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HIV特异性CTL反应研究进展
HIV原发感染可以诱发强烈的特异性CTL反应.HIV特异性CTL可以直接裂解病毒感染的细胞、分泌IFN等细胞因子抑制病毒的复制或分泌趋化因子阻断病毒进入靶细胞,从而抑制的HIV复制.但随着疾病的进展,已建立的细胞免疫反应逐渐丧失对HIV的控制,机体免疫系统崩溃并终导致AIDS的产生.HIV感染过程中特异性CTL确切的保护机制以及慢性期CTL功能受损的具体原因还不完全清楚,对这些问题继续深入的探讨无疑对HIV疫苗和免疫治疗研究具有重要意义.
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噬菌体展示技术在病毒研究中的应用
噬菌体展示技术是近些年发展起来的一项新技术.在蛋白质,小分子活性物质以及抗原抗体间相互作用的研究中应用广泛.本文就噬菌体展示技术在病毒研究中的应用现状作一综述.
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结核分枝杆菌Rv1419蛋白抗原表位的预测
目的 预测结核分枝杆菌Rv1419蛋白的抗原表位.方法 利用DNAStar软件包中Protean软件对Rv1419氨基酸序列进行分析,采用包括二级结构、亲水性、抗原性、可及性、柔韧性、电荷分布等多参数预测其二级结构及T细胞和B细胞抗原表位.结果 Rv1419蛋白具有丰富的二级结构和多处抗原指数较高的区段,含有少数潜在的B细胞抗原肽表位(可能在67～70、72～82、142～154、131～137位氨基酸残基或其附近),这些表位抗原性较好,都含有β转角和无规则卷曲结构,呈现在表面的可能性和柔韧性都较大.该蛋白含有较多潜在的T细胞抗原肽表位(可能在5～15、18～22、29～32、43～55、58～62、64～68、86～97、99～109、110～114、117～123,126～128、136～140位氨基酸残基或其附近).结论 结核分枝杆菌Rv1419蛋白是一个T细胞抗原表位占优势的蛋白抗原,也存在B细胞抗原表位,本研究结果为该蛋白抗原表位的进一步研究、应用奠定了基础.
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丙型肝炎病毒T细胞模拟表位的研究及应用
HCV的研究主要集中在以下几个方面:①HCV基因及其产物结构与功能的分析;②HCV的复制机制;③HCV保护性抗原的鉴定及疫苗的研制;④抗HCV药物筛选;上述4个方面的研究都需要HCV动物模型和体外细胞模型.筛选出与原始抗原序列完全相同的线性表位(Liner epitope),又可以筛选出与原始抗原序列不同但功能相似的构像表位(conformational epitope),即模拟表位.这些研究及技术为选取中国HCV流行株T细胞模拟表位和构建细胞模型奠定了基础.理想的细胞模型应具备以下基本条件:①稳定性,即细胞在培养条件下能够稳定地复制和表达;②易于重复;③高水平表达基因产物;④检测方法方便敏感.有研究利用人外周血淋巴细胞建立了HCV感染HCV病毒细胞模型.所以采用人丙型肝炎病毒T细胞模拟表位片段融合基因转染外周血淋巴细胞具有充分依据.
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沙眼衣原体主要外膜蛋白多表位基因的免疫原性研究
目的 构建包含沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)主要外膜蛋白(major outermembrsne protein,MOMP)多表位基因的真核表达质粒PcDNA3.1-Ct MOMP168,检测其诱导BALB/c小鼠产生Ct MOMP特异性体液和细胞免疫反应的水平.方法 构建包含Ct MOMP多表位基因的重组质粒PcDNA3.1-Ct MOMP168并以肌肉注射方式免疫BALB/c小鼠,同时设置pcDNA3.1组和PBS组对照(每组12只,每只100μg/次).采用酶联免疫吸附试验(ELISA)、乳酸脱氢酶释放法及细胞内细胞因子染色-流式细胞术(ICS-FACS)分别检测免疫小鼠血清中Ct MOMP特异性抗体的滴度及其抗体亚型、脾脏中细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的杀伤活性及特异性分泌细胞因子,如γ-干扰素-(IFN-γ)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-10(IL-10)等的CD3+T细胞的水平.结果 同pcDNA3.1(A490=0.180±0.025)和PBS免疫(A490=0.110±0.015)相比,PcDNA3.1-Ct MOMP168免疫可刺激小鼠产生高效价Ct特异性IgG抗体(A490=0.973±0.136;血清滴度1:1000),且抗体亚型以IgG2a为主,差异有统计学意义(F=106.884,P<0.05);pcDNA3.1-Ct MOMP168免疫组小鼠脾细胞中CTL杀伤活性(41.71%±8.34%)高于pcDNA3.1组(18.40%±3.45%)和PBS组(14.50%±2.42%),差异有统计学意义(F=22.315,P<0.05;效靶比为50:1);pcDNA3.1-Ct MOMP168免疫组小鼠的脾细胞中Ct MOMP特异性CD3+IFN-γ+T细胞的水平(1.15%±0.16%)高于pcDNA3.1组(0.12%±0.08%)和PBS组(0.09%±0.03%),差异有统计学意义(F=99.638,P<0.05),而PcDNA3.1-CtMOMP168组IL-4+CD3+T细胞(0.13%±0.08%)和IL-10+CD3+T细胞(0.14%±0.08%)的水平与pcDNA3.1(0.07%±0.05%,0.13%±0.06%)和PBS(0.08%±0.04%,0.07%±0.04%)组比较差异无统计学意义(F值分别为0.886、1.112,P值均>0.05).结论pcDNA3.1-Ct MOMP168重组质粒能诱导BALB/c小鼠产生Ct MOMP特异性的体液免疫和细胞免疫应答.
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广东地区流感H3N2毒株血凝素基因特征、进化和变异分析
为揭示广东地区2007～2010年甲型H3N2毒株血凝素(HA)基因特征和变异,采用时空抽样方法抽样,检测广东2007～2010年甲型H3N2毒株HA基因核苷酸序列,同时检索全球HA基因序列作为对照,采用Lasergene 7.1和Mega 5.05软件对HA基因核苷酸序列进行比对和分析；并结合流行病学资料,对变异毒株进行进化速度分析；同时进行抗原分析.结果发现,广东2007～2010年H3N2毒株HA基因同义进化(Ks)和错义进化(Ka)速度分别为2.06×10-3～2.23×10-3核苷酸/年和1.05×10-3～1.21× 10-3核苷酸/年,HA1较HA2的错义突变速率要高3.13倍.与疫苗株A/Perth/16/2009的HA基因比较,2009年广东毒株同源性达到98.8％～99.7％、2010年同源性达到98.0％～98.4％.在广东2007～2010年毒株中,HA1五个抗原表位均有氨基酸位点变异,尤其是2010年毒株B区(N160K)和D区(K174R/N)的变异；此外,广东2010年毒株受体结合部位(RBS)还发生K189E/N/Q和T228A置换变异；两个糖基化位点变异影响到抗原性；目前使用的H3N2疫苗株与目前流行毒株的抗原性有差异.广东地区2007～2010年的毒株中,血凝抑制抗体的抗原分析结果有差异.结果提示,目前广东乃至全球甲型H3N2毒株HA1B区和D区均有氨基酸位点变异,RBS的两个位点发生置换,糖基化位点变异影响到表位A区和B区抗原性；与WHO推荐2011年流感H3N2毒株疫苗株比较,目前流行毒株HA基因有抗原位点变异.
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抗戊型肝炎病毒单克隆抗体识别表位的初步研究
通过 Western blot、体外捕获PCR、ELISA阻断实验及合成的多肽库等方法,对23株抗戊型肝炎病毒(HEV)单克隆抗体(单抗)识别HEV ORF2表位的作用进行系统研究.结果显示,7株线性单抗识别表位都位于ORF2aa408～458之间,16株构象型单抗识别表位都定位于ORF2 aa459～606之间,大部分构象型单抗识别表位都在天然病毒表面.对这些单抗识别表位系统地了解将为HEV疫苗、诊断、病毒受体和病毒感染机制等方面的研究提供重要工具.
关键词： 戊型肝炎病毒(HEV) 单克隆抗体(单抗 McAb) 表位 -
人源抗狂犬病毒糖蛋白Ⅲ号表位链置换基因工程抗体研究
为获得针对狂犬病毒糖蛋白Ⅲ号表位的人源单抗,本研究采用噬菌体展示平台,对一株狂犬病毒糖蛋白Ⅲ号抗原表位的人源单抗CR4098采用链置换法进行改造.以CR4098单链抗体为骨架,从狂犬疫苗接种者外周血分离淋巴细胞,提核酸逆转录,PCR扩增抗体轻链可变区基因,替换CR4098的轻链基因,构建轻链置换文库.经纯化狂犬病毒aG株富集筛选,以上述筛选出的轻链阳性克隆为骨架,构建重链置换抗体库,富集筛选后通过ELISA和IFA鉴定阳性抗体克隆并进行序列测定.利用IgG表达载体VH/VK双质粒系统瞬时转染293T细胞实现IgG抗体的分泌型表达,通过亲和力测定和中和试验鉴定IgG抗体功能.结果显示,通过轻链置换,我们获得14株抗狂犬病毒scFv抗体,通过ELISA、IFA、亲和力测定及中和试验确定人源抗体RV3A5特异性结合狂犬病毒糖蛋白,对狂犬病毒CVS株和aG株均具有良好的中和活性,亲和力达到2.8×10-9M.通过竞争ELISA对抗体结合表位进行鉴定,结果表明RV3A5特异性识别糖蛋白Ⅲ号抗原表位.通过链置换法成功获得1株全新的针对狂犬病毒糖蛋白Ⅲ号表位的高亲和力人源中和抗体,为狂犬病毒抗体制剂鸡尾酒治疗奠定了基础.
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MERS-CoV棘突蛋白表位多肽疫苗设计及在小鼠体内免疫效果分析
筛选有效的免疫原,研制安全有效的疫苗,是预防中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)感染的有利武器.本研究应用生物信息学方法,预测了MERS-CoV棘突蛋白(Spike,S)上的多肽抗原表位.基于生物信息学分析结果人工合成9条多肽并偶联钥孔戚血蓝素后,分别免疫BALB/C小鼠,检测了多肽诱导的体液免疫和细胞免疫应答.结果表明,YVDVGPDSVKSACIEVDIQQTFFDKT-WPRPIDVSKADGI的多肽,三次免疫小鼠后,可在小鼠体内诱导较强的IgG抗体(滴度达1∶10 000)和较高水平的抗原特异性细胞免疫应答.本研究结果为基于生物信息学预测的多肽疫苗的设计及MERS-CoV疫苗的研制提供了科学参考.
关键词： 中东呼吸综合征冠状病毒 多肽 表位 疫苗 生物信息学 -
猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2中和表位的定位及其免疫反应性分析
猪瘟病毒(CSFV)囊膜结构糖蛋白E2(gp55)是激发保护性免疫应答的主要抗原蛋白.Ems和E2与细胞表面受体的相互作用介导病毒对细胞的感染过程.采用抗CSFV中和性单克隆抗体c24/10,淘选噬菌体展示的12肽随机肽库,结合噬菌体拟位免疫反应性分析结果,对CSFV E2蛋白中和表位进行定位.结果表明:E2蛋白的SPTTLR基序(832～837位氨基酸)构成CSFV特异性线性中和表位,基序的第一、二、三位氨基酸是表位与单克隆抗体c24/10结合所必需的氨基酸,也是表位的关键性氨基酸.
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日本血吸虫细胞免疫原模拟表位的筛选及初步鉴定
目的 从噬菌体随机12肽库中筛选日本血吸虫(Schistosoma japonicum, S.j)具有保护性的细胞免疫原模拟表位,为进一步阐明其免疫保护性分子机制提供依据. 方法 用具有保护性的S.j12d童虫培养细胞(S.jC-12)免疫鼠血清中的IgG对随机12肽库作亲和筛选,随机挑取20个噬菌体克隆用ELISA检测其特异性;对阳性克隆进行测序,采用ELISA和Western blot检测阳性克隆免疫鼠血清中的特异性抗体及其识别天然抗原的特性. 结果 经过4轮免疫淘洗,洗脱的噬菌体得到了有效富集(16 250倍).20个噬菌体克隆经检测有15个能被S.jC-12免疫鼠血清识别,有12个序列不同的噬菌体克隆;ELISA检测显示有11个阳性噬菌体克隆诱导小鼠产生IgG应答,其中含精氨酸的阳性噬菌体克隆免疫血清中IgG水平与不含精氨酸克隆免疫鼠比较差异有统计学意义(P＜0.01). 结论 利用噬菌体展示技术可筛选出S.jC-12免疫原的部分模拟表位且能在小鼠模型中诱导免疫应答.
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布鲁氏菌S2株L7/L12蛋白B细胞线性抗原表位的预测与鉴定
目的 预测猪布鲁氏菌S2株L7/L12蛋白B细胞线性抗原表位,并鉴定其抗原性. 方法 以布鲁氏菌S2株为对象,采用NCBI提供的BLAST程序分析其L7/L12蛋白与原核模式生物大肠埃希菌L7/L12蛋白的同源性;使用IEDB网络服务器初步预测B细胞线性表位;在大肠埃希菌L7/L12蛋白空间结构的基础上,使用SWISS-MODEL服务器构建猪布鲁氏菌S2株L7/L12蛋白空间结构模型,参考空间结构特点筛选符合形成表位的区域,同时分析区域内易形成表位的3种氨基酸(缬氨酸、亮氨酸、半胱氨酸)所在位置,综合分析以上结果获得所预测表位;以预测表位序列为基础,人工合成表位多肽—匙孔血蓝蛋白复合抗原并包被酶标板,分别以rL7/L12多克隆抗体及小鼠布鲁氏菌免疫血清为一抗,采用间接ELISA方法验证所预测表位的抗原活性. 结果 L7/L12含有潜在的B细胞线性抗原表位,所预测表位区位于N末端第51-66aa,60-75aa,87-102aa;ELISA检测合成的表位多肽蛋白复合物抗原性,60-75aa表位能够与rL7/L12多克隆抗体及布鲁氏菌免疫鼠血清抗体结合. 结论 筛选的猪布鲁氏菌L7/L12蛋白B细胞线性表位位于N末端第60-75aa区域,具有与特异性血清结合的能力,为布鲁氏菌的感染诊断与疫苗研发奠定了基础.
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金黄色葡萄球菌IsdA蛋白B细胞线性抗原表位的预测与鉴定
目的 预测金黄色葡萄球球菌Newman株IsdA蛋白B细胞线性抗原表位,并对所预测B细胞表位的免疫反应性进行初步鉴定. 方法 以金黄色葡萄球球菌Newman株IsdA蛋白为对象,采用NCBI提供的蛋白质查询程序确定IsdA蛋白的氨基酸序列,然后使用网络在线预测软件SOPMA分析IsdA蛋白质二级结构;使用IEDB网络服务器预测IsdA蛋白B细胞线性表位和Th细胞表位;使用VectorNTI10.0软件分析IsdA蛋白序列中易形成B细胞表位的氨基酸-缬氨酸、亮氨酸及半胱氨酸所在的位置.综合以上分析结果获得所预测B细胞线性表位.以预测表位序列为参考,人工合成表位多肽,通过肽间接ELISA法验证所预测表位与IsdA多克隆抗体血清的免疫反应性. 结果 IsdA存在潜在的B细胞线性抗原表位,所预测表位区分别位于N末端P120-140、P181-200、P210-230和P300-320,间接ELISA检测rIs-dA多克隆抗体血清中存在着可与P210-230、P300-320结合的组分. 结论 IsdA蛋白潜在的B细胞线性表位位于N末端P210-230和P300-320区域,具有与特异性血清结合的能力,为金黄色葡萄球菌的表位疫苗研发奠定了基础.
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肺吸虫模拟抗原诊断价值及序列分析
目的探讨噬菌体展示肺吸虫模拟抗原的诊断价值并分析与天然抗原的同源性.方法建立肺吸虫噬菌体模拟抗原的ELISA,对肺吸虫病人、日本血吸虫病人、旋毛虫病人及健康者血清进行检测,分析其敏感性和特异性;提纯噬菌体模拟肽的DNA模板进行序列测定,以Blast软件分析其序列同源性.结果肺吸虫模拟抗原的6个阳性克隆中P5、P6、P8、P13、P16的阳性、阴性预测值及诊断效率均为100%,P7的阳性、阴性预测值及诊断效率分别为100%、78.9%、86.7%.上述6个克隆有2个克隆的DNA序列完全相同,即6个克隆包含了5种不同的抗原表位;Blast分析表明5个表位与已知的肺吸虫抗原表位无DNA序列的同源性.结论肺吸虫模拟抗原对肺吸虫病具有一定的诊断价值,这5种表位可能从空间结构上模拟了天然抗原表位.
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Eps8抗原HLA-A*0201限制性CTL表位的预测和鉴定
目的:寻找并鉴定肿瘤相关抗原Eps8来源的HLA-A* 0201限制性CTL表位,为临床开展基于Eps8表位的特异性免疫治疗奠定基础.方法:通过在线生物学软件从C-末端酶切位点、MHC-Ⅰ类分子结合力及TAP转运效率3个方面初步预测Eps8抗原的HLA-A* 0201限制性CTL表位,通过肽/MHC分子结合力及肽/MHC分子复合物稳定性实验初步验证预测结果,利用酶联免疫斑点检测(enzyme-linked immuospot assay,ELISPOT)方法检测候选表位刺激健康志愿者外周血单个核细胞(PBMNC)分泌IFN-γ的能力,以及LDH细胞毒实验验证其体外杀伤肿瘤细胞的功能,后在HLA-A* 0201/Kb转基因小鼠中检测候选表位的体内免疫功能.结果:通过在线生物学软件筛选得到4个候选表位.结合力实验结果显示,p360-368具有高结合力,p101-109、p276-284具有中等结合力.稳定性实验结果显示,该3个表位的DC50均大于8h.LDH细胞毒实验中p101-109、p276-284、p360-368都能诱导产生特异性CTL,对靶细胞具有显著的杀伤效应,还能提高效应细胞分泌IFN-γ的水平.在HLA-A* 0201/Kb转基因小鼠体内免疫功能检测中同样证实该Eps8抗原表位能产生强烈的免疫应答.结论:天然表位p101-109、p276-284、p360-368可能是Eps8抗原HLA-A* 0201限制性CTL表位.
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重组CYP2D26主要B细胞表位在Ⅱ型自身免疫性肝炎小鼠模型构建中的效应研究
目的 研究在大肠杆菌中以重组病毒样颗粒形式表达的人Ⅱ型自身免疫性肝炎标志蛋白 CYP2D6主要抗原表位aa262-270免疫小鼠后对构建小鼠自身免疫性肝炎模型的效应.方法 设计人Ⅱ型自身免疫性肝炎标志蛋白主要抗原表位aa262-270 (WDPAQPPRD)的下负链寡核苷酸片段,经退火后插入表达乙肝核心蛋白 HBcAg的质粒pNP中(pNP质粒由pThioHisA质粒插入HBcAg基因片段构建而成).构建成质粒pNP-AIH2;转染大肠杆菌DH5α感受态细胞；以IPTG诱导重组蛋白表达,经硫酸铵沉淀、洗涤,密度梯度离心纯化和脱盐后,肌肉注射免疫小鼠3次,以ELISA和western blot检测免疫后小鼠特异性抗体的产生和水平,通过转氨酶检测和肝脏石蜡切片HE染色观察炎症反应.结果 SDS-PAGE结果显示重组菌诱导表达的目的蛋白分子量为19kD,与预期相符;电镜证实其以可溶性的病毒样颗粒形式存在;ELISA显示,免疫小鼠血.清与包被的肝脏匀浆蛋白特异反应,检测到持续存在的特异抗体,滴度至少为1∶2000; western blot检测表明,抗血清在分子量约为55 kD的地方产生了一个特异的条带,与小鼠CYP2D6蛋白大小一致.与正常对照相比,实验组小鼠转氨酶水平未明显升高,肝切片HE染色没有观测到明显的病理特征.结论 携带人Ⅱ型自身免疫性肝炎标志蛋白 CYP2D26主要表位的病毒样颗粒免疫小鼠后,可刺激产生较强的特异抗体水平,但在观测时间内,未见诱导小鼠产生明显的肝脏炎症反应.
关键词： 肝炎 自身免疫性 表位 B淋巴细胞 细胞色素P450 CYP2D6 -
结核分枝杆菌CFP-10/ESAT-6融合蛋白模拟抗原表位的筛选
目的 探讨噬菌体展示随机肽库技术在结核分枝杆菌培养滤过蛋白 10(CFP-10)/早期分泌抗原靶点 6(ESAT-6)融合蛋白 (CE 融合蛋白) 模拟抗原表位筛选中的应用.方法 以抗 CE 融合蛋白多克隆抗体为靶分子,对随机噬菌体 7 肽库进行筛选,经 3 轮生物淘选后,随机选取 18 个单噬菌体进行测序分析.采用双抗体夹心和竞争 ELISA 方法 对测序后噬菌体进行阳性克隆及其活性鉴定.采用间接ELISA 方法 ,选取阳性单噬菌体与 CE 融合蛋白分别对20 份活动性肺结核患者和 10 份有卡介苗接种史健康人的血清标本抗体进行检测.结果 经过 3 轮生物淘选,能与靶分子特异性结合的噬菌体得到了明显富集.18 个单噬菌体测序共获得 9 种序列,其中单噬菌体 5、6、18 的氨基酸序列均包含 Trp-Asp-Ala-Thr (WDAT) 保守序列,该序列与 ESAT-6 第 58-61 位氨基酸的序列一致.9 种序列中各取 1 个单噬菌体经双抗体夹心和竞争 ELISA 检测,有 7 个单噬菌体 (1、5、6、10、13、14、18,S/N 值依次为9.2、9.7、9.4、8.9、9.6、9.9、9.0)确定为具有免疫活性的阳性克隆.选取含有 WDAT保守序列的阳性单噬菌体 5 与 CE 融合蛋白分别对 2 种血清标本抗体进行间接 ELISA 检测结果 显示,单噬菌体5 对 2 种血清标本抗体检测的吸光度值均高于 CE 融合蛋白(分别为0.931±0.298 vs 0.317±0.157、0.496±0.073vs 0.118±0.026,均P＜0.05);单噬菌体 5 对活动性肺结核患者血清标本抗体的检出率 (95%,19/20) 明显高于 CE融合蛋白 (60%,12/20),而对有卡介苗接种史健康人血清标本抗体的检出率 (9/10) 低于 CE 融合蛋白 (10/10).结论 利用噬菌体展示随机肽库技术成功筛选出 7 个 CE融合蛋白的模拟抗原表位,并获得了定位于 ESAT-6 第 58～61 位氨基酸序列的 CE 融合蛋白的 1 个线性 B 细胞抗原表位,提高了 ELISA 检测的敏感性,为进一步研究 CE融合蛋白的其他抗原表位及以特异性抗原表位为基础开发结核抗体检测试剂奠定了基础.
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乙肝病毒表面抗原"a"决定簇病毒样颗粒的构建和鉴定
目的 构建一个以乙肝核心抗原为骨架的病毒样颗粒,乙肝表面抗原"a"决定簇呈现在该病毒样颗粒的表面.方法 乙肝adr血清型的HBsAg蛋白"a"抗原决定簇(aa139～148,CSKPTDGNCT)插入到HBcAg的第78位天冬氨酸和第79位脯氨酸之间,密码子优化之后基因合成,酶切后连接到表达载体上,在大肠埃希菌中进行表达,纯化后对蛋白进行电镜观察、ELISA检测抗原性、免疫兔后检测免疫原性.结果 构建得到预期的原核表达质粒,并在大肠埃希菌中表达,纯化后电镜观察为病毒样颗粒,ELISA检测证实具有良好的抗原性和免疫原性.结论 成功获得预期的带乙肝表面抗原"a"决定簇的病毒样颗粒,为其应用奠定基础.
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两种嵌合乙型肝炎病毒preS1中和表位的乙肝核心病毒样颗粒的制备与抗原性分析
目的 构建嵌合preS1 21-47位氨基酸(aa)、以全长乙肝病毒(HBV)核心抗原(HBcAg)为骨架的病毒样颗粒H2和嵌合preS1 aa 37-45、以截断HBcAg为骨架的病毒样颗粒H3,并对比其抗原性.方法 将HBVadr血清型preS1中和表位aa 21-47和aa 37-45分别插入到全长HBc(aa 1-183)和截断HBc (aa 1-144)的第78位天冬氨酸和第79位脯氨酸之间,密码子优化之后全基因合成,目的片段经双酶切(NdeI和XhoI)回收后连接到同样处理的pET43.1a载体上,在大肠埃希菌E.coli BL21(DE3)中表达,精细纯化后通过电镜观察蛋白形态、ELISA以及Western Blott检测其抗原性.结果 成功构建表达质粒H2和H3,并在BL21(DE3)中高效表达和自发组装成病毒样颗粒.纯化后电镜观察H2和H3形态为二十面体立体对称样病毒样颗粒,H2为实心颗粒,直径为(31.61±1.27) nm,H3为空心颗粒,直径为(28.46 ±1.16) nm.统计分析可得H2直径要比H3直径大(P＜0.01).ELISA和Western Blott检测结果证实其插入表位preS1以及载体蛋白HBc的抗原性.结论 成功获得两种嵌合HBV preS1中和表位的病毒样颗粒,为其在疫苗研究中的应用探索奠定基础.
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应用噬菌体表面展示技术筛选流感病毒H3N2抗原模拟表位
目的 筛选特异性流感病毒H3N2抗原模拟表位,为开展新的流感病毒疫苗研究探索新的途径.方法 应用噬菌体表面展示技术,以抗-H3N2的单克隆抗体作为固相筛选分子,对人工合成的噬菌体随机肽库进行5轮"吸附-洗脱-扩增"的筛选过程,在第5轮筛选后,随机挑取48个克隆,经噬菌体酶联免疫吸附法(ELISA)鉴定并进行交叉反应实验以及竞争抑制性实验,后对所选克隆进行DNA序列分析,以确定H3N2抗原的模拟表位.结果 经噬菌体富集后,从随机筛选的48个克隆中得到21个阳性克隆,经ELISA鉴定及交叉反应实验、竞争抑制性实验后,确定氨基酸序列XTXPYXX为H3N2的模拟表位.结论 用噬菌体7肽库筛选得到H3N2的模拟表位,为开展用流感病毒模拟表位探索新的防治方法研究奠定了基础.
