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  • 具有抑制肿瘤前景基因-人MCPIP基因的克隆及细胞定位

    作者:

    目的 构建人MCPIP基因的真核表达载体,观察其在人胚肾细胞系(HEK293T)细胞中的表达及其定位特征.方法 佛波酯(PMA)刺激单核细胞THP-1转化为巨噬细胞,提取细胞mRNA,反转录为cDNA作为模板,扩增MCPIP基因编码区序列,克隆入真核细胞载体中,酶切鉴定目的 基因.将重组质粒转染HEK293T细胞,Western blot检测MCPIP蛋白质表达状况,激光共聚焦显微镜下直接观察基因定位情况.结果 酶切鉴定和测序证明,成功构建MCPIP真核表达载体.Western blot检测表明MCPIP真核表达载体转染293T细胞表达大小约为70kD的蛋白质.激光共聚焦显微镜下直接观察RFP-MCPIP表达可见在293T细胞中主要为细胞质中点状分布.结论 本研究成功构建了MCPIP真核表达载体,检测到MCPIP在巨噬细胞中高表达.并成功证实其细胞质点状定位的特征.

  • 豆豉纤溶酶的研究进展

    作者:关晨晨;赵敏

    豆豉纤溶酶是从我国豆豉中分离得到的一种蛋白酶,具有良好的溶解血栓作用.文章综述了豆豉纤溶酶产生菌的菌种特性,酶的理化性质、发酵工艺、分离纯化、酶活测定、分子生物学及溶栓实验方面的研究现状,并对其应用和发展前景做了展望.

  • 海洋放线菌酰基转移酶基因的克隆

    作者:马艳玲;李海贤;翁萍;刘泽璇;许小庆;曾荣

    对稀有海洋放线菌酰基转移酶进行基因的克隆得到目的片段.先设计两对酰基转移酶特异性引物,以总DNA为模板,然后通过PCR扩增的方法得到酰基转移酶的完整的基因片段,并将该片段插入载体pUC18中,以酶连的方法对重组质粒进行酶切,得到的片段进行验证,成功地获得了稀有海洋放线菌酰基转移酶的基因片段.

  • 人DNA聚合酶β基因靶向RNA干扰重组子克隆及序列分析

    作者:胡大林;庄志雄;何云;纪卫东;唐冬生;袁建辉;方道奎;沙焱;杨建平;涂晓志;胡恭华

    目的克隆用于人DNA聚合酶β(DNA polymerase beta,Polβ)基因靶向RNA干扰的双链RNA(double strand RNA,dsRNA)寡核苷酸绿色荧光蛋白C1载体重组子"pEGFP-C1-pU6-dsRNA",为进一步研究人Polβ基因在环境化学污染物所致的DNA损伤修复中的作用机制作准备.方法依据Genbank中人polβ基因的cDNA序列,运用dsRNA oligonucleotide designer设计出用于RNA干扰用的dsRNA寡核苷酸序列,并以化学方法合成之.通过重组DNA技术将合成好的dsRNA克隆到含人pU6启动子的pSIREN-RetroQ逆转录病毒载体上,以此重组子转化感受态E.coli DH5α,经氨卞青霉素筛选后进行扩增,并抽提质粒.运用EcoR Ⅰ和BglⅡ消化并回收"pU6-dsRNA"目的片段,再将"pU6-dsRNA"亚克隆到pEGFP-C1上,获"pEGFP-C1-pU6-dsRNA"重组子,并进行酶切鉴定和序列分析.结果经酶切鉴定发现,"pEGFP-C1-pU6-dsRNA"载体重组子处于预期条带位置,序列分析显示与所设计的目的片段序列完全相符.结论作者克隆了用于人Polβ基因靶向RNA干扰的dsRNA绿色荧光蛋白C1载体重组子"pEGFP-C1-pU6-dsRNA",为进一步研究Polβ基因功能作好了准备.

  • 人肿瘤坏死因子相关凋亡配体克隆、表达及纯化

    作者:姚根宏;栾建凤;叶东;雷千红;朱培元;金洁;侯亚义

    目的 应用基因工程技术克隆人肿瘤坏死因子相关凋亡配体分子胞外区(TRAIL)114~281片段的cDNA,构建其原核表达载体,建立原核表达体系.方法 采用RT-PCR方法从外周血单个核细胞的总RNA中扩增TRAIL分子的cDNA,克隆入T载体,阳性克隆经过RT-PCR、酶切和测序鉴定.将阳性克隆中TRAIL再亚克隆至原核表达载体pET28a,构建的表达载体用RT-PCR和酶切来验证,IPTG诱导表达.融合表达蛋白复性后,再用层析纯化表达产物.结果 电泳显示RT-PCR产物约500 bp,与预期值一致.TA克隆RT-PCR和酶切鉴定时的片段大小也为500 bp.阳性克隆测序结果与GeneBank报道一致.构建的原核表达载体经RT-PCR和酶切鉴定后用IPTG诱导后,得到大量的融合表达蛋白,此蛋白是以包涵体形式存在的,对表达的蛋白复性和纯化后,电泳显示得到一条约20 kD的蛋白条带.结论 成功地构建了人肿瘤坏死因子相关凋亡配体分子原核表达载体.

  • 人谷胱甘肽硫转移酶M1基因的克隆及在大肠杆菌的温控表达

    作者:陈萍萍;吴逸明;张朝武;吴拥军

    人谷胱甘肽硫转移酶M1基因的克隆及在大肠杆菌的温控高效表达,采用RT-PCR技术从人肝脏组织总RNA中扩增谷胱甘肽硫转移酶M1基因的cDNA序列,将其插入到原核温控表达载体pBV220多克隆位点中,构建重组表达质粒,并用PCR扩增、酶切分析及序列测定等方法对重组质粒进行鉴定,并进行了温控表达,表达量约达到28.3%.人谷胱甘肽硫转移酶M1基因克隆到原核表达载体pBV220中,测序结果同Genbank中的人谷胱甘肽硫转移酶M基因序列比较,在619位点C→A,氨基酸由Pro→Thr,在528位点C→T,编码氨基酸仍为Asp.通过温控诱导,在28kDa的表达量约达到28.3%.人谷胱甘肽硫转移酶M1原核温控表达载体pBV220的构建,为毒理学、遗传药理学的研究提供了应用基础.

  • 补锌糖尿病大鼠差异显示新基因片段的克隆鉴定及组织表达

    作者:孙忠;吴蕴棠;张万起;王夏;王永明

    目的 克隆补锌糖尿病大鼠差异显示的新基因片段并检测其在各组织中的表达分布.方法 对前期研究中分离到的与补锌有关的糖尿病大鼠差异显示的基因片段进行克隆、测序,同源性分析,对发现的2条新基因(2#差异显示片段及6#差异显示片段)设计特异性引物,进行RT-PCR检测,以观察新基因在各组大鼠肝脏中的表达变化,并检测新基因在不同组织中的表达情况.结果 经克隆、测序、同源性分析,在GenBank中未找到与2#差异显示片段及6#差异显示片段高同源性的序列,确定2#及6#差异显示片段为新的基因片段;2#及6#新基因片段在糖尿病对照组、糖尿病补锌组的表达量均低于正常对照组,糖尿病补锌组的表达量高于糖尿病对照组(P<0.05);2#新基因片段在大脑及胰腺中表达量较高,在肾脏中表达量较低,在心肌、骨骼肌、胸腺中无表达.6#新基因片段在心肌、骨骼肌、大脑、肾脏、胰腺中均有表达,但在胸腺中无表达;2#及6#新基因片段被GenBank收录,接收号分别为AY952968、AY959770.结论 分离并克隆了2条与补锌有关的糖尿病大鼠差异显示的新基因片段,经RT-PCR检测其在各组大鼠肝脏及其它各组织中表达分布后,在GenBank上成功登录.

  • 肺炎衣原体CPn0308的基因克隆及其内源性蛋白定位的研究

    作者:贾天军;刘殿武;罗建华;张庶民;钟光明

    目的 克隆肺炎表原体基因CPn0308,表达融合蛋白,并制备抗体对其表达的内源性蛋白进行初步定位.方法 根据STD基因库提供的信息设计引物,聚合酶链反应(PCR)克隆目的 基因,用BamHI/NotI对克隆的目的 基因和pGEX-6P2载体进行酶切,T4连接酶连接后,重组质粒经42℃转化XL1-blue细菌;用PCR进行初步筛选,交叉PCR对提取质粒进一步确定,后对插入片断进行序列分析;用IPTG诱导阳性克隆的细菌使其表达GST融合蛋白,纯化后免疫小鼠制备抗体,使用IFA对内源性蛋白进行定位分析.结果 克隆出肺炎衣原体基因CPn0308,全长为366bp,编码121个氨基酸;并表达了融合蛋白GST-CPn0308,分子量约为39kD;制备了抗体,IFA实验发现该蛋白初步定位于肺炎衣原体包涵体膜蛋白上.结论 成功克隆肺炎衣原体基因CPn0308,其内源性蛋白初步定位于肺炎衣原体包涵体膜上.

  • 结核分支杆菌含信号肽的mtb8.4基因的克隆及真核表达质粒的构建

    作者:李晖;任小华;钟森;任红

    目的:对结核杆菌新抗原-带信号肽的mtb8.4(MS)进行基因克隆,构建其真核表达质粒并加以鉴定.

  • 腰果主要过敏原Ana o 3的重组表达与鉴定

    作者:闫娟娟;佘钿田;张嘉懿;边颖;李会强

    目的 克隆获得腰果主要过敏原Ana o 3基因,并利用pCold-SUMO原核表达载体重组表达Ana o 3并鉴定免疫活性.方法 提取腰果总RNA,逆转录至cDNA,设计特异性引物,通过巢式PCR技术克隆腰果Ana o 3基因,将其插入pCold-SUMO vector,鉴定并测序;将测序正确的阳性质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3),低温15℃诱导表达.摸索诱导表达条件,经镍柱纯化,并通过Western blot鉴定免疫活性.结果 测序结果表明,克隆腰果Ana o 3基因片段全长为417 bp,与GenBank上Ana o 3基因CDS序列基本一致;十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明,目的蛋白分子量为27 kD左右,大小与理论值相符;Western blot结果表明,与腰果过敏阳性血清具有良好的反应性.结论 从腰果中成功克隆了Ana o 3基因,并于原核系统表达了Ana o 3蛋白,证实了此蛋白与腰果过敏血清具有良好的反应性.

  • 丙型肝炎病毒聚合酶底物及pH值佳范围研究

    作者:杨振;蒋建东;祁自柏;陈鸿珊;张华远;李河民

    目的 研究丙型肝炎病毒(HCV)聚合酶底物及pH值佳范围.方法 构建HCV聚合酶基因的重组原核表达质粒后,测序及读码框架分析结果表明得到相关HCV NS5b RNA聚合酶全基因序列,进一步利用Ni2+金属离子螯和亲和层析将其纯化.结果 研究获得高效表达聚合酶蛋白的适条件,利用DNA-BAND培养96孔板,建立生物素标记检测HCV NS5b聚合酶活性的模型.同时研究细胞外丙型肝炎病毒聚合酶复制模型使用的HCV聚合酶作用底物及pH值的佳条件.结论 HCV聚合酶的高效表达和有效纯化,以及HCV聚合酶的底物及pH值对聚合酶的佳条件的确定为建立细胞外丙型肝炎病毒聚合酶复制模型及筛选药物奠定基础.

  • 戊型肝炎病毒诊断抗原的克隆表达及抗原性初步鉴定

    作者:万李;苏秋东;伊瑶;毕胜利;管茶香

    目的 克隆、表达与纯化硫氧还原蛋白-戊型肝炎病毒(HEV)诊断抗原(命名为N5),并对其抗原性和血清学检测效果初步评价.方法 根据GenBank上HEV-ORF2以及ORF3羧基端的基因序列,按照大肠埃希菌密码子偏好表进行密码子优化,全基因合成后插入M48原核表达载体中,在大肠埃希菌中表达融合硫氧还蛋白的融合蛋白N5.并利用亲和层析技术对融合蛋白进行纯化,用Western blot技术评价其抗原性,并利用实验室和临床检测确定的HEV感染阴、阳性血清评价其血清学检测效果.结果 成功构建表达N5诊断抗原的重组质粒;高水平表达并纯化获取纯度高、浓度大的可溶性诊断抗原;Western blot结果显示融合蛋白N5可与HEVIgM抗体阳性血清特异性结合,具有良好的抗原性;以融合蛋白N5作为捕获抗原,建立间接ELISA,对病原检测和临床诊断确诊的40份戊型肝炎病例血清和40份健康人血清进行检测,其灵敏度和特异度分别为95%(38/40)和90%(36/40).结论 成功构建了可表达融合硫氧还蛋白的HEV诊断抗原的重组质粒,并获得表达量高、抗原性强的可溶性融合蛋白N5,可应用于HEV血清学诊断,且有良好的应用前景.

  • 60例丙型肝炎患者血清丙型肝炎病毒RNA的基因分析

    作者:张大军;吴秀娟;杜绍财

    丙型肝炎(丙肝)病毒(HCV)全基因或片段基因克隆的序列分析,据国内外报道证实至少存在12种基因型,不同国家地区核苷酸有很大差异.目前日本和美国已分离出4种基因型,美国以Ⅰ型为主,日本以Ⅱ型为主,中国是Ⅱ、Ⅲ型,其次是Ⅱ/Ⅲ混合型.不同基因型的HCV致病性及对干扰素治疗反应不同.我们对克拉玛依地区慢性丙肝患者血清HCV RNA进行基因分型的检测,了解该地区HCV基因型分布情况,指导治疗及判断预后.

  • 珊瑚菜Gl4CL基因克隆与生物信息学分析

    作者:宋洁洁;罗红梅;朱珣之;张玉;高婷

    目的:对珊瑚菜(Glehnia littoralis)4-香豆酸:辅酸A连接酶(4-Coumarate:Coenzyme A Ligase,Gl4CL)基因编码区进行克隆及序列分析.方法:本研究在前期珊瑚菜高通量测序的基础上,利用cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)方法对Gl4CL基因全长cDNA序列进行克隆.对Gl4CL蛋白进行理化性质、蛋白二级结构及三维结构预测分析.利用实时荧光定量PCR方法检测Gl4CL基因在珊瑚菜的根、叶中的表达情况.结果:Gl4CL基因cDNA序列全长1 951 bp,编码544个氨基酸,其中开放阅读框1 635 bp,5'非编码区153 bp,3'非编码区163 bp.生物信息学分析表明,G14CL蛋白大小约为59.481 kDa,等电点为8.20.Gl4CL基因在珊瑚菜的根和叶均存在表达,且在根中表达量显著高于叶.结论:本研究为进一步开展Gl4CL基因功能和遗传调控研究奠定基础,通过深入探讨Gl4CL基因的表达调控与木质素、植株生长表型等关系,有望获得抗病虫害、抗逆性强的北沙参高产优质品系.

  • 北葶苈子GGPS基因的克隆、序列分析与原核表达

    作者:马利刚;赵乐;李英超;冯卫生;匡海学;郑晓珂

    目的:获得北葶苈子(Lepidium apetalum)中牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPS)的编码基因,进行生物信息学分析,在大肠杆菌中表达该蛋白.方法:根据北葶苈子转录组测序结果中的GGPS基因序列,设计特异性引物,通过PCR扩增得到北葶苈子GGPS的cDNA序列,进行TA克隆、测序及序列分析,构建原核表达载体并于大肠杆菌中表达北葶苈子GGPS蛋白.结果:得到北葶苈子GGPS cDNA全长1 146 bp,编码381个氨基酸;序列分析表明北葶苈子GGPS基因编码的氨基酸序列包含类异戊二烯合成酶结构域,氨基酸序列进化关系表明北葶苈子GGPS与拟南芥(Arabidopsis thaliana)和白芥(Sinapis alba)亲缘关系近;成功构建了pET-32a-LaGGPS原核表达载体,并在大肠杆菌BL21菌株中成功诱导表达.结论:首次克隆得到北葶苈子GGPS基因,并在大肠杆菌中成功表达了北葶苈子GGPS蛋白,为纯化该蛋白并研究其结构和功能奠定了基础.

  • 独行菜幼苗叶片乙酰CoA酰基转移酶基因克隆、序列分析与原核表达

    作者:赵乐;马利刚;杨泽岸;冯卫生;匡海学;郑晓珂

    目的:研究独行菜强心苷生物合成途径的相关基因,从独行菜幼苗叶片中克隆强心苷生物合成途径关键酶乙酰CoA酰基转移酶(acetyl-CoA C-acetyltransferase,AACT)基因,进行序列分析和原核表达.方法:根据独行菜转录组数据中LaAACT基因序列设计特异性引物,克隆得到LaAACT基因的cDNA序列,构建pET-32a-LaAACT原核表达载体,诱导表达LaAACT重组蛋白.结果:LaAACT基因ORF全长为1 212 bp,编码403个氨基酸.序列分析结果显示LaAACT蛋白没有跨膜区,不含信号肽,位于细胞质中,含有硫解酶家族保守结构域.系统进化结果显示LaAACT蛋白与十字花科植物的AACT蛋白亲缘关系较近.通过IPTG诱导,在大肠埃希菌中成功表达LaAACT重组蛋白,并得到了纯化的LaAACT重组蛋白.结论:首次从独行菜幼苗叶片中克隆了LaAACT基因,建立其稳定的原核表达体系,为LaAACT蛋白抗体的制备,进一步研究LaAACT基因在独行菜强心苷生物合成途径中的功能奠定了基础.

  • 华细辛苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与生物信息学分析

    作者:林懋怡;郑柳;刘晋杰;吉平平;刘忠

    目的:克隆华细辛Asarum sieboldii苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)基因(AsPAL),并进行序列特征分析.方法:通过同源克隆的原理,利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增(RACE)相结合的方法,以华细辛叶片总RNA为模板,获得了该基因的cDNA全长,并通过DNAMAN软件和ExPASy在线分析等对其进行了生物信息学分析.结果:获得AsPAL全长cDNA,Genbank登录号为KY428932,序列分析表明,所克隆的cDNA含有1个2 157 bp的完整开放阅读框,编码718个氨基酸,预测蛋白质相对分子质量为78 758 Da,理论等电点为6.24,没有跨膜区,含有PAL酶活性中心序列GTITASGDLVPLSYVAG,不含信号肽;氨基酸序列多重比较发现,AsPAL与土肉桂、葡萄、当归和杏的同源性达到80%以上.结论:获得了AsPAL cDNA全长序列,对其进行初步生物信息学分析,为进一步探究AsPAL的功能和华细辛甲基丁香酚生物合成的调控机制奠定了必要的基础.

  • 滇龙胆3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因克隆、表达及分析

    作者:周伟;吴昕怡;张琳;刘小莉

    目的:从药用植物滇龙胆中克隆得到3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl CoAreductase,HMGR)基因的cDNA全长,构建原核表达载体使其在大肠埃希菌中表达,对其进行定量表达并进行生物信息学分析.方法:利用PCR扩增克隆得到滇龙胆HMGR基因cDNA全长.构建pEASY-E1-HMGR表达载体,IPTG诱导表达.利用生物信息学方法分析克隆到的cDNA序列并预测结构和功能.采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)分析滇龙胆根、茎、叶在4个不同发育时期的HMGR表达情况.结果:克隆出两组HMGR基因,其中一组HMGR cDNA全长1 747 bp,开放阅读框长1 697 bp,编码565个氨基酸,定名为GRHMGR-1;另一组HMGR cDNA全长1 731 bp,开放阅读框长1 572 bp,编码523个氨基酸,定名为GRHMGR-2.SDS-PAGE显示重组质粒成功表达目的蛋白.Blastp发现,GRHMGR-1,GRHMGR-2与同属植物黄龙胆、秦艽的亲缘关系为相近.结构分析显示都含有2个HMG-CoA结合位点,2个NADPH结合位点,预测都定位于内质网上.HMGR在滇龙胆根、茎、叶这4个不同发育期均有表达,表达量高的是叶.结论:首次从滇龙胆中克隆到可能编码HMGR酶的基因,可为深入探讨滇龙胆龙胆苦苷生物合成奠定基础.

  • 茅苍术DXS基因的克隆与分析

    作者:邓娟;万倩芸;龚玲;刘合刚;余坤

    目的:克隆茅苍术萜类化合物生物合成关键酶1-脱氧木糖-5-磷酸合酶(DXS)基因,并进行序列特征分析和组织特异性表达分析.方法:根据转录组测序所得的DXS基因片段,克隆出全长eDNA序列.运用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR),以tublin为内参基因,检测DXS基因在不同组织中的表达量.结果:克隆得到的DXS基因全长eDNA序列为2 151 bp,编码716个氨基酸,并在GenBank注册(登录号KY659208).氨基酸序列系统发育分析表明,该序列与甜叶菊等菊科植物DXS基因有较高的同源性.Real-time PCR法检测发现茅苍术DXS在叶片中表达量高,其次为花,而在根茎和根中表达很低.结论:获得了茅苍术DXS基因的全长eDNA序列,对其进行了初步生物信息学分析,揭示了其组织差异性表达特征,为进一步阐述该基因在茅苍术萜类成分生物合成途径中的功能奠定了基础.

  • 桑黄鲨烯合酶基因片段的克隆与序列分析

    作者:孙婷婷;邹莉;于洋;李丹蕾;张健;张国权;郭静

    目的:对桑黄鲨烯合酶(SS或SQS)基因进行克隆及序列分析.方法:搜索网上美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中SS基因,与本实验室测得的桑黄转录组数据进行生物信息学比对,找到转录组数据中与SS相似性高的片段,并根据它设计引物,提取桑黄菌丝体总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增SS基因片段并对PCR产物进行测序.结果:得到一段492bp的序列,序列分析表明,该片段编码164个氨基酸,与其他物种SS基因核苷酸序列同源性高在84%以上.结论:首次从桑黄中克隆出了SS基因,为有效利用该基因奠定了基础.

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