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结核分枝杆菌glcB基因原核表达质粒的构建、表达和纯化
目的 构建结核分枝杆菌glcB基因原核表达工程株,并进行表达、纯化.方法 用PCR扩增结核分枝杆菌glcB基因,并克隆入pTA2质粒.测序正确后,再亚克隆入pET30a(+)质粒,构建pET30a(+):glcB重组体,转化宿主菌大肠埃希菌BL21(DE3).结果 结核分枝杆菌glcB基因工程株经0.4 mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后,表达出相对分子质量为92 kD重组蛋白.SDS-PAGE分析显示,IPTG诱导4 h重组蛋白的表达量高.表达蛋白以包涵体形式存在于胞质中,表达量占全菌蛋白质的50%.经Ni-NTA柱纯化,获得纯度为90%的重组蛋白.结论 成功地构建了结核分枝杆菌glcB基因工程表达株,并获得GlcB重组蛋白,为研究新型血清学诊断活动性结核病奠定了基础.
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复苏促生长因子结构域及其突变体重组蛋白诱导小鼠免疫应答的研究
目的 评价复苏促生长因子结构域蛋白(Rpfd)及其突变体蛋白(Rpfd1、Rpfd2)等3种重组蛋白的免疫效能.方法 2011年11月至2012年2月间,分别以本实验前期制备的重组蛋白Rpfd(A组)、Rpfd1(A1组)、Rpfd2(A2组)分别于0、2、4周免疫无特定病原体(SPF)级BALB/c小鼠,每组14只,并分别以BCG(B组)和生理盐水(C组)同期免疫同种小鼠各14只作为对照.第5周,每组取7只小鼠摘眼球取血,ELISA法检测血清特异性抗体、血清IFN-γ和IL-2表达水平；第8周,每组剩余7只小鼠用1×105 CFU结核分枝杆菌标准株H37Rv感染小鼠,第9周检测感染后小鼠血清细胞因子IFN-γ和IL-2水平.结果 (1)抗体水平:①Rpfd抗原包被.A1组刺激小鼠产生抗体A450的检测值(0.990±0.272)高于B组(0.631±0.180) (t=4.635,P＜0.05)；A2组(1.470±0.455)高于B组(t=6.634,P＜0.05).②Rpfd1抗原包被.A组刺激小鼠产生抗体A450的检测值(1.030±0.304)高于B组(0.573±0.004)(t=5.276,P＜0.05)；A1组(1.368±0.171)高于B组(t＝17.20,P＜0.05)；A2组(2.766±0.245)高于B组(t＝31.643,P＜0.05)；③Rpfd2抗原包被.A1组刺激小鼠产生抗体A450的检测值(1.055±0.202)高于B组(0.538±0.100)(t＝8.009,P＜0.05)；A2组(1.605±0.544)高于B组(t=8.192,P＜0.05).(2) IFN-γ水平:①感染前.A组刺激小鼠产生IFN-γ水平[(553.47±132.00) pg/ml]高于B组[(385.28±129.07) pg/ml](t=3.150,P＜0.05)；②感染后.A1蛋白组刺激小鼠产生IFN-γ水平[(492.41±211.74) pg/ml]高于B组[(335.36±207.72) pg/ml](t＝2.874,P＜0.05)；A2组[(543.09±223.07) pg/ml]高于B组(t=3.15,P＜0.05).(3) IL-2水平:①感染前.A组刺激小鼠产生IL-2水平[(1490.05±215.35) pg/ml]高于B组[(718.70±269.29) pg/ml](t=7.763,P＜0.05)；A1组[(1738.91±358.40) pg/ml]高于B组(t=7.903,P＜0.05)；A2组[(2270.74±193.40) pg/ml]高于B组(t=16.308,P＜0.05)；②感染后.A组刺激小鼠产生IL-2水平[(806.81±306.39) pg/ml]高于B组[(335.26±176.81) pg/ml](t=4.627,P＜0.05)；A1组[(1373.22±143.75) pg/ml]高于B组(t=15.90,P＜0.05).结论 Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白具有启动宿主体液免疫功能及增强宿主细胞免疫功能的双重作用,可能成为预防及治疗Mtb感染的免疫新策略.
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结核分枝杆菌重组蛋白Rv0222的表达及血清学鉴定
目的 构建Mtb重组蛋白Rv0222的重组质粒,评价其用于结核病血清学诊断的价值.方法 通过PCR从Mtb染色体基因组中扩增出Rv0222基因片段,插入pMD18-T载体后,再亚克隆入表达载体pET30a中,诱导表达重组菌,组氨酸标签(His-tag)亲和层析纯化蛋白,通过免疫印迹法分析重组蛋白的免疫反应性,通过间接ELISA方法检测142例血清样本,来自82例结核病患者(痰涂片或痰培养阳性,抗结核治疗症状减轻者),28例非结核病患者(8例肺癌、15例肺炎和5例肺气肿)和32例健康体检者,检测数据通过专业医学软件MedCalc 11.5.0分析ROC曲线下面积和佳阳性判定值.结果 成功构建重组载体,重组蛋白Rv0222经电泳后显示相对分子质量约为27 000,镍柱纯化后蛋白纯度达95％以上,通过蛋白免疫印迹法证实重组蛋白Rv0222与结核病患者血清能特异性结合.酶联免疫检测ROC曲线下面积为0.893,佳阳性判定值为0.12时,结核病患者组抗体检测敏感度为69.5％(57/82),非结核病患者和健康体检者抗体检测特异度为90.0％(54/60),结核病患者与非结核病患者及健康体检者相比,差异有统计学意义(t=25.78,P＜0.0001).结论 成功构建pET30a-Rv0222表达载体,获得高纯度的重组蛋白Rv0222,ELISA结果显示Rv0222蛋白有望成为结核病血清学诊断的有效抗原之一.
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结核分枝杆菌phoS2基因在大肠埃希菌中的高效表达及其产物抗原性分析
目的 在大肠埃希菌中高效表达结核杆菌phoS2,通过免疫印迹反应初步鉴定重组蛋白的抗原性和特异性.方法 采用DNA重组技术构建结核分枝杆菌phoS2抗原表达载体,用双酶切和PCR等方法鉴定转化子,重组质粒转化大肠埃希菌,诱导表达phoS2;用SDS-PAGE初步鉴定其表达量;将表达产物进行纯化;重组蛋白用Western blot分析其抗原性和特异性.结果 phoS2基因在大肠埃希菌中得到高效表达,表达量占全菌蛋白的40%以上;重组蛋白与结核病患者血清标本呈强阳性反应,与健康人血清标本呈阴性反应.结论 重组phoS2蛋白在大肠埃希菌中主要以包涵体形式表达,有很好的抗原特异性和免疫原性,对结核病诊断有潜在的应用价值.
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5种结核分枝杆菌特异蛋白质的抗原性分析
目的 评价14、16、38 kD、mtb81和ESAT-6等5种结核分枝杆菌特异蛋白质的抗原性.方法 利用14、16、38 kD、mtb81和ESAT-6等5种重组蛋白建立ELISA方法,检测120份结核病人、30份非结核呼吸道感染病人和30份健康人血清中相应抗体.结果 ELISA显示5种结核杆菌特异性蛋白质的特异性均高于95%;敏感性和准确性则不尽相同,其中38 kD的检测敏感性高,为80.8%;14、16 kD、mtb81和ESAT-6的检测敏感性分别为52.5%、68.3%、35.8%和44.2%.结论 5种结核杆菌特异性蛋白质均具有不同程度的抗原性.进一步提高抗原或抗体的检测灵敏度将有利于结核病的诊断.
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日本血吸虫核糖体蛋白S4基因的克隆、表达、纯化及免疫诊断价值的初步研究
目的 体外重组日本血吸虫核糖体蛋白S4(SjRPS4),并评价其在日本血吸虫病免疫诊断中的应用价值.方法 从日本血吸虫尾蚴cDNA文库获得了SjRPS4蛋白相关基因,将该段基因克隆入pQE30表达载体并转化到大肠杆菌M15中,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白表达.融合蛋白经Ni2+-NTA树脂柱进行亲和层析纯化,并通过十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定蛋白反应,通过Western blot和ELISA对其免疫原性进行鉴定.结果 成功构建了pQE30/SjRPS4重组菌.重组菌诱导培养后,SDS-PAGE电泳分析可见在相对分子质量约30×103处有SjRPS4融合蛋白的表达,经纯化获得纯度达90%以上的表达蛋白.Western blot检测结果表明该重组蛋白能被日本血吸虫病患者血清识别.用ELISA法检测疑似血吸虫病患者血清,敏感性为90.91%(70/77),特异性为92.59%(25/27),SjRPS4重组表达蛋白阳性率为67.30%(70/104),与肺吸虫病患者血清无交叉反应.结论 成功克隆表达了SjRPS4蛋白,初步证实了SjRPS4在诊断血吸虫病中具有良好的应用价值.
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重组日本血吸虫信号蛋白14-3-3不同剂量对免疫保护性的影响
目的观察不同剂量重组日本血吸虫(中国大陆株)信号蛋白14-3-3(rSj14-3-3)的免疫保护性,以探讨佳的免疫剂量.方法以逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)扩增Sj14-3-3基因,并将其亚克隆入原核表达载体pET28a,然后转化大肠埃希菌进行诱导表达;用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、电洗脱和透析的方法制备纯化的rSj14-3-3蛋白,分5组(第1、2、3组为rSj14-3-3蛋白50μg、100μg和300μg实验组,第4、5组分别为福氏佐剂和生理盐水对照组)免疫BALB/c小鼠并进行攻击感染实验.在尾蚴攻击感染6周后,剖杀小鼠计算各组的减虫率和减卵率.并在试验过程中留取不同时期小鼠血清,检测抗Sj14-3-3特异性IgG抗体.结果成功表达出rSj14-3-3蛋白,纯化蛋白免疫小鼠行攻击感染后各实验组的减虫率为第1组28.20%、第2组43.10%、第3组40.00%;各组的减卵率分别为(按以上组序)41.80%、57.50%、55.70%.各实验组与对照组比较,差异有统计学意义(减虫率:第1组t=6.8、第2组t=8.7、第3组t=7.3,各组P值均＜0.01;减卵率:第1组t=11.23、第2组t=11.54、第3组t=7.99,各组P值均＜0.01);各实验组间两两比较,第1组与第2组间(减虫率:x2=8.96,P＜0.05;减卵率:x2=15.69,P＜0.05)、第1组与第3组间(减虫率:x2=6.52,P＜0.05;减卵率:x2=12.52,P＜0.05)差异有统计学意义;第2、3两组间差异无统计学意义(减虫率:x2=1.20,P＞0.05;减卵率:x2=0.93,P＞0.05).各实验组的抗Sj14-3-3特异性总IgG水平都有显著升高,所测的4个亚型中以IgG1和IgG2a亚型升高为主,IgG2b和IgG3亚型升高不明显.结论重组Sj14-3-3的免疫保护性与免疫剂量有一定关系,以100μg抗原量免疫小鼠获得的保护性好.
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蝎毒重组蛋白对人肺腺癌A549细胞的抑制作用及其机制
目的 探讨蝎毒重组蛋白对人肺腺癌A549细胞的抑制作用及其抗肿瘤机制.方法 四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测蝎毒重组蛋白对人肺癌A549细胞增殖的抑制作用;荧光显微镜及流式细胞仪(FCM)技术观测蝎毒重组蛋白对肿瘤细胞内钙离子浓度([Ca2+]I)的影响,探讨[Ca2+]I变化时Ca2+的可能来源.结果 蝎毒重组蛋白对人肺癌A549细胞生长有明显抑制作用;荧光显微镜显示,蝎毒重组蛋白作用细胞48 h后细胞内钙离子荧光强度增强,提示[Ca2+]I升高;流式细胞仪显示蝎毒重组蛋白在不同情况下可显著增加肿瘤[Ca2+]I(P<0.05).结论 蝎毒重组蛋白对人肺腺癌A549细胞增殖具有显著抑制作用,可能与升高肿瘤[Ca2+]I继而诱导肿瘤细胞凋亡有关;其升高肿瘤[Ca2+]I是通过开放肿瘤细胞膜钙通道和肿瘤细胞内钙库释放两条途径实现.
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肺炎链球菌蛋白PspC的制备与鉴定
目的 对肺炎链球菌表面蛋白C (PspC)进行全基因合成、重组表达、纯化制备和鉴定.方法 根据GenBank中PspC的基因序列和氨基酸序列,通过密码子优化和全基因合成的方式获得目的蛋白基因,构建无标签、高效重组表达菌株,建立重组蛋白的纯化制备方法,并进行抗原鉴定及免疫原性检测分析.结果 人工合成的PspC基因序列经鉴定与预期一致,目的蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达,表达量在30％以上,经两步纯化后纯度达到95％.重组蛋白能与肺炎链球菌阳性血清产生特异性抗原抗体反应,免疫小鼠后可诱导产生较高水平的蛋白特异性抗体.结论 获得了重组肺炎链球菌蛋白PspC,其具有与天然抗原相似的抗原性和免疫原性,为今后开展疫苗研制、载体蛋白应用等研究奠定基础.
关键词： 肺炎链球菌 重组蛋白质类 肺炎链球菌表面蛋白C -
PCV2-ORF2去信号肽基因的克隆与原核表达及对小鼠免疫效力的评价
目的 通过基因工程的方法表达猪圆环病毒2型的ORF2蛋白,并对表达蛋白进行小鼠免疫效力评价,为猪圆环病毒病疫苗的研制提供技术支持.方法 根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2基因序列,设计了1对引物.从疑似断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的死亡仔猪病料中提取基因组DNA,用PCR方法扩增出ORF2去信号肽基因,将该基因克隆至原核表达载体pET32α,获得重组质粒,经PCR、酶切以及序列分析鉴定,表明插入的片段为目的基因,插入的位置、大小和阅读框均正确,成功构建了重组质粒pet32α-ORF2,阳性重组质粒转化大肠杆菌Blgold(DE3),用IPTG诱导表达并确定表达的佳条件,表达产物经纯化后,以每只小鼠0.2mg免疫5周龄的雌性小鼠,然后用ELISA检测免疫小鼠血清中抗体的产生情况.结果 纯化的重组蛋白能使小鼠产生了抗猪圆环病毒的特异性抗体,从第7d开始产生抗体,第28d抗体水平达到高,抗体可维持7周以上,并具有良好的安全性.结论 表达目的蛋白能在小鼠体内产生特异性抗体,为进一步研究猪圆环病毒亚单位疫苗奠定了基础.
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国产和进口培养基发酵培养重组人SOD工程菌的比较研究
目的 以国产培养基替代昂贵进口培养基发酵培养重组人超氧化物歧化酶(rhSOD)工程菌.方法 利用国产LB培养基对自行构建的含重组质粒pTK-rhSOD的基因工程菌E.coli DH5α通过摇瓶进行发酵培养,以SDS-PAGE分析方法考察不同菌体接种量(1%～5%)、菌体生长密度[波长600 nm处吸光度(A600)值]、诱导时间(1～8 h)、氨苄青霉素(Amp)浓度(终浓度150、200、250 μg/ml)及加入时机(分别于接种前和诱导前加入)、摇瓶装液量(10%～40%)和诱导温度(42、43、44、45℃)对rhSOD表达的影响,优选适培养条件,并与进口LB培养基进行比较.结果 对于国产LB培养基,采用3%～5%接种量,菌体密度生长至A600达0.38～0.63,诱导前补加Amp由初始的100 μg/ml至200 μg/ml,于42～44℃诱导3～5 h,rhSOD表达量可达30%;对于进口LB培养基,采用2%接种量,菌体密度生长至A600达0.55～0.93,诱导前补加Amp由初始的100 μg/ml至150 μg/ml,于42～43℃诱导2～4 h,rhSOD表达量可达30%.两种培养基摇瓶装液量对rhSOD的表达均没有明显影响.结论 国产LB培养基经条件优化后可获得与进口培养基相同的 蛋白表达量,可以替代昂贵的进口产品,为rhSOD进一步规模化生产降低发酵成本提供了实验依据.
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一种高效制备人β2微球蛋白标准物质的方法和应用
目的 构建重组人 β2微球蛋白表达体系,高效快速获取 β2微球蛋白,为临床实验室检测参考物质的制备奠定基础.方法 优化人 β2微球蛋白序列,人工合成优化序列片段并与麦芽糖结合蛋白(MBP)分别克隆至pRSF-Duet载体以构建重组人 β2微球蛋白表达质粒.使用大肠杆菌E.coli BL21(DE3)对重组质粒进行诱导表达,TEV蛋白酶切除MBP,全自动生化仪测定 β2微球蛋白浓度.对重组蛋白在4℃和 –20℃储存条件下的稳定性进行检测,对 β2微球蛋白纯品与校准品的互通性进行分析.结果 成功构建重组人 β2微球蛋白表达质粒,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)成功诱导重组蛋白表达,MBP-β2微球蛋白(MBP-β2-MG)浓度可达100 mg/L,β2微球蛋白浓度可达185 mg/L.在4℃和 –20℃储存条件下监测64周,β2微球蛋白稳定存在.β2微球蛋白纯品与RANDOX生化校准品互通性良好.结论 通过密码子优化,成功构建了重组 β2微球蛋白的高效表达系统,β2微球蛋白可溶性高,稳定性好,与国际通用校准品互通性好,可充分满足该产品诊断试剂制备的需求.
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PD-L1重组蛋白的表达及生物学活性分析
目的 构建细胞程序死亡因子1配体1(PD-L1)的重组表达质粒,在原核系统中表达并分析其生物学活性.方法 经密码子优化后合成PD-L1全基因序列,构建硫氧还原蛋白-pET43b/(PD-L1)重组表达质粒并在大肠埃希菌中表达;用ELISA验证表达产物与其受体结合的生物学活性.结果 正确构建了PD-L1重组表达质粒及其大肠埃菌基因工程菌,能稳定、高效地表达目的 蛋白,相对分子质量为47×103,目的 蛋白能与其受体特异性结合.结论 成功获得有生物学活性的PD-L1重组蛋白,为研制单克隆抗体及其与病毒感染慢性化的关系提供基础条件.
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酵母表达的重组戊型肝炎病毒结构区ORF2蛋白的抗原性鉴定
目的对应用巴氏毕赤酵母表达系统制备的重组戊型肝炎病毒(HEV)结构区ORF2蛋白的抗原性进行鉴定.方法以原核细胞表达的重组HEV ORF2抗原作为对照,应用间接ELISA方法鉴定重组HEV ORF2蛋白在HEV IgM和IgG抗体检测中的特异性和敏感性;并测定不同保存时间对抗原稳定性的影响.同时,比较了两种重组抗原与国外5株HEV ORF2单克隆抗体的反应特性.结果应用酵母抗原可检测到HEV抗体的低包被量为12.5 ng/ml,可检测到HEV IgM、IgG抗体的血清大稀释度皆为1:5 120.重组蛋白与其他类型肝炎患者血清无交叉反应,37℃加速试验证实重组蛋白4℃保存12个月可保持良好的抗原性.各株单克隆抗体与酵母表达的HEV ORF2蛋白有更好的反应性,其中4B2、2E2与酵母表达的HEV ORF2蛋白的反应性比与原核表达抗原的反应性分别高出125倍和25倍.结论应用巴氏毕赤酵母表达系统制备的重组HEV ORF2蛋白可能包含了更为广泛的构象依赖性抗原表位,具有良好抗原性、特异性和稳定性.提示其可作为开发戊型肝炎诊断试剂的一个独具优势的候选抗原.
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重组抗原在HSV-Ⅰ感染ELISA检测中的应用
目的用单纯疱疹病毒(HSV)重组蛋白作为包被抗原建立一种特异性和灵敏性较高的ELISA方法.方法将重组糖蛋白D(gD)和HSV-Ⅰ分别作为包被抗原,检测57份临床标本,同时用国产和德国试剂盒进行检测;将德国试剂盒作为金标准,另外三者检测结果在特异性、灵敏性和符合率等方面与其进行比较.结果与德国试剂盒相比,在特异度、敏感度、符合率方面,重组抗原分别为57.1%、82.0%、78.9%.病毒抗原分别为57.1%、78.0%、75.4%;国产试剂盒分别为100.0%、48.0%、54.4%.重组蛋白重复性实验结果经统计学处理差异无统计学意义(P＞0.05).结论用酵母菌表达的HSV-Ⅰ重组gD蛋白作为包被抗原进行ELISA检测是一种敏感、特异的方法,具有较大的应用价值.
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流感病毒中和性基因工程Fab抗体的研制
目的获得基因工程抗流感病毒抗体，为检测其粘膜用药在动物模型中的抗病毒效果奠定基础。方法 从酶联免疫吸附试验阳性的人外周血中分离淋巴细胞，提取总RNA，Oligo\|Dt逆转录Cdna，聚合酶链反应扩增人IgG轻、重链基因，利用pComb3载体构建噬菌体抗体库。用纯化的流感病毒A/Sydeny/5/97(H3N2)为固相抗原筛选抗体Fab段，并在大肠埃希菌中进行分泌性表达。通过血凝抑制实验、免疫荧光实验和病毒中和实验选择具有中和作用的Fab抗体。结果 分离到两株Fab克隆，IV-2和IV-6，流感病毒抗原和抗Fab抗体直接ELISA检测阳性，间接免疫荧光实验呈阳性。它们都具有血凝抑制作用，病毒中和实验显示能使病毒滴度下降30倍和20倍。结论 获得了两株具有病毒中和活性的人源抗流感病毒悉尼株的Fab段抗体，为进一步的表达纯化及粘膜给药研究其抗病毒效果提供材料。
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重组结核分枝杆菌 ESAT6-CFP10蛋白与 PPD 皮肤试验的动物实验比较
目的：动物实验中评价重组结核分枝杆菌ESAT6-CFP10蛋白（以下简称：重组ESAT6-CFP10蛋白）皮肤试验情况，同时与PPD（结核菌素纯蛋白衍生物）皮肤试验进行比较。方法以不同分枝杆菌分别致敏豚鼠，致敏成功后每只豚鼠皮内分别注射重组ESAT6-CFP10蛋白和PPD。用双盲法记录注射后48 h局部皮肤反应的纵径和横径，计算其均值。以结核分枝杆菌活菌感染豚鼠，在感染后不同时间内选取一定只数的豚鼠，皮内分别注射重组ESAT6-CFP10蛋白和PPD，记录注射后24 h局部皮肤反应的纵径和横径，计算其均值，并统计两种皮试反应的阳转率情况。结果在结核分枝杆菌活菌、结核分枝杆菌死菌和卡介苗致敏豚鼠中，PPD皮肤试验均为阳性，局部硬结直径分别为（11．4±0．9） mm、（11．8±1．1） mm和（13．2±0．8） mm。在结核分枝杆菌活菌致敏豚鼠中，重组ESAT6-CFP10蛋白皮肤试验为阳性，局部硬结直径为（13．7±5．7） mm；在结核分枝杆菌死菌和卡介苗致敏豚鼠中，重组ESAT6-CFP10蛋白皮肤试验均为阴性，局部硬结直径为0。结核分枝杆菌H37 Rv感染豚鼠后，第9天开始随机选取相应只数的豚鼠进行重组 ESAT6-CFP10蛋白和PPD的皮肤试验。第2周时24只豚鼠全部进行皮试试验，ESAT6-CFP10蛋白全部阳转，阳转率为24/24，硬结反应平均值为（19．9±3．0） mm；而PPD的阳转率仅为15/24，硬结反应平均值为（6．1±5．5） mm。第4周时PPD开始全部阳转，阳转率为33/，硬结反应平均值为（12．7±2．5） mm。结论重组ESAT6-CFP10蛋白皮肤试验能够鉴别卡介苗接种和结核分枝杆菌死菌、活菌感染，并且较PPD能够早期进行诊断。
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丙型肝炎病毒非结构蛋白3的体外表达与纯化
目的 构建丙型肝炎病毒非结构蛋白3(HCV NS3)表达质粒并在大肠杆菌中表达其全长蛋白.方法 克隆HCV NS3的核酸序列3420-5312位点,插入pQE-11质粒的Bam H1限制性酶切位点,将此重组质粒转入大肠杆菌表达,用Western blot方法筛选阳性克隆,将含有额外拷贝的argU、ileY和leuW的tRNA基因的pACYA质粒引入HCV NS3表达系统以提高HCV NS3蛋白的表达量.收集培养扩增的大肠杆菌菌体,用卵白溶菌酶裂解,收集含有HCV NS3重组蛋白的不溶性包涵体,将包涵体充分洗涤后,溶于含10 mmol/L二硫苏糖醇的缓冲液中.释放的可溶性蛋白用SDS-PAGE电泳分离、洗脱,用离心过滤方法浓缩,乙醇沉淀,重复洗涤去除内毒素.结果 用此方法克隆的HCV NS3全长基因片段表达的重组蛋白分子量为69 kD.含有额外拷贝的argU、ileY和leuW的tRNA基因的pACYA质粒引入HCV NS3表达系统后,HCV NS3蛋白的产出率可提高10倍以上.此方法生产的NS3纯化蛋白质产量,每升培养物为40 mg.内毒素含量低于20 EU/mg NS3蛋白.结论 HCV NS3与HCV的免疫逃逸及感染的慢性化有密切关系,是HCV的抗病毒治疗和疫苗研究的重要靶点,全长HCV NS3蛋白的体外合成为HCV研究提供了一个有用的工具.
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胃泌素释放肽前体对小细胞肺癌的诊断价值
目的 评估分析血清胃泌素释放肽前体(ProGRP)对小细胞肺癌(SCLC)的临床诊断价值.方法 用化学发光法和电化学发光法检测2010年9月至2011年4月期间,青岛大学医学院附属医院46例初诊SCLC(局限期26例、广泛期20例)、51例非小细胞肺癌(NSCLC)、45例肺良性疾病患者及56名健康体检者血清ProGRP和神经元特异性烯醇化酶(NSE)水平,以受试者工作特征( ROC)曲线确定ProGRP和NSE诊断SCLC的临界值及曲线下面积(ROC-AUC),评估2项指标诊断SCLC的敏感度和特异度.结果 健康对照组、肺良性疾病组、NSCLC组和SCLC组血清ProGRP水平分别为22.9(19.5～28.7)、23.7(20.0 ～ 27.8)、28.9(23.8 ～34.7)和370.9( 129.4 ～ 1951.6) ng/L;血清NSE水平分别为14.1(12.5～15.7)、13.3(10.3 ～ 15.3)、16.8(11.7 ～22.1)和39.9(16.1 ～93.9) μg/L；经非参数Kruskal-WallisH检验,各组间ProGRP和NSE的差异均有统计学意义(H值分别为92.116和55.481,P均＜0.001).局限期SCLC (LD-SCLC)组血清ProGRP[ 156.2(65.4～547.5) ng/L]也高于健康对照组、肺良性疾病组和NSCLC组(U值分别为57、70和144,P均＜0.001).广泛期SCLC (ED-SCLC)组血清ProGRP和NSE为[1933.1(325.9 ～4512.1) ng/L和61.0(35.4～115.5)μg/L],均高于LD-SCLC组ProGR和NSE[24.3(15.1～61.3) μg/L,U值分别为119和153,P均＜0.05].以健康组为对照,ROC曲线上取约登指数大点确定ProGRP和NSE的临界值分别为34.0 ng/L和20.2μg/L,SCLC组ProGRP的ROC-AUC(0.96)较NSE(0.86)明显增高(Z=2.57,P＜0.05)；ProGRP和NSE联合检测的ROC-AUC(0.96)与ProGRP单项检测(0.96)比较,差异无统计学意义(Z =0.21,P＞0.05).ProGRP的敏感度(89.1％)也高于NSE(71.7％,x2 =4.90,P＜0.05)；其特异度(98.2％)与NSE比较的差异无统计学意义(96.4％,x2 =0.00,P＞0.05)；ProGRP和NSE联合检测的敏感度和特异度与ProGRP单项检测比较,差异无统计学意义(91.3％比89.1％,94.6％比98.2％,x2均为0.00,P＞0.05).以肺良性疾病组为对照,ROC曲线上取约登指数大点确定ProGRP和NSE的临界值分别为49.5 ng/L和23.1 μg/L,SCLC组ProGRP的ROC-AUC(0.95)比NSE(0.87)明显升高(Z=1.99,P＜0.05)；ProGRP和NSE联合检测的ROC-AUC (0.95)与ProGRP单项检测(0.95)比较,差异无统计学意义(Z=0.02,P＞ 0.05).ProGRP的敏感度(84.8％)也高于NSE(69.6％,x2=4.00,P＜ 0.05);其特异度(97.8％)与NSE比较,差异无统计学意义(97.8％,x2=0.50,P＞0.05)；ProGRP和NSE联合检测的敏感度和特异度与ProGRP单项检测比较,差异无统计学意义(87.0％比84.8％,95.6％比97.8％,x2均为0.00,P＞0.05).以NSCLC组为对照,ROC曲线上取约登指数大点确定ProGRP和NSE的临界值分别为49.1 ng/L和23.0μg/L,SCLC组ProGRP的ROC-AUC(0.90)较NSE(0.76)明显升高(Z=2.90,P＜0.05)；ProGRP和NSE联合检测的ROC-AUC(0.90)与ProGRP单项检测(0.90)比较,差异无统计学意义(Z=0.00,P＞0.05).ProGRP的敏感度(84.8％)也高于NSE(69.6％,x2 =4.00,P＜0.05),其特异度(96.1％)与NSE也明显升高(80.4％,x2=6.13,P＜0.05)；ProGRP和NSE联合检测的敏感度和特异度与ProGRP单项检测比较,差异无统计学意义(87.0％比84.8％,95.6％比96.1％,x2均为0.00,P＞0.05).结论 ProGRP用于诊断SCLC较好,其比NSE对SCLC有更高的辅助诊断价值.
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人丙氨酸转氨酶高效重组表达体系的构建
目的：构建人丙氨酸转氨酶（ ALT）高效重组表达体系，为ALT相关参考物质的原料制备奠定基础。方法利用生物信息学方法优化编码人ALT核苷酸序列中的密码子，合成人ALT新的基因，并将其克隆至pRSF-Duet表达载体中。重组表达质粒pRSF-Duet-ALT转化大肠埃希菌BL21，以2 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷（ IPTG）诱导目的蛋白的表达，并通过改变诱导剂浓度、振摇速度及诱导温度优化表达条件，以产生可溶性蛋白。可溶性蛋白经镍离子柱亲和层析及分子筛层析纯化，以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS-PAGE）及蛋白质免疫印迹（ Western blot）鉴定蛋白的性质，并对重组蛋白的活性、不同储存条件下在血清基质中的稳定性进行检测。结果经过优化的ALT核苷酸密码子在大肠埃希菌中的使用频率均在10％以上；经表达优化，在IPTG 终浓度为2 mmol/L、25℃、150 rpm振摇8 h诱导条件下，可增加可溶性蛋白的产率；纯化后的目的蛋白经电泳及免疫印迹鉴定为谷丙转氨酶，活性可达80000 U/L。重组ALT在2～8℃、25℃均可稳定2～8 d，相对偏差均在5％以内。结论通过密码子优化，成功构建了重组ALT的高效表达系统，本重组蛋白可以达到作为参考物质原料的要求。（中华检验医学杂志，2014，37：767-771）
