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柯萨奇B组病毒致病的分子生物学机制
本文对柯萨奇B组病毒(CVB)致病性与抗原性的近期研究内容进行了复习.CVB的每个血清型存在多种毒株,病毒基因组编码区与非编码区核苷酸决定CVB的致病力.心肌球蛋白的氨基酸序列与疾病的发生有关联.T细胞基因在CVB致病及CVB蛋白2PC在CVB性自身免疫反应中均有重要地位.
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丙型肝炎病毒基因编码的蛋白及其功能
丙型肝炎病毒(HCV)基因组是一单股正链RNA,全长9 600个碱基对(bp),含有一个大的开放读码框架(ORF),编码约3 010个氨基酸的病毒前体蛋白,HCV基因组5'端(5'UTR)和3'端(3'UTR)为非翻译区,或称非编码区(UCR),前者位于ORF上游;后者位于下游,含有poly A或ply U尾巴.
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1-03 塞替派诱发人支气管上皮细胞恶性转化的基因突变
目的了解药物致癌过程中的基因突变情况.方法利用以塞替派为致癌原诱导永生化人支管上皮细胞(BEAS-2B)发生恶性转化建立的癌前转化细胞(BEAS-TE)以及从软琼脂上筛选到了克隆化多倍体细胞,沿转化细胞代龄进行了转化进程中p53、p16和Ki-ras基因突变情况的动态观察.结果 p53、Ki-ras基因存在多位点、p16基因单位点的的碱基突变.结论 p53和Ki-ras基因的多位点突变是塞替派诱导细胞转化过程中发生的重要分子事件,p16基因非编码区单个碱基的缺失是细胞转化过程中的次要分子事件.
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不同引物对扩增SEN病毒的实验研究
为了解国内SENV的感染状况,根据SENV的5'非编码区和编码区ORF1的保守序列设计引物,采用巢式聚合酶链反应(nPCR)检测SENV,对PCR产物进行序列分析.
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乙型脑炎病毒表达载体的研究
用RT-PCR方法分段扩增了乙型脑炎病毒SA14-14-2疫苗株5'、3'NCR,利用融合PCR技术在5'、3'NCR之间引入BamHⅠ酶切位点,将5'NCR置于T7启动子控制之下,构建乙脑病毒微复制子表达载体pMR.分别将绿色荧光蛋白(GFP)和汉滩病毒核蛋白编码区基因插入到pMR中,构建两种表达外源基因的乙脑病毒微复制子表达载体:pMR-GFP和pMR-84FliS.经荧光显微镜直接观察、Western blot、ELISA等方法检测,证实外源基因能够在辅助病毒SA14-14-2感染的BHK-21细胞中表达.
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HCV LNAzyme对病毒5'非编码区基因调控的特异性抑制作用
目的 探讨针对丙肝病毒5 '非编码区内源性核糖体进入位点的锁核酸核酶(LNAzyme)对病毒基因复制与表达的特异性抑制作用.方法 设计合成能切割HCV-5'-NCR-IRES位点的DNAzyme、硫代DNAzyme和LNAzyme.实验设对照组和实验组.对照组包括空白对照组、脂质体对照组和无关LNAzyme对照组.实验组包括DNAzyme、硫代DNAzyme组和LNAzyme组.以阳离子脂质体介导转染hepG2.9706细胞,用荧光定量PCR和化学发光技术分别监测24、48和96 h细胞培养上清液中HCV RNA含量及荧光素酶基因表达;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法监测细胞活性.结果 加入核酶后,LNAzyme对HCV RNA复制和荧光素酶基因表达的抑制作用强(P<0.05),平均抑制率分别为48.02%和53.05%,且随用药时间延长,抑制率呈增高趋势,96 h后,平均抑制率分别为81.21%和84.25%.LNAzyme对细胞活性无影响.结论 LNAzyme能特异性抑制丙型肝炎病毒5 '非编码区的基因调控,且优于硫代修饰的DNAzyme.
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LNAzyme特异性阻断丙肝病毒5'-NCR/C基因表达
目的 探讨针对HCV 5'-NCR/C双靶基因位点的锁核酸核酶对病毒基因复制与表达的特异性抑制作用.方法 实验分对照组和实验组.对照组分别为空白对照组和脂质体对照组.实验组分别为单靶区NCR组、单靶区C组和双靶区NCR/C组.半乳糖配体介导转染HepG2.9706细胞,用荧光定量PCR检测细胞培养液中HCV mRNA表达;化学发光技术检测细胞培养液中荧光素酶基因表达;荧光显微镜系统检测细胞内荧光蛋白表达;四甲基偶氮唑蓝法检测细胞代谢.应用SPSS 19.0统计学软件分析.各组间比较采用重复测量方差分析的SNK检验和Kruskal Wallis H检验.结果 加入锁核酸核酶后,对HCV RNA的复制均显示有较强的抑制作用(F=77.50,P<0.05),单靶区NCR组、单靶区C组和双靶区NCR/C组的平均抑制率分别为62.12%、61.39%和75.37%;对荧光素酶的表达有抑制作用(F =48.65,P<0.05),平均抑制率分别为66.49%、65.06%和73.30%.给药后24、48和96 h,HCV mRNA的平均抑制率分别为52.36%、66.81%和75.05%;荧光素酶的平均抑制率分别为53.02%、62.98%和79.45%;细胞内的荧光蛋白表达阳性细胞数均较对照组明显减少(P<0.05).结论 针对5'-NCR/C基因位点的LNAzyme能特异性抑制丙型肝炎病毒的复制与表达,且双基因靶位优于单基因靶位.
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肠道病毒71型3'非编码区序列分析及重组病毒的构建
目的 对EV-A71的3'UTR核苷酸序列进行分析,并利用反向遗传学技术构建3'UTR置换的重组病毒,为研究3'UTR功能及其对毒力的影响奠定基础.方法 提取分离病毒的RNA,对3'UTR核苷酸序列进行测定并分析.以SDLY107株全长感染性克隆为骨架,将SDLY1株的3'UTR替换到其相应部分,拯救重组病毒并鉴定.结果 序列分析表明,9个EV-A71临床分离株的3'UTR核苷酸同源性为94%~100%,个别位点突变可能影响病毒的致病性.经PCR测序鉴定重组病毒的3'UTR成功替换,转染后出现典型的致细胞病变效应,可稳定传代并具有感染性.结论 EV-A71 3'UTR可能与致病性有关.成功拯救重组EV-A71 SDLY107(1-3'UTR)株,为进一步研究3'UTR对其毒力的影响提供了基础.
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中国甲型肝炎病毒龙甲株全基因序列的cDNA克隆及序列分析
甲型肝炎是我国主要传染病之一,经粪-口途径传播.甲型肝炎病毒(HAV)在组织培养中生长缓慢,滴度低,限制了甲型肝炎疫苗及诊断试剂的生产.因此有必要克隆我国自己的HAV基因,为体外表达HAV抗原打下基础.HAV属小RNA病毒科肝病毒属,为无包膜的单链RNA病毒,含有长约7.5 kb的正链RNA,5′端有长的非编码区,3′端有polyA的尾巴.基因组含有一个长的开放读码框架,编码2 227个氨基酸的大蛋白.基因排列顺序为:5′-NCR-VP4-VP2-VP3-VP1-2A-2B-2C-3A-3B-3C-3D-3′NCR,其中VP4至VP1为结构蛋白区又称P1区,2A至3D为非结构蛋白区,又称P2(2A-2C),P3(3A-3D)区.HAV只有一个血清型,结构蛋白抗原具有构型依赖性,抗原序列相对保守.其中5′NCR、2B、2C、3A及3′NCR区对细胞培养株的适应性有关,3C为蛋白酶区,几乎切割多蛋白的所有位点,3D为RNA聚合酶区[1].我们对我国HAV龙甲株全序列的cDNA克隆及序列进行了分析,并与HM175株[2]和MBB株[3]以及已发表的甲肝病毒龙甲株结构区基因[4]进行了比较.
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深圳地区小儿肠道病毒感染的核酸检测分析
为了解深圳地区肠道病毒(EV)的感染流行情况和病毒分型特征,我们采用检测EV的套式逆转录聚合酶链反应(RT-nPCR)方法进行EV感染检测,并对临床分离株5′端非编码区(5′UTR)基因序列进行分子进化树分析.
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戊型肝炎病毒摩洛哥株非编码区基因序列鉴定及基因型分型
目的检测戊型肝炎病毒(HEV)摩洛哥株非编码区(UTR)序列,探讨HEV非编码区序列能否作为其基因型分型的依据. 方法使用基于RNA连接酶的cDNA末端快速扩增法(RLM-RACE)扩增HEV摩洛哥株5′和3′端片段并测序.所得序列使用LASERGENE和PHYLIP软件包与其他29株HEV序列比较. 结果只有基于甲基化帽子结构的RLM-RACE扩增出了5′端片段.HEV摩洛哥株5′端UTR有26个核苷酸,3′端polyA之前有65个核苷酸.基于3′端UTR序列的进化树与基于全基因序列的进化树不全相同.HEV 3′端至少需要100个左右核苷酸长的序列才可进行HEV基因型分型. 结论 HEV摩洛哥株5′端有甲基化帽子结构.HEV 3′端UTR序列不能完全代替全基因组序列进行基因型分型.部分序列替代全基因组进行基因型分型时需要考虑其部位和长度因素.
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HCV山东株C区的基因序列分析
丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)为RNA病毒,其基因组的变异性较大,不同地理区域分离株的基因组结构有较大差异,根据病毒编码区和非编码区核苷酸序列的不同可把病毒分为不同的基因型.对HCV基因型的研究国内外均有报道.本研究采用C区基因的核苷酸序列作为HCV基因分型的依据,对山东省HCV地方株的C区进行了序列测定及分析,以摸清山东省HCV地方株的基因型.
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乌鲁木齐市部分高危人群庚型肝炎病毒感染现状及5′ UTR区基因序列分析
新疆地处我国西部边陲,存在着各型肝炎散发流行的危险因素,庚型肝炎病毒在乌鲁木齐市的流行现状尚未见报道.在新疆医科大学第一附院收集了267份各类人群的血清,用酶标法检测血清中庚型肝炎病毒抗体(抗-HGV),再以庚型肝炎病毒NS3区为引物运用RT-PCR法对抗-HGV(阳性)血清进行庚型肝炎病毒核酸(HGV RNA)的扩增检测,阳性扩增产物为83bp.后,选择该病毒5′非编码区为引物对第一次RT-PCR扩增HGV RNA(阳性)血清,再次进行
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HGV RNA逆转录套式聚合酶链反应法的优选实验
1995年,美国Simons等和Linnen等分别从肝炎患者的血清中克隆出庚型肝炎病毒(GBV-C/HGV)的基因组,并建立了检测血清GBV-C/HGV RNA的逆转录套式聚合酶链反应(RT-nPCR)方法.但是,该检测方法的灵敏度存在着较大差异.本实验使用A~E共5套PCR引物,基中A、B、D为自行设计的HGV 5′端非编码区引物,目的产物长度分别为368bp, 158bp及220bp;C引物为参照文献设计的核心区引物,目的产物为302bp;E引物为李倬副研究员设计的NS3区引物,目的产物长度为591bp.采用改良的异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取HGV RNA,套式逆转录聚合酶链反应(RT-nPCR).
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戊型肝炎病毒 ORF1研究进展
戊型肝炎病毒(hepatitus E virus,HEV)是急性病毒性戊型肝炎的病原体[1],近年来研究发现免疫力低下或器官移植患者感染 HEV 后形成 HEV 的持续性感染,发展成为慢性戊型肝炎[2]。公认的 HEV包括4个基因型,其中基因1、2型只感染人,而基因3、4型既感染人也感染猪[3]。除人、猪 HEV 外,还发现了兔、禽、鹿、鼠等 HEV[4]。HEV 是肝炎病毒科戊型肝炎病毒属的唯一成员,为无包膜、正义、单链RNA 病毒,病毒基因组全长约7.2 kb,包括5ˊ非编码区、3个开放阅读框(ORFs)和3ˊ非编码区;ORF1编码与病毒复制相关的酶等非结构蛋白,ORF2编码660 aa 的病毒衣壳蛋白,ORF3编码小分子的磷蛋白[5]。ORF2蛋白是公认的病毒抗原,是病毒的主要结构蛋白[6],ORF3蛋白是病毒多功能蛋白,参与多种调节及病毒释放[7];ORF1在明确其与病毒复制相关功能后研究较少,近年来,对 ORF1的研究报道增多,发现其新的特征,以下综述 ORF1的研究进展。
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microRNAs在肿瘤病理学研究中的进展
microRNAs (miRNAs)是一类长度约为20~23 nt的内源性小分子单链非编码RNA,其位于基因组内非编码区,进化上高度保守,可在转录后水平对基因表达进行调节[1-3].miRNAs通过调控基因表达、在细胞增殖、凋亡、分化及个体发育等过程中发挥着非常重要的作用.近十多年的研究[4,5]已证实,miRNAs与肿瘤的发生及发展关系密切,通过调控其靶基因的表达从而影响肿瘤的发生发展,发挥着类似癌基因或抑癌基因的作用.这些与肿瘤相关的miRNAs对肿瘤的诊断、治疗及判断预后都具有重要的意义及应用前景.
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肺腺癌患者血浆线粒体DNA D-LOOP高变区基因突变的研究
目的 探讨检测线粒体DNA D-LOOP高变区基因突变对于肺腺癌诊断的参考价值.方法 选取肺腺癌患者31例,分别提取血浆和癌组织DNA,用聚合酶链反应扩增血浆和癌组织线粒体DNA的D环HVR1,然后用变性高效液相色谱法进行突变筛选.直接测序法测定D环HVR1序列,确定肺腺癌患者组织和血浆中的D环HVR1区的基因突变.结果 与对照组相比,肺腺癌患者的血浆和癌组织DNA的扩增率有显著差异(P<0.05),D-LOOP高变区HVR1存在点突变.结论 线粒体基因D环高变区HVR1在肺腺癌肿的突变在肺腺癌的诊断中可能有一定作用.
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肝特异性微小RNA-122在原发性肝癌中的应用研究进展
微小RNA(MicroRNAs,简称为miRNAs)是一类长度约19~25个核苷酸的非编码单链小分子RNA,通过与mRNA的3’端非编码区(3'untranslated region,3'UTR)结合而介导转录后调控,在细胞的增殖、分化、凋亡、个体的发育以及疾病的发生发展中发挥着重要的作用,具有高度保守性和内源性.研究表明,miRNAs在正常组织和肿瘤组织中的表达具有明显不同,且多数miRNA基因位于与肿瘤形成相关性脆弱基因位点,推测miRNA在肿瘤发生发展过程中可能起重要作用,检测组织和(或)体液中的miRNA分子表达的变化可作为肿瘤诊断和预后评价的判断指标,为肿瘤诊断和靶向治疗提供了新的思路[1].
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miR-1与肿瘤
MicroRNAs (miRNAs)是近年来发现于真核细胞中的一类长21~22个核苷酸的内源性非编码小RNA分子,它们由相应的基因编码,转录后通过一系列加工过程,形成成熟的miRNA分子.成熟的miRNA通过与靶mRNA的3'非编码区(3UTR)结合,抑制mRNA的翻译或影响mRNA的稳定性,从而调节基因表达,在个体发育、细胞增殖、凋亡和肿瘤发生等过程中发挥了重要的调控作用[1].据估计,30%的人类基因受到miRNAs调控,这也表明miRNAs可能影响所有的信号途径[2].其中,miR-1存在于大多数动物种系,特异性表达于心肌和骨骼肌细胞,通过作用于组蛋白去乙酰化酶4(HDAC4)而促进成肌细胞分化,抑制细胞扩增,近年来研究发现其与肿瘤发生发展也密切相关,本文将就上述问题进行系统阐述.
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戊型肝炎病毒实验室诊断技术的现状
戊型肝炎与甲型肝炎相似,是一种经肠道传播的自限性疾病.戊型肝炎病毒(HEV)是引起戊型肝炎的病原体.HEV主要通过粪-口途径传播.HEV主要分为4个基因型,1和2型主要在人群中传播,可引起流行和散发的戊型肝炎;3和4型可在人群与动物之间传播,是人畜共患性疾病,主要引起散发性的戊型肝炎.HEV是一种直径为27~34 nm的无包膜单股正链RNA病毒,基因组全长约7 500 bp,其5'端和3'端各含有一个非编码区,在5'和3'非编码区之间含有3个开放读码框架(ORF),依次为ORF1、ORF2和ORF3,ORF1编码病毒复制所需要的酶类,ORF2编码衣壳蛋白,可诱导机体产生保护性免疫反应;ORF3功能尚不清楚,但含有可被患者血清抗体识别的抗原表位[1-3].