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家蝇抗菌肽defensin基因的克隆、原核表达纯化及抑菌、抑肿瘤活性鉴定
为研究家蝇防御素融合蛋白对肿瘤细胞K562有抑制作用,在GenBank中检索家蝇defensin基因,设计特异引物,在家蝇幼虫组织中提取RNA,并通过PCR扩增defensin基因成熟肽部分(Mature defensin,MD),将该基因与原核质粒表达载体pGEX-6P-1进行重组,构建家蝇抗菌肽重组蛋白pGEX-6P-1/MD.通过双酶切鉴定证明目的片段已稳定融合到载体pGEX-6P-1中并将其转化至BL21(DE3)感受态细胞中,经25℃ IPTG诱导在大肠杆菌E.coli DH5ɑ中表达.用GST-Sefinose亲和层析纯化蛋白,15% SDS-PAGE分析鉴定,可见相对分子量为约30 kDa的特异性目的条带.运用琼脂孔穴平板扩散法测定表达产物的活性,得知纯化后的重组融合蛋白pGEX-6P-1/MD对大肠杆菌生长有一定的抑制作用,并首次证明家蝇防御素融合蛋白pGEX-6P-1/MD对肿瘤细胞K562有抑制作用.家蝇抗菌肽融合蛋白pGEX-6P-1/MD被成功克隆和表达,证明纯化融合蛋白pGEX-6P-1/MD对肿瘤细胞K562有抑制和损伤作用,这为以后研发蝇防御素抗菌肽药物提供了依据.
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家蝇抗菌肽defensin对人肝癌细胞HepG2的增殖、凋亡和周期的影响
采用四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)比色法,分析家蝇抗菌肽defensin对人肝癌细胞HepG2体外生长增殖与凋亡的影响,用倒置光学显微镜检测defensin对人肝癌细胞HepG2和人正常心肌细胞H9C2生长增殖情况的影响,并采用流式细胞术检测defensin对人肝癌细胞HepG2细胞凋亡及细胞周期的影响.结果显示,家蝇抗菌肽defensin对人肝癌细胞HepG2的生长有抑制作用,对人正常心肌细胞H9C2无抑制作用.通过显微镜观察HepG2细胞凋亡的形态变化,MTT检测发现defensin对肿瘤细胞的增殖抑制率呈剂量反应关系和时间反应关系.defensin能诱导人肝癌细胞HepG2发生凋亡,并且影响人肝癌细胞HepG2的细胞周期.家蝇抗菌肽defensin对人肝癌细胞HepG2具有增殖抑制作用及凋亡作用,对正常人心肌细胞H9C2基本无抑制作用.
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家蝇Defensin基因原核表达条件的优化及其抑菌活性
目的 优化家蝇Defensin基因原核表达条件,并初步研究其抑菌活性.方法 Defensin基因成熟肽被克隆入pGEX-4T-1原核表达载体中,构建重组质粒pGEX-4T-1/Defensin,并转化宿主菌后诱导表达,表达过程中对菌液起始浓度、IPTG浓度、诱导温度和时间进行优化.采用亲和层析法分离纯化融合蛋白,SDS-PAGE鉴定目的 蛋白的表达情况和分子量.用凝血酶切除谷胱甘肽标签,并通过体外抑菌实验检测其抗菌活性.结果 成功构建重组质粒pGEX-4T-1/Defensin,目的 基因能够在大肠埃希菌内高效表达,分子量为4 kD,与预期值一致,表达量约达40%.抑菌实验显示其对大肠埃希菌K12D31生长有一定的抑制作用.结论 本实验为家蝇Defensin基因功能的深入研究奠定了工作基础.
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家蝇幼虫Defensin成熟蛋白序列的克隆及在原核中的表达
目的克隆家蝇幼虫defensin成熟蛋白编码序列并在大肠杆菌中表达,为进一步的研究该基因的功能奠定基础.方法以家蝇幼虫Cdna文库为模板扩增出defensin基因的成熟蛋白全长编码序列,构建重组原核表达载体Pgex/MDEF,转化的克隆(质粒)通过筛选并测序鉴定.重组的Pgex/MDEF在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,SDS-PAGE鉴定其表达情况和分子质量并用抗鼠GSR单抗作western blot杂交进一步鉴定融合蛋白的表达.结果以家蝇幼虫Cdna文库扩增出一条长约为140bp的Cdna片段,经测序证实其为defensin基因成熟蛋白的编码序列,它编码含40个氨基酸的蛋白质,预测其分子质量单位为4kD.被成功克隆入Pgex-4T-1载体的家蝇幼虫defensin基因的Cd-NA,在重组大肠杆菌BL21(DE3)中诱导可大量生成相对分子质量30KD融合蛋白.结论成功构建了家蝇幼虫de-fensin基因原核表达载体,且其成熟蛋白的编码序列在大肠杆菌高效表达.为下一步表达蛋白纯化,以及研究其生物活性提供了材料.
