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结核分枝杆菌Ag85B-ESAT-6融合蛋白重组耻垢分枝杆菌对小鼠的免疫原性研究
目的 评价表达Mtb Ag85B ESAT-6融合蛋白的莺组耻垢分枝杆菌(Ag85B-ESAT-6-rM.s)在小鼠中的免疫原性.方法 6周龄BALB/c小鼠经背部皮下注射1×106 CFU(colony-forming unit,菌落形成单位)的Ag85B-ESAT-6-rM.s,同时设M.s免疫组(10只)、B[CG免疫组(10只)、Ag85B-ESAT-6融合蛋白免疫组(10只)和生理盐水组(10只).接种免疫后1～6周,尾静脉采血,检测小鼠外周血CD4+和CD8+T细胞所占百分比；免疫后6周,MTS[ 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl )-2 H-tetrazolium,inner salt]法检测小鼠脾淋巴细胞增殖和酶联免疫斑点检测(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)检测脾淋巴细胞分泌γ干扰素(interferon γ,IFN-γ)、白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)和白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)等细胞因子的水平.结果 Ag85B-ESAT-6-rM.s免疫小鼠后能够明显刺激小鼠外周血CD4+和CD8+T细胞的产生,其所占百分比[(59.6±1.5)％]明显高于BCG免疫组[(48.8±2.3)％](t=12.252,P＜0.05)和原始M.s免疫组[(45.7±1.6)％](t=20.166,P＜0.05).Ag85B- ESAT-6-rM.s免疫小鼠的脾淋巴细胞增殖指数(3.23±0.31)与BCG免疫刺激的增殖指数(2.95±0.36)相当(t=1.864,P＞0.05),但其诱生IFN-γ的能力[斑点形成细胞(spot forming cells,SFC)][(167.5±36.6)SFC/106]明显高于BCG[(98.5±26.9)SFC/106](t=4.804,P＜0.05).结论 Ag85B-ESAT-6融合蛋白在耻垢分枝杆菌中的表达能够明显提高M.s的免疫原性,并能够刺激小鼠机体产生有利于抗Mtb感染的免疫反应,作为TB新型候选疫苗具有一定的研究前景.
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结核分枝杆菌ESAT6-RpfE亚单位疫苗的构建与免疫原性研究
目的 构建Mtb ESAT6-RpfE(早期分泌抗原靶6-复活促进因子E)的原核表达载体,表达和纯化融合蛋白,并对其免疫原性进行研究.方法 分别以Mtb H37Rv及临床株的基因组为模板,PCR扩增esat6、rpfE基因,依次插入pET30a质粒并在大肠埃希菌BL21中表达纯化ESAT6-RpfE蛋白.采用完全随机的方法将C57BL/6小鼠分组,每组6只,共进行了两次实验,第一次实验分为ESAT6、RpfE、ESAT6-RpfE、PBS、BCG五组,佐剂为二甲基三十六烷基胺(dimethyl-dioctyldecyl ammonium bromide,DDA)；第二次实验有ESAT6-RpfE、PBS、BCG三组,佐剂为DPG[DDA+ poly(I:C)+明胶].分别于0、3、6周皮下免疫C57BL/6小鼠.末次免疫8周后,用特异性抗原ESAT6及RpfE刺激,检测其分泌IFN-γ的水平；ELISA检测血清特异性抗体IgG2b、IgG1.结果 PCR扩增的esat6、rp/E基因序列与GenBank报道一致；融合蛋白主要以包涵体形式表达；亚单位疫苗免疫动物能够分泌RpfE特异性IFN-γ的脾淋巴细胞数量[(427.13±100.46)]显著高于PBS组(26.13±22.34;q=7.924,P＜0.001)；分泌ESAT6刺激特异性IFN-γ的脾淋巴细胞数量[(506.50±140.40)]明显高于PBS组(19.25±14.75；q=11.36,P＜0.001)和BCG组(125.5±46.41；q=8.882,P＜0.001).FSAT6-RpfE免疫组能诱导产生特异性抗体.结论 成功构建并表达ESAT6-RpfE融合蛋白.此融合蛋白可在C57BL/6小鼠中诱导抗原特异性的免疫应答,可作为新型结核亚单位疫苗的候选疫苗予以进一步研究.
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结核分枝杆菌抗原对人单核细胞核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白12表达的影响
目的 研究结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)抗原对人单核细胞中核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白12(NLRP12)表达的影响,为深入研究NLRP12在结核病中的作用奠定实验基础.方法 采集15例活动性肺结核患者和15名健康人的抗凝血,分离外周血中单核细胞,用Mtb抗原H37Rv全菌裂解液、早期分泌靶抗原6 (EAST-6)和培养分泌蛋白10(CFP-10)的抗原多肽刺激,提取单核细胞的总RNA,采用荧光定量PCR方法检测NLRP12 mRNA的表达,采用配对t检验分析刺激前后单核细胞NLRP12的表达差异.以P＜0.05为差异有统计学意义.结果 全菌裂解液、EAST-6和CFP-10抗原多肽刺激后的活动性肺结核患者单核细胞与未刺激前的单核细胞相比,其NLRP12 mRNA的表达显著下调,由未刺激前的(1.8±1.26)×10-2分别下降到(1.09±0.78)×10-2(t=3.826,P＜0.01)和(1.14±0.87)×10-2(t=3.695,P＜0.01).全菌裂解液、EAST-6和CFP-10抗原多肽刺激后,健康人单核细胞中NLRP12 mRNA的表达与未刺激前相比也降低,由未刺激前的(1.65±0.99)×10-2分别降至(1.2±0.87)×10-2(t=1.909,P＞0.05)和(1.38±1.02)×10-2(t=1.151,P＞0.05),差异无统计学意义.结论 Mtb抗原体外刺激能够抑制活动性肺结核患者单核细胞NLRP12的表达.
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不同抗原全血ELISA检测技术对活动性肺结核的辅助诊断价值研究
目的 探讨克隆表达的抗原PPD、早期分泌抗原靶6(ESAT-6)/培养滤液蛋白10(CFP-10)融合蛋白(简写为E/C)和ESAT-6的全血干扰素释放试验对活动性肺结核的辅助诊断价值.方法 选取活动性结核组96例和对照组91例共计187例,抽取清晨空腹肝素钠抗凝外周静脉血5 ml,分别给以抗原PPD、E/C和EAST-6刺激,通过ELISA的方法检测抗原刺激后血浆中IFN-γ的数值.结果 在活动性肺结核组中3种抗原刺激后IFN-γ含量的中位数分别为ESAT-6[96(41～379)pg/ml]、E/C[3180(1192～7231)pg/ml]、PPD[4348(1230～9026) pg/ml];明显高于对照组中IFN-γ含量ESAT-6[10(4～52)]、E/C[210(49～523)]、PPD[1800 (70～3021) pg/ml],U值分别为1190.5、2405和1309.5,P值均＜0.01;ESAT-6、E/C和PPD的全血ELISA敏感度分别为78.1％(75/96)、87.5％(84/96)和85.4％(82/96),特异度分别为76.9％(70/91)、83.5％(76/91)和65.9％(60/91).结论 融合蛋白ESAT-6/CFP-10对活动性结核病具有一定的辅助诊断价值.
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结核分枝杆菌38 kD-16 kD融合蛋白克隆表达及血清学诊断价值
目的 构建重组结核分枝杆菌38 kD-16 kD融合蛋白,评价其在结核病血清学诊断方面的价值.方法 通过聚合酶链反应扩增获得16 kD和38 kD基因片段,分别连接到表达载体pET21a中,同时将2片段2次连接到表达载体pET21a中,形成38 kD-16 kD(3 816),16 kD,38 kD重组载体;经表达、纯化和复性后,通过Western blot分析,以酶联免疫吸附试验检测184例血清抗体,肺结核患者96例、非结核肺部疾病患者50例,正常对照38例.结果 成功构建重组质粒pET21a-3816,表达蛋白经SDS-PAGE后显示相对分子质量约为65 kD,重组蛋白经镍柱纯化后,纯度均达90 %以上;经 Western blotting 证实重组蛋白能与结核病患者血清反应;重组蛋白3816血清检测,其敏感性为80.2%(77/96),特异性为90.9%(80/88).结论 成功表达和纯化了3816融合蛋白,其对血清学检测证明重组融合蛋白有希望成为结核病血清学诊断的有效候选者之一.
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卡介苗接种对酶联免疫斑点试验检测结核分枝杆菌感染的影响
目的 研究卡介苗(BCG)接种对采用重组培养滤液蛋白10(CFP10)-早期分泌靶抗原6(ESAT6)融合蛋白(重组CFP10-ESAT6融合蛋白)进行酶联免疫斑点试验(ELISPOT)检测结核分枝杆菌感染的影响,评价ELISPOT诊断结核分枝杆菌潜伏感染的价值.方法 以结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)皮肤试验为对照,应用重组CFP10-ESAT6融合蛋白进行ELISPOT检测105名2013年驻京部队入伍新兵外周血中分泌结核分枝杆菌CFP10-ESAT6抗原特异性γ干扰素(IFN-γ)的效应T淋巴细胞斑点数.对PPD和ELISPOT均为阴性的入伍新兵接种卡介苗,3个月后再做PPD试验和ELISPOT.应用SPSS 18.0统计软件进行统计学分析处理,率的比较采用卡方检验,均数比较采用t检验,P＜0.05为差异有统计学意义.结果 105名入伍新兵中,PPD试验和ELISPOT阳性率分别为59.0％(62/105)和14.3％(15/105).43名PPD试验阴性和62例PPD试验阳性者中,分别有6例(14.0％)和9例(14.5％)ELISPOT阳性,两种方法的检测结果差异具有统计学意义(x2=35.86,P=0.00),两种方法的一致率为43.8％(46/105).35名PPD试验和ELISPOT检测均为阴性的入伍新兵卡介苗接种3个月后,PPD试验阳转率为37.1％(13/35),而ELISPOT检测均为阴性,接种前斑点数[(2.6±3.1)个]与接种后斑点数[(2.6±5.0)个]比较,差异无统计学意义(t=0.52,P=0.61).结论 ELISPOT检测结核分枝杆菌感染不受卡介苗接种的影响,能更真实地反映驻京部队入伍新兵的结核潜伏感染情况.
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重组分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白和CFP32的表达及其抗原性
目的 重组表达结核分枝杆菌CFP10和ESAT 6的融合蛋白及卡介苗(BCG)CFP32,分析其抗原性.方法 用重组PCR从结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA中扩增获得融合基因cfp10-esat6;从BCG基因组DNA中扩增cfp32基因.经克隆和测序分析后,分别亚克隆至表达载体pQE-30和pET-23a(+),在大肠埃希菌BL21中表达重组蛋白,予以纯化、鉴定,Western blot和间接E1.ISA分析重组蛋白的抗原性.结果 构建了重组表达质粒pQE30-cfp10-esat6和pET-cfp32,表达了CFP10-ESAT6融合蛋白和CFP32.CFP10-ESAT6蛋白表达量约占菌体总蛋白的15.2%,纯化后蛋白纯度约为92%,浓度为0.456g/L;CFP32蛋白表达量约占菌体总蛋白的10.6%,纯化后蛋白纯度约为90%,浓度为0.310g/L.纯化CFP10-ESAT6融合蛋白和CFP32检测结核病的敏感性分别为85.7%和71.4%,特异性均为100%.结论 重组表达获得具有良好抗原性的重组融合蛋白CFP10-ESAT6和重组蛋白CFP32.
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结核分枝杆菌CFP10-ESAT6-CFP21融合蛋白克隆表达及全血IFN-γ的检测
目的 构建结核分枝杆菌CFP10-ESAT-6-CFP21(CE21)融合蛋白的重组质粒,通过IFN-γ的检测探讨CE21在结核病检测中的价值.方法 通过聚合酶链式反应(PCR)扩增获得CFP21和CFP10-ESAT-6(CE)基因片段,分别连接到pMD18-T,并将两片段2次连接到表达载体pET21a(+)中,获得pET21a-CFP10-ESAT-6-CFP21重组质粒;经表达纯化和复性后,去除内毒素,利用酶联免疫吸附试验检测48例结核病患者、30例非结核肺部疾病患者及32例健康对照者全血中IFN-γ的释放量.结果 CE21经SDS-PAGE分析后相对分子质量为45,与预期大小一致.CE21融合蛋白全血标本IFN-γ的检测,结核组阳性率为72.9%,非结核疾病对照组和健康对照组阳性率 分别为3.3%和3.1%.结论 成功获得CE21融合蛋白,IFN-γ的检测证明该融合抗原具有良好的结核病检测价值.
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重组结核分枝杆菌ESAT6-CFP10蛋白对不同分枝杆菌致敏豚鼠的皮试反应研究
目的 研究重组结核分枝杆菌ESAT6-CFP10蛋白对临床常见致病分枝杆菌及常见环境分枝杆菌致敏豚鼠的皮试反应.方法 以鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌、瘰疠分枝杆菌、戈登分枝杆菌、苏加分枝杆菌、龟分枝杆菌脓肿亚种、偶发分枝杆菌、草分枝杆菌、微黄分枝杆菌、非洲分枝杆菌、牛分枝杆菌、结核分枝杆菌与卡介菌等16株菌株的活菌菌液分别经腹股沟皮下攻击豚鼠,每组5只,3～4周后,分别皮内注射TB-PPD、PPD-B和重组结核分枝杆菌ESAT6-CFP10蛋白各0.1ml,于注射后24、48 h观察局部硬结的纵径与横径,根据48h的反应结果进行判定.结果 PPD-B对16种分枝杆菌活菌致敏豚鼠的皮试硬结直径均≥5mm,呈阳性,阳性比例均为5/5；TB-PPD对结核、牛、非洲分枝杆菌和卡介菌等活菌致敏豚鼠的皮试硬结直径均≥5mm,呈阳性,阳性比例均为5/5；重组结核分枝杆菌ESAT6-CFP10蛋白对结核、牛和非洲分枝杆菌活菌致敏豚鼠的皮试硬结直径均≥5mm,呈阳性,阳性比例均为5/5；而对鸟、胞内、蟾蜍、堪萨斯、海、瘰疠、戈登、苏加、龟脓、偶发、草、微黄和卡介菌等分枝杆菌活菌、结核分枝杆菌死菌致敏豚鼠的皮试反应均呈阴性,阳性比例均为0/5.结论 重组结核分枝杆菌ESAT6-CFP10蛋白能提高结核分枝杆菌感染诊断的特异度并能区别结核分枝杆菌是否存活、卡介菌致敏导致的皮试超敏反应.
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高通量结核分枝杆菌蛋白可溶表达筛选平台的构建与应用
目的 为了改变结核分枝杆菌蛋白质的结构与功能研究由于受结核分枝杆菌蛋白难以可溶性表达和纯化的影响而进展缓慢的问题.方法 将多个能促进可溶性表达的蛋白标签与高通量的Gateway克隆技术相结合,构建结核分枝杆菌蛋白可溶性表达快速通量的筛选平台.挑选46个不同分子量且已知以包涵体形式表达或者不表达的结核分枝杆菌蛋白的基因,分别克隆到带有N-末端的氮源利用物质A(N utilization substance A,NusA)、小分子泛素样修饰蛋白(small ubiquitin-like modifier-1,SUMO)、麦芽糖结合蛋白(maltose-binding protein,MBP)、硫氧还蛋白(thioredoxin A,TrxA)、酰基载体蛋白(acyl carrier protein,ACP)五种蛋白标签基因的载体上,进行融合表达,分析比较各标签促进可溶性表达的效果.结果 融合NusA标签后,19个蛋白以可溶性形式表达,占总样本的41％(19/46);同时融合SUMO、MBP、TrxA、ACP标签后,可溶性表达的蛋白也分别达到总样本数的22％ (10/46)、26％(12/46)、26％(12/46)、22％ (10/46).结论 结核分枝杆菌蛋白可溶性表达快速通量筛选平台的建立,实现了结核分枝杆菌重组蛋白可溶性表达的快速通量筛选,为更进一步研究结核分枝杆菌蛋白、特别是重要药物靶标蛋白的结构与功能创造了条件.
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结核亚单位疫苗AEC/BC-C02诱导小鼠长期的抗原特异性细胞应答
目的 动态评价结核亚单位候选疫苗AEC/BC-C02在小鼠中的细胞免疫应答水平.方法 6～8周龄SPF级BALB/c雌鼠48只,按数字表法随机分成两组,一组免疫AEC/BC-C02,另一组免疫PBS.末次免疫后第1、2、4、8周分别取两组小鼠(6只/组)分离脾淋巴细胞,ELISPOT检测分泌抗原特异性IFN-γ的T细胞频率；在第2、4、8周ELISA检测抗原特异性IFN-γ的分泌量；在第4、8周,Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测脾淋巴细胞增殖.结果 (1)末次免疫后第1、2、4、8周,对疫苗组小鼠脾淋巴细胞,Ag85B特异性的IFN-γ斑点形成细胞(spot forming cells,SFC)分别为168.8±103.5、205.2±51.0、206.8±65.3和160.0±67.9,与PBS对照组的8.9±6.0、16.1±18.8、9.3±4.9和7.7±6.6比较,差异均有统计学意义(成组t检验,t值分别为3.779、8.525、7.424、5.473;P值均＜0.01)；EC特异性的IFN-γ SFC分别为45.1±18.6、75.6±39.3、86.2±50.4和54.3±26.3,与PBS对照组的4.5±3.5、11.7±10.5、3.8±5.8和5.2±4.3比较,差异均有统计学意义(成组t检验,t值分别为5.258、3.850、3.977、4.521；P值均＜0.01).(2)末次免疫后第2、4、8周,对疫苗组小鼠脾淋巴细胞,Ag85B多肽刺激的IFN-γ分泌量分别是(1.27±0.13) ng/ml,(1.76±0.55) ng/ml和(1.44±0.44) ng/ml;EC多肽刺激的IFN-γ分泌量分别是(0.81±0.33) ng/ml,(0.81±0.69) ng/ml和(0.54±0.29) ng/ml,两者间差异有统计学意义(配对t检验,分别为:t=3.008,P＜0.05;t=2.631,P＜0.05;t=10.02,P＜0.01).(3)末次免疫后第4、8周,Ag85B多肽对疫苗组小鼠脾淋巴细胞的刺激指数(SI)分别为1.756±0.339和1.936±0.287,均分别高于PBS组的1.287±0.0581和1.382±0.114,差异有统计学意义(成组t检验,分别为:t=3.030,P＜0.05;t=4.387,P＜0.01)；EC多肽对疫苗组SI分别为1.599±0.154和1.581±0.156,均分别高于PBS组的1.380±0.126和1.314±0.170,差异有统计学意义(成组f检验,t值分别为2.540、2.844;P值均＜0.05).结论 新型结核亚单位疫苗AEC/BC-C02免疫小鼠可诱导长期稳定存在的抗原特异性记忆T细胞,为后期抗Mtb保护力研究提供药理学基础.
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融合蛋白anti-CD19（Fab）-LDM对B细胞淋巴瘤的抑制作用
目的：探讨融合蛋白anti?CD19（Fab）?LDM在体内对B细胞淋巴瘤生长的抑制作用。方法利用流式细胞检测技术分析anti?CD19（Fab）?LDP抗体与B型淋巴瘤细胞体外免疫结合活性，并分析其平衡解离常数。建立Balb/c裸鼠Raji细胞移植瘤模型，活体成像技术观察Cy5标记的anti?CD19（Fab）?LDP在裸鼠体内靶向定位作用。将融合蛋白anti?CD19（Fab）?LDM经尾静脉注射入Raji荷瘤裸鼠体内，观察其对肿瘤生长的抑制情况，计算抑瘤率，评价疗效。结果 anti?CD19（Fab）?LDP抗体与靶抗原的亲和活性与anti?CD19（Fab）抗体相当，两者的平衡解离常数分别为3.3×109M-1和4.3×109M-1。成功建立Raji淋巴瘤细胞皮下移植瘤模型，体内活体成像结果表明，融合蛋白anti?CD19（Fab）?LDP可靶向定位到肿瘤部位。融合蛋白anti?CD19（Fab）?LDM对裸鼠移植性CD19+B细胞淋巴瘤的生长具有抑制作用，并且具有剂量依赖性。结论融合蛋白anti?CD19（Fab）?LDM，具有较强的特异抗肿瘤疗效，作为抗体靶向药物，在B系淋巴瘤治疗中具有很好的应用前景。
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重组蟹金属硫蛋白的分离纯化及其在兔体内的抗氧化作用
并提高其纯度.GST-MT在短期内可增强实验兔体内抗氧化酶活性.
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卵巢癌抗独特型单链抗体6B11ScFv/鼠HSP70融合蛋白复性条件的研究
目的 探讨大肠杆菌表达的卵巢癌抗独特型单链抗体,小鼠热休克蛋白70(6B11ScFv/mHSP70)融合蛋白包涵体变性、复性条件,以确定其佳体外复性条件.方法 大肠杆菌表达大量融合蛋白6B11ScFv/mHSP70:①比较不同的裂解液(8 mol/L 尿素和6 mol/L 盐酸胍)对包涵体的裂解效率及其对复性蛋白活性的影响;②探索序贯稀释方法,以及氧化还原环境和复性液中不同浓度 L-精氨酸对蛋白稀释复件的影响;③比较稀释复性和柱上复性对融合蛋白复件效率及活性的影响.采用Bradford法测定包涵体裂解液与复性后蛋白浓度.所有复性蛋白活性的检测均采用ELISA方法.结果 以包涵体形式表达6B11ScFv/mHSP70蛋白:①经6 mol/L 盐酸胍裂解包涵体的效率远高于8 mol/L 尿素,但前者复性所得蛋白活性低,6 mol/L 盐酸胍彻底裂解的包涵体经8 mol/L 尿素透析后再复性,复性效率显著提高;②序贯稀释方法可提高蛋白复性效率;加入0.5 mol/L L-精氨酸可降低稀释复性过程中蛋白聚集物的产生,提高复性效率;加入还原型谷胱甘肽(GSH)与氧化型谷胱甘肽(GSSH)浓度比为1:5时,可提高复性后蛋白活性;③柱上复性可一步完成蛋白的复性和纯化,所得蛋白纯度较高,但复性效率和复性后蛋白活性较稀释复性低.结论 本研究建立了6B11ScFv/mHSP70融合蛋白的佳复性条件:包涵体经6 mol/L 盐酸胍彻底裂解后,再经8 mol/L 尿素透析,然后进行序贯稀释复性,且复性液中加入0.5 mol/L L-精氨酸和GSH:GSSH=1:5以提高复性效率和蛋白活性,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础.
关键词： 卵巢肿瘤 重组融合蛋白质类 HSP70热休克蛋白质类 抗体 包涵体 -
TRAIL和EGFR配体寡肽与力达霉素辅基蛋白融合蛋白制备过程的优化
目的对以包涵体形式表达的 TRAIL 和 EGFR 配体寡肽与力达霉素辅基蛋白融合蛋白 Ec-LDP-TRAIL 的制备过程进行优化。
方法对大肠杆菌原核表达 Ec-LDP-TRAIL 目的蛋白的温度、诱导物浓度、起始菌体密度及时间等条件进行优化；在Ni2+亲和层析纯化蛋白过程中对样品预处理以及纯化缓冲液成分进行优化；对纯化后蛋白的分步透析复性过程进行一系列优化，并通过基于 ELISA 的结合活性实验分析Ec-LDP-TRAIL 与肿瘤细胞的结合能力。
结果经过工艺优化后，纯化后的融合蛋白 Ec-LDP-TRAIL纯度达95%以上，复性后 LB 培养基活性蛋白收率约为2.2 mg/L，与初始复性条件相比提高近2倍。复性后融合蛋白 Ec-LDP-TRAIL 显示出能够与人表皮癌 A431和人大细胞肺癌 H460细胞的结合活性。
结论融合蛋白 Ec-LDP-TRAIL 制备过程的优化为后续研发和生产奠定了实验基础，同时也为其他以包涵体形式表达的基于 TRAIL 的抗肿瘤蛋白药物的制备提供借鉴。关键词： 包涵体 重组融合蛋白质类 蛋白质复性 肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体 -
卵巢癌抗独特型单链抗体6B11ScFv与鼠HSP70融合蛋白的构建、表达及鉴定
目的 构建卵巢癌抗独特型单链抗体6B11ScFv与小鼠热休克蛋白70(mHSP70)融合蛋白6811ScFv/mHSP70,并初步鉴定其免疫活性.方法 根据Genebank上已发表的mHSP70基因序列(NM_010478)合成引物行PCR扩增,以扩增所得mHSP70基因插入pET30a(+)-6811ScFv质粒后转化入E.coli DH5a,获得pET30a(+)-6B11ScFv/mHSP70重组质粒.将鉴定正确的pET30a(+)-6811ScFv/mHSP70重组质粒转化入E.coli BL21(DE3),获得E.coli BL21(DE3)[pET30a(+).6811ScFv/mHSP70]重组菌株.以异内基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达并行SDS-PAGE分析,对表达产物进行复性和Ni2+-NTA柱亲和层析纯化后,采用蛋白质印迹法和ELISA方法 进行鉴定和免疫活性检测.结果 6811ScFv/mHSP70融合基因测序结果基本与理论序列相符.SDS-PAGE分析显示,重组菌株表达产物相对分子质量与预期相符.复性、亲和层析纯化后的蛋白复性率达20.9%,蛋白纯度达95%以上.蛋白质印迹分析证实6B11ScFv/mHSP70融合蛋白相对分子质量为104 000,ELISA检测表明其具有6811ScFv和mHSP70的免疫活性.结论 构建表达的6811ScFv/mHSP70融合蛋白具有良好的免疫活性,为进一步研究其体内外抗卵巢癌活性奠定了基础.
关键词： 抗体 抗独特型 HSP70热休克蛋白质类 重组融合蛋白质类 卵巢肿瘤 -
可溶性HLA-G1与NK-92细胞表面ILT2及KIR2DL4受体相互作用的研究
目的 探讨可溶性 HLA-G1(sHLA-G1)对人 NK-92细胞杀伤活性的抑制与细胞表面免疫球蛋白样转录分子2(ILT2)和杀伤细胞免疫球蛋白样受体2DL4(KIR2DL4)受体的关系.方法 ①通过原核表达技术获得 sHLA-G1重组蛋白(重组蛋白),并采用蛋白质印迹法进行鉴定.②取NK-92细胞,加入终浓度20μg/ml的重组蛋白分别培养10、30 min,再分别加入抗HLA-G1/G5、抗ILT2和抗KIR2DL4抗体,采用流式细胞术检测各组 NK-92细胞表面sHLA-G1和ILT2、KIR2DL4受体表达阳性率;以NK-92细胞单独培养作为对照组.③以人白血病K562细胞为靶细胞,以经不同方式处理的NK-92细胞为效应细胞,效靶比为5∶1,共同培养2h,采用流式细胞术检测NK-92细胞对K562细胞的杀伤率.NK-92细胞处理方式为单纯重组蛋白处理(分别加入终浓度为0、10、20 μg/ml的重组蛋白培养30 min)和表面受体封闭+重组蛋白处理(分别加入抗ILT2、抗KIR2DL4、抗LT2+抗KIR2DL4抗体培养30min,再分别加入终浓度为0、10、20μg/ml的重组蛋白培养30 min).结果 ①蛋白质印迹分析表明所获重组蛋白为带有组氨酸标签的特异蛋白.②NK-92细胞与20μg/ml重组蛋白共培养30 min后,sHLA-G1表达阳性率明显高于而ILT2、KIR2DL4受体表达阳性率均明显低于对照组(均P＜0.05).③以终浓度0、10、20μg/ml的重组蛋白处理的NK-92细胞对K562细胞的杀伤率分别为39.79%±2.00%、27.79%±0.75%、21.36%±0.67%(两两比较,均P＜0.01);单独封闭ILT2受体,杀伤率分别为23.09%±1.63%、21.13%±0.38%、18.42%±0.47%(两两比较,均P＜0.01);单独封闭KIR2DL4受体,杀伤率分别为30.74%±0.44%、26.03%±0.38%、21.15%±0.35%(两两比较,均P＜0.01).结论 sHLA-G1通过与NK-92细胞表面ILT2和KIR2DL4受体直接结合而抑制 NK-92细胞的杀伤活性.
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甘氨酸和Triton X-100对ZZ-EGFP融合蛋白分泌表达影响的初步研究
目的 考察不同浓度的甘氨酸和Triton X-100对葡萄球菌蛋白质A ZZ亲和肽-增强型绿色荧光蛋白(ZZ-EGFP)融合蛋白在大肠杆菌分泌表达的影响.方法 研究设计为两因素三水平析因设计.向液体培养基中分别加入终浓度0、1%、2%的甘氨酸和0、1%、2%的Triton X-100(共9种组合方式,终浓度均为0者为对照组),诱导大肠杆菌周质腔内ZZ-EGFP融合蛋白泄漏到液体培养基中,以培养上清液荧光强度为观察指标,通过ZZ-EGFP融合蛋白浓度-荧光强度标准曲线快速检测培养基中ZZ-EGFP融合蛋白表达量.结果 培养基中分别加入1%、2%甘氨酸或1%、2%TritonX-100培养后,培养上清液荧光强度分别为 283±11、711±19和622±25、733±25,与对照组(74±5)比较,组间差异均有统计学意义(甘氨酸:F=10.881,P=0.024;Triton X-10:F=12.848,P=0.018);而且甘氨酸与TritonX-100两者之间有交互效应(F=5.441,P=0.005),其中培养基中同时含有终浓度2%甘氨酸及1%Triton X-100时培养上清液荧光强度高(1854±45),ZZ-EGFP融合蛋白分泌表达量达到10.4 mg/L,与对照组(0.94 mg/L)相比提高了11倍.结论 甘氨酸和Triton X-100能提高ZZ-EGFP融合蛋白在液体培养基中的分泌表达量.
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双靶向配体化力达霉素DTLL的制备优化和稳定性研究
目的 通过对具有高效抗肿瘤活性的类抗体偶联药物——双靶向配体化力达霉素(DTLL)制备过程的优化,获得纯度高和活性强的DTLL产品;探讨影响DTLL稳定性的主要因素,为临床申报和工业化生产提供依据.方法 分别对DTLL前体(DTLP)蛋白表达载体、宿主菌株、表达温度、诱导剂终浓度、菌体密度和诱导时间进行优化.以高压破碎法提取可溶性目的蛋白,采用Ni+亲和与分子筛层析两步纯化,得到高纯度DTLP,再与力达霉素发色团组装获得DTLL.采用HPLC、MTS、ELISA法进行稳定性试验,分别监测DTLL冻干样品的蛋白纯度、发色团含量、细胞毒和亲和力活性的变化.结果 经过发酵提取工艺优化,每升发酵液所得DTLP蛋白约为22 mg,是优化前每升9 mg的2.4倍,其蛋白纯度达到99.7％;DTLL组装效率达到68％;稳定性试验结果显示,DTLL冻干样品对光照敏感,在-80℃低温避光环境下可稳定保存.结论 成功优化了双靶向配体化力达霉素DTLL的制备工艺,提升了产品纯度和产率,为其后续生产和临床申报提供了实验基础,也为其他抗体偶联药物的制备提供了较成熟完善的技术平台.
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单链抗体与力达霉素融合蛋白在链霉菌中的表达
目的 构建可表达力达霉素(LDM)辅基蛋白基因与抗Ⅳ型胶原酶单链抗体(scFv)融合蛋白的重组菌株,获得既具有靶向性、又具有抗肿瘤活性的scFV-LDM.方法 以大肠埃希菌-链霉菌穿梭质粒pBS03 为基础构建同源双交换质粒pBS-scFv,利用接合转移将该质粒转入球孢链霉菌(S. Globisporus)C-1027,根据抗性差异筛选获得重组菌株.用PCR、DNA 印迹法对重组菌株进行验证.用SDS-PAGE 检测重组菌株中目的融合蛋白的表达.用抑菌圈试验检测重组菌株发酵液的抑菌活性.结果 经同源重组得到重组菌株S. Globisporus C-1027-scFv.PCR 显示重组菌株扩增产物与预期一致,DNA 印迹分析显示重组菌株得到与预期吻合的杂交片段,表明scFv-LDM 融合蛋白基因已经成功取代LDM 辅基蛋白基因.SDS-PAGE 结果显示重组菌株不再产生辅基蛋白.抑菌圈试验显示重组菌株发酵液在第5 天能够检测到抑菌活性.初步结果表明,重组菌株可产生scFv-LDM 融合蛋白.结论 成功构建了可产生scFv-LDM 融合蛋白且具有分泌活性的重组菌株.这对改造和研发新型单抗导向药物有实际意义.
