2,5-己二酮中毒大鼠坐骨神经中PKA、PKC和CDK5含量的变化

目的 探讨蛋白激酶A(PKA),蛋白激酶C(PKC)和细胞周期依赖性蛋白激酶5(CDK5)在2,5-己二酮(HD)中毒性周围神经病发病过程中的作用.方法 雄性Wistar大鼠200、400mg/kg HD腹腔注射染毒,每周5次,连续8周,建立HD中毒性神经病模型.利用SDS-PAGE和Western Blotting方法检测坐骨神经胞浆和膜组分中PKA、PKC、p35前体、p35、p25和CDK5的相对含量.结果 PKA、PKC、p35前体、p25和CDK5含量在200和400mg/kg染毒组大鼠坐骨神经胞浆蛋白组分中均呈明显升高,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);PKC、p35前体和p35在胞膜蛋白组分中变化趋势与胞浆蛋白中相似,也明显升高,并且与对照组相比差异亦有统计学意义(P<0.05),但PKA、CDK5在坐骨神经胞膜蛋白组分中未能检出.结论 坐骨神经中PKA、PKC和CDK5含量明显升高,提示相关蛋白激酶含量的升高可能是HD致中毒性周围神经病的发病机制之一.

SD大鼠平滑肌肉瘤一例/Wistar大鼠的生殖功能和胎儿发育的正常指标/阿片成瘾的相关磷酸化蛋白研究

电磁辐射对N9小胶质细胞STAT3核转位以乃磷酸化水平的影响

目的 研究STAT3信号分子是否参与电磁辐射诱导的小胶质细胞活化.方法 Western-blot检测小胶质细胞STAT3蛋白质表达及磷酸化表达变化,凝胶迁移率实验(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA)检测小胶质细胞STAT3的DNA结合活性的变化.结果 电磁辐射后小胶质细胞STAT3磷酸化增强,STAT3核转位与DNA结合活性在辐照后6-24 h增加,并以12h为明显.结论 STAT3信号分子参与了电磁辐射诱导的小胶质细胞活化过程.

核糖体蛋白激酶磷酸化程度与人乳头瘤病毒16感染情况的相关性分析

目的:检测人乳头瘤病毒16型(HPV16)感染的宫颈鳞癌组织中核糖体蛋白激酶S6K和S6的磷酸化水平,探讨HPV16感染在宫颈癌发生发展中的作用.方法:利用PCR方法将收集到的135例人子宫颈鳞癌样本分为HPV16感染阳性组和阴性组,用免疫组织化学方法检测磷酸化S6K(p-S6K)和磷酸化S6(p-S6)蛋白在病例样本中的表达水平.结果:HPV16感染的宫颈癌组织内,核糖体蛋白S6K和S6的磷酸化比率分别为46.5％和68.7％,分别高于未感染的宫颈癌组织(8.33％和30.6％),差异具有统计学意义(P均＜0.05).两种蛋白相关性分析,p-S6K与p-S6蛋白在HPV16型病毒感染的宫颈癌组织中表达呈正相关性(r=0.095,P=0.019).结论:HPV16病毒的感染与核糖体蛋白激酶S6K和S6的磷酸化(活化)具有强相关性,后两者的活化能促进细胞的生长增殖,在肿瘤的发生发展中起重要作用.

磷酸化P120ctn在宫颈腺癌Hela、鳞癌Caski细胞系中的表达及意义

目的:探讨P120连环蛋白(P120ctn)及磷酸化P120ctn在宫颈腺癌(Hela)、鳞癌(Caski)细胞系及正常人脐静脉内皮细胞系(HECV)中的表达,分析P120etn表达量的改变是否涉及P120ctn磷酸化修饰.方法:应用蛋白质印迹实验(western-blotting)检测Hela、Caski细胞系及HECV中P120ctn与磷酸化P120etn的表达.结果:①HECV、He-la、Caski细胞系中都有P120etn与磷酸化P120ctn的表达,P120ctn与磷酸化P120ctn在三种细胞系之间有统计学差异(P<0.05);②P120ctn在HECV细胞中表达量高于Hela、Caski细胞(P<0.05),Hela与Caski细胞之间没有表达量差异(P>0.05);③磷酸化P120etn在Hela、Caski与HECV三种细胞之间有表达量差异(P<0.05),HECV细胞表达量低,Hela其次,Caski细胞高.结论:磷酸化P120ctn在宫颈肿瘤细胞系中的表达量高于正常细胞系,P120ctn的磷酸化修饰可能参与了宫颈肿瘤细胞的生物学行为.

幽门螺杆菌与胃癌相关研究

一、我国在幽门螺杆菌与胃癌研究领域的机遇与挑战关于幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)与胃癌的关系,1994年国际癌症研究中心(IARC)也已将其列为人类胃癌的第一类致癌物,当时的主要依据为人群流行病学资料[1,2].近年来,各国学者开展了大量分子流行病学、分子生物学和动物实验研究,对Hp与人类胃癌间发生的关系有了更进一步的认识.在流行病学研究中, 提出了特定菌型与人类胃癌发生相关的学说,注意到细胞毒素相关蛋白A(CagA)以及cag毒力岛(cag-PAI)的差异在各地的意义不同.在相关的动物实验研究和实验室研究中,已取得了部分较为直接的Hp与胃癌相关的证据,如发现某些类型的Hp菌株在与机体的相互作用中,能将其CagA通过Ⅳ型分泌系统注射到上皮细胞内部,进入细胞的CagA成分(包括进入细胞后被磷酸化的CagA和未被磷酸化的CagA)均可参与细胞信号传导的多个环节、引起细胞骨架重排和细胞增殖特征的改变[3].但要深入探讨并终明确Hp与人类胃癌发生的关系及相关机制,必须结合大量胃癌高、中、低发病率地区人群资料,有效利用宏观流行病学方法与分子流行病学、分子生物学方法的结合来进行.我国属胃癌高发国,其胃癌人群的分布特征和人群的稳定性特征已成为国际公认的良好研究现场.

c-Jun N-末端激酶在维生素E琥珀酸酯诱导人胃癌细胞凋亡中的作用

c-Jun N-末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)属于丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)家族成员,多种细胞外应激信号可使其磷酸化而活化,在细胞应激反应中起重要作用.我们通过研究维生素E琥珀酸酯(vitamin E succinate, VES)对人胃癌SGC-7901细胞中JNK MAPK表达的影响,探讨该途径在VES诱导SGC-7901细胞凋亡中的作用.

腺苷二磷酸核糖基化及其生物学效应

真核生物体内蛋白质表达后均需经过一系列的修饰过程才能发挥作用,主要包括腺苷二磷酸(ADP)核糖基化、乙酰化、磷酸化、糖基化等.ADP-核糖基化是蛋白质翻译后的重要修饰方式之一,分为单-ADP-核糖基化,聚-ADP-核糖基化2种,其与染色质的功能与调节、肿瘤的发生、细胞死亡、细胞分化与信号转导、程序性细胞死亡等很多重要的生命活动相关[1-2].笔者将重点介绍哺乳动物细胞中的酶促的单-ADP-核糖基化反应和聚-ADP-核糖基化反应,以及这些反应的主要生物学效应.

044 galloyl pedunculagin作为C-激酶自动磷酸化有效抑制剂的进一步研究

“智七针”对非痴呆型血管性认知功能障碍的影响及其部分机制研究

目的:观察“智七针”对非痴呆型血管性认知功能障碍的临床疗效及探讨其部分机制.方法:选取2013年1月至2015年1月绵阳市中医院神经内科就诊的VCIND患者60例,随机分为对照组和观察组,每组30例,2组患者均口服多奈哌齐(5 mg/次,1次/d)或石杉碱甲(100 μg/次,2次/d),观察组在此基础上加“智七针”,1次/d,30 min/次,针刺5次/周.2组患者均连续治疗3个月,分别比较2组患者治疗前、治疗1个月及治疗3个月后蒙特利尔量表(Montreal scale,Mo-CA)、数字广度(Digit Span,DST)、听觉词语学习测试(Auditory Words Learning Test,AVLT)及语言流畅性测试(languagefluency test,VFT)的变化,同时检测2组治疗前后外周血清JNK信号通路上标志性蛋白表达变化.结果:1)治疗1个月后观察组在MoCA总分、AVLT总分及VFT较治疗前明显增加,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05),而DST评分2组治疗后均较治疗前改善(P＜0.05),但治疗后2组评分相仿(P＞0.05).治疗3个月后观察组MoCA、AVLT及VFT均明显优于对照组,差异均有统计学意义(P均＜0.05).DST评分2组治疗后3个月后组间差异无统计学意义(P＞0.05).2)2组治疗后pJNK浓度较治疗前下降,其中观察组下降趋势较明显(P＜0.05).结论:智七针可明显改善非痴呆型血管性认知功能障碍患者认知能力,其作用机制可能与降低JNK磷酸化有关.

木鳖子抗肿瘤有效作用部位筛选及作用机制探讨

目的:观察中药木鳖子不同提取部位体内体外的抗肿瘤作用,并考察其中抗肿瘤效果显著的木鳖子乙酸乙酯提取部位的抗肿瘤作用机制.方法:采用索氏提取技术将中药木鳖子按照溶剂极性顺序依次提取,得到不同成分,采用细胞增殖实验结合动物抗肿瘤模型方法进行药效评价,运用现代分子生物学技术阐明其中优部位可能的抗肿瘤作用机制.结果:中药木鳖子乙酸乙酯提取部位在体外和体内实验中均可表现出明显的抑制肿瘤生长能力(P＜0.05),且对实验动物无明显的毒副作用,本研究首次发现木鳖子乙酸乙酯提取部位可影响表皮生长因子(EGFR)激酶活性(P＜0.05),并可明显抑制EGFR蛋白磷酸化表达(P＜0.05),可明显抑制丝裂原活化蛋白激酶家族(mitogen activated protein kinase,MAPKs)通路上重要节点蛋白细胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK1/2),氨基末端激酶(C-Jun N-terminal kinase,JNK)和丝裂原激活蛋白激酶p38的磷酸化水平(P＜0.05),且具有浓度依赖关系.结论:中药木鳖子乙酸乙酯提取部位可通过抑制EGFR蛋白及相关通路蛋白活性,在体内外实验中显著抑制肿瘤的生长.

氧化苦参碱通过调控MAPK信息通路改善醛固酮诱导的心肌细胞损伤

目的:研究氧化苦参碱(OMT)对醛固酮(ALD)诱导心肌细胞损伤的改善作用及其作用机制.方法:采用胰酶消化法和差速贴壁法分离和纯化新生大鼠心肌细胞进行培养,采用1×10-5 mol·L-1ALD建立心肌细胞损伤模型.实验分为空白组,模型组(1×10-5 mol·L-1 ALD),ALD+OMT高浓度(3.78×10-4 mol·L-1)组,ALD+ OMT低浓度(1.89×10-4 mol·L-1)组,ALD+ JNK抑制剂(JNK I,5×10-6mol·L-1)组,ALD+阿司匹林(Asp,1×10-5mol·L-1)组,即OMT,JNK抑制剂和阿司匹林组先以相应药物预处理2h后加入终浓度为1×10-5mol·L-1的ALD共同孵育24 h.二甲基噻唑蓝(MTT)法检测细胞存活率,Giemsa染色观察心肌细胞形态学变化情况.蛋白免疫印迹法(Western blot)及实时荧光定量PCR(Real-time PCR)分析OMT对ALD诱导JNK蛋白表达水平,JNK磷酸化(p-JNK)水平及mRNA表达的影响.结果:与空白组比较,ALD可显著降低心肌细胞存活率(P＜0.01)并改变细胞形态,OMT可显著改善醛固酮诱导的心肌细胞存活率降低(P＜0.01)并使细胞恢复至正常形态;Western blot结果显示ALD可诱导JNK蛋白磷酸化水平升高(P＜0.01),而OMT可显著抑制ALD诱导的p-JNK表达增加(P＜0.01);Real-time PCR结果显示,与空白组比较,ALD可诱导JNK mRNA表达增加(P＜0.01),使用OMT进行预保护后,各组基因表达均没有显著改变.结论:OMT对ALD诱导的心肌细胞损伤具有保护作用,其作用机制与抑制JNK蛋白磷酸化密切相关.

氧化苦参碱保护醛固酮诱导的心肌细胞损伤作用机制分析

目的:研究氧化苦参碱(OMT)抑制细胞外信号调节激酶ERK1/2磷酸化对醛固酮(ALD)诱导心肌细胞损伤的干预作用.方法:采用胰酶消化与差数贴壁分离纯化原代心肌细胞,免疫细胞化学分析心肌细胞纯度.实验分为空白组、模型组(1 ×10-5 mol· L-1 ALD)和OMT高(3.78×10-4 mol· L-1),低剂量(1.89×10-4 mol· L-1)组共4组.运用MTT法检测细胞存活率,LDH外漏法测定细胞膜损伤程度,蛋白免疫印迹法分析p-ERK1/2及ERK1/2蛋白表达,实时荧光定量PCR分析ERK mRNA表达.结果:OMT可抑制ALD诱导的细胞存活率降低和LDH外漏增加;与模型组比较,OMT预处理后p-ERK1/2蛋白表达明显下调.结论:OMT对ALD诱导的心肌细胞损伤具有保护作用,其作用与抑制ERK1/2蛋白磷酸化有关.

丹芍颗粒Ⅲ号诱导Akt磷酸化在治疗大鼠紫癜性肾炎中的作用

目的:探讨丹芍颗粒Ⅲ号对紫癜性肾炎(HSPN)大鼠的作用机制.方法:将雄性SD大鼠随机分为5组:空白组,模型组,丹芍低、中、高剂量组,各5只,造模后丹芍各剂量组给予丹芍颗粒Ⅲ号治疗,取肾组织后送病理观察;BCA法进行大鼠24h尿蛋白定量;Western blot法检测大鼠肾组织中p-Akt蛋白量;RT-PCR法检测大鼠肾组织Akt mRNA的表达量;透射电子显微镜下观察肾小球基底膜及足细胞.结果:光镜下,模型组肾组织存在明显异常改变;丹芍各剂量组肾组织病变较模型组减轻.24h尿蛋白定量模型组显著高于空白组(P＜0.05);丹芍高、中、低剂量组均低于模型组(P＜0.05).与空白组比,模型组p-Akt蛋白灰度值比率显著下降(P＜0.01),与模型组比,丹芍高、中剂量组p-Akt蛋白比率均升高(P＜0.05).5组Akt mRNA表达不等,但两两之间差异无统计学意义.空白组肾小球基底膜清晰完整,足突未见融合,而模型组肾小球基底膜偶见增厚,但足突大部分融合,消失.丹芍各剂量组大鼠肾小球基底膜基本光滑均匀,足突融合较模型组明显减轻.结论:丹芍颗粒Ⅲ号诱导Akt蛋白的磷酸化,促进PI3K/Akt信号通路抑制肾小球足细胞融合、凋亡的作用,可能是发挥对大鼠HSPN治疗作用的机制.

黄连解毒汤对2型糖尿病大鼠脑内GLUT3及tau蛋白O-GlcNAc糖基化的影响

目的:观察黄连解毒汤(HLD)对链脲佐菌素(STZ)诱导2型糖尿病(T2DM)模型大鼠脑内葡萄糖转运蛋白3(GLUT3)及tau蛋白O-乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc)糖基化水平的影响,探讨HLD抑制其脑内tau蛋白过度磷酸化的作用机制.方法:健康雄性Wistar大鼠72只,随机分为6组:空白组,模型组,罗格列酮组,黄连解毒汤低、中、高剂量组(1.5、3、6g/kg).通过高糖高脂饮食及小剂量STZ制备T2DM模型.除空白组、模型组灌胃给予等容积的蒸馏水,其他治疗组以相应药物治疗.8周后,采用Western blot和免疫组化法观察大鼠脑内GLUT3及tau蛋白O-GlcNAc糖基化水平.结果:与空白组比较,模型组大鼠海马中GLUT3的含量明显减少(P＜0.01),RL2表达明显下降(P＜0.05);与模型组比较,HLD可增加大鼠海马中GLUT3表达(P＜0.01),增加RL2蛋白表达(P＜0.05,P＜0.01).结论:HLD通过改善T2DM大鼠脑内葡萄糖摄入和代谢障碍,增加tau蛋白O-GlcNAc糖基化表达,进而降低tau蛋白磷酸化水平.

知母宁对阿霉素致乳鼠心肌细胞损伤的保护作用机制研究

目的:观察知母宁对阿霉素所致心肌细胞损伤的保护作用及其NF-κB和JNK信号通路的关系.方法:采用乳鼠心肌细胞培养法,实验分为空白对照组、阿霉素处理组、阿霉素合并知母宁3组.MTT法检测心肌细胞存活率,Western blot法检测NF-κB p65和JNK磷酸化水平.结果:高剂量组知母宁能够显著对抗阿霉素所致心肌细胞损伤,并显著抑制炎症通路NF-κB和细胞凋亡通路JNK的磷酸化水平.结论:知母宁能抑制NF-κB和JNK的磷酸化水平,以对抗阿霉素所引起的心肌细胞损伤.

化学修饰辅助技术在蛋白质组研究中的应用

介绍了化学修饰辅助技术在蛋白质组表达谱、比较蛋白质组、磷酸化蛋白质组、糖蛋白质组和酶蛋白质组研究中的应用,对当前蛋白质组研究中所用到的化学修饰辅助技术进行了评述.

基于贝叶斯决策理论的磷酸化位点蛋白激酶识别算法

通过提出一种新颖的生物信息学算法，以准确识别已知磷酸化位点的蛋白激酶信息，进而解决蛋白激酶的信息缺乏问题。方法根据人类激酶的聚类规则，首先从新版本的磷酸化数据库Phospho．ELM（9.0）中提取出激酶特异性的磷酸化数据，构建用于激酶识别的数据集。然后基于贝叶斯决策理论，分析阳性数据和阴性数据中磷酸化位点附近的氨基酸分布规律，进而给出相应的统计模型并使用留一法对模型进行评估。结果对 MAPK、PKA 和 RSK 3个激酶家族的测试表明，在假阳性率不超过1％的高置信度水平下，激酶识别的准确率分别达到了23％、24％和33％。同时，该算法的识别结果明显优于 KinasePhos、Netphosk 等蛋白质磷酸化位点预测方法。结论本文提出的基于贝叶斯决策理论的磷酸化位点激酶信息识别算法可有效提高对已知磷酸化位点的蛋白激酶识别性能，有助于理解蛋白质磷酸化的生物机制。

14－3－3蛋白的新认识

14－3－3蛋白是一个在真核生物中广泛表达的高度保守的酸性蛋白家族，主要以同源／异源二聚体形式存在，在哺乳动物中由7种亚型组成。7种不同亚型的14－3－3蛋白在人类细胞中发挥着重要作用。本文就14－3－3蛋白的序列保守性和独特性、结构特征、结合靶点、调控机制以及作为潜在药物治疗靶点的相关研究进展做一综述。

Tyk2促进前列腺癌细胞系雄激素受体特异位点Tyr-267磷酸化

目的 探讨JAK激酶家族成员Tyk2在雄激素受体(AR)磷酸化和前列腺癌细胞增殖中的作用.方法 以LNCaP及LAPC-4细胞系为研究对象,在无雄激素条件下,用表皮生长因子(EGF)刺激,给予AIM-100/Baricitinib(INCB 028050)处理,免疫沉淀法和Western blot法检测AR磷酸化;将Tyk2 siRNA转染LNCaP及LAPC-4细胞系,用Western blot法检测沉默Tyk2对AR磷酸化的影响;用CCK-8试剂盒检测前列腺癌细胞增殖.结果 EGF诱导AR Tyr-267特异位点磷酸化并促进前列腺癌细胞增殖(P ＜0.05);AIM-100抑制Ack1和Tyk2介导的LNCaP/LAPC-4细胞增殖(P＜0.05)和AR Tyr-267位点磷酸化;INCB抑制Tyk2磷酸化、AR Tyr-267位点磷酸化及LNCaP/LAPC-4细胞增殖(P＜0.05).结论 Tyk2是EGF诱导AR Tyr-267特异位点磷酸化和前列腺癌细胞增殖的关键激酶,在前列腺癌发病过程中可能扮演重要角色.