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噬菌体展示技术在病毒研究中的应用
噬菌体展示技术是近些年发展起来的一项新技术.在蛋白质,小分子活性物质以及抗原抗体间相互作用的研究中应用广泛.本文就噬菌体展示技术在病毒研究中的应用现状作一综述.
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噬菌体展示技术在病毒抗原表位筛选中的应用
病毒的抗原表位分析在揭示病毒抗原分子的结构和功能,抗原-抗体反应机制方面具有重要意义,亦为研制诊断试剂,设计多肽疫苗和筛选药物等研究提供依据.近年来,许多学者将噬菌体展示技术应用于病毒抗原表位的筛选中,结果显示:这种新型分析技术弥补了传统分析技术的不足,为基于抗原表位的后继研究奠定了基础.
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噬菌体展示技术在真菌毒素检测中的应用研究
噬菌体展示技术是一项筛选技术,能将外源多肽或蛋白质与噬菌体的衣壳蛋白融合表达,并展示在噬菌体颗粒的表面.因此,可通过该技术获得真菌毒素的模拟表位和抗真菌毒素的重组抗体,这为利用免疫学原理建立无毒检测体系检测真菌毒素带来了新的模式.本文综述了近几年噬菌体展示技术在真菌毒素检测中的应用研究.
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噬菌体展示技术
回顾噬菌体展示技术(PDT)的研究进展.应用噬菌体展示技术将外源蛋白通过与噬菌体外壳蛋白融合而表达于噬菌体颗粒表面,被展示的外源蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性.目前此技术已被广泛应用于生命科学研究的不同领域,尤其在人工抗体和疫苗的研制、多肽药物的开发等方面,具有广阔应用前景.
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噬菌体展示技术在病原体血清学检测中的应用研究进展
噬菌体展示技术广泛应用于临床治疗、诊断和科研等诸多领域并在病原体血清学检测新方法的研究方面显示出明显优势.利用该技术研究者可以在短期内筛选获得具有检测及诊断价值的抗原表位、特异性的结合肽以及重组抗体分子,彻底改变了抗体制备的传统途径,使得大量制备多样化的重组抗体分子成为可能.掌握噬菌体展示技术在病原体血清学检测中的特点,为该技术在筛选目标靶分子的血清学检测中寻求新的突破.
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噬菌体展示技术与中药活性成分靶点蛋白筛选研究
噬菌体展示技术是将所需多肽/蛋白从大量变异体的集落中提取出来的一种高通量的体外筛选技术,因其高效、实用、便捷的优势现已广泛应用于药物研发的多方面领域,在中药活性成分靶点蛋白中也有越来越广泛的应用.靶点蛋白是药物分子在体内的结合位点,良好的靶点是获得优良药物的基础.该文综述了噬菌体展示技术的研究进展及其在中药活性分子靶点蛋白筛选中的应用.
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从噬菌体展示抗体文库筛选对虾白斑综合征病毒的单链抗体
对虾白斑综合征是一种严重危害对虾养殖业的病毒性疾病.由于目前对其病原体对虾白斑综合征病毒(WSSV)的研究不够深入,所以对WSSV的有效防治仍然是一大难题.为此,用完整的对虾白斑综合征病毒粒子作为靶抗原固相包被,淘选噬菌体展示单链抗体文库,得到两个能够与WSSV结合的单链抗体:E2和H4.单链抗体H4能够结合病毒并抑制病毒对原代培养的对虾淋巴细胞的感染,这些结果表明此单链抗体具有开发为诊断试剂盒和抗病毒药物的潜力.
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利用噬菌体展示技术研究功能基因组和蛋白质-蛋白质相互作用——与酵母双杂交方法比较
近年来基因组测序工作已揭示了数以万计的新基因,但是这些基因序列的价值只有当这些数据被翻译成蛋白质功能的时候才能被了解.而蛋白质与蛋白质之间相互作用构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分,不仅可以从分子水平揭示蛋白质的功能,而且为我们更好地理解生命过程、疾病机制和新药开发等提供了一个很好的基础.
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HCV非结构蛋白NS5A人源单链可变区抗体基因的筛选与鉴定
目的筛选、鉴定抗丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A的人源单链可变区抗体(ScFv)的编码基因,为HCV NS5A蛋白质生物学功能的研究及抗HCV的基因治疗研究开辟新途径.方法采用噬菌体表面展示技术,以重组纯化的HCV非结构蛋白NS5A为固相抗原,从噬菌体单链可变区抗体半合成库中经过5轮"吸附-洗脱-扩增”筛选过程,获得抗原结合活性和特异性较强的HCV NS5A人源单链可变区抗体基因片段的阳性克隆,并对其进行免疫检测及序列测定.结果筛选得到的ScFv片段基因核苷酸序列为789 nt,编码由262个氨基酸残基组成的多肽,具有典型的免疫球蛋白轻链和重链可变区的结构特点.基因编码产物具有HCV NS5A蛋白反应的免疫学活性和特异性.结论利用噬菌体抗体库技术,成功获得了HCV NS5A人单链可变区抗体ScFv编码基因,并获得了可溶性单链抗体的表达.
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核糖体展示技术的原理与应用
通过构建分子文库(cDNA文库、随机肽库、抗体库及其它蛋白文库),采用合适的筛选技术可以非常方便、有效、快速地筛选生物活性物质.目前分子文库技术已经广泛应用于抗原表位分析、功能小肽分子(如肽类拮抗剂和激动剂)或功能蛋白分子(如抗体)的筛选和改造等领域.筛选技术主要有两类:1. 体内筛选技术,如噬菌体展示技术[1]、选择性感染噬菌体技术[2]等.
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金黄葡萄球菌agrC结合小肽的筛选及初步鉴定
金黄葡萄球菌(简称金葡菌)附属基因调节系统(accessory gene regulatory system,agr)是重要的毒力因子调节系统和生物被膜形成调控系统.金葡菌几乎所有的胞外和表面毒力因子都在agr的控制之下~([1]),asrC是该系统中重要的信号转导分子.本研究通过噬菌体展示技术,以agrC蛋白为靶分子,对噬菌体随机12肽库进行筛选,寻找能与agrC特异结合的多肽,将其作为靶向治疗金葡菌感染的载体,为临床研究金葡菌生物被膜形成的机制和研制新型靶向药物提供实验依据.
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人单链抗体亲和力成熟研究
目的探索基因工程抗体亲和力体外成熟新技术,获得抗血管内皮生长因子高亲和力的抗体,使之成为肿瘤血管靶向治疗的载体。方法采用错配PCR和单链重叠延伸法,随机突变抗体重链可变区,建立次级噬菌体单链抗体突变库,并从中筛选出高亲和力单链抗体突变株。结果抗体突变株不仅保留了母体抗体的特异性,而且亲和力明显提高。根据基因序列分析,高亲和力突变株中有4个氨基酸发生了改变,分别是Trp38→Cys38,Gln45→Arg45,Lys107→Arg107,Arg109→Leu109。抗体立体结构模拟显示其中3个氨基酸突变位于抗原结合部位。结论实验结果为抗血管内皮生长因子人源单链抗体的应用奠定了基础,同时为抗体结构与功能研究以及抗体亲和力体外成熟提供了参考模型。
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噬菌体展示技术筛选HBV前-前-S抗原基因启动子结合蛋白基因
目的:筛选乙型肝炎病毒(HBV)前-前-S抗原基因启动子的结合蛋白.方法:应用噬菌体表面展示技术,以HBV前-前-S抗原基因启动子的聚合酶链反应产物作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮"黏附-洗脱-扩增"的筛选过程,经噬斑的PCR扩增后,构建克隆载体,并对所筛选克隆进行DNA测序和生物信息学分析.结果:噬菌体经富集后,从随机筛选的43个克隆中得到20个与HBV前-前-S抗原基因启动子特异结合的阳性克隆,包括人类SMG-1的磷脂酰肌醇3相关激酶激酶、28S核糖体、单倍型As2A线粒体、组氨酰-tRNA合成酶、脂肪醛脱氢酶、桥粒相关蛋白、MAX相互作用蛋白1等17个已知功能基因及3个未知功能基因.结论:用噬菌体人肝细胞cDNA文库筛选得到HBV前-前-S抗原基因启动子的结合蛋白基因,为进一步研究HBV发病机制创造了新的途径.
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抗体库优化策略对特异性抗肝癌单链抗体的人源化
目的:对特异性抗肝癌单链抗体(single chain variable fragment,scFv)DM同步进行人源化和优化,以获得亲和力高和免疫原性低的人源化抗肝癌单链抗体.方法:通过分子结构和序列分析,确定对抗原结合位点的构象有重要影响的骨架区(FR)残基,把难以判断回复突变残基的人、鼠源副本同时编入人源化抗体序列中;通过重叠延伸PCR技术合成人源化抗体全基因,利用噬茵体展示技术构建人源化组合抗体库;通过肝癌细胞筛选阳性克隆,ELISA方法测定各个克隆抗原结合活性;用硫氰酸盐洗脱法测定并比较亲本抗体和人源化scFv的相对亲和力.结果:成功构建人源化组合抗体库,实际库容4.77×10 5,包含由2 5不同重链和2 2不同轻链组成的128种人源化DM;经过筛淘及ELISA鉴定,获得HDM1、HDM2和HDM3 3个阳性克隆,相对亲和力指数分别为HDM1 1.6 mol/L、HDM2 1.2 mol/L和HDM3 2.2 mol/L.结论:抗体库优化法是一个高效、简便的人源化方法;获得的3株阳性克隆HDM1、HDM2、HDM3与亲本抗体DM同样具有良好的抗原结合特异性和较高的亲和力.
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应用噬菌体展示技术筛选原发性肝癌血清结合蛋白
目的:通过筛选原发性肝癌血清蛋白结合蛋白,探究肝癌的分子发病机制.方法:应用噬菌体展示技术,以肝癌患者的血清作为固相筛选分子,对T7 Select噬菌体人肝细胞cDNA文库进行5轮"吸附-洗脱-扩增"的筛选过程,经噬斑的聚合酶链式反应(PCR)扩增后,对阳性PCR产物直接进行序列测定和同源性分析.结果:噬菌体经富集后,随机挑取48个噬斑进行PCR扩增,得到5种大小不同的PCR片断,序列测定后经序列同源性分析,结果发现与肝癌患者血清蛋白结合的蛋白有以下5种:人核仁螺旋体磷酸化蛋白NOLC1,人高度迁移基核小体结合域1(HMGN1),人依赖ATP的DNA连接酶1(LIG1),人小EDRK-丰富因子2(SERF2)和A-kinase anchor protein 9 isoform.结论:用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到了肝癌血清蛋白结合蛋白,为进一步阐明肝癌的发生及发病机制奠定了基础.
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应用噬菌体展示技术筛选HBsAg启动子I的DNA结合蛋白
目的:通过筛选HBsAg基因启动子I(SPI,surface promoter I)结合蛋白,为HBV复制机制的研究探索新的途径.方法:应用噬菌体展示技术,以HBsAg基因启动子I的聚合酶链反应(PCR)产物DNA作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮"黏附-洗脱-扩增"筛选过程,经噬斑的PCR扩增后,构建克隆载体,后对所筛选克隆进行DNA序列分析和同源性搜索.结果:噬菌体经富集后,从随机筛选的14个克隆中得到8个阳性克隆,成功构建了克隆载体.序列测定后经过同源性搜索,确定了和HBV表面抗原基因启动子I特异结合的肝细胞蛋白,共编码7种蛋白.其中3个克隆编码未知功能蛋白;其余的克隆分别编码4-氨基丁酸氨基转移酶、触珠蛋白、复制蛋白等蛋白.结论:用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到HBsAg基因启动子I的结合蛋白,分析了该蛋白的编码基因.
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噬菌体展示技术的原理及应用
0引言1985年Smith[1]首次证实丝状噬菌体fd基因组能通过基因工程的手段进行改造,将EcoR Ⅰ内切酶的部分基因片段(171 bp和132 bp)与pⅢ基因融合,获得的重组噬菌体可在体外稳定增生,表达产物能被抗EcoR Ⅰ内切酶抗体所识别.1988年Parmley et al[2]将已知抗原决定族与pⅢ的N端融合呈现在表面,可特异性地被抗体选择出来,并提出通过构建随机肽库可以了解抗体识别的抗原决定簇表位的设想.1990年McCafferty et al[3]也报道了用噬菌体展示技术筛选溶菌酶的单链抗体的方法,从而开始了这项技术的广泛应用的新时代.
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HBV前-S1蛋白结合蛋白大鼠同源基因的克隆化
目的:利用生物信息学(bioinformatics)技术克隆,鉴定人HBsAg前-S1蛋白结合蛋白(PSlBP)编码基因的同源基因.方法:人PSlBP由表达型cDNA文库的噬菌体展示技术筛选获得.以人的PSlBP的cDNA序列作为参照,对于美国国立卫生研究院(NIH)国立医学图书馆(NLM)生物工程信息学研究中心(NCBI)建立的核苷酸序列数据库GenBank,利用同源基因序列比对的在线分析软件BLASn进行同源基因序列的比对,发现新的来源于大鼠的同源基因.确定大鼠PSlBP的cDNA序列之后,对于大鼠PSlBP蛋白质一级结构序列与人和小鼠的PSlBP蛋白质一级结构序列的同源性进行分析.利用在线分析软件,对于大鼠PSlBP一级结构序列中潜在的修饰和功能位点进行初步的预测分析.结果:利用噬菌体展示技术获得了人的PSlBP的cDNA序列.以生物信息学技术确定了大鼠PSlBP的cDNA其编码产物的序列.大鼠PSlBP的cDNA由1 455 nt组成,编码产物由484aa组成.大鼠PS1BP蛋白质一级结构与人和小鼠PS1BP蛋白质一级结构的同源性分别为80.79%(391/484)和92.98%(450/484).利用在线分析软件,在大鼠PSlBP蛋白质一级结构中还发现了一系列潜在的蛋白质修饰结构位点.结论:大鼠PSlBP基因及其编码产物序列被确定.
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羧肽酶N调节乙型肝炎病毒核心启动子表达活性的研究
目的:乙型肝炎病毒(HBV)的感染,不仅引起急、慢性病毒性肝炎,而且与肝纤维化、肝细胞癌的发生发展密切相关.为深入研究HBV调节表达的机制,我们应用噬菌体展示技术,以HBV核心启动子DNA片段为固相支持物,筛选肝细胞cDNA文库,获得HBV核心启动子的肝细胞结合蛋白-羧肽酶N(CPN).CPN是一种从多肽和蛋白质C端氨基酸残基分离的血浆金属蛋白酶,他在调节激肽和过敏毒素的生物活性上起关键作用.CPN是分子量280 kD的四聚体,包含两个50KD酶性亚单位和两个83 kD调节亚单位.核心启动子产生两个3.5kb RNA:前-核心和前基因组RNA.前-核心RNA编码前-核心蛋白和e抗原,前基因组RNA不仅作为mRNA编码核心蛋白和聚合酶蛋白,而且与病毒蛋白一起包埋入核衣壳,作为模板逆转录.前基因组RNA的表达调控在病毒复制周期中起着关键作用.核心启动子分为两部分:基本核心启动子和核心上游调节元件(CURS),其上游为负性调节元件(NER,1616-1621 nt).CPD在体内与HBV核心启动子结合的作用还不清楚,我们分别构建HBV核心启动子及羧肽酶N的重组载体,通过脂质体转染NIH 3T3细胞,研究CPN对核心启动子的调节表达.方法:根据HBV核心启动子及羧肽酶N的序列设计引物,在核心启动子的引物两端引入MIu Ⅰ和Nhe Ⅰ的酶切位点,在羧肽酶N的引物两端引入EcoR Ⅰ和BamHⅠ的酶切位点.用聚合酶链反应(PCR)的方法分别扩增HBV核心启动子和羧肽酶N基因,克隆到pGEM-Teasy载体上.核心启动子经MIu Ⅰ和Nhe Ⅰ双酶切回收连接到同样酶切的pCAT载体上,羧肽酶N经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切回收连接到同样酶切的pcDNA3.1(-)质粒上,构建HBV核心启动子的报告载体及羧肽酶N的真核表达载体,脂质体法瞬时转染NIH 3T3细胞.结果:HBV核心启动子和羧肽酶N(CPN)的PCR产物经1%琼脂糖电泳鉴定与预期大小符合,分别为206 bp和580 bp.重组载体经双酶切鉴定后,证明HBV核心启动子的报告载体及羧肽酶N(CPN)的真核表达载体构建成功.脂质体法瞬时转染NIH 3T3细胞48 h后,用ELISA法检测β-gal的表达,显示核心启动子在羧肽酶N(CPN)的影响下,其活性有大约5-6倍的增加.通过体内实验证明羧肽酶N(CPN)可以上调HBV核心启动子的表达.结论:HBV核心启动子结合蛋白羧肽酶N(CPN)与HBV核心启动子共转染细胞,明显调节HBV核心启动子的表达,为进一步研究HBV复制的分子生物学机制提供了新的理论基础.
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前列腺癌噬菌体抗体库的构建及抗特异性膜抗原抗体的筛选
目的 建立国人前列腺癌噬菌体Fab抗体片段库,筛选、鉴定抗前列腺特异性膜抗原(PSMA)的人源Fab抗体可变区的编码基因,为前列腺癌的诊断与基因治疗研究开辟新途径.方法 20例前列腺癌患者外周血分离淋巴细胞,提取其总RNA,经RT-PCR及半套式扩增得到免疫球蛋白全部轻链和重链Fd段基因,克隆进载体pComb3,并电转化大肠杆菌XL1-Blue,构建前列腺癌噬菌体Fab抗体片段库.采用噬菌体表面展示技术,以PSMA原核表达重组子pET30a(+)-PSMA诱导表达并纯化后的PSMA为固相抗原,从噬菌体Fab抗体库中经过"吸附-洗脱-扩增"筛选过程,获得抗原结合活性和特异性较强的PSMA人源Fab可变区抗体基因片段的阳性克隆,并进行免疫检测及序列测定.结果 成功构建前列腺癌噬菌体抗体Fab片段库,其轻链及重链Fd段与载体DNA的重组率分别为87%、79%,库容为2.32×107,滴度为8.7×1013 pfu/ml.筛选得到Fab抗体克隆的Fd段基因核苷酸序列为696 bp,编码由232个氨基酸残基组成的多肽,与人免疫球蛋白γ链恒定区的同源性为98%;轻链κ基因核苷酸序列为630 bp,编码由210个氨基酸残基组成的多肽,与κ链恒定区同源性为93%.结论 成功构建了前列腺癌噬菌体抗体库,并获得了PSMA人Fab抗体可变区编码基因克隆,该克隆抗体基因具有典型的免疫球蛋白轻链和重链可变区的结构特点,基因编码产物具有与PSMA反应的免疫学活性和特异性.