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核糖体蛋白激酶磷酸化程度与人乳头瘤病毒16感染情况的相关性分析
目的:检测人乳头瘤病毒16型(HPV16)感染的宫颈鳞癌组织中核糖体蛋白激酶S6K和S6的磷酸化水平,探讨HPV16感染在宫颈癌发生发展中的作用.方法:利用PCR方法将收集到的135例人子宫颈鳞癌样本分为HPV16感染阳性组和阴性组,用免疫组织化学方法检测磷酸化S6K(p-S6K)和磷酸化S6(p-S6)蛋白在病例样本中的表达水平.结果:HPV16感染的宫颈癌组织内,核糖体蛋白S6K和S6的磷酸化比率分别为46.5％和68.7％,分别高于未感染的宫颈癌组织(8.33％和30.6％),差异具有统计学意义(P均＜0.05).两种蛋白相关性分析,p-S6K与p-S6蛋白在HPV16型病毒感染的宫颈癌组织中表达呈正相关性(r=0.095,P=0.019).结论:HPV16病毒的感染与核糖体蛋白激酶S6K和S6的磷酸化(活化)具有强相关性,后两者的活化能促进细胞的生长增殖,在肿瘤的发生发展中起重要作用.
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宫颈病变HPV16感染及其与c-myc、P53表达的关系
目的:探讨HPV16在宫颈癌发生发展中的作用及其与c-myc、P53表达产物之间的关系.方法:采用原位杂交和免疫组化方法检测了18例慢性宫颈炎、28例CIN、4例宫颈浸润性腺鳞癌和55例宫颈浸润性鳞癌HPV16E6DNA及其蛋白和c-myc、P53蛋白的表达情况.结果:浸润性宫颈癌HPV16 E6DNA及其蛋白、P53蛋白阳性率明显高于慢性宫颈炎组,而c-myc蛋白阳性率则明显低于慢性宫颈炎组,P53蛋白阳性率与HPV16 E6 DNA 的检出率之间并无负相关关系.结论:HPV16 E6 DNA的检出及c-myc蛋白的低表达和P53蛋白的高表达与宫颈癌的发生发展密切相关.
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FHIT基因甲基化及蛋白表达与HPV16感染在宫颈癌变中的交互效应
目的 探讨脆性组氨酸三联体(FHIT)基因甲基化及蛋白表达异常与HPV16感染在宫颈癌变中的作用及其交互效应.方法 选择2009年9月至2011年3月在山西省肿瘤医院、山西医科大学第二医院妇科、太原市妇幼保健院和介休市妇幼保健院就诊的宫颈鳞状细胞癌(SCC)新发患者100例,宫颈上皮内瘤样变(CIN)患者142例(72例CIN1,70例CIN2+)和正常宫颈(NC)妇女108例为研究对象.采用多重PCR法检测HPV16感染状况,应用甲基化特异性PCR(MSP)和Western Blot法分别检测FHIT基因甲基化状态和蛋白的表达水平.利用SPSS 20.0软件进行相关资料的f检验、方差分析、x2检验、因素与疾病关联效应分析(OR值及其95％CI),应用相加效应模型进行交互作用评价.结果 HPV16感染率在CIN1组(45.8％)、CIN2+组(68.6％)和SCC组(73.0％)均高于NC组(28.7％),差异均有统计学意义(P＜0.001);在NC、CIN1、CIN2+和SCC组,FHIT基因甲基化率分别为3.7％、13.9％、21.4％和38.0％,蛋白表达永平分别为1.255±0.130、1.184±0.172、1.133±0.126和1.099±0.148,各组的差异均有统计学意义(P＜0.00l);随宫颈病变程度的加重,HPVI6感染率逐渐升高(趋势检验x2=47.623,P＜0.001),FHIT基因甲基化率逐渐升高(趋势检验x2=40.147,P＜0.001),FHIT蛋白低表达率也逐渐升高(趋势检验x2=65.098,P＜0.001);FHIT基因高甲基化、FHIT蛋白低表达与HPV16感染在不同宫颈病变组均存在正相加交互效应.结论FHIT基因高甲基化和FHIT蛋白低表达与HPV16感染均可增加宫颈癌及其癌前病变的发生风险,FHIT基因高甲基化和FHIT蛋白低表达与HPV16感染在宫颈癌变中均具有协同作用.
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hnRNP K在宫颈上皮内瘤样变中的作用及其与HPV16交互效应
目的 探讨hnRNPK与HPV16感染在宫颈上皮内瘤样变(CIN)中的作用及其交互效应.方法 选取2014年6月至2015年6月在山西省介休市建立的社区队列中经病理学确诊的正常宫颈(NC)女性67例和CIN患者137例(CIN Ⅰ患者69例、CINⅡ/Ⅲ患者68例)为研究对象.采用结构式问卷收集研究对象人口学资料及宫颈病变相关因素的基础上,采集宫颈脱落细胞和宫颈活检或手术组织,应用分子导流杂交法检测HPV16感染状况,并采用Western blot技术检测宫颈组织中hnRNPK蛋白表达水平.采用SPSS 23.0软件对资料进行整理分析,研究对象的人口学特征、相关因素、hnRNPK蛋白和HPV16感染在NC组、CIN Ⅰ和CINⅡ/Ⅲ组的差异通过x2检验、趋势x2检验、Kruskal-Wallis H检验进行比较;hnRNPK蛋白表达量的组间两两多重比较采用Bonferroni法;采用非条件logistic回归模型计算hnRNPK蛋白、HPV16感染与CIN的关联强度OR值及其95％CI,采用相加交互模型及交互效应指标评价hnRNP K蛋白和HPV16感染两因素在CIN中的交互效应.结果 CINⅡ/Ⅲ组HPV16感染率(41.2％)高于NC(10.4％)、CIN Ⅰ (14.5％),差异有统计学意义(P＜0.001),且随着CIN程度加重,HPV16的感染率呈上升趋势(趋势x2=18.512).hnRNPK蛋白表达量在NC组、CIN Ⅰ组和CINⅡ/Ⅲ组间差异有统计学意义(H=48.138,P＜0.001),且随着C1N程度加重呈上升趋势(趋势x2=21.765,P＜0.001).交互效应分析显示,hnRNPK蛋白高表达与HPV16感染在CINⅡ/Ⅲ组存在正相加交互作用(API=0.639,95％CI:0.083～1.196),在CIN Ⅰ组尚未发现存在类似交互作用.结论 hnRNP K蛋白高表达、HPV16感染均可能增加CIN的发生风险,且在高度CIN发生中存在正相加交互作用.
关键词： 核不均一核糖核蛋白K 人乳头瘤病毒16型 宫颈上皮内瘤样变 交互效应 -
叶酸缺乏及其与HPV16感染的交互效应对宫颈癌变的影响
目的 探讨血清叶酸和红细胞叶酸水平与宫颈癌变的关系以及叶酸缺乏和HPV16型感染在宫颈癌变中的相互作用.方法 选取经病理学确诊的宫颈炎症(CI)患者80例、低度宫颈上皮内瘤样变(CINⅠ)患者55例、高度宫颈上皮内瘤样变(CINⅡ/Ⅲ)患者55例以及宫颈鳞状细胞癌(SCC)患者64例作为研究对象.采用PCR法检测HPV 16感染状况、微生物法测定血清叶酸及红细胞叶酸水平.结果 随着宫颈癌变的进展,HPV16感染率升高(趋势x2=34.96,P＜0.001),血清叶酸含量(趋势x2=42.17,P＜0.001)和红细胞叶酸含量(趋势x2=31.39,P＜0.001)均呈逐渐降低趋势,血清叶酸和红细胞叶酸含量呈正相关(r=0.405,P＜0.001).分组分析显示,血清叶酸和红细胞叶酸含量的OR和调整OR(aOR)值在CINⅡ/Ⅲ和SCC组均呈上升趋势,趋势检验有统计学意义(P＜0.001),但在CIN Ⅰ组未显示相同趋势.血清叶酸缺乏与HPV16感染在CINⅡ/Ⅲ及SCC组中存在正相加作用,而红细胞叶酸缺乏与HPV16感染在CIN各组和SCC组中均存在正相加作用.结论 叶酸缺乏可增加宫颈癌变的发生风险,在宫颈癌变的过程中与HPV16感染可能具有协同作用.
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紫金化毒栓治疗宫颈炎的体内外药效学评价
目的:观察紫金化毒栓在体内外对病毒、细菌、苯酚致宫颈炎的药效作用,为评价其治疗宫颈炎的药效作用提供实验依据.方法:SD大鼠70只,随机分为正常组,模型组,妇宁栓组(0.15 g·kg-1 ·d-1),聚甲酚磺醛栓组(8.4 mg·kg-1·d-1)及紫金化毒栓高、中、低剂量组(1.2,0.6,0.3 g·kg-1·d-1),每组10只,除正常组外,其余各组采用针头刮擦3次,造成子宫表面损伤,每隔2日注入1次,共3次,造成感染模型,造模成功后阴道内给药,每日1次,连续12 d,采用HE染色病理切片观察大鼠宫颈炎病变,采用ELISA检测宫颈组织中病毒的表达.体外实验观察对单纯疱疹病毒2型(HSV-2)的抑制作用,采用RT-PCR和CPE法观察紫金化毒栓对病毒的抑制作用、采用比浊法观察抑菌作用.结果:在HPV16感染的大鼠宫颈炎模型上,紫金化毒栓1.2,0.6,0.3 g·kg-1·d-1剂量组对大鼠宫颈组织中HPV16表达具有明显的抑制作用,1.2,0.6 g·kg-1·d-1剂量组对宫颈组织病理改变具有明显的抑制作用;在大肠埃希菌、淋球菌和金黄色葡萄球菌混合感染的大鼠宫颈炎模型上,紫金化毒栓1.2,0.6g·kg-1 ·d-1剂量组对大鼠宫颈的病理改变具有明显的抑制作用;在化学物质致大鼠宫颈炎的模型上,紫金化毒栓1.2 g·kg-1·d-1剂量组对大鼠阴道、宫颈病变具有明显的抑制作用.紫金化毒栓在体外对疱疹病毒2型、人乳头瘤病毒16型、金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、乙型链球菌、大肠埃希菌、绿脓杆菌、变形杆菌、淋球菌、白色念珠菌具有明显的抑制作用.结论:紫金化毒栓在体外对病毒、细菌均有明显的抑制作用,对苯酚致宫颈炎的具有明显的改善作用.
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人乳头瘤病毒16L1-减毒志贺氏杆菌为载体疫苗的构建及免疫效应初步鉴定
为预防高危型人乳头瘤病毒16型(HPV16)诱发宫颈癌,制备以减毒志贺氏杆菌为载体的HPV16预防疫苗,以期载体可介导机体产生粘膜免疫反应,达到预防HPV16感染的目的.为此构建了以HPV16L1为免疫原的减毒志贺氏杆菌苗,并初步鉴定候选疫苗的减毒特性和免疫效果.利用基于志贺氏杆菌virG/icsA基因的表达载体(pHS3199),将HPV16L1基因插入后构成pHS3199-hpv16L1质粒,电穿孔法将其转入减毒志贺氏杆菌sh42,经筛选获得重组减毒sh42-HPV16L1工程菌.用免疫印迹法检测HPV16L1蛋白表达,连续传代法确定其传代和目的蛋白表达的稳定性;豚鼠角膜巩膜炎症试验检测细菌的毒力和菌苗的免疫效果;小鼠红细胞凝集抑制试验检测免疫血清对病毒样颗粒(VLP)的中和活性.免疫印迹检测证实,重组菌株sh42-HPV16L1可稳定表达HPV16L1;豚鼠角膜巩膜炎症试验证实,该候选菌苗无致病性.减毒sh42-HPV16L1经结膜囊途径免疫豚鼠,可以产生特异性体液免疫应答,免疫动物体内的血清、肠道、阴道分泌物中抗HPV16L1 VLP IgG、IgA含量显著高于对照组,并且sh42-HPV16L1免疫动物血清可明显抑制HPV16L1 VLP引起的小鼠红细胞凝集.因而sh42-HPV16L1将是一种潜在的HPV16候选预防疫苗.
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人乳头瘤病毒16型病毒样颗粒的制备及其免疫原性研究
利用PCR技术从HPV16阳性阴道分泌物标本中获得HPV16 L1基因片段,并将其插入表达载体pTO-T7中,构建重组表达质粒pTO-T7-HPV16-L1;以该重组质粒转化大肠杆菌ER2566并表达HPV16 L1蛋白;所表达的HPV16 L1蛋白经过硫酸铵沉淀、离子交换层析和疏水相互作用层析等纯化步骤后,HPV16 L1纯度达到98%以上,并可在体外装配为直径50nm的病毒样颗粒;动物免疫原性研究结果显示,该病毒样颗粒可诱导高滴度的针对HPV16的中和抗体.上述研究结果表明通过大肠杆菌表达系统制备的HPV16病毒样颗粒具有纯度高,与天然病毒颗粒形态高度相似的特点,并具有高度免疫原性,可以应用于HPV16病毒样颗粒的结构功能研究及HPV16疫苗研发等领域.
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腺病毒载体介导密码子优化型HPV 16 L1基因在哺乳动物细胞中的高效表达及病毒样颗粒的装配
为研究重组腺病毒载体作为HPV16预防性疫苗的可行性,构建了含密码子优化型HPV 16 L1基因的重组腺病毒,并对优化基因在哺乳动物细胞中的表达进行研究.首先按照哺乳动物密码子偏好对野生型HPV16 L1基因进行改造并合成优化基因,命名为mod.HPV16L1.将mod.HPV16L1基因克隆到穿梭质粒PDC316上,与骨架质粒共转染293细胞,在细胞内包装重组腺病毒rAd-mod.HPV16L1.用免疫印迹法检测病毒感染的293T细胞中HPV16L1蛋白的表达.通过Optiprep密度梯度超速离心法纯化HPV16 L1病毒样颗粒(VLPs).用磷钨酸负染,在电子显微镜下观察HPV16 L1蛋白自我装配形成的VLPs.结果显示,重组腺病毒载体可介导mod.HPV16 L1基因在哺乳动物细胞内的高效表达,L1蛋白可自我装配形成VLPs.
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腺伴随病毒载体介导HPV16 E6E7基因转化人胎食管上皮细胞
为了证实人乳头瘤病毒16型(HPV16)感染与食管鳞状细胞癌发生的关系,构建了包含HPV16E6E7基因的重组腺伴随病毒载体并包装重组病毒,重组病毒感染人胎食管粘膜组织,注射SCID小鼠皮下,在TPA协同下12周左右诱发肿瘤.PCR及打点杂交检测到瘤组织中HPV16E6E7基因的存在,HE染色表明为恶性鳞状上皮癌,培养形态及透射电镜观察证实了瘤组织的上皮来源.以上结果对于阐明食管癌发生的病毒病因、食管癌发生的分子机制以及为食管癌防治提供了理论和实践依据.
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人乳头瘤病毒16型转换基因的序列分析
为了解中国地区宫颈癌病人中人乳头瘤病毒16型E6E7基因结构特点, 从中国山东地区宫颈癌活检组织中提取组织DNA, 经HPV多重引物PCR法鉴定标本中感染HPV型别 ,选单纯感染HPV16型两例标本DNA为模板进行PCR扩增,获得HPV16 E6E7基因后, 重组入pALTER-1载体, 进行双向测序、分析.DNA序列分析表明: 两例标本的HPV16 E6E7序列全长均为776bp, 与已发表的德国标准株长度相等, 两例均为变异株,共检出5处核苷酸变异位点,其中4处可导致氨基酸改变.中国山东地区宫颈癌病人中HPV16 E6E7的基因结构与德国标准株的HPV16 E6E7基因之间存在差异.
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人乳头瘤病毒16型修饰后E6E7基因免疫原性增强
利用突变修饰后消除转化活性并保留抗原性的中国山东地方株人乳头瘤病毒16型(human papillomavirus type 16, HPV16)E6E7融合基因(fmE6E7), 研制治疗HPV16 相关疾病的DNA疫苗.用PCR扩增fmE6E7基因后,插入真核表达质粒获得pVR1012-fmE6E7,瞬时转染Cos-7细胞,免疫荧光法检测证实其表达后,在C57BL/6小鼠后腿肌肉进行裸DNA免疫,51Cr释放法体外分析免疫鼠的细胞毒性T淋巴细胞活性(cytotoxic T lymphocyte, CTL),间接ELISA法检测免疫鼠血清中E7特异性抗体.研究表明修饰后的中国地方株E6E7融合基因可诱导机体产生特异的抗体反应和CTL反应,与单独野生型E7基因免疫相比,E6E7融和基因可更好的活化CTL反应.表明修饰后消除转化活性的中国地方株E6E7融合基因可作为HPV16治疗性DNA疫苗的靶基因.
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人类风湿性关节炎滑膜细胞系(RASB)的建立和生物学特性的观察
目的建立人类风湿性关节炎滑膜细胞永生细胞系. 方法用重组有HPV16病毒E6/E7基因阅读框架的逆转录病毒载体转染原代培养的人类风湿性关节炎滑膜细胞,经G418筛选,获取细胞克隆RASB,并从形态学、生长特性、核型组成、致瘤性和分泌功能等多方面对建系细胞RASB进行生物学观察. 结果实验和观察证实,转化滑膜细胞染色体整合HPV病毒DNA,表达HPV E6蛋白,基本保留了B型滑膜细胞特征形态、细胞骨架和分泌功能,倍增时间缩短一半,对裸鼠无致瘤性,软琼脂培养形成细小集落.已稳定传代大于100代. 结论建立了能长期体外稳定传代的人类风湿性关节炎滑膜细胞系.此细胞系的建立将为类风湿关节炎致病机理的研究和治疗提供极有意义的体外细胞模型.
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浙江省宁波市妇女子宫颈感染人乳头瘤病毒16型的L1基因多态性与蛋白特性预测
目的 了解浙江省宁波市人乳头瘤病毒16型(Human Papillomavirus Typel6,HPV16)的分布和L1区基因变异情况.方法 收集宁波市社区和某医院就诊妇女的宫颈脱落细胞样本进行HPV分型检测,并对其中HPV16阳性株进行基因序列分析,并预测蛋白疏水性及抗原性.结果 在778例社区人群样本中HPV16阳性23例,检出率3.0％,在1848例就诊人群样本中HPV16阳性87例,检出率4.7％;在HPV16阳性标本中随机抽取29例进行L1基因扩增,阳性率为55.2％ (16/29),经测序获得完整序列13条,L1区有12处基因变异,其中C6240G、A6432G、6902插入ATC和6950缺失TGA为主要突变形式(13/13);系统进化树分析显示,宁波市HPV16存在亚洲型和欧洲型;和参考株相比,其蛋白疏水性和抗原性在氨基酸289～292位减弱、448～ 449位增强、450～465位减弱.结论 宁波社区人群HPV16感染率较高,多数感染者携带病毒的L1基因发生变异,这些突变引起HPV16 L1蛋白疏水性和抗原性改变.
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HPV16 E2与IL-12联合基因疫苗的免疫效果初步研究
目的 将HPV16 E2与IL-12真核表达载体联合免疫小鼠,检测小鼠产生的特异性体液免疫和细胞免疫应答水平,为HPV16诱发的宫颈癌治疗性核酸疫苗的研制奠定实验基础. 方法 40只BALB/c小鼠随机分成PBS组、pcD-NA3.1(+)空质粒组、pcDNA3.1(+)/IL-12组、pcDNA3.1(+)/HPV16 E2组以及pcDNA3.1(+)/HPV16 E2+pcD-NA3.1(+)/IL-12联合组,每组8只,共免疫4次,每2周1次.于免疫前1d及第8周采血,分离血清,-20℃保存；颈椎脱臼处死小鼠,无菌取脾脏,制备脾细胞悬液.ELISA法测定小鼠血清HPV16 E2 IgG抗体水平及脾细胞培养上清IFN-γ、IL-4水平；MTT比色法检测脾淋巴细胞的增殖. 结果 免疫8周后,血清IgG抗体A450值E2组和联合组与PBS组和空质粒组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；但在每个时间点,联合组与E2组比较差异无统计学意义(P＞0.05).IL-12组、E2组、联合组脾淋巴细胞培养上清中的IFN γ和IL-4含量与PBS组和空质粒组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；联合组与E2组比较IFN-γ含量差异有统计学意义(P＜0.05),两组的IL-4含量差异无统计学意义(P＞0.05).IL-12组、E2组、联合组脾淋巴细胞SI值与PBS组和空质粒组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；联合组与E2组比较差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 HPV16 E2单基因疫苗及其与IL-12联合基因疫苗能刺激小鼠产生特异性抗体,脾淋巴细胞培养上清IFN-γ含量升高,且联合基因疫苗优于E2单基因疫苗.
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新疆南部地区维吾尔族妇女宫颈癌组织中HPV-16型L2基因多态性分析
目的探讨新疆南部地区维吾尔族妇女宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16型(human papillomavirus 16,HPV-16)L2基因的变异,并预测L2蛋白的功能变化. 方法从19份中国新疆南部地区维吾尔族妇女宫颈癌活检组织标本中提取DNA,以此DNA为模板,PCR扩增HPV-16 L2全长基因,PCR 产物直接测序或克隆后测序,分析新疆维吾尔族妇女宫颈癌组织HPV-16 L2基因多态性及HPV-16 L2蛋白功能的变化. 结果 PCR检测结果显示宫颈癌组织中HPV-16 L2阳性率为84.21%(16/19);测序和序列分析表明L2基因核苷酸多处发生变异,并引起编码氨基酸的变异;L2基因在核苷酸水平上形成7种突变模式(XJL2-1～XJL2-7),各模式与HPV-16原型比较,同源性在99.37%～99.79%之间;在氨基酸水平上形成5种突变模式,其中XJL1-1/2/3突变模式占66.67%(8/12),是突变的主流模式,各模式与HPV-16原型比较,同源性在98.31%～99.58%之间;以上突变引起HPV-16 L2蛋白疏水性和抗原性的改变,继而改变了L1蛋白的结构及功能. 结论中国新疆南部地区维吾尔族妇女宫颈癌组织中HPV-16 L2基因发生多位点变异,并形成多种突变模式和突变主流模式;这些突变引起HPV-16 L2蛋白疏水性和抗原性的改变,提示HPV-16 L2基因突变可能与HPV-16的系统发生以及病毒逃避机体免疫识别有关.
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人乳头瘤病毒16型晚期蛋白L1的表达及病毒样颗粒的装配
目的在昆虫细胞中表达人乳头瘤病毒16型(HPV16)哈尔滨地区分离株的晚期蛋白L1,并分离纯化由L1蛋白在细胞中自主组装成的病毒样颗粒,为HPV16预防性疫苗的研制奠定基础.方法获得含有HPV16 L1基因的重组杆状病毒并使目的蛋白L1在昆虫细胞中表达;对重组杆状病毒的扩增条件及L1蛋白的表达水平进行优化;电镜下观察昆虫细胞中晚期蛋白装配成病毒样颗粒的情况,经氯化铯密度梯度纯化病毒样颗粒,并经Western blot进行验证.结果获得了稳定表达L1蛋白的重组杆状病毒;以MOI值为0.2感染昆虫细胞可获得较高滴度的重组病毒,以MOI值为10感染昆虫细胞可获得较高水平的L1蛋白表达;电镜下可观察到昆虫细胞核内直径为55nm的病毒样颗粒;病毒样颗粒可通过氯化铯密度梯度离心获得.结论获得人乳头瘤病毒哈尔滨地区分离株L1蛋白可在昆虫细胞中自主装配的病毒样颗粒并成功分离纯化.
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修饰后中国山东地方株HPV16 E6E7基因的转化活性检测及免疫原性研究
目的利用突变修饰后消除转化活性并保留抗原性的中国山东地方株人乳头瘤病毒16型(HPV16)E6E7基因, 研制HPV16 DNA疫苗. 方法定点突变E6的终止密码,并保证E7读码框架不变;定点突变E7蛋白的Rb结合区中对其转化活性维持起关键作用的第24位氨基酸.突变修饰后的基因命名为fmE6E7.PCR扩增fmE6E7,重组入pLNCX载体,脂质体法转染3T3细胞,免疫荧光组织化学及Western blot检测转染细胞蛋白的表达.经软琼脂集落培养法和BALB/c裸鼠皮下接种法检测fmE6E7的转化活性.然后PCR扩增fmE6E7,构建pVR1012-fmE6E7真核表达质粒,于C57BL/6小鼠肌肉内直接进行裸DNA免疫,51Cr释放法体外分析免疫鼠的细胞毒性T淋巴细胞活性,间接ELISA法检测免疫鼠血清中E7特异性抗体. 结果测序证实获得了预期的突变结果.pLNCX-fmE6E7转染细胞体外软琼脂培养3周未见集落形成;裸鼠皮下接种2月后未见移植瘤形成(0/3).免疫鼠获得了较好的E7特异性的抗体E和抗原特异性的CTL. 结论修饰后E6E7基因可融合表达,转化活性消除的同时还可诱发特异的细胞免疫和体液免疫,表明中国山东地方株的E6E7基因可作为HPV16治疗性DNA疫苗的靶基因.
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HPV16E7E6重组腺病毒的构建及免疫效果评价
目的 构建用于宫颈癌治疗的HPV16E7E6重组腺病毒并评价其免疫效果.方法 根据哺乳细胞使用密码子的偏嗜性设计HPV16E7E6融合蛋白表达优势密码子基因序列并合成.将合成的E7E6基因插入腺病毒重组穿棱质粒pCD316后,与Ad5腺病毒骨架质粒共转染293细胞,重组病毒经单斑纯化并进行目的基因插入及表达的鉴定.扩增纯化重组病毒后免疫小鼠,评价其免疫活性.结果 PCR试验证明E7E6密码子优化基因成功插入Ad5病毒；Western blot检测结果表明重组腺病毒中E7E6优化基因能高效表达,该重组腺病毒免疫C57小鼠后,可诱发强特异性T细胞免疫应答,在小鼠体内能完全抑制5×104 TC-1移植瘤细胞的生长.结论 重组HPV16E7E6腺病毒可作为治疗HPV慢性感染或宫颈癌的候选疫苗.
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抗HPV16E6核酶的原核表达与体外活性研究
目的 获得一种特异性抗人乳头瘤病毒(HPV)16型E6基因的核酶,用以在基因调控水平预防、治疗HPV相关性肿瘤.方法 以核酶(ribozyme,Rz)的锤头结构为模型,采用计算机软件针对HPV16E6基因,设计相应的Rz;体外合成其基因后,克隆于原核表达质粒中.将HPV16E6基因片段也克隆于原核表达质粒中,通过体外转录而得到核酶和病毒mRNA,进行体外切割试验以鉴定核酶的活性.结果 抗HPV16E6核酶(简称抗16HRz)被装入pRG523中而构成pRG16HRz,体外转录后能将核酶独立地释放出来.HPV16E6 mRNA转录质粒pTZ16E6含有HPV16E6基因片段(+94位～+296位),体外切割实验证明抗16HRz具备切割活性,在体外能准确、有效地识别和切割HPV16E6 mRNA片段,得到82nt和132nt的切割产物.结论 所获得的抗HPV16E6核酶能特异性切割HPV16E6 mRNA,可作为对HPV相关性肿瘤进行基因治疗的工具.
