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4种金属化合物对小鼠生殖细胞DNA损伤的研究
随着工业化的发展和矿资源的开发利用,重金属对环境的污染越来越严重.其中镉、铬、铅、汞是常见的环境和工业毒物,有关其遗传毒性的报道较多.研究已证明[1,2]:镉和铬是确定的人类致癌物,汞对真核细胞具有致裂作用,铅可诱发实验动物肾脏肿瘤,属人类可疑致癌物,但有关其是否能够直接诱导生殖细胞的DNA损伤未见报道.
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1-15 3种化学物致CHL细胞DNA链断裂及酪醇的保护作用
目的检测H2O2、K2Cr2O2和阿霉素所致CHL细胞DNA的损伤效应及酪醇对DNA氧化损伤的影响.方法 (1)CHL细胞以不同浓度化学物作用一定时间(K2Cr2O2:1 h 45 min;H2O2:25 min,阿毒素:1 h 15 min),用SCGE(单细胞凝胶电泳)检测DNA链断裂情况;(2)CHL细胞以不同浓度酪醇作用1h 35 min后,再加入0.4 mmol/LH2O2培养25 min,用SCGE测定DNA链断裂情况,分析酪醇的抗氧化损伤作用.结果(1)0.1 mmol/L H2O2及K2Cr2O2及0.1 μmol/L阿霉素均可引起CHL细胞DNA链断裂;随三者浓度增加,链断裂更趋严重,平均尾长与浓度呈明显的剂量-反应关系;当H2O2、K2Cr2O2为1 mmo1/L,阿霉素为1 μmol/L时,所有细胞都有拖尾现象.(2)10、20μg/ml酪醇及0.33 mol/L DMSO(@OH清除剂)的预处理可明显抑制H2O2所致DNA损伤,使细胞拖尾率和平均尾长明显下降.结论 H2O2、K2Cr2O2和阿霉素均是强烈的DNA断裂剂,而酪醇能减轻H2O2所致CHL细胞DNA链断裂,证实了它对真核细胞DNA氧化损伤具有抑制作用,这可能部分与其对@OH的清除有关.
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结核分支杆菌抗原ESAT-6基因真核表达质粒的构建及蛋白表达的鉴定
目的:用结核分支杆菌早期分泌性抗原靶ESAT-6基因构建真核表达重组质粒pcDNA3.1(+)-ESAT-6,并鉴定其在真核细胞(COS-7)中表达的蛋白.
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拉沙病毒IgG抗体间接免疫荧光检测方法的建立
目的 建立简便、快速的拉沙病毒IgG抗体检测方法.方法 利用293F细胞表达重组拉沙病毒糖蛋白GP1,固相化在腔室玻片上,加入GP1抗血清,后加入荧光标记的二抗,利用间接免疫荧光法检测拉沙病毒IgG抗体.结果 制备了重组拉沙病毒糖蛋白GP1,GP1抗血清效价>1∶1000000;拉沙病毒IgG抗体间接免疫荧光方法具有专一性强(检测20份健康人血清,无交叉反应),灵敏度较高(抗血清在1∶1000稀释时仍有较强信号)的特点.结论 建立了拉沙病毒IgG抗体的快速间接免疫荧光检测方法,可用于口岸拉沙病毒的快速筛查.
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《分子佐剂C3d增强hCG-β基因避孕疫苗Th2型体液免疫效应》通过专家鉴定
目前,hCG疫苗研制与应用已取得进展,但其免疫原性弱、体内存留时间短等问题仍待解决.复旦大学附属妇产科研究所于2000年6月~2002年12月,将分子佐剂C3d引入基因避孕疫苗,构建了pCMV4-hCG β-C3d和pCDNA3-hCG β-C3d表达质粒并转染了真核细胞,成功表达了hCG β-C3d融合蛋白.
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RNA干扰在男性避孕方面的研究前景
真核细胞可产生多种类型长度不等的小RNA分子.随着小RNA种类和数量的增加,人们逐渐意识到小RNA广泛的功能和多种多样的生物来源,并开始掌握它们的共同点以及各种小RNA通路的关键环节.
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甲醛对三种真核细胞DNA的损伤作用
目前,甲醛造成的空气污染已引起了人们的普遍关注.环境中的甲醛污染具有来源广、范围大、持续时间长等特点.甲醛具有正电性,是一种化学性质比较活泼的小分子醛类化合物,可以进攻亲核基团而造成大分子物质如蛋白质、核酸的损伤.
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中药诱导肿瘤细胞自噬研究
自噬(autophagy)又称为Ⅱ型程序性细胞死亡(type Ⅱ programed cell death),是以胞质内出现双层膜结构包裹长寿命蛋白和细胞器的自噬体为特征的细胞“自我消化”的一系列生化过程,是一种在正常细胞和病态细胞中普遍存在的真核细胞特有的生命现象,在维持细胞自我稳态、促进细胞生存方面起重要作用.早在1962年,Ashford和Porten用电子显微镜观察人肝细胞时发现了自噬现象,但直到近10年,随着酵母模型的建立和基因技术的发展,人们对自噬分子机制和形态特点等研究的深入,才认识到自噬与人类的多种疾病(特别是恶性肿瘤)密切相关.通过对自噬作用的研究,可进一步揭示肿瘤发生、发展的潜在机制,为肿瘤的预防和治疗提供新的思路.
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流感病毒的反向遗传学研究进展
反向遗传学是指对病原微生物的cDNA进行目的性修饰,以对其进行功能和表型的分析[1].它是相对于经典遗传学而言的,后者是从生物的性状、表型到遗传物质来研究生命的发生与发展规律.反向遗传学则是在获得生物体基因组全部序列的基础上,通过对靶基因进行必要的加工和修饰,如定点突变、基因插入/缺失、基因置换等,再按组成顺序构建含生物体必需元件的修饰基因组,让其装配出具有生命活性的个体,研究生物体基因组的结构与功能,以及这些修饰可能对生物体的表型、性状有何种影响等方面的内容.与之相关的研究技术称为反向遗传学技术.在病毒学研究中,反向遗传学常利用经修饰的克隆化cDNA用来获得有感染性的病毒,从而可研究这些修饰对表型产生哪些影响.早报道的是正链RNA病毒的反向遗传学系统.将来自正链RNA的病毒全基因组RNA转染真核细胞,可使RNA充任mRNA(s),从而可翻译出病毒蛋白;反过来,这些蛋白又有助于完整病毒的包装.
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SARS冠状病毒S蛋白在昆虫细胞中的表达和纯化
导致严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome,SARS)的元凶是一种新型的冠状病毒(SARS coronavirus,SARS-CoV).SARS-CoV感染入侵宿主细胞关键的一环是病毒自身的棘突蛋白(spike protein,S protein)与细胞受体的相互作用,故而S蛋白已成为SARS研究的主要热点.本文通过构建杆状病毒载体,利用昆虫细胞表达体系,在真核细胞中得到了全长S蛋白,并用恢复期SARS患者的血清对其进行了初步鉴定.这为进一步深入研究SARS-CoV S蛋白与宿主细胞的作用机制、研发SARS疫苗等提供了实验材料.
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CRISPR-Cas9系统在真核细胞领域内的研究进展
CRISPR-Cas免疫系统在天然状态下保护细菌和古生菌免受外来质粒或噬菌体的入侵.研究者们根据Ⅱ型CRISPR-Cas系统开发了全新的基因编辑工具——CRISPR-Cas9,它利用与靶序列互补的向导RNA引导Cas9酶定点切割DNA,该技术具有设计简单、操作方便、特异性强、效率高等优势,成为新一代基因组编辑技术.本文综述了CRISPR-Cas系统的技术发展史、新分类和作用原理,重点介绍了近几年来CRISPR-Cas9系统应用于真核细胞领域的研究进展.
关键词: CRISPR-Cas9系统 真核细胞 基因编辑 基因调节 -
抗菌肽Defensin真核表达载体的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达
目的 构建家蝇幼虫抗菌肽的真核表达载体,并检测它在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的表达情况.方法 以pUCm-T/Defensin为模板,设计带His标签特异引物,扩增C-末端融合6×His标签的Defensin基因的cDNA全长编码区序列,将其克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体.经酶切及测序鉴定后,以阳离子脂质体Lipofect AmineTM 2000转染CHO细胞,G418抗性筛选稳定转染的阳性克隆细胞,以RT-PCR分析其mRNA的转录情况,通过Ni-NTA琼脂糖柱层析纯化目的蛋白并以Western免疫印迹鉴定蛋白质表达情况.结果 构建了pcDNA3.1 (+)-Defensin-His表达质粒,建立了稳定转染的CHO细胞系.RT- PCR从阳性克隆CHO细胞系中扩增出320 bp大小的目的片段,从转录水平证实pcDNA3.1(+)-Defensin-His重组细胞株表达了Defensin基因.Western免疫印迹检测可见相对分子质量为10000的阳性条带,表明Defensin-His在该细胞系中成功表达.结论 成功构建了质粒pcDNA3.1(+)-Defensin-His,并获得了稳定表达的CHO-Defensin细胞株,有利于进一步研究家蝇幼虫抗菌肽Defensin基因的生物学功能.
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蛋白质磷酸化检测方法及原理
蛋白质是生命活动的物质基础,是机体细胞的重要组成部分.新生蛋白质多肽需要经过翻译后修饰才能转变为成熟蛋白质.翻译后修饰包括:甲基化、羟基化、羧基化、糖基化、脂酰化、异戊烯基化等共价修饰[1].蛋白质磷酸化是重要的蛋白质翻译后修饰之一,在蛋白激酶催化作用下,磷酸基团由供体分子转移到蛋白质的含有羟基的氨基酸侧链上,具有可逆性[2].蛋白质磷酸化和去磷酸化几乎调节着生命活动的全部过程,文献显示在任何时间内真核细胞蛋白分子中约有1/3的数量在发生磷酸化[3],主要发生在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸上,较少见的磷酸化氨基酸还有精氨酸、组氨酸、赖氨酸以及天冬氨酸和谷氨酸等.蛋白质磷酸化氨基酸有4种类型:①氧-磷酸盐,通过羟氨基酸的磷酸化形成;②氮-磷酸盐,通过精氨酸、赖氨酸或组氨酸的磷酸化形成;③酰基磷酸盐,通过天冬氨酸或谷氨酸的磷酸化形成;④硫-磷酸盐,通过半胱氨酸磷酸化形成[4].
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未折叠蛋白反应的信号通路
对于真核细胞来说,内质网(endoplasmic reticulum,ER)承担新生蛋白质的折叠、组装和转运.内质网的蛋白折叠机制对了解疾病的发展过程和治疗提供了新的方向,成为当下研究的热点.
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组蛋白乙酰化及其与肿瘤的关系
真核细胞中染色质的基本单位核小体,由核心组蛋白(H2A、H2B、H3和H4)、H1及DNA组成.核小体组装过程中,(H3/H4)2四聚体首先与DNA结合,随后两个H2A/H2B异二聚体,结合到(H3/H4)2结合处的5′和3′DNA上形成核小体.核小体结构修饰是DNA复制、转录、修复过程中的关键步骤.早在30多年前,Allfrey等已发现核心组蛋白N-端乙酰化能调节多种反式作用因子与核小体结合,从而影响基因转录.此后研究不断深入,发现组蛋白可有多种修饰方式:泛素化、磷酸化[1]、乙酰化[2]、甲基化等,它们单独(协同)调节基因转录[3].其中组蛋白乙酰化是解除核小体抑制作用的主要机制,受组蛋白乙酰基转移酶(histone acetyltransferases,HATs)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases,HDACs)的调控.本文就组蛋白乙酰化与基因转录及其在肿瘤发生、发展中的作用作一综述.
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囊泡膜蛋白相关蛋白VAP33的研究进展
囊泡膜蛋白相关蛋白(VAP)是一种在进化上相当保守的Ⅱ型膜整合蛋白,其同源蛋白存在于所有的真核细胞中,它们具有相似的结构和相似的功能.因其早发现时相对分子质量为33 000,所以也称VAP33.关于该蛋白的研究报道有限,至今在Googlescholar上仅查到相关文章20余篇.本文拟从VAP33的生物学特性、功能及其与疾病相关性3方面进行综述,归纳VAP33的研究进展.
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端粒与Shelterin复合体
端粒是真核细胞线性染色体的末端结构,由简单的DNA串联重复序列和一系列相关的蛋白质组成,在染色体末端形成一个"帽状"结构,对染色体起重要的保护作用,防止出现染色体的断裂、降解与末端融合,与细胞分化、组织再生、DNA修复、细胞的衰老和死亡,以及恶性肿瘤的发生都有着密切的关系.
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对流感病毒神经氨酸酶N1亚型抗体筛选体系的评价
目的 比较真核表达、活病毒感染、酵母展示系统用于流感病毒神经氨酸酶(NA) N1亚型抗体筛选的差别,寻找合适的抗体筛选系统.方法 将pVRC-VN NA-HAtag质粒转染入293T,通过酵母展示获得重组NA.通过反向遗传学获得重组病毒A/Sichuan/1/2009.用荧光发光法检测NA性能,用流式细胞仪检测NA与5种候选抗体结合情况.结果 真核表达、酵母展示系统均可以使NA在表面展示,且具有与活病毒NA相似的特性.在候选的5种抗体中,真核表达以及病毒的NA可与抗体1、5结合,病毒的NA还能与抗体4结合;而酵母展示系统的NA与5种抗体均不能结合.结论 真核表达、真病毒感染系统适合NA抗体的筛选,酵母展示系统表达的NA其表面抗体识别的表位有差异.
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Hyper-IL-6基因转染的肝癌细胞株的建立及生物学特性的观察
IL-6是一种具有广泛生物学活性的细胞因子,近年曾有学者应用基因瘤苗的方法治疗肿瘤并取得一定的效果.Hyper-IL-6是Fischer等依据已知的关于IL-6受体的结构信息设计的一种“设计细胞因子”,即将人类IL-6基因与截短形式的可溶性IL-6受体基因通过基因操作共价连接,并在真核细胞进行表达得到的一种具有超高效IL-6活性的融合蛋白.本研究我们建立了稳定表达Hyper-IL-6的小鼠肝癌细胞克隆株,同时观察其生物学特性的改变.
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肺炎衣原体蛋白酶样活性因子在急性感染期的表达和分泌
肺炎衣原体(Chlamydia pneumonia, C.pn)是一类专性的细胞内革兰阴性菌,可在真核细胞的胞浆内复制并生存很长时间[1].C.pn在人群感染率很高,20岁以上的人群感染率高达50%以上,在某些个体还存在持续的慢性感染,可引起肺炎、咽炎和支气管炎,并且可能导致哮喘、动脉粥样硬化.C.pn的致病机理,尤其是其导致宿主持续感染的机制至今仍不清楚.钟光明等[2]首次克隆并鉴定了一个由C.pn基因编码的衣原体蛋白酶样活性因子(CPAF),是目前发现的惟一由C.pn合成并分泌至宿主细胞的蛋白,是C.pn和宿主之间相互作用的途径之一,在C.pn的致病中可能发挥了重要作用.本实验分别观察C.pn感染培养细胞和小鼠肺组织后CPAF合成分泌的动态变化,对我们了解CPAF的调节作用有重要意义.