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细小病毒非结构蛋白诱导细胞凋亡研究进展
迄今,据新报道可感染哺乳动物和禽类的细小病毒有17余种.被感染细胞常出现不同程度的凋亡和坏死,呈现典型以细胞折光性增强、圆缩直至溶解脱落等为特征的细胞病变.NS1蛋白是细小病毒主要的非结构蛋白,其结构和功能保守,在病毒生命周期与感染宿主中扮演重要角色.它不仅影响病毒复制,还参与诱导宿主细胞凋亡.细小病毒NS1蛋白主要经由线粒体途径诱导被感染宿主细胞发生凋亡,本文全面归纳与总结细小病毒NS1蛋白诱导细胞凋亡的分子机制的新研究进展.
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表达2型登革病毒NS1重组麻疹病毒的拯救及鉴定
以麻疹病毒沪-191疫苗株(MVs191)为载体构建表达2型登革病毒非结构蛋白NS1 (DENV2 NS1)的重组麻疹病毒.将编码DENV2 NS1 6×His蛋白的核酸序列用BsiWI和BssHII酶切位点插入至载体pT7-MVF23ATU上,然后构建载体pT7F123 DENV2 NS1 6×His,后构建获得插入了外源基因DENV2 NS1 6×His的载体pT7MVs191-DENV2 NS1 6×His.质粒pT7MVs191-DENV2 NS1 6×His与表达麻疹病毒N、P、L蛋白的辅助质粒共转染BSRT7细胞完成病毒包装后,在Vero细胞内增殖,完成重组病毒的拯救.重组病毒在Vero细胞上传至第4代,基因测序证明重组病毒中成功插入了外源基因DENV2 NS1 6×His;Western Blot、原位免疫荧光反应可检测到重组病毒中麻疹病毒N蛋白及外源抗原DENV2 NS1 6×His的表达;重组病毒增值特性与疫苗株MVs191相似;P1至P4代的重组病毒滴度稳定在6log10 CCID50/mL～6.5log10 CCID50/mL之间;P4代重组病毒免疫家兔,兔抗血清中麻疹病毒中和抗体效价大于1∶160;Western Blot可检测到免疫兔血清中DENV2 NS1的抗体.本文成功构建了以麻疹病毒为载体,表达外源抗原DENV2 NS1的重组病毒,为以麻疹病毒为载体的登革疫苗研发奠定基础.
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细小病毒H-1非结构蛋白NS1在人肝癌细胞内的超显微结构定位
目的研究细小病毒H-1非结构蛋白NS1对体内人肝癌细胞的抑制作用机制方法利用免疫胶体金标记电镜技术,在感染细小病毒H-1后不同时间,观察了病毒非结构蛋白NS1在人肝癌裸小鼠QGY-9204移植瘤模型细胞内的超显微结构定位.结果研究表明,在感染后4 h,H-1病毒的NS1蛋白主要集中在核仁内;感染后12 h,NS1蛋白由核仁内向常染色区转移;感染后24 h,常染色区的NS1蛋白逐渐增多并且向核外扩散;感染后72 h,核内和胞质内NS1蛋白越来越多,与此同时,细胞核圆缩,核仁消失.H-1 NS1蛋白表达在细胞内的定位过程与H-1DNA复制的定位相一致.用原位杂交研究表明,在感染24 h,阳性杂交颗粒仅在少数细胞核内出现,在感染后72 h,核内阳性杂交颗粒增多并向核外扩散.结论 NS1从核仁扩散到细胞质,辅证了NS-1蛋白在病毒生活周期和抑制肿瘤细胞生长中起重要作用.
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甲型H1N1流感病毒非结构蛋白NS1与人CPSF30结合拮抗剂筛选模型的建立及药物筛选
利用酵母双杂交技术研究甲型H1N1流感病毒非结构蛋白NS1和人切割与多聚腺苷酸化特异因子30kDa亚基(CPSF30)的相互作用,构建了一个酵母模型用于筛选NS1和CPSF30相互作用的拮抗剂,从而为筛选抗甲型H1N1流感病毒药物奠定基础.采用连续重叠PCR技术克隆得到H1N1流感病毒NS1基因.提取人HeLa细胞RNA,通过RT-PCR克隆得到人CPSF30基因.将NS1基因克隆到表达载体pGBKT7中获得诱饵载体pGBKNS1,将CPSF30基因克降到载体pGADT7中获得捕获载体pGADCPSF;将pGBKNS1和pGADCPSF共转入酿酒酵母AH109,获得重组酿酒酵母AH109[pGADCPSF+pGBKNS1].利用该模型筛选了30余种中成药,发现双黄连口服液等4种中成药能抑制NS1和CPSF30之间的相互作用.
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呼吸道合胞病毒非结构蛋白1对凋亡调节机制的研究
目的 研究呼吸道合胞病毒(RSV)非结构蛋白(NS)1调节人肺Ⅱ型腺上皮癌细胞(A549)凋亡基因/抗凋亡基因表达的作用机制.方法 构建RSV-NS1表达质粒(pNS1),合成siRNA(siRNA-bcl-2、siRNA-NS1、错配序列),制作其复合物.选用A549细胞,进行质粒转染,获得pNS1 A549细胞、sibcl-2-pNS1 A549细胞、siRNA-pNS1 A549细胞、错配序列A549细胞.进行质粒对凋亡调节实验[pNS1转染组(分2亚组),错配对照组]和抑制基因实验[siNS1干预处理组、RSV感染组、错配对照组].应用Western blot检测pNS1转染A549细胞后0、24、48、72 h Bax及Bcl-2的蛋白表达水平、流式细胞仪测细胞凋亡率;流式细胞仪测NS1沉默后的细胞凋亡率.结果 Bax和Bcl-2在A549细胞均有表达,当pNS1转染A549细胞后,Bax蛋白表达随时间逐渐降低,Bcl-2表达明显上调,组内蛋白表达量差异有统计学意义(P＜0.05).pNS1转染亚1组细胞凋亡率较错配对照组显著下降(P＜0.05).经sibcl-2转染后的细胞,pNS1转染显著上调Bax的蛋白表达,24 h达到高峰,并持续表达72 h;细胞凋亡率显著增加(P＜0.05).RSV感染组在72 h内显著抑制细胞凋亡(P＜0.05),而在siNS1干预处理组,细胞凋亡率虽然均较错配对照组降低,但无统计学意义(P＞0.05).结论 呼吸道合胞病毒NS1通过上调抗凋亡基因bcl-2、下调凋亡基因bax延迟A549细胞凋亡.
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Ⅱ型登革病毒非结构蛋白NS1的克隆表达及抗体制备
目的 克隆表达Ⅱ型登革病毒(dengue virus 2,DV2)非结构蛋白1(DV2-NS1)基因,并制备其单克隆抗体.方法 提取Ⅱ型登革病毒的RNA,扩增其NS1全长基因片段,经TA克隆将NS1基因克隆至pQE30载体中进行诱导表达,表达产物经变性处理后用Ni柱亲和层析纯化并复性,经免疫印迹法(Western Blot)鉴定抗原性.用复性后的NS1蛋白和灭活Ⅱ型登革病毒交替免疫Balb/c小鼠,取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,杂交瘤细胞经间接ELISA法、间接免疫荧光法(IFA)进行单抗亚类、特异性的筛选与鉴定.结果 携带重组质粒pQE30/DV2-NS1的菌株经诱导,可高效表达重组DV2-NS1蛋白,经复性获得可溶性蛋白,Western Blot证实重组的DV2-NS1蛋白具有抗原性;用重组蛋白和病毒混合免疫,共获得10株抗NS1蛋白的单抗,其中3株为特异性抗DV2-NS1蛋白,与其他3型登革病毒无交叉,另7株为混合交叉型;亚类分析一株为IgG2b,余为IgG1.结论 获得重组Ⅱ型登革病毒非结构蛋白NS1,并得到10株抗DV2-NS1蛋白的杂交瘤细胞株,为进一步研究NS1的生物学特性和临床诊断试剂建立奠定了基础.
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A型流感病毒非结构蛋白NS1的研究进展
A型流感病毒引起的疾病主要包括猪流感、禽流感、人类流感等,主要通过飞沫传播,可引起全身肌肉酸痛、疲倦无力、厌食,并可能引发病毒性肺炎[1].高致病性禽流感感染还可能引发严重的并发症,包括广泛的肺水肿、急性呼吸窘迫综合症、以肾和心脏功能失调为代表的多器官功能衰竭[2],病死率极高.
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Ⅱ型登革病毒非结构蛋白NS1血清型特异性单克隆抗体的制备与鉴定
目的 制备并鉴定Ⅱ型登革病毒非结构蛋白NS1(DV2-NS1)的血清型特异性单克隆抗体.方法 以具有良好抗原性的重组DV2-NS1蛋白与灭活的Ⅱ型登革病毒(DV2)混合免疫Ba1b/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,杂交瘤细胞经间接ELISA法、IFA法筛选,ELISA、IFA及Western Blot对mAbs的类型及亚类、交叉实验及特异性等进行鉴定.结果 免疫的Ba1b/c小鼠经多次融合筛选,共获得14株血清型特异性抗DV2-NS1蛋白的mAbs,其亚类测定两株为IgG2b,余均为IgG1.ELISA和免疫印迹显示这些mAbs与重组DV2-NS1蛋白和DV2抗原均特异性结合,IFA结果显示这14株单抗特异结合Ⅱ型登革病毒,与其它3型登革病毒无交叉.结论 成功获得了特异性针对DV2-NS1蛋白的mAb,为进一步研究NS1蛋白的结构和功能以及研制早期诊断试剂奠定基础.
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流感病毒对环氧合酶-2表达的影响及其机制探讨
目的 探讨流感病毒对环氧合酶2(COX-2)表达的影响及其调节机制.方法 流感病毒感染A549细胞,将其非结构蛋白NS1真核表达载体与COX-2基因启动子的报告质粒pCOX-2-Luc共转染A549细胞,测定其荧光素酶活性,采用反转录PCR和Western印迹法检测COX-2 mRNA和蛋白表达的变化.结果 流感病毒上调mRNA和蛋白的表达,其NS1蛋白能显著激活COX-2基因启动子的活性,并上调COX-2 mRNA和蛋白的表达,激活作用呈剂量依赖关系.结论 流感病毒通过其NS1蛋白上调COX-2的表达.
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呼吸道合胞病毒非结构蛋白NS1调节Ⅰ/Ⅱ型细胞因子的表达
目的:研究呼吸道合胞病毒(RSV)非结构蛋白NS1转染人上皮细胞后对Ⅰ/Ⅱ型细胞因子表达的调节效应.方法:在遗传信息不变的条件下,构建稳定的RSV-NS1表达质粒(富含GC),采用Western blotting技术检测质粒NS1在转染A549细胞不同时间段其蛋白的表达,并用ELISA法检测培养上清中干扰素(IFN)-β和白细胞介素(IL)-10的浓度.结果:NS1转染A549细胞1、2、4、8、24 h后,Western blotting法鉴定显示质粒NS1转染细胞1h后即可检测到其蛋白表达.IFN-β在NS1转染细胞8h后浓度逐渐降低(P＜0.05),这一下降趋势持续至24h仍有意义;IL-10在NS1转染细胞4h后浓度开始上调,8h增加到基础值7.8倍,并在8～24h内持续上调(P＜0.05).结论:RSV NS1转染早期即在上皮细胞表达并差异性调节Ⅰ/Ⅱ型细胞因子的表达.
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登革病毒非结构蛋白NS1群特异性单克隆抗体的制备及初步应用
目的 制备登革病毒NS1群特异性单克隆抗体,建立可检测登革病毒1～4型NS1抗原的ELISA检测法,为登革热的早期快速诊断奠定基础.方法 应用毕赤酵母表达系统分泌表达登革病毒2型重组非结构蛋白NS1,以此为抗原免疫BABL/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,经HAT选择培养、间接ELISA筛选和亚克隆,获得能稳定分泌登革病毒NS1群特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株;用所获得的单克隆抗体建立可检测1～4型登革病毒NS1抗原的双抗体夹心ELISA法.结果 从登革病毒2型NS1重组毕赤酵母(Pichia Pastoris-NS1)中获得了大量纯化的登革病毒重组NS1蛋白;经免疫小鼠、细胞融合、间接ELISA筛选及3次亚克隆后,终获得2株能高效分泌抗登革病毒NS1单克隆抗体的杂交瘤细胞株2D7B6B4和2D10E2F6,间接ELISA显示抗体效价高达1∶8 000～1∶16 000;ELISA及免疫荧光检测证实,其所分泌的抗体与1～4型登革病毒及其重组NS1蛋白均有特异性免疫反应,为登革病毒NS1群特异性单克隆抗体;两株单克隆抗体均为IgG2a亚类;初步建立了检测4个血清型登革病毒NS1抗原的双抗体夹心ELISA法.结论 成功研制出两株能高效分泌抗登革病毒NS1群特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株.初步建立了可检测1～4型登革病毒NS1抗原的双抗体夹心ELISA检测法.
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登革2型病毒非结构蛋白NS1的生物信息学分析
目的:分析登革2型病毒非结构蛋白NS1的结构和功能特征并预测其优势抗原表位.方法:利用NCBI、CBS等生物信息学网站和DNAStar、Vector NTI等软件包,分析登革2型病毒NS1的理化性质和结构与功能特征,及可能的空间结构和抗原表位.结果:NS1基因编码352个氨基酸,含12个保守的半胱氨酸.脂质含量相对较多,理化性质不稳定.无分泌型信号肽及跨膜结构,但存在多个糖基化、磷酸化、酰胺化位点.空间结构为一紧凑球形,N端和C端暴露于球体表面,线性B细胞抗原表位的区域较为密集.中段包埋于分子内部,但含有一些与血小板、血管内皮或纤维蛋白素原高度同源的B细胞表位序列,可能在登革出血热的病理过程中发挥重要作用.结论:NS1不仅是一个极具潜力的诊断性抗原,其抗原表位的预测将为登革病毒表位多肽疫苗的开发提供依据.
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H5N1流感病毒NS1蛋白D92E变异趋势的分析
目的 分析H5N1流感病毒NS1蛋白D92E的变异趋势,为研究禽流感病毒的致病性及其逃避宿主免疫应答提供科学依据.方法 利用美国国立生物技术信息中心(NCBI)的流感数据库,搜索2000年以前以及2000年以后世界各地流行的A/ human/ H5N1、A/ avian/H5N1、A/swine/H5N1流感病毒的相关信息,然后进行NS1蛋白序列比对,分析其变异趋势.结果 2000年以前H5N1流感病毒NS1蛋白第92位大部分是谷氨酸,而2000年以后H5N1流感病毒的NS1蛋白第92位大部分是天冬氨酸.结论 H5N1流感病毒的NS1蛋白第92位天冬氨酸的存在有可能增强了病毒的抵抗力和毒力.
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西尼罗病毒NS1蛋白的原核表达及其免疫原性研究
[目的]采用大肠杆菌表达系统表达西尼罗病毒NS1蛋白,并对表达产物进行免疫原性分析.[方法]将 WNV NS1 基因克隆入pET30a载体,获得重组表达质粒pE130a - WNV - NS1,并转化入BL21感受态细胞,将表达产物进行 SDS - PAGE 和 Western - blot 分析,经 Ni+ 亲和层析纯化、阴离子交换层析后获得纯化的WNV NS1蛋白;将纯化产物免疫新西兰兔,获得的免疫血清作 ELISA 检测.将重组蛋白包板,检测 FOCUS 公司商品化试剂盒中的阳性血清.[结果](1) 重组 WNV NS1 蛋白获得表达并纯化成功.(2)Westem blot 结果显示表达的蛋白是带有His 标签的目的蛋白.(3)兔免疫血清的间接ELISA结果显示血清效价达到1:50000以上.(4)检测商品化试剂盒中的阳性血清,其OD450吸光值与阴性血清吸光值之比大于2.[结论]重组 NS1 蛋白能在大肠杆菌系统中获得表达;纯化产物具有免疫原性,而且可以作为抗原检测西尼罗病毒感染的血清,为进一步研究 NS1 蛋白的生物学特性及西尼罗病毒的诊断试剂奠定了基础.
