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结核分枝杆菌抗原对人单核细胞核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白12表达的影响
目的 研究结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)抗原对人单核细胞中核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白12(NLRP12)表达的影响,为深入研究NLRP12在结核病中的作用奠定实验基础.方法 采集15例活动性肺结核患者和15名健康人的抗凝血,分离外周血中单核细胞,用Mtb抗原H37Rv全菌裂解液、早期分泌靶抗原6 (EAST-6)和培养分泌蛋白10(CFP-10)的抗原多肽刺激,提取单核细胞的总RNA,采用荧光定量PCR方法检测NLRP12 mRNA的表达,采用配对t检验分析刺激前后单核细胞NLRP12的表达差异.以P＜0.05为差异有统计学意义.结果 全菌裂解液、EAST-6和CFP-10抗原多肽刺激后的活动性肺结核患者单核细胞与未刺激前的单核细胞相比,其NLRP12 mRNA的表达显著下调,由未刺激前的(1.8±1.26)×10-2分别下降到(1.09±0.78)×10-2(t=3.826,P＜0.01)和(1.14±0.87)×10-2(t=3.695,P＜0.01).全菌裂解液、EAST-6和CFP-10抗原多肽刺激后,健康人单核细胞中NLRP12 mRNA的表达与未刺激前相比也降低,由未刺激前的(1.65±0.99)×10-2分别降至(1.2±0.87)×10-2(t=1.909,P＞0.05)和(1.38±1.02)×10-2(t=1.151,P＞0.05),差异无统计学意义.结论 Mtb抗原体外刺激能够抑制活动性肺结核患者单核细胞NLRP12的表达.
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TaqMan－MGB 实时荧光定量 PCR 检测 RIG－G基因方法的建立及其方法学验证
目的：建立一种以TaqMan－MGB荧光探针为特点，检测人类急性早幼粒细胞白血病（ M3型）中维甲酸诱导基因G（ RIG－G）的实时荧光定量聚合酶链反应（ RT－qPCR）方法，并运用该方法对正常人、M3患者外周血中的RIG－G表达水平进行分析，探讨其在M3诊断中的价值。方法方法学建立。针对人RIG－G基因设计特异性引物和TaqMan－MGB荧光探针，以逆转录的互补DNA为模板，建立TaqMan－MGB实时荧光定量PCR检测方法和标准曲线；在方法特异性、正确度、精密度、分析灵敏度、干扰物质等各方面对检测方法的性能进行评估，并用该法验证20例M3患者外周血与骨髓中RIG－G表达水平相关性，同时检测40份正常人及20份M3患者标本，t检验比较两组外周血RIG－G水平，用ROC曲线分析其对M3的检测效能。结果 RIG－G标准品拷贝数log值与循环阈值数（ Ct ）的标准曲线方程为：Y＝－3．539X＋42．952，R2＝0．999，呈良好的线性关系。用建立的实时荧光定量PCR方法检测标准品，结果与已知值比较，相关性系数r＝0．999，计算偏倚值均＜5％；分别选取高值（107拷贝／μl）、中值（104拷贝／μl）、低值（101拷贝／μl）3个浓度，批内CV分别为1．38％、2．31％、7．56％；批间CV分别为0．71％、1．17％、5．07％，均＜10％；该方法的分析灵敏度为101拷贝／μl。 M3患者外周血与骨髓中RIG－G表达水平相关系数为r＝0．996，斜率b＝0．973，结果相关性良好，t＝0．099，P＞0．05，显示两组标本检测结果差异无统计学意义。40份正常健康体检外周血RIG－G基因的拷贝数[3．62×104（1．61×104～4．90×104）拷贝／μl]与M3患者[7．10×102（5．43×102～2．21×103）拷贝／μl]差异有统计学意义（U＝18，P＜0．001）。结论成功建立了检测人外周血RIG－G基因的TaqMan－MGB荧光实时定量PCR方法。该法具有较好的正确度、精密度、灵敏度及特异性，能够为临床M3患者的早期诊断及治疗监测提供必要帮助。（中华检验医学杂志，2016，39：936－940）
关键词： 实时聚合酶链反应 细胞内信号肽和蛋白质类 白血病 早幼粒细胞 急性 -
缺血性脑卒中患者血清GFAP、NDKA和PARK7的临床应用价值
目的 探讨血清GFAP、NDKA和PARK7与IS的相关性，及其对IS诊断、预后评估的临床价值。方法用ELISA法检测37例IS患者、28例ICH患者和30名健康人血清GFAP、NDKA和PARK7含量水平，所有患者在发病12 h内、第3、14天除进行上述3项指标检测外，还在相应时间点用MESSS进行神经功能缺损评分，在14 d出院时用Barthel指数(BI)评价其日常生活能力。同时分析3项指标单项检测和联合检测对IS的诊断效能。结果IS组发病12 h内、第3、14天血清GFAP含量分别为(5.49±2.25)、(5.17±2.29)、(5.96±2.39) μg/L，血清NDKA含量分别为9.15(6.28～12.79)、9.13（6.31～12.23）、9.31(6.40～11.83) μg/L，血清PARK7含量分别为(32.71±6.34)、(31.23±6.04)、（32.79±6.94）μg/L；健康对照组血清GFAP、NDKA、PARK7含量分别为(4.62±1.56)、4.24(3.30～5.61)、(14.25±2.65) μg/L。IS组与健康对照组比较，除第3天的GFAP差异无统计学意义(t =1.129,P＞0.05),IS组其余各时间点的3项指标水平分别高于健康对照组（GFAP的t值分别为2.642、1.870，P均＜0.05；NDKA的Z值分别为6.173、6.100、6.278，P均＜0.01；PARK7的t值分别为14.964、15.367、16.060,P均＜0.01）。检测GFAP对IS诊断的特异度和敏感度分别为46.7％ (14/30)和81.1％ (30/37)，NDKA对IS诊断的特异度和敏感度分别为90.0％ (27/30)和78.4％ (29/37)，PARK7对IS诊断的特异度和敏感度分别为96.7％ (29/30)和97.3％ (36/37)；3项标志物联合检测对IS诊断的特异度和敏感度分别为96.7％ (29/30)和100％( 37/37)。此外，IS组GFAP升高的发病风险是健康对照组的1.3倍（OR=1.300，P=0.044）,NDKA升高是1.7倍（0R=1.668,P=0.036）,PARK7则是1.8倍（OR=1.809,P=0.005）。IS患者发病＜12h时GFAP血清含量在IS组和ICH组的差异有统计学意义（t=4.097,P=0.000）；发病不同时间的GFAP、NDKA和PARK7血清含量与MESSS存在不同程度正相关，即IS发病＜12 h时,3者r值分别为0.534、0.482、0.357，P均＜0.05；3d时，3者r值分别为0.433、0.487、0.299，P值分别为0.007、0.002、0.073；14 d时,3者r值分别为0.394、0.200、0.084,P值分别为0.016、0.236、0.620。14 d出院时GFAP、NDKA和PARK7血清含量与BI呈负相关（r值分别为-0.430、-0.321、-0.076，P值分别为0.044、0.050、0.657）。结论血清GFAP、NDKA和PARK7含量与IS密切相关，血清3项指标志升高是IS发病的危险因子，检测3项指标有助于IS的早期诊断，且对患者及时治疗和预后评估有重要意义。
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腺病毒介导的小鼠可溶性endoglin和可溶性血管内皮生长因子受体-1重组蛋白的构建和功能初步鉴定
目的 构建腺病毒介导的小鼠可溶性endoglin(sEng)和可溶性血管内皮生长因子受体-1(sFlt-1)重组蛋白,观察其对内皮细胞管化及滋养细胞迁移的影响.方法 提取小鼠胎盘组织总RNA,通过RT-PCR获得sEng和sFlt-1 cDNA,插入到穿梭载体pAdTrack-CMV中,获得pATC-sEng和pATC-sFlt-1质粒,转化其至pAdeasy-1受体菌,选阳性克隆转染293A细胞,获得Ad/sEng和Ad/sFlt-1,制备高滴度病毒液.用病毒感染COS7细胞,检测sEng和sFlt-1蛋白表达,并通过成管和划痕实验观察两种蛋白对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)管化和BeWo细胞迁移的影响.结果 成功获得sEng和sFlt-1重组腺病毒,其滴度分别为2.2×1011pfu/ml和2.0×1011pfu/ml.感染COS7细胞后,sEng和sFlt-1蛋白均较高表达,并能抑制HUVEC管化及BeWo细胞迁移,两者有协同作用.结论 构建的腺病毒介导的小鼠sEng和sFlt-1重组蛋白对血管生成和滋养细胞迁移有明显抑制作用.
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过氧化物酶体增殖物激活受体γ2及其靶基因在胎儿生长受限子鼠内脏脂肪中的表达
目的 研究胎儿生长受限(fetal growth restriction,FGR)子鼠内脏脂肪组织中转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ2(peroxisome proliferator activated receptor gamma 2,PPARγ2)及其靶基因——脂肪分化相关蛋白(adipose differentiation-related protein,ADFP)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1(phosphoenolpyruvate carboxykinase 1,PCK1)的表达变化,探讨其在成年肥胖和代谢综合征发生中的作用机制. 方法 采用孕期低蛋白饮食法建立大鼠FGR模型.以雄性子鼠为研究对象,采用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,PCR)和蛋白印迹实验检测3周龄和8周龄子鼠肾周脂肪组织中的PPARγ2基因及其靶基因ADFP、PCK1的mRNA和蛋白表达,与同龄正常对照组子鼠进行比较.数据采用独立样本t检验及Spearman直线相关分析. 结果 3周龄和8周龄FGR组子鼠肾周脂肪组织中PPARγ2 mRNA的转录水平明显高于同龄对照组子鼠(3周龄:2.43±0.38与1.03±0.11,t=2.74,P＜0.05；8周龄:2.17±0.34与1.07±0.14,t=2.49,P＜0.05),蛋白含量也明显增高(3周龄:1.07±0.17与0.41±0.06,t=3.01,P＜0.05;8周龄:1.29±0.20与0.68±0.09,t=2.62,P＜0.05),分别是对照组的(261±31)％和(190±24)％.3周龄和8周龄FGR组子鼠肾周脂肪组织中PPARγ2调控的靶基因ADFP mRNA(3周龄:1.87±0.29与1.02±0.12,t=2.20；8周龄:1.64±0.31与1.06±0.14,t=3.47)和PCK1mRNA含量(3周龄:2.03±0.26与0.98±0.08,t=2.97；8周龄:1.79±0.28与1.03±0.11,t=3.24)和蛋白表达水平(ADFP蛋白表达3周龄:0.43±0.06与0.14±0.03,t=3.01；8周龄:0.71±0.09与0.38±0.05,t=3.06；PCK1蛋白表达3周龄:0.82±0.10与0.39±0.05,t=2.65；8周龄:0.85±0.11与0.67±0.07,t=2.86)也均高于对照组(P均＜0.05),且2个靶基因的表达水平与PPARγ2表达均成正相关(mRNA表达水平:r=0.907和0.826,P均＜0.01；蛋白表达水平:r=0.763和0.805,P均＜0.05).结论 宫内发育的“程序化”影响使FGR子代内脏脂肪组织中PPARγ2表达增加,进而引起靶基因ADFP和PCK1的表达增加,引起脂肪细胞积聚,这可能是成年肥胖和代谢综合征发生的机制之一.
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新生儿Sotos综合征二例报道及文献复习
目的 探讨Sotos综合征新生儿临床表型和基因型的关系. 方法 2009年10月16日和2011年1月13日,2例新生儿分别收住复旦大学附属儿科医院,临床表现疑似Sotos综合征.分别应用基因芯片和多重连接依赖探针扩增技术进行基因检测,诊断为Sotos综合征.复习相关文献,分析基因型与临床表型的关系. 结果 (1)例l患儿出生时即表现为过度生长,出生体重及头围均大于同胎龄新生儿的第97百分位数;存在尖下颌、动脉导管未闭、阴茎短小、肾盂增宽、头颅MRI异常及低血糖.例2患儿出生时过度生长不明显,随访至45月龄时身高大于同龄儿童平均值的3个标准差;存在左肾积水、脑损伤、喂养困难和黄疸等.(2)基因检测结果显示,例1患儿5q35.2-5q35.3区域缺失1.97 Mb(175 496 385～177 466 774 bp),例2患儿5号染色体长臂NSD1基因区域缺失.2例患儿均确诊为NSD1基因缺失型的Sotos综合征. 结论 Sotos综合征表型与基因型具有相关性,基因检测有助于临床诊断.
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低氧预处理激活神经元细胞JAK/STAT并促进血管内皮生长因子受体-2的表达
目的 研究低氧预处理对神经元细胞Janus激酶(JAK)/信号转导和转录激活因子(STAT)信号通路以及血管内皮生长因子受体-2 (VEGFR-2)表达的影响.方法 将培养的小鼠神经元细胞分为细胞对照组、细胞类缺血组和细胞低氧预处理组,细胞类缺血组细胞经95％ NO2+5％ CO2混合气体处理30 min,细胞低氧预处理组细胞于89％N2、1％O2和10％CO2环境中处理8次,每次20 min,2d后进行类缺血处理.定量分析各组细胞中VEGFR-2、JAK及STAT蛋白磷酸化(p-STAT)的表达变化.细胞转染JAK特异性小干扰RNA(siRNA),之后进行低氧预处理和类缺血处理,检测p-STAT和VEGFR-2的表达.另取45只BALB/c小鼠分为动物对照组(n=8)、动物对照+血管内皮生长因子(VEGF)组(n=7)、动物脑缺血组(n=8)、动物脑缺血+VEGF组(n=7)、动物低氧预处理组(n=8)和动物低氧预处理+VEGF组(n=7),分析各组海马神经元细胞p-STAT和VEGFR-2的表达,并检测细胞中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase 3)的活化情况.结果 与细胞对照组相比较,细胞类缺血组细胞中VEGFR-2 mRNA表达显著下调(P＜0.05);与细胞类缺血组相比,细胞低氧预处理组细胞VEGFR-2 mRNA表达上调(P＜0.05),并促进JAK mRNA和蛋白的表达(P＜0.05)以及STAT蛋白的活化(P＜0.05).与非特异性转染组相比,JAK沉默组细胞p-STAT和VEGFR-2的表达显著降低(均P＜0.05).在小鼠体内,脑缺血降低p-STAT和VEGFR-2的表达(P＜0.05),而低氧预处理则可有效逆转缺氧对p-STAT和VEGFR-2的抑制(P＜0.05).与动物脑缺血+VEGF组相比,动物低氧预处理+VEGF干预可显著抑制caspase3的活化(P＜0.05).结论 低氧预处理可以激活神经元细胞JAK/STAT信号通路并诱导VEGFR-2的表达,并增强VEGF的神经保护作用.
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中国汉族人群早发性帕金森综合征DJ-1基因突变分析
目的 探讨中国汉族人群早发性帕金森综合征(early-onset parkinsonism,EOP)DJ-1基因突变情况.方法 应用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)结合DNA直接测序技术对160例EOP患者进行了DJ-1基因突变分析.结果 对DJ-1基因外显子重排突变分析发现,4例新的DJ-1基因外显子2的杂合缺失突变,突变频率2.5%(4/160);DNA直接测序方法未发现DJ-1基因的致病突变,发现了4种已报道的单核苷酸多态(SNP)和1种新的SNP,分别为:IVS4+30 T→G、IVS4+45 G→A、IVS4+46 G→A、IVS5+31 G→A和IVS6+52 C→T.结论 DJ-1基因外显子2的杂合缺失突变扩展了DJ-1基因的突变谱,可能是中国汉族人群EOP DJ-1基因突变的重要形式.
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快速眼球运动睡眠剥夺及γ-氨基丁酸能药物干预对大鼠认知功能的影响
目的 建立快速眼球运动(REM)睡眠剥夺和下丘脑穹隆周围核微量渗析大鼠模型,研究不同程度REM睡眠剥夺和恢复对SD大鼠认知功能、下丘脑泌素(Hcrt)能系统和γ-氨基丁酸(GABA)能系统的影响及其可能机制.方法 将雄性SD大鼠随机分为对照组和REM睡眠剥夺组,REM睡眠剥夺组又分非手术对照组(nonOP)、假手术对照组(Sham)、GABAA受体拈抗剂SR-95531组(SR)和GABA再摄取抑制剂NO-711组(NO).采用改良多平台水环境法(MMPM)建立REM睡眠剥夺SD大鼠模型,利用Morris水迷宫测定大鼠在不同程度REM睡眠剥夺对认知功能的影响变化,采用免疫荧光技术检测下丘脑Hcrt神经元数量形态和原癌基因(Fos)表达、下丘脑GABA的A型受体α1(GABAA Rα1)亚单位表达累积吸光度值;采用高效液相色谱仪(HPLC)测定下丘脑GABA和谷氨酸(Glu)含量.建立穹隆周围核微量渗析SD大鼠模型,观察GABAA受体拈抗剂SR-95531和GABA再摄取抑制剂NO-711对上述指标的影响.结果 REM睡眠剥夺导致nonOP组和Sham组SD大鼠认知功能下降、下丘脑外侧区Fos阳性细胞总数和Fos-Hcrt双阳性细胞(F+&H+)数量增加、下丘脑GABA含量和GABAA Rα1表达增加,且变化程度均与REM睡眠剥夺时间长短呈正相关.但上述指标的变化都能够在不同程度睡眠恢复后得以修正.NO组与对照组比较,睡眠剥夺期间认知功能下降、下丘脑外侧区Fos阳性细胞总数和F+&H+数量增加(F=9.56、12.14、10.12,P＜0.05),且增加程度均与REM睡眠剥夺时间长短呈正相关;但睡眠恢复后差异无统计学意义.SR组与对照组比较,睡眠剥夺期间差异无统计学意义,但睡眠恢复期间认知功能下降、下丘脑外侧区Fos阳性细胞总数和F+&H+数量增加(F=12.03、11.38、8.36,均P＜0.05).SR组GABA含量和GABAA Rα1表达在全部5个时间点均明显增加(F=11.36、14.67,均P＜0.05),而NO组仅在SD 5d的GABAA Rα1表达明显增加(F=12.06,P＜0.05).结论 在REM睡眠剥夺和恢复过程中,GABA能系统存在自身调节机制,但无论是其再摄取抑制剂NO-711还是受体竞争剂SR-95531,均对认知功能下降产生不利影响,因此GABA能系统并不是治疗失眠的理想靶点.Hcrt能神经元系统和GABA能系统之间存在相互抑制的作用,可以通过降低Hcrt神经元激活来改善睡眠的效果.并据此推断,Hcrt能系统可能是诱导睡眠和治疗失眠的潜在理想靶点.
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早发型帕金森病患者DJ-1基因突变及启动子区g.168_185del多态与帕金森病的关系
目的 探讨在早发型帕金森病患者(early-onset Parkinson's disease,EOPD)中DJ-1基因的突变情况,并分析1号内含子上g.168_185del多态类型是否与帕金森病的发生有关.方法 应用聚合酶链反应(PCR)结合直接测序法对90例EOPD患者进行DJ-1基因7个外显子突变分析.针对1号内含子的g.168_185del多态性,比较EOPD患者与健康人的基因型频率及等位基因频率是否存在差异.结果 (1)在90例EOPD患者中没有筛查出DJ-1基因的致病性突变,但发现位于1号外显子上g.5027G＞A(rs17523802)、g.5065T＞C(rs226249)、g.5094C ＞T (rs11121064)及位于1号内含子的g.168 185del 4种多态类型.(2)针对g.168_185del分析,EOPD组与健康对照组插入/缺失频率分别为11.1％ (10/90)和13.3％(14/105),插入/插入频率分别为88.9％(80/90)和86.7％(91/105),比较基因型频率x2值为0.222,P值为0.669；EOPD组与对照组插入型频率分别为94.4％(170/180)和93.3％ (196/210),缺失型频率分别为5.6％ (10/180)和6.7％ (14/210),比较等位基因频率x2值为0.207,P值为0.679；家族性EOPD组与对照组间基因型频率及等位基因频率,散发性EOPD组与对照组间基因型频率及等位基因频率差异均无统计学意义.结论 本组EOPD患者中DJ-1基因的突变率较低,不是常见致病因素；g.168_185del多态位点与EOPD患者可能无直接致病关系.
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Jab1基因沉默对裸鼠人喉癌移植瘤生长影响的研究
目的 探讨Jab1重组质粒对人喉鳞状细胞癌(简称鳞癌)Hep-2细胞裸鼠移植瘤生长的影响.方法 利用喉鳞癌Hep-2细胞裸鼠皮下移植瘤模型,通过向瘤体内注射pJab1、阴性对照质粒和生理盐水,观察瘤体增长情况,通过免疫组化方法、反转录聚合酶链反应( RT-PCR)观察瘤体内Jab1、p27的mRNA及蛋白表达水平的变化.结果 pJab1质粒组的肿瘤体积为(267.60±88.19)mm3((x)±s,以下同),与阴性对照组的(832.20±140.39) mm3及生理盐水组的( 895.40±145.93) mm3相比,差异有统计学意义(F=36.73,P＜0.001)；免疫组化结果显示pJab1质粒组瘤内的Jab1蛋白的表达率降低为32.40％±5.59％,p27蛋白的表达率增高到76.80％±6.30％(P＜0.001),与阴性对照组及生理盐水组比较,差异有统计学意义；RT-PCR结果显示实验组瘤内Jab1的mRNA相对表达水平降低至0.65±0.03(F=558.00,P＜0.001),p27的mRNA无明显变化,为0.80±0.02(F=1.52,P＞0.05).结论 pJab1干扰质粒可明显降低裸鼠肿瘤组织内Jab1基因的表达并抑制瘤体的生长；pJab1质粒能有效抑制Jab1基因的表达,有望成为临床治疗喉癌的新途径.
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新生大鼠耳蜗血管纹缘细胞释放ATP的机制
目的 证实体外培养的新生大鼠耳蜗血管纹缘细胞能够释放ATP,并进一步探讨缘细胞释放ATP的机制.方法 分离、培养新生大鼠耳蜗血管纹缘细胞,采用生物发光法分别检测巴佛洛霉素A1、己二酸二癸酯( didecyl adipate,DDA)、细胞外K+、毒胡萝卜素、细胞外Ca2、U73122及马兜铃酸钠对细胞外液中缘细胞ATP释放的影响.结果 随着巴佛洛霉素A1浓度的增加,细胞外液中ATP的浓度明显下降；当DDA浓度增加时,细胞外液中ATP的浓度几乎呈线性增加.随着细胞外液中的K+浓度的增高,缘细胞释放的ATP浓度呈现上升趋势,当细胞外液中的K+浓度为9.15 mmol/L时,ATP的释放量达到峰值,之后随着K+浓度的继续升高ATP的释放量呈下降趋势.随着毒胡萝卜素浓度的增加,缘细胞释放的ATP浓度呈现明显下降的趋势.当细胞外Ca2+浓度为0 mmol/L时,缘细胞仍然释放ATP;Ca2+浓度增加与ATP的释放呈负相关,但当细胞外的Ca2+浓度达到1.25 mmol/L以上时,ATP的释放量维持在一个较稳定的水平.U73122的浓度在0.25～1.25 μmol/L时,其与缘细胞释放的ATP浓度呈负相关.当马兜铃酸钠的浓度为12.5 ～ 100.0 μmol/L,缘细胞ATP释放呈明显下降的趋势；当其浓度＞100.0 μmol/L时,ATP释放浓度趋于平稳.结论 体外培养的新生大鼠耳蜗血管纹缘细胞能够释放ATP,其释放量与钙泵、K+通道状态以及细胞内信号传导通路相关酶的活性有关.
关键词： 腺苷三磷酸 血管纹 离子通道 细胞内信号肽和蛋白质类 -
DJ-1蛋白在喉鳞状细胞癌中的表达及其与复发和转移的关系
目的 探讨喉鳞状细胞癌(简称鳞癌)中DJ-1蛋白表达水平与喉鳞癌临床病理特征的关系.方法 将1995年1月至2006年1月收治的71例喉鳞癌患者术后肿瘤组织和9例非喉癌者喉黏膜组织应用免疫组织化学法检测,分析其DJ-1蛋白表达水平与临床病理特征的关系.结果 喉鳞癌组织中DJ-1蛋白阳性表达率为85.9%(61/71),与非喉痛的喉黏膜组织55.5%(5/9)比较,差异有统计学意义(精确概率法P<0.05).分别就患者的性别、年龄、原发部位、T分期、临床分期、淋巴转移和肿瘤的病理学分级等情况进行分组比较,各组间喉鳞癌组织中DJ-1蛋白表达水平的差异均无统计学意义;DJ-1蛋白高表达患者其肿瘤复发率(53.3%)明显高于DJ-1蛋白低表达患者的复发率(26.8%;x2=5.164,P<0.05).Kaplan-Meier法和Cox回归分析发现喉鳞癌患者的肿瘤原发部位、性别、年龄、T分期、临床分期和肿瘤病理学分级对术后累积生存率影响均无统计学意义;DJ-1蛋白表达水平和淋巴转移对术后累积生存率影响有统计学意义(X2值分别为6.20和3.97,P值均<0.05).结论 DJ-1蛋白在喉鳞癌组织的表达水平高于喉黏膜组织.DJ-1蛋白表达水平较高的喉癌患者生存率可能低.
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圆锥角膜基质细胞端粒长度与衰老相关标记物的变化
目的 探讨圆锥角膜基质细胞内端粒长度的变化和圆锥角膜基质内衰老相关β-半乳糖苷酶与衰老标记蛋白30(SMP-30)的表达,以及其在圆锥角膜发牛发展中的临床意义.方法 实验研究.收集2006年1月至12月间于山东省眼科研究所青岛眼科医院接受角膜移植治疗的圆锥角膜患者(32例)的病变角膜37份、来源于眼库的正常角膜20份.所收集圆锥角膜患者年龄范围13～34岁,平均(19±5)岁;正常角膜供体年龄范围9～25岁,平均(19±4)岁.采用Southern印迹杂交检测圆锥角膜和正常角膜基质细胞的端粒长度.以5-溴4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷原位染色法染色圆锥角膜和正常角膜基质中的衰老相关β-半乳糖苷酶,应用逆转录PCR分别检测圆锥角膜和正常角膜基质中的SMP-30.同时对圆锥角膜和正常角膜基质进行组织病理学观察.应用t检验进行统计处理.结果 圆锥角膜基质细胞的端粒长度为10.29～14.12 kb,平均端粒长度为(11.54±1.41)kb;正常角膜基质细胞的端粒长度为12.64～15.32 kb,平均端粒长度为(13.45±0.99)kb;统计学分析显示两者比较差异有统计学意义(t=4.753,P＜0.05).组织化学染色显示圆锥角膜基质内X-Gal染色町见散在分布蓝色阳性着色,表明存在衰老相关β-半乳糖苷酶的表达;而正常角膜基质中X-Gal染色阴性,未见衰老相关-β-半乳糖苷酶表达.RT-PCR检测结果 显示圆锥角膜与正常角膜中均无SMP-30蛋白的表达.组织学病理学观察显示正常角膜基质纤维排列规则紧密,角膜细胞规则地分布在基质中.而圆锥角膜基质胶原纤维排列呈现疏松不规则,细胞分布较前者散乱且数量减少.结论 与正常角膜基质相比,圆锥角膜基质细胞的端粒长度有所缩短,基质中衰老相关β-半乳糖苷酶表达增加.圆锥角膜可能是一种与组织异常老化有关的疾病.
关键词： 圆锥角膜 端粒 钙结合蛋白质类 细胞内信号肽和蛋白质类 衰老 -
白细胞介素1受体拮抗剂对大鼠过敏性哮喘的治疗作用及相关机制研究
目的 研究白细胞介素1受体拮抗剂(IL-1ra)对大鼠过敏性哮喘的治疗作用及相关机制.方法 雌性SD大鼠分为正常对照组、哮喘模型组、哮喘模型低剂量IL-1ra(6 mg/kg)治疗组(低剂量治疗组)和高剂量IL-1ra(30 mg/ks)治疗组(高剂量治疗组).每组10只.采用卵白蛋白腹腔及皮下注射致敏加雾化吸入激发的方法建立大鼠过敏性哮喘模型.激发前尾静脉注射不同剂量的IL-1ra.通过检测各组大鼠肺功能、肺泡灌洗液(BALF)炎性细胞构成、肺组织病理切片、血清总IgE含量等指标评价治疗效果,利用半定量RT-PCR检测信号转导子和转录激活子6(STAT6)mRNA以及核因子κB(NF-κB)mRNA表达情况.结果 哮喘模型组大鼠呼吸速率[(206±11)次/min]、呼气流量[(77±8)μl/s]、BALF嗜酸粒细胞比例(24.8%±1.3%)、血清总IgE含量[(72.5±8.1)ng/ml]、STAT6表达(0.294±0.048)和NF-κB表达(0.686±0.052)均明显高于低剂量治疗组[分别为(183±9)移c/min,(64±5)μl/,s,18.5%±3.1%,(63.4±4.8)ng/ml,0.229±0.038,0.613±0.062,均P＜0.05]和高剂量治疗组[分别为(181±11)次/min,(57±4)μl/s,14.7%±2.1%,(41.4±7.8)ng/ml,0.194±0.076,0.352±0.267,均P＜0.05].高剂量治疗组治疗效应优于低剂量治疗组(P＜0.05).肺组织病理检查与以上结果相近.结论 IL-1ra对大鼠过敏性哮喘具有明显的治疗效果,这种作用可能是通过同时调控STAT6 mRNA和NF-κB mRNA的表达实现的.
关键词： 哮喘 受体 白细胞介素1 细胞内信号肽和蛋白质类 NF-κB -
浅低温对脑缺血再灌注小鼠海马磷酸化真核翻译起始因子2α表达的影响
目的 评价浅低温对脑缺血再灌注小鼠海马磷酸化真核翻译起始因子2α(p-eIf2α)表达的影响.方法 清洁级健康雄性C57BL6小鼠60只,8～12周龄,体重20～ 30 g,采用随机数字表法分为3组(n=20):假手术组(S组)、脑缺血再灌注组(I/R组)和浅低温组(H组).采用阻断双侧颈总动脉15 min后恢复灌注的方法制备小鼠脑缺血再灌注损伤模型.H组再灌注即刻小鼠全身喷洒酒精行体表降温,维持直肠温度32～ 34℃,持续3h.于再灌注24 h时进行神经功能缺陷评分.随后处死小鼠取海马,观察海马CA1区病理学结果,采用TUNEL法检测神经元凋亡情况,计算神经元凋亡率,采用Western blot法检测p-eIf2α的表达.结果 与S组比较,I/R组和H组再灌注24 h时神经功能缺陷评分和海马神经元凋亡率升高,p-eIf2α表达上调(P＜0.05);与I/R组比较,H组神经功能缺陷评分和海马神经元凋亡率降低,p-eIf2α表达下调(P＜0.05).结论 浅低温通过抑制脑缺血再灌注小鼠海马p-eIF2α表达,减轻内质网应激,抑制神经元凋亡.
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缺氧后处理对糖尿病性心肌细胞缺氧复氧时保护作用削弱的机制:与DJ-1表达的关系
目的 评价缺氧后处理对糖尿病性心肌细胞缺氧复氧时保护作用削弱的机制及其与D J-1表达的关系.方法 正常培养的H9c2细胞,采用随机数字表法分为6组(n=36):对照组(C组)、缺氧复氧组(H/R组)、缺氧后处理组(HPO组)、质粒转染DJ-1基因组(D组)、质粒转染DJ-1基因+缺氧复氧组(DH组)和质粒转染DJ-1基因+缺氧复氧+缺氧后处理组(DHH组).采用缺氧4h复氧2h的方法制备心肌细胞缺氧复氧损伤模型.C组、H/R组和HPO组采用高糖(30 mmol/L)培养基培养H9c2细胞48 h,H/R组和HPO组制备模型,HPO组复氧前行3个循环的复氧5 min,缺氧5min处理.D组、DH组和DHH组H9c2细胞质粒转染DJ-1基因(pEX-2-EGFP-DJ-1),随后处理对应以上3组.于复氧2h时,采用CCK-8试剂盒检测细胞存活率,ELISA法检测上清液LDH水平,电镜下观察自噬小体,Western blot法检测细胞DJ-1、p62表达及LC3Ⅱ/Ⅰ比值.结果 与C组比较,H/R组和HPO组细胞存活率、DJ-1表达水平降低,LDH活性升高(P＜0.01);H/R组与HPO组比较上述指标差异无统计意义(P＞0.05).与D组比较,DH组细胞存活率降低,LDH活性升高(P＜0.01);与DH组比较,DHH组细胞存活率、自噬小体数量、LC3Ⅱ/Ⅰ比值升高,LDH活性和p62表达水平降低(P＜0.01);H/R组与DH组比较上述指标差异无统计学意义(P＞0.05).结论 缺氧后处理对糖尿病性心肌细胞缺氧复氧时保护作用削弱的机制与高糖抑制D J-1表达,降低自噬有关.
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糖尿病大鼠心肌缺血再灌注时DJ-1蛋白表达的变化
目的 评价糖尿病大鼠心肌缺血再灌注时DJ-1蛋白表达的变化.方法 成年雄性SD大鼠50只,体重220～280 g,以腹腔注射1％链脲佐菌素-柠檬酸盐缓冲液60 mg/kg的方法制备1型糖尿病模型.取糖尿病模型制备成功的大鼠40只,采用随机数字表法,将其分为3组:糖尿病组(D组,n=10)、糖尿病假手术组(DS组,n=15)和糖尿病心肌缺血再灌注损伤组(DIR组,n=15).另取正常大鼠10只,单次腹腔注射檬酸盐缓冲液6 ml/kg,作为对照组(C组).DIR组采用结扎左冠状动脉前降支30 min,再灌注120 min的方法建立大鼠心肌缺血再灌注损伤模型.于再灌注120 min时,DS组和DIR组随机处死5只大鼠,取心肌组织,测定心肌梗死面积,计算心肌梗死体积百分比；各组处死10只大鼠,取心肌组织,光镜下观察病理学变化,采用比色法测定MDA含量,采用羟胺法测定SOD活力,采用TUNEL法检测细胞凋亡,计算细胞凋亡指数(AI),采用免疫组化SP法测定DJ-1和磷酸酶-张力蛋白酶基因(PTEN)的蛋白表达.DJ-I蛋白表达分别与MDA含量、SOD活性、AI和PTEN蛋白表达进行直线相关分析.结果 与DS组比较,DIR组心肌梗死体积百分比升高(P＜0.05).与C组比较,D组、DS组和DIR组MDA含量和AI升高,SOD活性降低,DJ-1蛋白表达下调,PTEN蛋白表达上调(P＜0.05)；与D组和DS组比较,DIR组MDA含量和AI升高,SOD活性降低,DJ-1蛋白表达下调,PTEN蛋白表达上调(P＜0.05)；D组和DS组上述各指标比较差异无统计学意义(P＞0.05).MDA含量、SOD活性、AI、PTEN蛋白表达均与DJ-1蛋白表达具有相关性,r依次为-0.734、0.593、-0.818、-0.812(P＜0.05).结论 DJ-1蛋白表达下调可能通过减弱抗氧化应激反应,上调PTEN蛋白表达参与了糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤.
关键词： 细胞内信号肽和蛋白质类 心肌再灌注损伤 糖尿病 -
抑制JAK/STAT信号通路对实验性急性胰腺炎大鼠肝损伤的保护作用
JAK/STAT细胞内信号通路广泛参与细胞的增殖、分化、凋亡以及炎症、肿瘤的发生等多种生理、病理生理过程.然而关于其在重症急性胰腺炎(SAP)急性肝损伤中作用的研究尚少.目的:观察抑制JAK/STAT通路对实验性急性胰腺炎(AP)大鼠肝损伤的保护作用.方法:56只Sprague-Dawley大鼠随机分为正常对照组、3组AP模型组和3组JAK特异性抑制剂AG490干预组.以4%牛磺胆酸钠胰胆管逆行注射诱导AP模型.分批处死各组大鼠,动态测定血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平,观察肝脏大体和组织学表现,以免疫组化染色和蛋白质印迹法检测肝组织中JAK2的定位和表达.结果:与正常对照组相比,AP模型组各时间点血清ALT、AST水平均显著升高:肝组织大体和组织学损伤随病情进展而逐渐加重;肝组织JAK2表达逐渐增强,于18 h时达高峰.经AG490预处理的大鼠,上述各项指标均较同时间点AP模型组显著改善.结论:JAK2参与了大鼠实验性AP肝损伤的病理过程,抑制肝组织JAK/STAT通路活化有助于SAP急性肝损伤的防治.
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吡格列酮和非诺贝特对高脂饮食大鼠胰岛细胞内信号分子的影响
目的 观察吡格列酮和非诺贝特对高脂饮食大鼠胰岛内PPAR-α、-γ和细胞内信号分子的影响.方法 40只雄性SD大鼠随机分为4组:空白对照组(NC)、单纯高脂饮食组(HF)、高脂+非诺贝特组(FF)、高脂+吡格列酮组(FP).HE染色测定胰岛面积;免疫组织化学方法检测胰岛中各种蛋白的表达.结果 HF组胰岛面积、胰岛素、PPAR-γ、PPAR-α、NF-кB、p38丝裂原活化的蛋白激酶(MAPK)、ERKl蛋白水平与对照组相比,差别有统计学意义(P<0.05);吡格列酮明显增加PPAR-γ蛋白水平,降低NF-кB、p38 MAPK、ERKl的表达水平;非诺贝特能使PPAR-α.表达水平明显升高,也能够降低NF-кB、p38MAPK的水平.结论 非诺贝特和吡格列酮在一定程度上可以纠正胰岛功能的异常和细胞内信号转导的紊乱,保护胰岛细胞.
