首页 > 文献资料
-
猴/人免疫缺陷嵌合病毒(SHIV)的研究进展
SHIV是在SIV其因组框架的基础上利用基因重组技术以HIV部分基因片段来取代SIV相应基因而构建的一种重组病毒.SHIV与亲本株病毒有相似的生物学特性,能在CD4+细胞、PBMCs、巨噬细胞中复制,并能引起猴发生AIDS症状.另外SHIV能诱使机体产生中和抗体,可以作为侯选疫苗株,在AIDS预防中有广阔的前景.
-
脊髓灰质炎Ⅰ型重组病毒病例的流行病学研究
1989～1991年在河北省发生了脊髓灰质炎Ⅰ型自然重组株病毒的流行(为脊髓灰质炎野病毒和疫苗病毒的基因重组),对重组病毒麻痹病例进行了调查,已发现的病例分布在河北省的六个市地,占省辖市地数的50%,病例全部为4岁以下农村儿童,发病时间以四月为高峰,85%病例为没有接种或没有全程接种脊髓灰质炎疫苗,病例的临床症状主要是发热、腹泄、肢体麻痹,严重病例可发生呼吸困难.但有半数病例在60天肢体麻痹恢复.
-
禽流感H9N2亚型的进化促使新型H7N9病毒的产生
中国人感染H7N9亚型流感病毒引起了广泛的关注。研究表明，鸡源H9N2亚型禽流感病毒为该新型重组病毒提供了内部基因。然而，鸡源H9N2亚型禽流感病毒的流行和进化是如何促进新型禽流感H7N9出现的机制尚不清楚，中国农业大学刘金华教授团队对该机制进行了研究，研究表明在过去长达10多年中，多种H9N2基因型共同存在，G57基因型出现并随着抗体特性变化更加适应鸡宿主。在2010—2013年期间，也就是新型禽流感病毒H7N9出现前期，G57基因型成为免疫鸡农场的主要基因型，并引起了鸡场禽流感的广泛爆发，终为新型禽流感H7N9提供了内部基因。禽农场中H9N2病毒的流行和变化监测可以为可能造成流感大流行的新型禽流感病毒出现提供重要的早期预警。
-
表达NDV-F基因重组马立克病病毒的构建及其在鸡体内外的复制
以敲除meq基因的MDV-Ⅰ型弱毒GX0101△meq为载体构建一株表达外源基因NDV-F的重组病毒.将外源基因NDV F的ORF插入到真核表达载体pcDNA3.1(-)中,扩增含有CMV启动子的NDV-F表达盒,同时扩增筛选基因Kan+表达盒,将他们插入到载体PMD18-T中.用含有MDV-US2区50 bp同源臂的引物扩增串联表达盒,将产物电转进含有GX0101△meq的EL250宿主菌中,1％阿拉伯糖诱导掉阳性重组病毒基因组中的Kan+表达盒.挑选敲除Kan+表达盒的阳性克隆提取质粒,转染CEF细胞拯救重组病毒.将重组病毒腹腔注射鸡体,观察其在鸡体内的生长复制.成功拯救插入外源基因NDV-F的重组马立克病病毒rMDV-F,重组病毒在CEF细胞内能很好的复制表达且其在鸡体内也能很好的生长复制.以GX0101△meq为载体,结合Red E/T和FLP/FRT重组系统成功构建了表达外源基因NDV-F的重组病毒,为我们重组病毒的研究奠定了基础.
关键词： 马立克病病毒 GX0101△meq NDV-F 重组病毒 -
表达H120 S基因膜外区段的重组鸡传染性支气管炎病毒的拯救
为探索以鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV) Beaudette毒株为骨架表达H120纤突蛋白膜外区的可行性,本研究利用RT-PCR技术,扩增得到H120纤突基因膜外区段(1 302bp),将其置换到IBV Beaudette株全长cDNA克隆相应区段,构建了含有上述区段的重组IBV cDNA克隆BeauR-H120 (S1).然后直接将BeauR-H120(S1)作为DNA模板在体外转录出病毒基因组RNA,该转录产物电转入Vero细胞后48h收获细胞继续传代,直至第4代时出现合胞体,拯救获得一株重组IBV(rBeau-H 120(S1)).通过RT-PCR方法证明rBeau-H120(S1)基因组中包含有完整的H120纤突基因膜外区段.Western-blot试验证实rBeau-H120 (S1)的N蛋白有表达,表明重组病毒在Vero细胞内进行了增殖.经连续传代后测定rBeau-H120 (S1)的TCID50和EID50,结果显示,该重组病毒在Vero细胞中的滴度可达到105.90±0.22TCID50/mL,在9日龄SPF鸡胚中生长滴度为106.13±0.23EID50/mL.免疫保护实验表明,在接种重组病毒21d时,鸡群抗体阳性率达到90％,使用强毒株M41(103 EID50/只)攻毒时免疫保护率为85％.本研究采用反向遗传操作技术构建的重组IBV,为进一步研制IBV重组基因工程疫苗奠定了基础.
-
XJ-160病毒单方向血清学反应分子基础研究
本研究通过基因替换和重组等技术构建重组病毒解释XJ-160病毒单方向血清学反应的分子基础.以实验室构建的XJ-160病毒全感染性克隆为基础获得XJ-160病毒和辛德毕斯病毒(SINV)糖蛋白基因单独和同时相互替换的重组病毒.首先研究重组病毒对细胞及动物感染性和致病性,同时利用微量细胞中和试验方法鉴定引起XJ-160病毒单方向血清学反应的基因区段.研究结果显示XJ-160病毒E2糖蛋白是影响病毒在细胞中的生长速率,空斑形态及对乳鼠致病性的主要因素.中和试验结果显示SIN病毒E2糖蛋白对决定引起XJ-160病毒单方向血清学反应起着重要作用.本研究确定了引起XJ-160病毒单方向血清学反应的基因区段,并为进一步研究XJ-160病毒基因组结构与功能打下了基础.
-
山东省1例脊髓灰质炎疫苗高变异株病例的变异分析
为了解山东省2011年分离的1株脊髓灰质炎(脊灰)疫苗高变异株的基因特征,并对该病例接触者标本进行病原学鉴定及分析.本研究对采集的2份病例及40份接触者粪便标本进行病毒分离,对脊灰病毒进行全基因组序列测定和分析,对非脊灰肠道病毒进行VP1区序列测定,并将分离率较高的柯萨奇病毒(Coxsackievirus,CV) B1和CV-B3与国内外其他地区分离株进行VP1区同源性及系统进化树分析.其中病例标本中分离到1株脊灰病毒(P1/11186),1株CV-A4和1株CV-A8;接触者标本中分离到1株CV-A2、10株CV-B1、5株CV-B3和埃可病毒(Echovirus,E)3型、12型、14型各1株,提示当地可能存在肠道病毒流行,应加强监测.P1/11186为Ⅰ型脊灰疫苗病毒,在2A及3A区分别与Ⅱ型和Ⅲ型脊灰病毒发生重组,与相应的疫苗株相比全基因组共有25个核苷酸、9个氨基酸发生变异,其中VP1区8个核苷酸、5个氨基酸发生突变.CV-B1和CV-B3的同源性分析显示10株CV-B1之间核苷酸同源性为97.0％～100％,氨基酸同源性为98.9％～100％;5株CV-B3之间核苷酸与氨基酸同源性分别为92.6％～100％与99.2％～100％.CV-B1与CV-B3 VP1完整编码区进化树分析显示,山东分离株与国内其他省份分离株亲缘关系较近,位于同一基因簇,与世界其他地区分离株位于不同分支.
-
表达猪细小病毒VP2蛋白的重组猪伪狂犬病毒在小鼠体内的免疫反应
为了研制出能够同时预防猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)和猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)的二联活疫苗,本研究将PPV VP2基因克隆到伪狂犬病毒通用转移质粒pG中,构建重组伪狂犬转移质粒pGVP2.利用脂质体转染法将重组质粒pGVP2和PRV HB98弱毒株DNA共转染至猪睾丸(ST)细胞,使其在ST细胞内发生同源重组,经5次绿色荧光空斑纯化重组病毒rPRV-VP2.分别用重组病毒rPRV-VP2、亲本PRVHB98弱毒株、商品化PPV灭活苗和DMEM细胞培养液免疫6周龄雌性昆明小鼠,2周后进行二免.一免后第7周用PRV强毒NY株对小鼠进行攻毒.结果获得表达VP2基因的重组病毒rPRV-VP2,经ELISA试验、血清中和试验(SN)、血凝抑制试验(HI)和流式细胞检测发现,重组病毒rPRV-VP2株可有效刺激小鼠机体产生抗PPV和PRV抗体,同时具有增强小鼠机体细胞免疫反应的能力,且对PRV强毒攻击具有保护作用.结果表明,重组病毒rPRV-VP2可作为同时预防PPV和PRV感染的重组疫苗候选株.
-
表达猪圆环病毒2型ORF2基因的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建与鉴定
猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)和猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是目前危害世界养猪业的两种重要病原.本研究采用PCR方法构建PRRSV疫苗株TJM-F92全长cDNA克隆载体pCMV-TJM,并在其ORF7和3'UTR之间插入AflⅡ/MluⅠ酶切位点和转录调控序列TRS6,构建获得pCMV-TJ M-TRS表达载体.将PCV2ORF2基因插入该载体AflⅡ/MluⅠ位点,获得重组质粒pCMV-TJM-Cap.将pCMV-TJM、pCMV-TJM-TRS和pCMV-TJ M-Cap分别转染Marc-145细胞,拯救获得3种重组病毒rTJM、rTJM/TRS和rTJM/Cap.基因测序列、酶切鉴定、Western blot、间接免疫荧光和病毒生长特性结果显示,3种重组PRRSV病毒都含有特征性分子标记,在Marc-145细胞增殖特性与亲本病毒相似;rTJM/Cap传至第8代,仍含有外源Cap基因,病毒感染细胞能有效表达PCV2 Cap蛋白,从而为PRRSV致病机制和PRRSV-PCV2疫苗研究奠定了重要基础.
关键词： 猪繁殖与呼吸综合征病毒 猪圆环病毒2型 反向遗传 重组病毒 -
表达绿色荧光蛋白的重组鸡传染性支气管炎病毒的构建
为探讨鸡传染性支气管炎病毒(IBV)作为载体表达外源基因的可行性,本研究根据IBV H120疫苗株的全基因组序列设计引物,采用RT-PCR方法分10个片段对其基因组进行扩增.并克隆至pMD19-T载体中;同时构建IBV基因组5a基因编码区被增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因替换的重组质粒.采用体外拼接策略,将Bsa Ⅰ酶切处理的10个基因片段顺序连接,构建5a基因编码区被EGFP基因替换的基因组全长cDNA,其5'端具有完整的T7 RNA聚合酶启动子核心序列,3'端具有polyA尾巴结构.然后通过T7 RNA聚合酶体外转录系统合成病毒基因组RNA.脂质体转染BHK-21细胞进行病毒拯救.结果表明成功的从基因组全长cDNA拯救出重组病毒H120-5a/EGFP株,其在鸡胚中能有效的复制和传代,并表达绿色荧光蛋白;5a基因的缺失并不影响病毒对鸡胚的致病性.本研究为进一步开展IBV的分子致病机理、载体疫苗等研究奠定了基础.
-
表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5的重组伪狂犬病毒TK-/gG-/GP5+的构建及其生物学特性初步探讨
以伪狂犬病毒基因缺失标志疫苗株TK/gG-/LacZ+为亲本株,通过同源重组,构建了表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)主要免疫原性蛋白GP5的重组伪狂犬病毒TK/gG-/GP5+.经PCR、Southern杂交、Western blot证实构建正确,并能表达GP5.同时,对重组病毒在PK-15细胞中的增殖特性进行了检测,结果与亲本株相比,增殖滴度无显著性差异.将重组病毒免疫BALB/c小鼠,2次免疫后4周,50%(3/6)小鼠产生了低水平的GP5特异性ELISA抗体,但中和抗体均小于1:4.
关键词： 伪狂犬病毒 猪繁殖与呼吸综合征 重组病毒 TK-/gG-/GP5+ -
表达2型登革病毒NS1重组麻疹病毒的拯救及鉴定
以麻疹病毒沪-191疫苗株(MVs191)为载体构建表达2型登革病毒非结构蛋白NS1 (DENV2 NS1)的重组麻疹病毒.将编码DENV2 NS1 6×His蛋白的核酸序列用BsiWI和BssHII酶切位点插入至载体pT7-MVF23ATU上,然后构建载体pT7F123 DENV2 NS1 6×His,后构建获得插入了外源基因DENV2 NS1 6×His的载体pT7MVs191-DENV2 NS1 6×His.质粒pT7MVs191-DENV2 NS1 6×His与表达麻疹病毒N、P、L蛋白的辅助质粒共转染BSRT7细胞完成病毒包装后,在Vero细胞内增殖,完成重组病毒的拯救.重组病毒在Vero细胞上传至第4代,基因测序证明重组病毒中成功插入了外源基因DENV2 NS1 6×His;Western Blot、原位免疫荧光反应可检测到重组病毒中麻疹病毒N蛋白及外源抗原DENV2 NS1 6×His的表达;重组病毒增值特性与疫苗株MVs191相似;P1至P4代的重组病毒滴度稳定在6log10 CCID50/mL～6.5log10 CCID50/mL之间;P4代重组病毒免疫家兔,兔抗血清中麻疹病毒中和抗体效价大于1∶160;Western Blot可检测到免疫兔血清中DENV2 NS1的抗体.本文成功构建了以麻疹病毒为载体,表达外源抗原DENV2 NS1的重组病毒,为以麻疹病毒为载体的登革疫苗研发奠定基础.
-
狂犬病毒CVS-N2c毒株糖蛋白基因的克隆和重组腺病毒的构建
克隆了狂犬病毒CVS-N2c毒株糖蛋白(GP)基因,并进行了GP全基因序列测定和对比分析.结果显示CVS-N2c GP基因编码区长1575bp,编码524个氨基酸,与国内外发表的狂犬病毒疫苗株3aG株、ERA株、和HEP-Flury株GP基因的核酸序列同源性分别为89.0%,89.3%,94.5%,而推导的氨基酸序列同源性分别为87.6%、88.4%、和91.2%.在此基础上,用pAdEasy载体系统构建了表达GP基因的重组腺病毒.电镜下确定重组病毒颗粒的直径约70nm,Western blot 显示重组病毒表达的GP 蛋白可被兔抗狂犬病毒血清识别,表达的GP 蛋白分子量约为66kD,与天然的狂犬病毒GP的分子量相符.该表达CVS-N2c毒株GP基因的重组腺病毒是筛选有效狂犬病毒基因工程疫苗的基础.
关键词： 狂犬病毒CVS-N2c毒株 糖蛋白基因 克隆 重组病毒 -
病毒预防靠病毒
异源基因转导细胞的重组病毒运载技术在各种基础与应用研究中已有几十年的历程.Darnell和同事利用重组腺病毒研究白蛋白启动子转录调控,属于早期应用实例之一[1].随着小鼠复制缺陷性反转录病毒问世,基因治疗的实验室研究进入了飞跃时期[2].该领域的研究热点为寻找各种DNA/RNA病毒载体或非病毒性载体[3-5].不久前,载体技术的思路已被引入基因疫苗的开发工作[6-10],这正是本系列综述所要涉及的主题.
-
pVR-IL15基因佐剂对表达HBsAg重组病毒免疫效果的影响
目的 探索pVR-IL15基因佐剂在表达HBsAg病毒治疗型疫苗的不同免疫策略中对免疫应答的影响.方法 采用了携带乙肝病毒S基因片段的DNA、重组Ankara痘病毒和重组腺病毒序贯免疫策略免疫BALB/c小鼠,在序贯免疫策略的基础上联合pVR-IL15免疫.用ELISA和IFN-γELISPOT方法检测不同免疫组别中小鼠的细胞免疫和体液免疫反应强度.结果 联合pVR-IL15免疫组的体液免疫应答水平和细胞免疫应答水平均显著高于无联合pVR-IL15免疫组,差异具有统计学意义.结论 pVR-IL15基因佐剂能够增强表达HBsAg重组病毒诱导的小鼠免疫应答.
-
肠道病毒71型3'非编码区序列分析及重组病毒的构建
目的 对EV-A71的3'UTR核苷酸序列进行分析,并利用反向遗传学技术构建3'UTR置换的重组病毒,为研究3'UTR功能及其对毒力的影响奠定基础.方法 提取分离病毒的RNA,对3'UTR核苷酸序列进行测定并分析.以SDLY107株全长感染性克隆为骨架,将SDLY1株的3'UTR替换到其相应部分,拯救重组病毒并鉴定.结果 序列分析表明,9个EV-A71临床分离株的3'UTR核苷酸同源性为94％～100％,个别位点突变可能影响病毒的致病性.经PCR测序鉴定重组病毒的3'UTR成功替换,转染后出现典型的致细胞病变效应,可稳定传代并具有感染性.结论 EV-A71 3'UTR可能与致病性有关.成功拯救重组EV-A71 SDLY107(1-3'UTR)株,为进一步研究3'UTR对其毒力的影响提供了基础.
-
基于狂犬病病毒载体的基因工程疫苗研究进展
对HIV-1和HCV等重大传染性疾病传统疫苗研制的失败,让科学家们把目光转向开发新型疫苗研制策略.其中之一就是用减毒的重组病毒载体表达外源抗原来免疫,可以保护个体免受相应病原体的暴露威胁.一种新的手段就是从cDNA克隆拯救单股负链RNA病毒,这一技术为弹状病毒科成员用于疫苗载体和生物医学工具打开了一扇窗.
-
重组结核抗原痘苗病毒免疫次数和免疫途径对免疫原性的影响
卡介苗(BCG)是目前用于预防结核病的惟一疫苗,但其对成年人结核病的预防效果不理想.本研究前期工作已构建了5种不同类型的表达结核杆菌特异抗原的重组痘苗病毒,其免疫小鼠2次后均可激发针对结核杆菌抗原的特异性细胞免疫.然而,重组安卡拉痘苗病毒(MVA)是一活的病毒载体[1],此重组病毒是否能多次免疫动物以及多次免疫动物后能否产生更有效的免疫反应尚不清楚.
-
建立产生gfp报道基因重组EB病毒细胞株
目的建立产生带有gfp报道基因的重组EB病毒株. 方法构建一个有EBV DNA BamHⅠ的C和H片段、gfp报道基因和puromycin选择基因的真核细胞穿梭质粒(pGFPUROEB);采用电穿孔法将其转染于B95-8细胞中,并用荧光显微镜和流式细胞仪检测gfp的表达,PCR及Southern blot检测重组gfp EB病毒基因. 结果经puromycin的长期筛选,建立80%以上表达gfp的B95-8细胞株(称gfpB95-8),PCR检测有gfp基因;经Southern blot检测证实gfpB95-8可产生重组gfp的EB病毒. 结论构建了gfp报道基因和puromycin选择基因的真核细胞穿梭质粒;并成功建立产生带有gfp报道基因的重组EB病毒株.
-
人 IFN-λ1重组腺病毒对胃癌细胞增殖的影响及其机制研究
目的探讨Ad-hIFN-λ1重组腺病毒对胃腺癌细胞SGC-7901增殖的影响及其机制。方法分别用Ad-hIFN-λ1重组腺病毒、Ad-LacZ 空质粒及PBS对照组作用于人胃腺癌细胞SGC-7901，MTT法测定细胞增殖情况，RT-PCR检测胃癌SGC-7901中IFN-λ1 mRNA的表达，免疫荧光法检测hIFN-λ1蛋白的表达，Tunel、流式细胞术检测细胞凋亡。结果 Ad-hIFN-λ1转染胃腺癌细胞SGC-7901后，肿瘤细胞生长明显抑制，细胞中hIFN-λ1 mRNA、蛋白高效表达，细胞凋亡率明显高于Ad-LacZ组、PBS空白对照组。结论 Ad-hIFN-λ1重组腺病毒转染至胃腺癌细胞SGC-7901后表达IFN-λ1，Ad-hIFN-λ1能够显著抑制人胃腺癌SGC-7901细胞生长，并可能通过诱导其凋亡而起作用。
