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非结构蛋白1抗原捕获酶联免疫吸附法评价登革病毒抗体中和活性
目的 在获得具有中和活性的针对Ⅰ型登革病毒(dengue virus serotype Ⅰ,DENV-1)的抗体基础上,评价已建立的非结构蛋白1(nonstructural protein 1,NSI)抗原捕获酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)分析抗体中和活性的可行性,为中和抗体的筛选和疫苗效果的评价提供一个更为快速、简便的检测方法.方法 使用重组DENV-1包膜蛋白Ⅲ区(envelopeprotein domainⅢ,EDⅢ)免疫5只BALB/c小鼠制备单克隆抗体(简称单抗),采用间接ELISA、间接免疫荧光法(immunofluorescenee assay,IFA)和免疫印迹法(Western Blot)对单抗进行筛选及鉴定;同时用该重组蛋白免疫1只新西兰兔,制备多克隆抗体血清;以传统噬斑减少中和试验(plaquereduction neutralization test,PRNT)作为参比方法,采用NSI抗原捕获ELISA对所获抗体进行中和活性检测.结果 获得4株针对DENV-1 EDⅢ单抗和1份兔多抗血清,且被PRNT试验证明均具有中和活性,四株单抗腹水(1A1、1B3、3D3、9D6)和兔多抗血清中和效价分别为1:1024、1:512、1:256、1:4096和1:4096.使用NS1抗原捕获ELISA法检测不到PRNT中和效价低的3D3抗体对DENV-1有中和能力,而检测其余3株单抗(1A1、1B3、9D6)和多抗兔血清中和效价均远低于PRNT测定结果,分别为1:32、1:32、1:128和1:128.结论 简单、快速的NS1抗原捕获ELISA可用于评价DENV抗体的中和活性,该方法适合于高效价中和抗体的筛选,有望成为评价疫苗效果的方法之一.
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HCV NS3 N端多肽诱导人肝细胞系转化及成瘤实验
目的研究丙型肝炎病毒(HCV)非结构区3 N端多肽(HCV NS3-5′)对人肝细胞株QSG7701的转化作用及致癌性.方法通过脂质体介导将含有HCV NS3 N端cDNA的真核表达质粒(pRcHCNS3-5′)导入人源性肝细胞株QSG7701,G418筛选目的基因表达的细胞;聚合酶链反应(PCR)及免疫组织化学SP法检测细胞中HCV NS3基因及蛋白的表达;细胞计数,锚着非依赖性生长实验,成瘤性检测等鉴定其生物学行为变化,免疫组织化学S-P法检测所致肿瘤中HCV NS3及c-myc蛋白表达.结果 HCV NS3-5′转染的QSG7701细胞中NS3蛋白过度表达于胞质,质粒pRcHCNS3-5′转染细胞的倍增时间较pRcCMV转染细胞和未转染QSG7701细胞明显缩短(分别为12 h,26 h,28 h).pRcHCNS3-5′和pRcCMV转染细胞及未转染QSG7701在软琼脂中的克隆形成率分别为33.0%、1.5%、1.1%.pRcHCNS3-5′转染细胞的克隆率高于其他两种转染细胞(P<0.01).三种细胞接种裸鼠后, pRcHCNS3-5′转染细胞注射组出现肿瘤,为肝细胞癌,肿瘤组织有HCV NS3蛋白和c-myc蛋白的表达.阳性对照组亦出现肿瘤,而pRcCMV转染细胞及未转染QSG7701细胞注射组在注射40 d后仍未见肿瘤发生.结论 HCV NS3 N端蛋白具有转化细胞和促进肿瘤发生的作用.
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蚊浓核病毒非结构蛋白1的生物信息学分析
目的 通过生物信息学分析软件对蚊浓核病毒(mosquito densovirus,MDV)菲结构蛋白1(Nostructual proteinl,NS1)的结构与功能进行分析预测.方法 应用EXPASY pmtparam tool、ClagtalX1.83、Bioedit、MEGA3.1、ScanProsite、Motifscan等分析软件和在线生物信息学分析工具对MDVNS1的理化特性、同源性、进化关系、二级结构与主要功能结构域进行分析预测.结果 MDV NSI属不稳定亲水性蛋白,氨基酸序列高度保守,与虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)进化距离较近;MDV NSI具有小分子DNA病毒编码的解螺旋酶超家族3(Saperfamily 3 helicage of DNA viruses)的结构域,该结构域包含有NTP-binding区域,使其具有金属离子依赖的ATPase的活性,蛋白靠近N端包含有病毒滚筒复制rolling-circle replication(RCR)起始蛋白的结构域并具有单链切口酶的生物学功能.结论 生物信息学预测结果提示MDV NS1蛋白在病毒的复制、包装等各个阶段起关键性作用.
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丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B肝细胞结合蛋白基因的筛选与克隆
目的筛选并克隆人肝细胞cDNA文库中与丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4B(NS4B)相互作用蛋白的基因,明确其具体作用机制.方法应用酵母双杂交系统3,将多聚酶链反应(PCR)法扩增的HCV NS4B基因连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选阳性菌落,提取阳性酵母菌落的质粒转化大肠埃希菌,接种在氨苄西林-LB平板上,选择生长菌落,提取质粒酶切鉴定,测序并在GenBank中进行生物信息学分析.结果成功克隆出HCV NS4B基因并在酵母细胞中表达,与肝文库配合后选出既能在4缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基又能在铺有X-α-gal的4缺培养基上生长,并变成蓝色的真阳性菌落5个,序列分析显示,筛选到的肝细胞蛋白编码基因参与细胞代谢、生物氧化、生长调节等多种生物学过程.结论成功克隆出HCV NS4B蛋白与肝细胞相互作用蛋白,为进一步研究NS4B蛋白的功能,阐明HCV致病的分子生物学机制提供了新线索.
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酵母双杂交技术筛选人白细胞cDNA文库中HCV NS4A结合蛋白及CAML基因的克隆
目的 应用酵母双杂交技术筛选人白细胞中与丙型肝炎病毒非结构蛋白4A(HCV NS4A)相互作用的蛋白.方法 连接有HCV NS4A酵母表达的载体pGBKT7-NS4A,转化入单倍体酵母细胞AH109,与转化了人白细胞cDNA文库质粒的单倍体酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-a-半乳糖(X-a-Gal)上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提取质粒,转化人大肠埃希细菌(DH5α),提取质粒并测序,进行生物信息学分析.对克隆重复率较高的蛋白编码基因进行克隆和回交验证.结果 筛选出在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基和在铺有X-a-gal的四缺培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落45个,其中钙离子信号调节亲环素配体(CAML)29个.对CAML基因成功克隆,回交验证了HCV NS4A与CAML的相互作用.结论 成功筛选出7种在人白细胞cDNA文库中与HCV NS4A特异性相互作用的蛋白,为进一步探讨HCV的致病机制提供了新的线索.
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Ⅱ型登革病毒非结构蛋白1特异性T细胞系的构建和特征分析
目的 构建Ⅱ型登革病毒(DENV2)非结构蛋白1(NS1)特异性T细胞系,分析其抗原特异性、表型特征和细胞因子分泌能力.方法 NS1蛋白与弗氏佐剂乳化后腹腔注射免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞分离T细胞,加入丝裂霉素C预处理的同系小鼠单核细胞和NS1蛋白,体外循环间歇刺激和有限稀释培养获得DENV2 NS1特异性T细胞,MTT法分析其抗原特异性,流式细胞术分析其表型特征,ELISA法分析其细胞因子分泌能力.结果 共获得9株DENV2 NS1抗原特异性的T细胞,其纯度和活细胞率均大于95%;与胎牛血清刺激培养比较,该抗原特异性T细胞在NS1特异性刺激和植物血凝素非特异性刺激下均明显增殖(t=6.2780,P<0.05;t=5.1176,P<0.05),而在DENV2 E非特异性刺激下无明显变化;与同系小鼠T细胞比较,九株NS1特异性T细胞均高表达死亡配体分子FasL(t=30.3652,P<0.05);培养6 h和12 h时,NS1特异性T细胞培养上清中IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ和TNF-α浓度均明显升高;其中IFN-γ浓度升高显著,6 h时达到峰值[(348.2±53.4)pg/ml],TNF-α浓度在培养24 h时仍维持在较高水平[(23.2±1.2)pg/ml],而同系小鼠T细胞培养上清中上述细胞因子浓度均无明显变化.结论 成功构建了DENV2 NS1特异性T细胞系,为进一步研究NS1蛋白介导的细胞免疫应答在登革病毒所致疾病中的作用奠定了一定基础.
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丙型肝炎病毒非结构蛋白3的体外表达与纯化
目的 构建丙型肝炎病毒非结构蛋白3(HCV NS3)表达质粒并在大肠杆菌中表达其全长蛋白.方法 克隆HCV NS3的核酸序列3420-5312位点,插入pQE-11质粒的Bam H1限制性酶切位点,将此重组质粒转入大肠杆菌表达,用Western blot方法筛选阳性克隆,将含有额外拷贝的argU、ileY和leuW的tRNA基因的pACYA质粒引入HCV NS3表达系统以提高HCV NS3蛋白的表达量.收集培养扩增的大肠杆菌菌体,用卵白溶菌酶裂解,收集含有HCV NS3重组蛋白的不溶性包涵体,将包涵体充分洗涤后,溶于含10 mmol/L二硫苏糖醇的缓冲液中.释放的可溶性蛋白用SDS-PAGE电泳分离、洗脱,用离心过滤方法浓缩,乙醇沉淀,重复洗涤去除内毒素.结果 用此方法克隆的HCV NS3全长基因片段表达的重组蛋白分子量为69 kD.含有额外拷贝的argU、ileY和leuW的tRNA基因的pACYA质粒引入HCV NS3表达系统后,HCV NS3蛋白的产出率可提高10倍以上.此方法生产的NS3纯化蛋白质产量,每升培养物为40 mg.内毒素含量低于20 EU/mg NS3蛋白.结论 HCV NS3与HCV的免疫逃逸及感染的慢性化有密切关系,是HCV的抗病毒治疗和疫苗研究的重要靶点,全长HCV NS3蛋白的体外合成为HCV研究提供了一个有用的工具.
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登革热初筛方法的比较与应用评价
目的：比较3种不同初筛方法对登革热的诊断价值，并探讨各种方法的应用范围及应用价值。方法采用回顾性研究。收集2014年及2015年9至10月佛山市第一人民医院门诊及住院共2137例疑似登革热病毒感染者的临床资料，同时采用ELISA法和快速法检测（血清标本）登革热病毒NS1抗原，采用快速法检测登革热病毒IgM抗体，并采用卡方（χ2）检验比较这3种方法对登革热的初筛价值。另对2015年确诊的48例，分别在发病第1～3天、4～5天、6～7天及14天同时采用3种方法进行检测，观察不同时间段3种方法的灵敏度和特异度变化。结果2014年1674例疑似病例中被确诊为登革热的有957例（57.2％），2015年463例中确诊的有48例（10.4％），共计1005例（47.0％）。3种方法对登革热的检出性能比较结果显示，NS1-ELISA方法灵敏度优于NS1抗原快速检测法和IgM抗体快速检测法（χ2＝40.865，P＜0.001；χ2＝151.383，P＜0.001），3种方法特异度相当，差异无统计学意义（χ2＝0.661，P＝0.416；χ2＝0.548，P＝0.459；χ2＝2.397，P＝0.122）。检测NS1抗原的2种方法发病7 d内灵敏度均较好，而检测IgM抗体的方法则随着时间推移灵敏度上升。结论 NS1抗原检测在疾病发生早期灵敏度和特异度良好，优于IgM抗体检测，可作为登革热早期筛查的重要方法，在登革热发病7 d内可根据登革热疫情情况选择ELISA方法或快速检测法。（中华检验医学杂志，2016，39：776-779）
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抗病毒治疗对慢性丙型肝炎患者HCV NS特异性T细胞应答的影响
目的探讨HCV特异性T细胞应答与慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C,CHC)患者抗病毒治疗疗效之间的关系.方法聚乙二醇干扰素α联合利巴韦林治疗CHC患者48例,在治疗前及治疗第4周、第12周时收集患者血清和外周血单个核细胞,通过酶联免疫斑点法检测对HCV非结构蛋白(non-structural protein,NS)区合成肽的特异性T细胞应答,进行纵向比较分析.结果基线时,52%的患者可检测出HCV NS3、NS4和NS5A特异性T细胞应答,其中NS3诱导的免疫反应强.持续病毒学应答(sustained virological response,SVR)组患者较非SVR组患者对多肽刺激的应答率高.SVR组患者在治疗第12周时仍维持较高水平的HCV特异性T细胞应答,而非SVR组患者在治疗第4周时HCV特异性T细胞应答明显下降,第12周时仅维持低水平.结论在接受抗病毒治疗的CHC患者中,HCV特异性T细胞应答与SVR相关.
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细小病毒H-1非结构蛋白NS1在人肝癌细胞内的超显微结构定位
目的研究细小病毒H-1非结构蛋白NS1对体内人肝癌细胞的抑制作用机制方法利用免疫胶体金标记电镜技术,在感染细小病毒H-1后不同时间,观察了病毒非结构蛋白NS1在人肝癌裸小鼠QGY-9204移植瘤模型细胞内的超显微结构定位.结果研究表明,在感染后4 h,H-1病毒的NS1蛋白主要集中在核仁内;感染后12 h,NS1蛋白由核仁内向常染色区转移;感染后24 h,常染色区的NS1蛋白逐渐增多并且向核外扩散;感染后72 h,核内和胞质内NS1蛋白越来越多,与此同时,细胞核圆缩,核仁消失.H-1 NS1蛋白表达在细胞内的定位过程与H-1DNA复制的定位相一致.用原位杂交研究表明,在感染24 h,阳性杂交颗粒仅在少数细胞核内出现,在感染后72 h,核内阳性杂交颗粒增多并向核外扩散.结论 NS1从核仁扩散到细胞质,辅证了NS-1蛋白在病毒生活周期和抑制肿瘤细胞生长中起重要作用.
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丙型肝炎病毒非结构蛋白5A抑制肿瘤坏死因子α诱导HepG2细胞凋亡的作用研究
目的研究丙型肝炎病毒非结构蛋白5A(HCV NS5A)对肿瘤坏死因子α(TNFα)诱导HepG2细胞凋亡的抑制作用.方法设计HCV-1b NS5A区基因片段的特异引物,以逆转录巢式PCR方法扩增NS5A基因片段,并将其进行TA克隆,对阳性克隆进行酶切与序列鉴定;构建NS5A基因表达载体;通过Lipofectamine基因转染法,将NS5A区基因导入HepG2细胞,加入TNFα培养48h;应用Western blot检测caspase-3被切割、细胞色素C释放的情况以及通过AnnecxinV-FITC染色两种方法,观察NS5A蛋白对TNFα诱导的HepG2细胞凋亡的抑制效应. 结果成功建立HCV NS5A蛋白真核表达转基因细胞模型,发现该蛋白对TNFα所诱导HepG2细胞凋亡有抑制作用.结论 HCV NS5A蛋白可以抑制TNFα诱导的HepG2细胞凋亡.
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我国输入性寨卡病毒的分子特征分析
2015年，在巴西等24个美洲国家和地区发生寨卡病毒病［1－3］，随着与疫情国家或地区人员交流的日益密切，我国面临着寨卡病毒输入的风险。截止2016年3月3日，国内共出现9例输入性寨卡病毒感染者，其中广东5例，浙江4例，近期均到过疫区。寨卡病毒病（Zika virus disease）是由寨卡病毒引起并通过蚊媒传播的一种自限性的急性病毒性传染病，其中主要通过感染该病毒的埃及伊蚊叮咬来传播［1－2］。寨卡病毒属黄病毒科黄病毒属，呈球形，有包膜，基因组为单股正链 RNA，包含约1．08万个核苷酸，编码约3419个氨基酸，分为两个基因型：亚洲型和非洲型［2］。寨卡病毒 E 蛋白是其重要的结构蛋白，与病毒活性，如嗜细胞性、毒力和血清特异性等功能密切相关，是引起宿主免疫应答的主要抗原；非编码结构蛋白 NS5含有重要的 RNA 依赖 RNA 聚合酶（RdRP）［4－5］。本研究分析寨卡病毒 E 和 NS5的核苷酸遗传变异和分子特征，为研究该病毒的溯源和进化特征提供重要依据，并用于指导诊断试剂、疫苗和药物的研发，为寨卡病毒传播及暴发的防控提供保障。
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应用巢式聚合酶链式反应技术检测孕妇人微小病毒B19非结构蛋白DNA
目的探讨巢式PCR技术检测人微小病毒B19(B19病毒)非结构蛋白DNA的灵敏性及特异性.方法参照经典的巢式PCR技术检测B19病毒结构蛋白DNA的方法,检测30例孕妇血清及胎盘绒毛组织中的B19病毒结构蛋白及非结构蛋白DNA.并与人巨细胞病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、腺病毒等及人类基因组DNA同批作巢式PCR检测,以观察巢式PCR检测B19病毒非结构蛋白DNA的特异性.结果 (1)巢式PCR检测B19病毒非结构蛋白DNA的小检出量为0.005 fg,灵敏性可达0.005 fg.(2)B19 病毒质粒模板在103 bp处出现靶条带,而人巨细胞病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、腺病毒等及人类基因组DNA均无扩增产物产生.(3)孕妇血清及胎盘、绒毛组织中的B19病毒结构蛋白检出率均为26.7%(8/30),而非结构蛋白DNA检出率在血清中为33.3%(10/30),胎盘、绒毛组织中均为26.7%(8/30).两者比较,差异均无显著性(P>0.05).结论巢式PCR技术检测B19病毒非结构蛋白DNA是一种灵敏、特异、简便、快速诊断B19病毒感染的新方法.
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登革1型病毒NS1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备
目的 重组表达登革1型病毒NS1蛋白并制备多克隆抗体.方法 通过RT-PCR扩增编码登革1型病毒NS1蛋白的基因序列,将其克隆到原核表达载体pET-32a(+)后经酶切测序鉴定,获得重组质粒pET-NS1.进一步使用IPTG诱导表达,经免疫印迹鉴定后,采用蛋白浸提方法从SDS-PAGE胶中纯化回收融合蛋白,并通过透析对目的蛋白进行复性;纯化复性后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,通过间接免疫荧光法测定抗体效价.结果 成功构建了高效表达登革1型病毒 NS1蛋白的原核表达载体,表达的重组NS1蛋白占菌体蛋白总量的50%以上,以包涵体形式存在;免疫印迹表明表达的重组NS1蛋白能够为登革病毒兔抗血清识别,纯化后纯度可达95%以上;免疫小鼠后获得了效价>1:1 000的抗登革病毒NS1蛋白的鼠多克隆抗体.结论 原核表达的重组NS1蛋白具有良好的免疫原性,诱导产生的多克隆抗体能够有效识别天然NS1蛋白,为进一步研究登革病毒NS1蛋白及其抗体的生物学功能奠定了基础.
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乙型脑炎病毒SA14-14-2株NS1蛋白基因在原核细胞中的高效表达及其表达产物的抗原性分析
目的 将乙型脑炎病毒NS1蛋白基因克隆至pET28-a(+)表达载体,构建原核表达载体pET-NS1,并使该基因在E.coli中高效表达,为进一步研制乙脑早期诊断试剂奠定基础.方法 根据GenBank中提供的乙型脑炎病毒SA14-14-2株全基因序列设计引物,通过反转录及巢式PCR方法扩增目的片段,测序后连接pET28-a(+)载体,构建重组表达载体pET-NS1,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,利用IPTG诱导获得高效表达.结果 扩增出了1300bp的基因片段,与预期大小一致,测序后经Blast验证与已发表乙型脑炎病毒SA14.14-2株NS1蛋白基因序列同源性为100%,成功克隆至表达载体pET28-a(+)并获得高效表达,表达产物分子量约为45kD,Western blot分析表明该表达产物具有良好抗原性.结论 该表达产物的稳定高效表达及其抗原特异性为乙脑的诊断试剂开发提供了依据.
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西尼罗病毒Chin-01株5'非编码区(UTR)中复制相关元件的功能研究
目的 研究西尼罗病毒Chin-01株5'非编码区(UTR)中复制相关元件的功能,为探讨该病毒基因组复制的分子机制提供理论依据.方法 通过生物信息学分析,初步筛选出Chin-01株5'UTR中可能的复制相关位点,并构建相应的重组亚基因组突变体,然后以上此为模板,经体外RdRp活性分析及凝胶阻滞试验,观察NS5的RdRp活性及与突变体的结合能力,再将突变位点引入该病毒感染性全长cDNA克隆,初步观察突变体恢复病毒的生物学特性.结果 5'UTR中第45-60位核苷酸缺失的突变体无法合成子链,与NS5的结合能力也显著降低.第8和9位核苷酸改变的突变体则丧失了合成子代RNA及与NS5的结合能力,第8、9、69和70位核苷酸突变后形成的结构恢复突变体则可以合成子链RNA,并可与NS5特异性结合.同时,第45-60位核苷酸缺失及第8和9位核苷酸突变的恢复病毒的增殖能力也显著降低.结论 Chin-01株5'UTR中的第45-60位及第8、9、69和70位核苷酸维持的结构可能是该病毒基因组复制的关键位点.
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日本脑炎病毒非结构蛋白NS5对IFN-α介导的信号转导通路的抑制作用
目的 探讨日本脑炎病毒抑制IFN-α介导的JAK-STAT信号转导通路过程中发挥关键作用的病毒特异蛋白,为阐明日本脑炎病毒抑制Ⅰ型IFN介导的JAK-STAT信号转导通路的作用机制奠定基础.方法 分别构建日本脑炎病毒编码的7种非结构蛋白基因(NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B和NS5)的重组真核表达载体.采用间接免疫荧光法和Western blotting观察它们在细胞内的表达及定位情况.利用含萤火虫荧光素酶(Luc)报告基因的重组载体pISRE-Luc,观察表达病毒不同非结构蛋白的细胞内IFN-α介导的JAK-STAT信号转导通路的活化程度.构建融合表达红色荧光蛋白的STAT 1重组真核表达载体pRed-STAT 1,利用该重组载体在表达病毒非结构蛋白的细胞内观察融合蛋白Red-STAT 1在IFN-α作用下的细胞内定位情况.同时,对表达病毒非结构蛋白的细胞内IFN-α介导的STAT 1分子的磷酸化水平进行检测.结果 日本脑炎病毒的7种非结构蛋白均可在哺乳动物细胞内正确表达,而且表达蛋白均位于细胞质中.在这7种非结构蛋白中,NS5可阻断STAT 1分子的核转运及抑制STAT 1分子的磷酸化水平,从而抑制IFN-α介导的细胞内JAK-STAT信号转导通路的活化.结论 日本脑炎病毒的非结构蛋白NS5棚IFN系统的信号转导通路具有显著的抑制作用,可能是一种Ⅰ型IFN系统的拮抗蛋白.
关键词： 干扰素I型 JAK-STAT信号转导通路 脑炎病毒 日本 病毒非结构蛋白质类 -
鼠肝炎冠状病毒非结构蛋白1内保守序列LLRKxGxKG的功能研究
目的 研究鼠肝炎冠状病毒(MHV)非结构蛋白1(NSP1)内的保守氨基酸序列LLRKxGxKG的功能.方法 扩增并构建MHV NSP1正常基因及LLRKxGxKG序列缺失突变的NSP1基因,分别将其插入真核表达载体pcDNA3.1中,获得真核表达质粒.用所构建的真核表达质粒转染L929细胞,经新城疫病毒(NDV)刺激诱导后,采用ELISA法检测IFN-β的表达水平,观察NSP1正常或突变蛋白对IFN-β表达的影响.通过与含CAT和Luc报告基因的重组质粒进行共转染,观察NSP1正常或突变蛋白对IEF-β启动子活性和干扰素刺激应答元件(ISRE)活性的影响.通过与三种报告基因(pRLuc-CMV、pGL3-basic、pGL3-control)共转染,观察NSP1正常或突变蛋白对共转染基因表达的影响.结果 MHV NSP1对真核细胞产生干扰素有一定的影响,并可显著抑制IFN-β启动子或ISRE应答元件的活性,且该抑制作用不受LLRKxGxKG序列缺失的影响.同时,MHV NSP1还可强烈抑制多种共转染报告基因的表达.该抑制作用在LLRKxGxKG序列缺失后显著降低.结论 MHV NSP1对Ⅰ型干扰素信号通路有特异的抑制作用.LLRKxGxKG序列是MHV NSP1的一个重要功能域,在抑制共转染基因表达过程中发挥着重要作用.
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应用噬菌体展示技术筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4A结合蛋白
目的筛选丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS4A结合蛋白,为HCV致病机制的研究探索新的途径.方法应用噬菌体展示技术,以HCV非结构蛋白NS4A作为固相筛选分子,对T7噬菌体人肝细胞cDNA文库进行5轮"吸附-洗脱-扩增"的筛选过程,经噬斑的PCR扩增后,构建克隆载体,后对所筛选克隆进行DNA序列测定和同源性分析.结果噬菌体经富集后,从随机挑选的12个克隆中得到2个阳性克隆,成功构建了克隆载体.序列测定后经过序列同源性分析,确定了与HCV非结构蛋白NS4A结合的是肝细胞蛋白-丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)激活蛋白激酶5(MAPKAPK5).结论用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到了HCV非结构蛋白NS4A的结合蛋白,为进一步研究HCV的致病机制奠定了良好的基础.
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丙型肝炎病毒非结构蛋白5B结合蛋白的酵母双杂交筛选研究
目前认为丙型肝炎病毒(HCV)的非结构蛋白5B(NS5B)是病毒复制酶,但是对其生物学特性还不十分清楚,我们应用酵母双杂交系统3,构建NS5B诱饵质粒,转化酵母AH109,与含人肝细胞cDNA文库质粒的酵母Y187进行配合,于涂有X-α-gal营养缺陷型培养基(SD/-Trp-Leu-His-Ade)上筛选生长.挑选蓝色克隆,筛选出33个与NS5B特异性相互作用的克隆,其中有31个已知功能基因及2个未知功能基因.所克隆到的基因对以后研究NS5B的功能有一定的提示作用,并为研究这些能与NS5B相互作用的基因在肝细胞中的生理功能奠定了基础.
