蛋白.方法:用RT-nest-PCR扩增TIMP-1编码区基因片段,用基因重组技术构建含该片段的重组质粒并进行序列分析.在大肠杆菌E.coli中表达融合蛋白MBP-TIMP-1,用SDS-PAGE和Western-blot对重组蛋白进行分析鉴定,并用亲和层析试剂盒纯化融合蛋白MBP-TIMP-1.结果:经核苷酸序列分析表明,本研究克隆的中国人TIMP-1为624bp,与报道的国外TIMP-1基因序列同源.经SDS-PAGE和Western blot表明,表达的融合蛋白MBP-TIMP-1分子质量为66Ku,具有TIMP-1的抗原性,并可进行亲和层析纯化.结论:克隆了中国人TIMP-1基因,表达和纯化了具有免疫原性的融合蛋白MBP-TIMP-1,他将对肝纤维化的诊断有一定作用.
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幽门螺杆菌的基因组及蛋白质组学研究进展
随着幽门螺杆菌26 695与J99菌株基因组测序工作的完成,人们对该菌的基因组学特点有了较清楚的认识,在此基础上,利用生物芯片、2-D电泳、质谱及生物信息学技术开展的后基因组学研究正成为Hp研究的前沿领域.本文首先对幽门螺杆菌的基因组特点及其多样性研究进行了概述,然后重点对后基因组学研究的新进展进行了综述,特别是对当前Hp蛋白质组研究的核心技术(2-D电泳、免疫印迹、亲和层析及基质辅助激光解析/电离质谱等)的特点及其优缺点以及在Hp遗传变异、免疫靶点筛选及毒力因子确定等方面的应用进行了比较和阐述,对目前Hp的基因组和蛋白质组研究面临的问题及发展趋势也进行了展望.
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抗人大肠癌单链抗体-胞嘧啶脱氨酶融合基因的构建及表达
目的:构建抗人大肠癌重组单链抗体ND-lscFv与酵母胞嘧啶脱氨酶CD的融合基因,并在大肠杆菌中表达.方法:采用基因重组技术借助GSGGSG Linker序列将酵母胞嘧啶脱氨酶基因融合于ND-lscFv基因的3'端,构建pET-28a(+)ND-lscFv-CD载体,转化E.coli BL21,经IPTG诱导,表达二者的融合蛋白.表达产物用Ni-NTAresin亲和层析方法纯化,并采用ELISA检测其免疫活性,MTF法测定由ND-lscFv-CD/5FC构成的ADEPT系统对大肠癌细胞的体外杀伤作用.结果:序列测定表明:ND-lscFv-CD基因全长l 269 bp,包含了732 bp的scFv基因和477 bp的CD基因.SDS-PAGE检测显示,融合蛋白相对分子质量47 KDa,与预测值一致.光密度扫描结果表明,重组蛋白占菌体蛋白总量的27%,ELISA检测证实,ND-lscFv-CD保留了与ND-1scFv相近的免疫活性.MTT实验检测结果显示,由scFv-CD/5FC构成的ADEPT体系对大肠癌细胞具靶向杀伤作用.结论:成功地构建了抗人大肠癌单链抗体ND-lscFv与酵母胞嘧啶脱氨酶CD的融合蛋白,并在大肠杆菌中高效表达.融合蛋白具有良好的免疫活性和一定的酶活性.
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显色型亲和层析法检测糖化血红蛋白的建立及性能评估
目的 利用显色型亲和层析技术,建立一种适用于即时检验的人全血HbA1c快速定量检测方法. 方法 采用水溶性蓝色苯硼酸衍生物与HbA1c糖链特异性结合原理,研制显色型亲和层析定量检测试剂盒.选取472例门诊糖尿病患者的全血标本,检测HbA1c水平,同时进行线性、精密度、特异性、稳定性等评价,并与国外试剂进行对比. 结果 该试剂盒线性范围为3％～18％,测量下限为1.0％.批内和批间CV均＜10％,偏倚可接受(P＞0.05).葡萄糖、糖化白蛋白、果糖胺等常见干扰物对HbA1c定量无明显影响.试剂保存8个月内相对偏差控制在±10％以内.与Bio-Rad HbA1c试剂盒平行检测472例临床标本,相关性良好(Y=0.180+1.006X,P＜0.01),定量偏差无统计学意义(Z=-1.6,P＞0.05). 结论 本研究建立了HbA1c显色型亲和层析快速定量检测方法,各项指标均达到临床检测的要求,可用于全血HbA1c含量的床旁快速检测.
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胃癌干细胞来源的伴侣分子-抗原肽瘤苗的制备及其免疫功能
目的：探讨从胃癌干细胞中提取伴侣分子?抗原肽的方法及其免疫功能。方法低温超声裂解筛选胃癌干细胞和胃癌细胞，经盐析粗提蛋白及透析后，采用十二烷基硫酸钠?聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS?PAGE）分析伴侣分子?抗原肽表达量，采用溴化氰活化琼脂糖凝胶4B亲和层析分离、纯化伴侣分子?抗原肽，采用反向高压液相色谱、SDS?PAGE和Western blot法进行蛋白纯度分析，采用淋巴细胞增殖实验和细胞毒活性实验检测伴侣分子?抗原肽的免疫活性。结果成功制备并鉴定胃癌干细胞的伴侣分子?抗原肽，主要组分为HSP60?抗原肽、HSP70?抗原肽、HSP90?抗原肽和HSP110?抗原肽。0．75μg HSP70?抗原肽、1．00μg HSP70?抗原肽和1．00μg HSP90?抗原肽对淋巴细胞有明显的增殖作用，其A490值分别为0．26±0．03、0．45±0．05和0．32±0．04，而相应剂量的 HSP60?抗原肽和HSP110?抗原肽不能激活淋巴细胞。1．00μg HSP70?抗原肽组和1．00μg HSP70组的细胞杀伤率分别为（45．0±2．0）％和（16．0±2．0）％，差异有统计学意义（P＝0．012）。1．00μg HSP90?抗原肽组和1．00μg HSP90组的细胞杀伤率分别为（36．0±5．0）％和（13．0±4．0）％，差异有统计学意义（P＝0．048）。结论胃癌细胞中伴侣分子?抗原肽含量极低，而胃癌干细胞中伴侣分子?抗原肽含量明显增多，经提纯后可制备纯度较高的伴侣分子?抗原肽。提取的伴侣分子?抗原肽具有较强的免疫原性，可在体外制作瘤苗，可能在胃癌靶向治疗上有较好的应用价值。
