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A型流感病毒核蛋白噬菌体单链抗体体外表达鉴定
目的从构建的A型流感病毒核蛋白(Nucleoprotein)噬菌体单链抗体库中筛选阳性克隆,在大肠杆菌HB2151中表达流感病毒核蛋白噬菌体单链抗体,为研究A型流感病毒免疫渗漏试剂盒建立基础.方法经过连续三轮固相"亲和-洗脱-富集"筛选,丰富噬菌体抗体库中阳性克隆的比例,采用ELISA、SDS-PAGE和Western-blot方法对大肠杆菌培养上清液和细菌周质腔蛋白进行分析目的产物.采用亲和层析方法对细菌周质腔蛋白进行分离纯化并进行单链抗体滴度分析.结果从96个克隆中筛选到10个阳性克隆,其中三个阳性信号较强,分别为A1、E1和G3.其A450分别达到0.469、0.582和0.507.A型流感病毒核蛋白噬菌体单链抗体主要表达于细菌周质腔中,亲和纯化产物稀释4096倍,ELISA结果仍为阳性.结论利用噬菌体抗体库技术,初步在大肠杆菌中表达了A型流感病毒噬菌体单链抗体.
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人源抗狂犬病毒糖蛋白Ⅲ号表位链置换基因工程抗体研究
为获得针对狂犬病毒糖蛋白Ⅲ号表位的人源单抗,本研究采用噬菌体展示平台,对一株狂犬病毒糖蛋白Ⅲ号抗原表位的人源单抗CR4098采用链置换法进行改造.以CR4098单链抗体为骨架,从狂犬疫苗接种者外周血分离淋巴细胞,提核酸逆转录,PCR扩增抗体轻链可变区基因,替换CR4098的轻链基因,构建轻链置换文库.经纯化狂犬病毒aG株富集筛选,以上述筛选出的轻链阳性克隆为骨架,构建重链置换抗体库,富集筛选后通过ELISA和IFA鉴定阳性抗体克隆并进行序列测定.利用IgG表达载体VH/VK双质粒系统瞬时转染293T细胞实现IgG抗体的分泌型表达,通过亲和力测定和中和试验鉴定IgG抗体功能.结果显示,通过轻链置换,我们获得14株抗狂犬病毒scFv抗体,通过ELISA、IFA、亲和力测定及中和试验确定人源抗体RV3A5特异性结合狂犬病毒糖蛋白,对狂犬病毒CVS株和aG株均具有良好的中和活性,亲和力达到2.8×10-9M.通过竞争ELISA对抗体结合表位进行鉴定,结果表明RV3A5特异性识别糖蛋白Ⅲ号抗原表位.通过链置换法成功获得1株全新的针对狂犬病毒糖蛋白Ⅲ号表位的高亲和力人源中和抗体,为狂犬病毒抗体制剂鸡尾酒治疗奠定了基础.
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H5N1亚型禽流感病毒血凝素蛋白单链抗体基因的克隆及表达
构建并表达H5N1亚型禽流感病毒血凝素蛋白单链抗体,为禽流感靶向治疗药物的研制制备靶向载体.从分泌血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞株中提取mRNA,采用RT-PCR法扩增出重链和轻链可变区基因,通过SOEPCR法将重链和轻链通过Linker连接起来构建单链抗体基因,将获得的单链抗体基因装入原核表达载体pET28a(+)中,构建重组质粒并表达,以Western blot鉴定单链抗体的特异性.结果成功构建了单链抗体基因,全长714bp,经原核表达,所构建的单链抗体可与H5亚型禽流感病毒HA蛋白特异结合,为禽流感的靶向治疗奠定了基础.
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从噬菌体展示抗体文库筛选对虾白斑综合征病毒的单链抗体
对虾白斑综合征是一种严重危害对虾养殖业的病毒性疾病.由于目前对其病原体对虾白斑综合征病毒(WSSV)的研究不够深入,所以对WSSV的有效防治仍然是一大难题.为此,用完整的对虾白斑综合征病毒粒子作为靶抗原固相包被,淘选噬菌体展示单链抗体文库,得到两个能够与WSSV结合的单链抗体:E2和H4.单链抗体H4能够结合病毒并抑制病毒对原代培养的对虾淋巴细胞的感染,这些结果表明此单链抗体具有开发为诊断试剂盒和抗病毒药物的潜力.
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抗H5亚型禽流感病毒单链抗体在毕赤酵母中的分泌型表达和生物活性分析
在本实验室研制出的多株针对H5N1亚型禽流感血凝素单抗中,13D4单抗对所有H5亚型病毒均有血凝抑制和中和活性,具有特异性高、反应性强和识别广的特点,且在小鼠实验中显示了对各种代表株禽流感的感染和发病均具有良好的治疗效果.在此研究基础上,本实验通过基因工程构建含有13D4单链抗体(scFv)基因的毕赤酵母表达载体,实现目的蛋白的分泌性表达和纯化.经过竞争法和血凝抑制检测其活性,表明获得的单链抗体具有与原始鼠源抗体相近的反应活性和相同的识别表位.H5N1广谱中和单抗13D4的单链抗体的成功构建,为进一步研制针对H5N1禽流感病毒的治疗性抗体奠定了基础.
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抗汉坦病毒核蛋白单链抗体的构建与表达
汉坦病毒核蛋白在病毒各个基因组片段核糖核蛋白(RNP)复合物的形成,以及RNP复合物装配入病毒颗粒中发挥重要作用.体外研究表明,核蛋白与病毒RNA的特异性结合结构域位于第175～217个氨基酸残基,羧基端其它部分为非特异性结合结构域.为了在细胞内病毒复制的正常过程中研究核蛋白的功能,应用噬菌体表面呈现技术,分别从鼠杂交瘤细胞和人外周血淋巴细胞天然抗体库中,筛选出两株不同抗原结合位点的抗汉坦病毒核蛋白抗体L13 F3和H34Fab抗体,并在大肠杆菌中进行表达.L13 F3 Fab抗体的抗原结合位点位于核蛋白氨基端25～65个氨基酸之间,H34的抗原结合位点位于核蛋白的羧基端的一半.分别使重链可变区羧基端与轻链可变区氨基端通过9个氨基酸寡肽连接起来,构建成单链抗体,并在大肠杆菌内进行表达.通过酶联免疫吸附试验(ELSIA)、间接免疫荧光试验(IFA)和Western blot检测,确定所构建单链抗体与母抗体的抗原结合特性无差别.单链抗体分子量小,易于操作并保留了全部的抗原结合活性,是在细胞内探索汉坦病毒核蛋白功能的良好工具.
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抗HBcAg人源性单链抗体细胞内表达及其抗病毒复制的实验研究
应用人源性抗HBcAg单链抗体细胞内表达技术,探讨抗HBV复制基因治疗的应用价值.应用噬菌体展示和基因重组技术,从HBV感染的外周血淋巴细胞克隆了人源性抗HBcAg单链抗体,并重组至逆转录病毒载体.以人肝癌细胞smmc-7721和PLC/PRF/5为靶细胞进行基因共转染,分别测定实验组细胞上清中的HBsAg和HBeAg,与对照组做比较,观察抗HBcAg单链抗体细胞内表达的抗病毒治疗作用.结果显示,在急性HBV感染的细胞株中,抑制病毒复制效率为49%～61%,在慢性病毒感染细胞,抑制率为41%～54%.实验结果表明,应用单链抗体细胞内表达技术,在抗病毒治疗研究中具有潜在的应用价值.应对HBV的4个开放阅读框架编码产物进行全面的对比研究,以发现抑制效率高、实用价值大的靶基因.
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人免疫缺陷病毒1型Rev单链抗体细胞内免疫抗病毒基因治疗研究
应用抗HIV-1 Rev单链抗体细胞内免疫方法,研究在人T细胞和周围血淋巴单核细胞内抗病毒复制的效果,探讨细胞内免疫抗HIV-1基因治疗的可行性.克隆抗HIV-1Rev单链抗体(sFv)基因,以逆转录病毒为基因载体,将包装后的含靶基因的逆转录病毒转导至人CD4阳性T-细胞株CEM和SupT1,以及HIV-1阴性自愿者的周围血淋巴单核细胞(PBMC),再分别用不同剂量(MOI)的HIV-1病毒株PNL4-3和HxB2进行病毒攻击实验.测定HIV-1 p24抗原.滴度以了解抗病毒复制的效果,检测带报道基因CAT以了解靶基因在细胞内的表达状况.分别应用0.24、0.06和0.024MOI的PNL4-3或HxB2病毒株攻击,测定p24抗原.结果显示,抗Rev sFv细胞内表达能有效地抑制病毒在细胞内的复制,与对照组比较,病毒复制被抑制效率达90%以上.体外培养细胞2个月,仍可观察到效果,病毒攻击后合胞体细胞形成显著减少.CAT实验表明,逆转录病毒载体可使靶基因在人T细胞和PBMC内有效表达.抗HIV-1 Rev sFv细胞内表达可有效地抑制病毒复制,有望成为抗HIV-1基因治疗的一种手段.
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荧光染料偶联抗HER-2单链抗体对乳腺癌的体内外检测研究
目的 探讨使用单链抗体偶联荧光染料的手段构建一种探针,用它进行人类表皮生长因子受体2(HER-2)阳性乳腺癌的体内外检测.方法 通过Overlap PCR (polymerase chain reaction)的方法和柔性肽G4S将赫赛汀(曲妥珠单抗)的轻链与重链连接,构建工程载体,并通过毕赤酵母进行表达纯化,获得靶向HER-2的单链抗体;流式细胞术检测单链抗体对HER-2阳性乳腺癌细胞MDA-MB-453的结合能力;将单链抗体与碱性荧光染料罗丹明B偶联,使用激光共聚焦检测单链抗体在体外对MDA-MB-453细胞的靶向能力;将单链抗体与近红外荧光染料NIRB-NHS偶联,通过CCD照相机实时收集荧光信号,检测偶联探针在荷瘤裸鼠体内的靶向能力,并判断其开发为检测试剂的潜力.结果 通过基因工程手段和毕赤酵母表达,成功获得抗HER-2单链抗体,经Western blot鉴定表明单链抗体anti-HER-2 scFv表达及装配正确.流式细胞术检测anti-HER-2 scFv与乳腺癌细胞MDA-MB-453的结合率为47.4%.体外靶向性实验验证单链抗体anti-HER-2 scFv可在体外很好地靶向乳腺癌细胞MDA-MB-453,单链抗体组的细胞平均荧光强度为101.68±5.76,明显优于阻断对照组25.95±7.32.体内近红外成像实验中,通过对荷MDA-MB-453细胞移植瘤裸鼠给药后的荧光信号分析,结果显示单链抗体探针可以很好靶向至肿瘤部位,分析热点区域的大肿瘤/正常组织荧光信号比可知,单链抗体组的信号比为4.96±0.38,明显强于阻断对照组1.12±0.41.结论 采用毕赤酵母表达体系成功构建并表达了单链抗体anti-HER-2 scFv.单链抗体保留了母本抗体的结合能力,并体现了很好的体外和体内的靶向能力,其具有应用于HER-2阳性乳腺癌检测的潜在价值.
关键词： 人类表皮生长因子受体2(HER-2) 乳腺癌 单链抗体 激光共聚焦 近红外成像 -
靶向EGFR分子的荧光探针设计及其对非小细胞肺癌体内外检测功能的研究
目的 使用单链抗体偶联荧光染料的手段构建一种探针,其可对表皮生长因子受体(EGFR)阳性非小细胞肺癌进行体内外检测.方法 通过Overlap PCR(polymerase chain reaction)的方法通过柔性肽G4S将爱必妥(西妥昔单抗)的轻链与重链连接,构建成工程载体,并通过毕赤酵母进行表达纯化,获得靶向EGFR的单链抗体;流式细胞术检测单链抗体对EGFR阳性非小细胞肺癌细胞A549的结合能力;将单链抗体与碱性荧光染料罗丹明B偶联,使用激光共聚焦检测单链抗体在体外对A549细胞的靶向能力;将单链抗体与近红外荧光染料NIRB-NHS偶联,通过CCD照相机实时收集荧光信号检测偶联探针在荷瘤裸鼠体内的靶向能力,并判断其开发为检测试剂的潜力.结果 通过基因工程手段和毕赤酵母表达,成功获得抗EGFR单链抗体,经Western blot鉴定结果说明单链抗体Anti-EGFR scFv表达及装配正确.流式细胞术检测Anti-EGFR scFv与非小细胞肺癌细胞A549的结合率为40.3％.体外靶向性实验验证单链抗体Anti-EGFR scFv可以在体外很好地靶向非小细胞肺癌细胞A549,单链抗体组的细胞平均荧光强度为136.38±7.62,明显优于阻断对照组(19.83 ±2.75).体内近红外成像实验中,通过荷A549细胞移植瘤裸鼠给药后的荧光信号分析结果显示单链抗体探针可以很好靶向至肿瘤部位,分析热点区域的大肿瘤/正常组织荧光信号比可知,单链抗体组的信号比为7.54±1.42,明显强于阻断对照组(1.17±0.28).结论 本文采用毕赤酵母表达体系成功构建并表达了单链抗体Anti-EGFR scFv.单链抗体保留了母本抗体的结合能力,并体现了很好的体外和体内的靶向能力,其靶向能力可以应用于EGFR阳性非小细胞肺癌的检测领域,拥有潜在的临床应用前景.
关键词： 表皮生长因子受体(EGFR) 非小细胞肺癌 单链抗体 激光共聚焦 近红外成像 -
抗ProGRP(31-98) scFv的131I标记及生物分布研究
目的 研究抗胃泌素释放前体(ProGRP(31-98)单链抗体(scFv)的131I标记方法,并对其标记后的稳定性、免疫活性及生物分布进行分析.方法 采用氯胺T法碘化标记制备131I-anti-ProGRP(31-98)scFv,凝胶柱层析法分离纯化标记产物,利用纸层析法测定标记物的标记率、放化纯度和稳定性,采用细胞结合分析法比较131I-anti-ProGRP(31-98)scFv对小细胞肺癌细胞株NCI-H446和肺腺癌细胞株A549的免疫结合率.将131I-ProGRP(31-98)scFv注射入动物体内,研究其在实验动物体内的分布情况.结果 131I-anti-ProGRP(31-98)标记率为(93.35±0.67)％,标记产物纯化后即刻放化纯度为(98.49±1.21)％.131I-anti-ProGRP(31-98)scFv对人小细胞肺癌NCI-H446和肺腺癌A549细胞株的免疫结合率分别为(85.36±1.45)％和(21.02±2.16)％,且差异有统计学意义(P＜0.05).131I-anti-ProGRP(31-98)scFv在实验动物体内主要通过肾脏和肝脏代谢,血液清除快.结论 131I-anti-ProGRP(31-98) scFv的标记率高,且有良好的稳定性和免疫活性,在实验动物体内主要通过肝脏和肾脏代谢,血液清除快.
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基因工程乳腺癌特异性人单链抗体的表达与特性
研究解决分泌人单抗的杂交瘤细胞系难于稳定持久分泌抗体的难题,制备单链抗体,使单抗分子小型化,为进一步研究其在肿瘤诊断和治疗中的应用作准备.从分泌抗乳腺癌人单抗的杂交瘤细胞CM-1总RNA中,利用RT-PCR技术分别扩增出人单抗重链可变区VH基因和轻链可变区VL基因,将扩增产物纯化后克隆于pGEM-T载体中,进行DNA测序和序列比较分析后,将两者共克隆于表达载体中诱导表达,利用斑点免疫印迹及竞争抑制法检测表达产物的抗原性. 所克隆的CM-1人单抗重链可变区和轻链可变区基因片段,分别属于人免疫球蛋白IgM Ⅲ亚群,和鼠κ轻链V亚群,ⅩⅦ家族,用斑点免疫印迹法检测可见表达产物能与人乳腺癌细胞特异结合;人CM-1单克隆抗体对此单链抗体与人乳腺癌细胞的结合有竞争性抑制作用,抑制率为75.7%.结论成功地制备了可特异结合乳腺癌细胞的CM-1单链抗体.
关键词： 乳腺癌 人单克隆抗体CM-1 单链抗体 -
抗人肺癌单链抗体噬菌体库的构建及特异性单链抗体的鉴定
目的 构建人源噬菌体抗体库,并从中筛选出抗肺癌人源单链抗体.方法 提取肺癌患者癌旁淋巴结组织,通过RT-PCR扩增出重链可变区基因(V_H)和轻链可变区基因(V_L),再经剪切-重叠-延伸PCR(SOE-PCR)将V_H和V_L连接得到单链抗体(ScFv).将双酶切后的ScFv基因片段克隆入噬菌体表达载体pCANTAB5E,得到初级噬菌体抗体库.以肺腺癌细胞株A549为抗原对抗体库进行4轮筛选富集,鉴定抗体库性能.将得到的阳性克隆用IPTG诱导表达并进行检测.结果 成功构建噬菌体单链抗体库.经筛选富集,噬菌体收获率得到增加,第4轮是第1轮的115倍.随机选取10个克隆,通过ELISA法检测到其中7个与A549细胞呈阳性反应,阳性率为70%.SDSPAGE及ELISA检测证实得到人源抗肺癌单链抗体.结论 成功构建人源单链抗体噬菌体库,从中获得具有较高特异性的抗人肺癌单链抗体.
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抗人γδ TCR单链抗体G5-4ScFv的制备及生物学功能分析
目的 构建并应用原核表达体系表达能体外刺激人γδ T细胞增殖的抗人γδ TCR单链抗体.方法 在成功建立稳定分泌鼠抗人γδTCR单克隆抗体杂交瘤细胞系G5-4的基础上,通过RT-PCR,扩增得到该单克隆抗体的重链(VH)和轻链(VL)可变区基因；通过搭桥PCR法,用连接肽(Gly4Ser)3,将VH和VL连接起来,构建了抗人γδ TCR单链抗体G5-4ScFv基因.将该基因插入原核表达载体pET22b(+),并在大肠杆菌TransB( DE3)中经IPTG诱导表达.通过SDS-PAGE,Werstern blot进行鉴定,并通过流式、固相扩增、细胞因子检测、杀伤检测等方法分析单链抗体G5-4ScFv的生物学功能.结果 单链抗体G5-4ScFv的相对分子质量约30ku,能与γδ TCR特异结合；固相化能刺激人PBMC中γδT细胞增殖,2周时其纯度可达90％；扩增得到的γδT细胞能有效杀伤肿瘤细胞系,如Daudi细胞,并在刺激时能有效分泌IFN-γ和TGF-α.结论 成功构建并表达了具有生物学活性的抗人γδ TCR单链抗体G5-4ScFv,为进一步研究其用于制备肿瘤过继免疫治疗用细胞制剂奠定了基础.
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抗卵巢癌单链免疫毒素183B2ScFvPE38融合蛋白的高效表达及活性测定
目的制备抗人卵巢癌单链免疫毒素融合蛋白183B2ScFvPE38,并对其活性进行测定,为卵巢癌导向治疗打下基础. 方法在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)的诱导下,高效表达免疫毒素183B2ScFvPE38,并采用直接ELISA及细胞毒性实验对抗体及毒素部分的活性进行检查 . 结果表达蛋白183B2ScFvPE38以包涵体形式为主高效表达,并有少量可溶性表达.该蛋白具有较好的抗体活性及毒素活性. 结论抗卵巢癌单链免疫毒素183B2ScFvPE38具有良好的免疫学活性及生物学活性,有良好的应用前景.
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抗隐孢子虫子孢子表膜单链抗体4G4的基因克隆及序列测定
应用RT-PCR技术,从分泌抗隐孢子虫表膜单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞4G4中,扩增出抗体VH和VL基因,用Linker(Gly4Ser)3基因,将VH和VL基因连接成ScFv基因,并将其克隆至pMD-18T载体中.经核甘酸序列分析证实,VH和VL基因及Linker基因拼接正确,基因全长717bp,经计算机分析,VH和VL基因均为新发现的基因序列,符合功能性重排的鼠抗体可变区基因特征.
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恶性疟原虫环子孢子蛋白单链抗体与按蚊cecropin A融合基因的构建、原核表达及生物学活性的初步分析
根据按蚊偏嗜性密码子对鼠源性恶性疟原虫环子孢子蛋白单链抗体2a10基因进行改造,并融合按蚊抗菌肽cecropin A编码基因.将获得的cecrop-m2a10融合基因克隆人原核表达载体pET32a(+)中,对表达产物进行SDS-PAGE、western-blot分析并利用琼脂糖扩散法检测其抗菌活性.结果对鼠源性环子孢子蛋白单链抗体2a10中6种氨基酸的170个核苷酸进行了改造,融合cecropin A编码基因,成功构建了cecrop-m2a10融合基因.靶基因在大肠杆菌中以融合蛋白和包涵体的形式高效表达,包涵体经尿素溶解变性及透析复性后表达蛋白的纯度达75%并具备抗大肠杆菌DH5a的活性.本实验为进一步研究cecrop-m2a10在转基因蚊中的多重抗病原效应提供了基础.
关键词： 恶性疟原虫 环子孢子蛋白 单链抗体 cecrop-m2a10 生物学活性 -
人源化单链抗体与白细胞介素2融合蛋白靶向治疗肿瘤的实验研究
目的 评价人源化抗Her2/neu单链抗体及人白细胞介素2(hIL-2)双功能融合蛋白H520C9scFv-hIL-2治疗Her2/neu阳性肿瘤的效果.方法 将构建的表达载体转染293细胞,G418筛选阳性克隆建立稳定表达细胞系.免疫印迹法(Western blotting)、酶联免疫吸附试验(ELISA)及[3H]脱氧胸苷(3H-TdR)渗入法检测融合蛋白浓度和生物学活性.建立荷瘤小鼠肿瘤模型,静脉给药,观测肿瘤体积变化判断治疗效果.结果 细胞培养上清中融合蛋白浓度达(1.2±0.23)mmol/L,5μl上清即可在46 000处见到清晰蛋白条带.纯化后的融合蛋白两个功能单位活性良好,在荷瘤小鼠肿瘤模型治疗实验中显示了明确的治疗效果.结论 哺乳动物细胞可高效表达生物活性良好的融合蛋白H520C9scFv-hIL-2,该蛋白在体内实验中有明显的抑瘤作用,显示了较好的应用前景.
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抗汉坦病毒核衣壳蛋白单链抗体基因的克隆与鉴定
目的 将已筛选出的抗汉坦病毒核衣壳蛋白(NP)抗原单链抗体基因克隆入原核表达载体pGEX-6p-1,构建重组表达质粒pGEX-6P-1-scFv.方法 提取含抗NP抗原单链抗体基因的T7噬菌体DNA,此为模板,PCR扩增单链抗体基因,BamHⅠ和SalⅠ双酶切,经连接酶与BamHⅠ和SalⅠ双酶切的表达载体pGEX-6p-1连接;重组DNA转化入宿主菌E.coli BL-21 (DE3),琼脂糖凝胶电泳初筛选阳性重组质粒,并用PCR法、双酶切法及DNA测序鉴定.结果 重组质粒pGEX-6P-1-scFv经BamHⅠ和SalⅠ双酶切,片段大小分别为5 000 bp和750 bp,与预期值一致;重组质粒PCR产物大小为750 bp,与预期值一致;测定重组质粒序列,并与scFv 序列比较,结果相一致.抗NP单链抗体基因序列克隆入表达载体pGEX-6p-1.结论 成功构建了含抗汉坦病毒NP抗原单链抗体基因的重组原核表达质粒pGEX-6P-1-scFv.
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单克隆抗体和基因工程抗体在感染性疾病病原体检测中的应用
感染性疾病病原体的准确检测对于其有效防控极为重要,也是合理用药、有效治疗的前提.抗体因其高度的特异性和亲和力,已经成为免疫诊断中一个关键性的分子.其类型多样,从多克隆抗体到单克隆抗体,再发展到基因工程抗体,而基因工程抗体又包括单链抗体、双特异性抗体和多特异性抗体等.各类型抗体在感染性疾病的免疫诊断方面均有应用.本文就单克隆抗体和基因工程抗体在感染性疾病免疫学诊断方面的应用作一综述.
