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两起疟疾爆发的处理报告
2002年6月16日、8月20日分别接到粤海铁路芙蓉田农场段工地和儋州市兰洋镇番打乡疟疾疫情的报告.粤海铁路芙蓉田农场段工地,四面环山,两侧有两条小溪沟,沟旁灌木丛生荫蔽.工地上居住着286名工人,都是来自广西、四川、湖南省区的民工.2002年6月16日先后有4名工人因发冷、发热而就诊,血检发现3例间日疟,1例恶性疟原虫阳性,据反映工地上仍有同样症状者几十人.表明已有疟疾爆发疫情.兰洋镇番打乡居住着黎族、苗族的农民,有上山垦植、放牧、采伐而住山寮或露宿山林之习惯;地形复杂,高山峻岭植被茂密,溪流纵横.有4个自然村,村间距离较远,居住着389人.该乡是一个老的低疟区.2002年8月20日,有3名村民来就诊,血检发现2例间日疟,1例间日疟和恶性疟原虫均阳性而确诊.
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青蒿素之谜及其启示——专访本刊学术主编陈凯先院士
问:青蒿素是如何被发现的,又如何成为拯救数百万人生命的新型抗疟药?陈凯先:19世纪,科学家从南美洲金鸡纳树皮中分离得到奎宁,该成分被开发成很有效的抗疟药物.20世纪50年代,奎宁类抗疟药氯喹、伯喹一直是治疗疟疾的主要药物,它们在起初使用时药效都很好,但是后来逐渐地产生耐药性.到了20世纪60年代的越南战争时期,恶性疟原虫对氯喹产生的抗药性已经十分明显,这导致氯喹等抗疟药物的疗效严重下降.当时,中越军民一起作战,当地湿热的丛林环境使许多战士感染疟疾,非战斗性的减员甚至超过了战场伤亡的人数.这是当时促使中国研究新型抗疟药的直接原因.
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低浓度双氢青蒿素对恶性疟原虫3D7株干预效应观察
疟疾仍是严重威胁人类健康和生命安全的重大传染病,非洲儿童死亡的头号杀手.既往研究表明,青蒿素类药物可选择性杀灭红内期疟原虫,且对环期影响较大.近年来其作用机制研究屡有新的发现,但这些研究中采用的青蒿素类药物的浓度可达体外实验半数抑制浓度的50～80倍.该实验采用恶性疟原虫国际标准株3D7体外培养,观察半数抑制浓度双氢青蒿素处置后,恶性疟原虫红内期形态特征的变化,进而探讨双氢青蒿素对3D7红内期生长周期及不同发育阶段的影响.恶性疟原虫3D7株进行连续同步化3次以上,于末次同步化后6h给予双氢青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)半数抑制浓度(10nmol· L-)1次,连续观察3个生长周期(132 h).研究结果显示,与对照组相比,双氢青蒿素作用后,3D7生长显著抑制(P＜0.001),环状体生成率显著降低(P＜0.05),滋养体形态异常且不饱满,裂殖体内裂殖子数量显著减少(P＜0.05),生长周期迟滞且紊乱.实验表明非杀灭浓度DHA可明显抑制恶性疟原虫的生长,对3D7的干预效应可能不止作用于环期,而是对疟原虫生长的各个环节均产生不同程度的影响.
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3例输入性恶性疟病例的快速检测
目的 对3例疑难恶性疟病例进行实验室快速检测,评价快速检测方法的临床应用价值.方法 以2014年6月至2015年5月3例因不明原因发热入院患者为研究对象,采用免疫胶体金快速检测法和显微镜检法分别检测患者血液疟原虫,采用核酸荧光染料和FCM检测白细胞计数(WBC)、红细胞计数(RBC)、血色素(Hgb)、血小板计数(PLT)等血常规指标,采用酶法检测患者C反应蛋白(CRP)、直接胆红素(DBIL)、总胆红素(TBIL)和谷丙转氨酶(ALT)等水平.结果 3例不明原因发热患者以畏寒、发热为主要症状,均出现血小板降低、CRP升高,和不同程度肝功能损害.胶体金快速检测和血涂片疟原虫显微镜检结果相同,均为恶性疟原虫感染.结论 免疫胶体金法快速检测有助于临床快速诊断疟原虫感染.
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恶性疟原虫多表位蛋白疫苗M.RCAg-1和M.RCAg-3佐剂的配伍
目的 评价恶性疟原虫多表位蛋白疫苗M.RCAg-1和M.RCAg-3与不同佐剂优配伍方式并进行初步的免疫机制研究.方法 将多表位疫苗表达纯化后混合4种佐剂(AD、ADL、CpG及CpG&A1)经皮下注射BALB/c小鼠,免疫3次,每次间隔2周.测定血清中抗M.RcAg-1和M.RCAg-3抗体滴度、IgG分型及血清抗体对抗原单表位识别.间接免疫荧光检测血清对天然疟原虫的识别.结果 佐剂ADL和AD分别能显著增强M.RCAg-1(P<0.05)和M.RCAg-3(P<0.05)免疫反应.而佐剂CpG和CpG&A1增强抗原免疫反应的能力相对较弱.与M.RCAg-1、M.RCAg-3和CpG、CpG&A1配伍的组相比,AD和ADL佐剂组的抗体水平和间接免疫荧光反应也都显著增强(P<0.05,P<0.05),抗体对单表位识别显著,抗体IgG分型中IgG1和IgG2a水平较高.结论 佐剂ADL和AD的效果显著,可以作为与M.RCAg-1和M.RCAg-3配伍的候选临床应用佐剂.
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恶性疟原虫红细胞表面膜蛋白1DBLα区不同区段与血型抗原的结合特性分析
根据大肠杆菌密码子组成特点,重新优化并合成FCR3S1.2株恶性疟原虫红细胞表膜蛋白1(PfEMP1)DBLα区基因序列,利用PCR的方法,将优化后的基因序列分为3段.分别将全长基因和3个基因片段在大肠杆菌中表达、纯化.通过重组蛋白与血型抗原的亲和试验,分析功能区与血型抗原是否具有亲和力.结果表明,重组的PfEMP1-DBLα全长蛋白质及分段表达的重组蛋白对血型抗原A、B均有特异性的亲和力.本实验结果为揭示恶性疟原虫的主要致病分子与人体细胞相互作用机制提供了实验依据.
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恶性疟疾疫苗M.RCAg-1与候选佐剂纳米乳配伍的免疫原性研究
为了评价纳米乳作为佐剂对恶性疟疾人工重组蛋白疫苗M.RCAg-1免疫原性的影响,将纳米乳佐剂与M.RCAg-1相配伍,于第0、14、28 d肌肉注射免疫小鼠,抗原量为20 μg/只.第3次免疫后10 d,眼球取血并取脾细胞.采用ELISA法检测小鼠血清特异性IgG抗体水平、抗体亚类及其对抗原单表位的识别,用间接免疫荧光反应(IFA)检测抗体对恶性疟原虫天然蛋白的识别,用ELISPOT法检测小鼠脾淋巴细胞免疫应答水平.结果显示疫苗佐剂组小鼠血清中抗M.RCAg-1的抗体水平可达1:108;疫苗佐剂组产生的特异性IgG抗体以IgG1为主;疫苗佐剂组抗体对抗原单表位和天然虫体的识别效果显著.各表位和蛋白诱发免疫小鼠分泌IFN-γ的特异性淋巴细胞克隆数高于分泌IL-4的特异性淋巴细胞克隆数.结果提示纳米乳作为恶性疟疾疫苗M.RCAg-1的佐剂,能够显著提高机体的体液免疫和细胞免疫应答水平.
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鼠疟模型作为恶性疟原虫多表位疫苗保护性的探索试验
目的：为寻找恶性疟原虫基因工程多表位疫苗保护性评价的模型动物，利用小鼠约氏疟原虫(Plasmodium yoelii)及小鼠伯氏疟原虫(Plasmodium berghei)模型对本实验室构建的恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)多阶段、多表位基因工程候选疫苗进行了体内保护性及免疫模式探索试验。结果在约氏疟原虫模型，先用该疫苗基因的大肠杆菌表达蛋白免疫，后用含同一基因的重组痘苗病毒加强免疫组，与野生型痘苗病毒免疫组及空白对照组相比，小鼠的死亡时间延长(P<0.01)。结果初步显示，约氏疟原虫鼠疟模型可用作该基因工程多表位恶性疟原虫候选疫苗的保护性评价。
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恶性疟原虫海南株翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)基因在M15中的表达
获得翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)基因后与表达载体pQE-30重组,然后转化大肠杆菌M15,经IPTG诱导后表达TCTP融合蛋白,薄层扫描结果显示目的蛋白占菌体总蛋白的23.4%,目的蛋白中可溶性蛋白所占比例高于非溶性蛋白.Ni-NTA纯化后C端测序,结果C端13个氨基酸序列与由GenBank国际基因库中恶性疟原虫TCTP基因推导出的C端13个氨基酸序列及组成完全一致.结果表明成功地在M15中表达了恶性疟原虫海南株TCTP基因,为进一步研究提供了实验材料.
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恶性疟原虫顶端膜抗原-1(P.f AMA-1)基因在大肠杆菌中的表达及表达产物的纯化
本文采用PCR方法自 P.f 基因组中扩增了编码AMA-1完整胞外域及其相应结构域的基因片段,定向克隆入原核表达载体pET-16b和pET-30a(+),经测序确证后将重组子转入BL21(DE3)进行诱导表达,用SDS PAGE鉴定,对可溶性和包涵体形式的重组蛋白分别采用天然状态和变性状态下的Ni离子亲和层析进行纯化,变性蛋白再在GSH/GSSG氧化还原条件下经透析重新折叠复性.所得纯化产物为进行有关AMA-1功能和免疫保护特性的研究提供了条件.
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基于山梨醇多次同步化处理的恶性疟原虫体外培养同步化方法
为了获得恶性疟原虫红细胞内期不同生长阶段更加精准的组织材料,本研究探索一种简便易行并能获得同步化程度很高的恶性疟原虫虫株的方法.该方法采用山梨醇多次连续同步化恶性疟原虫环状体,并继续培养得到同步化程度高、窗口小、虫血率高的红细胞内期各期的恶性疟原虫虫株;室温条件下(17～20C)继续培养同步化至裂成熟殖体期的恶性疟原虫虫株,用孔径1.2 μm的无菌滤膜过滤,收集裂殖子.经同步化处理之后,恶性疟原虫在环期、早期滋养体期、晚期滋养体期和成熟裂殖体期的同步化程度分别在90％、85％、85％和80％以上,同步化后各期恶性疟原虫虫血率可达10％～20％,各期虫株的生长周期的窗口可达4h以内.
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恶性疟原虫PfMAg?1对裂殖子入侵功能的影响
恶性疟原虫PfMAg?1蛋白为裂殖子表面相关蛋白,为了探究PfMAg?1的功能,本研究采用规律成簇间隔短回文重复及相关失活蛋白(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/dead CRISPR?associated protein 9,CRISPR/dCas9)技术,构建恶性疟原虫PfMAg?1低表达质粒,电穿孔方法转染后通过抗稻瘟菌素(Blasticidin S Deaminase,BSD)筛选出恶性疟原虫MAg1KD(Knock Down,KD)虫株.通过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)、 实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative Real Time Polymerase Chain Reaction,qRT?PCR)检测PfMAg?1表达水平.在体外培养条件下观察MAg1KD虫株生长趋势及裂殖子入侵效率来评价PfMAg?1的表达对恶性疟原虫红内期增殖的影响.结果表明,恶性疟原虫MAg1 KD虫株较对照虫株的体外生长率显著降低,进一步实验提示影响疟原虫增殖速度的原因是MAg1 KD虫株裂殖子入侵效率下降.本研究证实PfMAg?1在恶性疟原虫裂殖子入侵红细胞时发挥重要作用,为进一步评价PfMAg?1蛋白作为疟疾疫苗候选抗原的前景提供了实验依据.
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恶性疟原虫FCC-1/HN株裂殖子表面抗原2(MSA-2)基因在卡介苗BCG中的表达
目的:裂殖子表面抗原2基因(Merozoite surface antigen 2,MSA2)是恶性疟原虫的一种保护性抗原,为研究其重组BCG疫苗的保护作用,首先探讨携带有恶性疟原虫FCC-1/HN株MSA2基因的重组分枝杆菌-大肠杆菌穿梭质粒pBCG/MSA2在卡介苗(Bacillus Calmette Guerin,BCG)中的表达情况.方法:采用电穿孔转化法将重组质粒pBCG/MSA2导入BCG中,通过卡那霉素抗性筛选并经PCR鉴定的重组BCG培养于Middlebrook 7H9 Broth(M7H9)培养基,并添加10% M7H9 Enrichment ADC和0.05% Tween80,4周后于45℃进行诱导表达,表达产物进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)及免疫印迹(Western-blot)分析.结果:SDS-PAGE及Western-blot分析结果均显示在约31kDa的位置上可见明显的蛋白条带,并与MSA2基因编码序列推断的分子量相符.结论:恶性疟原虫裂殖子表面抗原2可在BCG中表达,这些结果将为恶性疟原虫多价BCG疫苗的研制提供科学依据.
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恶性疟原虫FCC-1/HN株环子孢子蛋白基因分枝杆菌——大肠杆菌穿梭表达重组质粒的构建及序列测定
本文对恶性疟原虫环子孢子蛋白(circumsporozoite protein,CSP)基因片段进行克隆和序列测定。根据恶性疟原虫837株基因编码序列设计合成一对引物，采用PCR技术从恶性疟原虫FCC-1/HN株基因组DNA中特异扩增CSP基因片段的Ⅰ区、中央重复区、重复区后可变区和Ⅱ区；经纯化的扩增产物用BamHⅠ和KpnⅠ双酶切后，定向克隆入大肠杆菌——分枝杆菌穿梭表达质粒，转化感受态大肠杆菌DH5α，重组克隆经抗性筛选和快速凝胶电泳鉴定，再经PCR和酶切鉴定，并对重组子进行序列测定。结果表明从恶性疟原虫FCC-1／HN株基因组DNA中可特异扩增出约1 171bp的基因片段，阳性重组质粒经双酶切和PCR鉴定与预期的结果一致，序列测定表明所克隆的基因和编码环子孢子抗原的基因片段相符。
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Hydroethidine-流式细胞术法相对定量分析恶性疟原虫虫血率及其生长周期
本文结合活体荧光染料Hydroethidine (HE)和结合流式细胞术,对实验室培养的恶性疟原虫虫血率及其生长周期进行了相对定量研究和分析,以期寻求一种可替代血涂片镜检法的检测方法.结果表明,染料Hydroethidine工作浓度10 μg/ml即可获得与50 μg/ml相同的效果;Hydroethidine-流式细胞术法与常规血涂片镜检法具有强相关性;此外,该方法可以进一步分析培养恶性疟原虫中早期(环期、滋养体期)和晚期(裂殖体期)的组成和比例.因此,Hydroethidine-流式细胞术法作为一种客观、准确、快速的相对定量分析方法,在疟原虫研究中具有广泛的应用空间,可以替代血涂片镜检法.
关键词： 流式细胞术 恶性疟原虫 Hydroethidine 虫血率 生长周期 -
中缅边境流行区恶性疟原虫野生株驯化方式的研究
本文旨在探讨恶性疟原虫野生株体外培养的驯化方法.在中缅边境流行区采集12株野生型恶性疟原虫样本,采用添加ALBUMAX II、 次黄嘌呤的改进配方,通过逐渐脱离灭活去纤维蛋白原人血浆的培养方式进行人工驯化临床恶性疟原虫株.分别对灭活去纤维蛋白原人血浆对野生型虫株驯化过程及驯化后生长的影响做统计学分析.结果表明灭活去纤维蛋白原人血浆对野生株体外驯化过程生长的影响具有统计学意义,对人工驯化后生长影响不具有统计学意义.终N13-1231和F08B38两虫株经驯化后可脱离灭活去纤维蛋白原人血浆连续培养.本文成功对中缅边境流行区恶性疟原虫野生株N13-1231和F0838进行驯化,可脱离灭活去纤维蛋白原人血浆连续培养,具有科学研究价值.
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恶性疟原虫丝氨酸重复抗原部分基因的克隆及其表达
采用PCR方法特异性扩增恶性疟原虫云南株(PFD-3/YN)丝氨酸重复抗原基因片段,经基因序列测定后克隆于pWR450-1融合蛋白表达载体,并转化大肠杆菌TG1.在不同菌体浓度及不同剂量IPTG诱导下检测SERA融合蛋白的表达.采用dot-ELISA及Western-blot分析对表达产物进行鉴定,结果显示SERA基因与pWR450-1重组后在大肠杆菌TG1中表达一72kDa的融合蛋白,当工程菌OD590值为0.8～1.2时,加入终浓度1mmol/L IPTG进行诱导,表达量较高.dot-ELISA和Western blot分析表明SERA基因表达产物能被抗SERA单克隆抗体所识别.
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恶性疟原虫环子孢子蛋白单链抗体与按蚊cecropin A融合基因的构建、原核表达及生物学活性的初步分析
根据按蚊偏嗜性密码子对鼠源性恶性疟原虫环子孢子蛋白单链抗体2a10基因进行改造,并融合按蚊抗菌肽cecropin A编码基因.将获得的cecrop-m2a10融合基因克隆人原核表达载体pET32a(+)中,对表达产物进行SDS-PAGE、western-blot分析并利用琼脂糖扩散法检测其抗菌活性.结果对鼠源性环子孢子蛋白单链抗体2a10中6种氨基酸的170个核苷酸进行了改造,融合cecropin A编码基因,成功构建了cecrop-m2a10融合基因.靶基因在大肠杆菌中以融合蛋白和包涵体的形式高效表达,包涵体经尿素溶解变性及透析复性后表达蛋白的纯度达75%并具备抗大肠杆菌DH5a的活性.本实验为进一步研究cecrop-m2a10在转基因蚊中的多重抗病原效应提供了基础.
关键词： 恶性疟原虫 环子孢子蛋白 单链抗体 cecrop-m2a10 生物学活性 -
重组恶性疟多表位杂合蛋白在大肠杆菌中的表达
将化学合成的恶性疟原虫保护性抗原复合基因(HGFSP)与表达载体pRSET重组并转化大肠杆菌BL21,工程菌经IPTG诱导后,HGFSP得到高效表达.SDS-PAGE结果显示表达产物以非融合、可溶性的形式表达,分子量为23 kDa,占总菌体蛋白的23.65%.Dot-ELISA和Western-blot分析表明表达产物具有免疫原性.
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我国恶性疟原虫裂殖子表面蛋白MSP-2的抗原表位分析
根据我国恶性疟原虫株MSP-2基因序列,检索我国虫株MSP-2是否具有国外已鉴定的MSP-2抗原表位.结果显示,我国虫株MSP-2具有已鉴定的FC-27等位基因型可变区抗原表位STNS和DTPTATE.同时应用计算机辅助抗原表位分析技术对MSP-2进行抗原表位分析预测,并以合成肽技术鉴定了预测表位的免疫原性.抗原指数分析表明,MSP-2分子亲水性指数和侧链易曲性指数高的区域分别位于aa153～166和aa65～72 而aa53～60可能是我国虫株特异的抗原表位.用4个合成肽进行免疫学鉴定,证实预测的表位可以诱导抗肽抗体反应,免疫血清可识别重组MSP-2和恶性疟原虫全抗原中MSP-2抗原区带,且合成肽可与我国流行区高度免疫人群免疫血清反应.由于这些表位存在于我国海南、云南、安徽株MSP-2序列中,可以作为研制我国恶性疟重组多价表位疫苗的候选抗原表位.
