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DNA疫苗在病毒感染疾病中的应用进展
DNA疫苗属于继第一代减毒、灭活疫苗,第二代重组基因工程亚单位疫苗之后的第三代新型疫苗.DNA疫苗不仅能诱导体液免疫反应,而且还可以有效地激发细胞免疫.考虑到细胞免疫在病毒感染性疾病的机体免疫过程中发挥重要作用,且目前临床上对病毒感染性疾病的防治措施及其相对效果都不尽如人意,DNA疫苗在此方面更是被寄于厚望.本文对DNA疫苗的历史发展,针对病毒防治方面的部分疾病研究进展、问题及前景进行简要综述.
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A型流感病毒NP基因核酸疫苗的构建与体外表达鉴定
目的构建A型流感病毒核蛋白核酸疫苗,研究核酸疫苗主动免疫保护效应.方法从A型流感病毒逆转录获得NP基因,与表达载体pSECTAG 2/Hygro A构建核酸疫苗,采用脂质体转染法转染VERO细胞,经ELISA鉴定,A型流感病毒NP基因核酸疫苗在VERO细胞中得到了表达.结果结果显示,在转染后36h得到大化表达,其A450达到0.382.在36到60h时间范围内,NP蛋白表达量基本没有变化(在48h和60h的A450分别为0.385和0.387).结论成功构建了A型流感病毒核蛋白核酸疫苗,为进一步研究该疫苗体内实验奠定了基础.
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结核病DNA疫苗的现状与未来
1990年Wolff等[1]在一次基因治疗的实验研究中意外地发现不加任何处理的基因也可在骨骼肌细胞中表达蛋白至少2月,从而产生了核酸疫苗或基因疫苗、基因免疫、核酸免疫的全新概念,开创了免疫学和疫苗学的新领域.核酸疫苗包括DNA疫苗和RNA疫苗,由能引起机体保护性免疫反应的病原体抗原的编码基因和真核表达载体构建而成,它被注入机体后,通过宿主细胞的转录系统表达蛋白抗原,诱导宿主产生细胞免疫应答和体液免疫应答,从而达到预防和治疗疾病的目的.DNA疫苗可诱导全面的免疫反应,尤其是特异性CTL识别、杀伤、破坏被感染的细胞及清除细胞内的病原体,这对于清除寄生于巨噬细胞内的结核分支杆菌非常有意义.1996年以来WHO将结核病核酸疫苗研究列为资助的项目之一.本文概述了结核病DNA疫苗研究的现状,及其在结核病预防和治疗方面需进一步研究的问题和应用前景.
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核酸疫苗的研究进展
核酸疫苗即DNA疫苗,是指将含有编码外源性蛋白基因的真核表达质粒DNA直接接种到机体后,通过宿主细胞的转录翻译系统合成抗原蛋白,诱导机体产生特异性细胞和体液免疫应答的一种新型的免疫策略.DNA疫苗由病原抗原编码基因及质粒载体两部分组成,可兼做预防和治疗性疫苗.
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血吸虫核酸疫苗研究进展
血吸虫病(Schistosomiasis)对人畜危害极大,它的防治是当今血防工作中的一个急待解决的重要课题.目前不少学者倾向于寻求一种有效的血吸虫疫苗,作为综合防治中的主要措施之一,随着现代分子生物学及免疫学的发展,血吸虫疫苗已由灭活疫苗、减毒活疫苗和基因工程重组蛋白疫苗进展到核酸疫苗,这是一种新型疫苗,同分子疫苗一样,也属于一种亚单位疫苗.本文拟在核酸疫苗及其在血吸虫方面的研究进展方面做一综述.
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免疫佐剂在寄生虫核酸疫苗中的应用研究
核酸疫苗是近年发展起来的一种新型疫苗,它能诱导机体产生持久的体液免疫和细胞免疫应答,能够抗病毒、细菌和寄生虫的感染,对自身免疫性疾病和过敏性疾病也有一定的疗效.但与传统的灭活疫苗相比,其免疫效价还比较低.目前研究表明,一些免疫佐剂如细胞因子、CpG ODN 等有助于提高核酸疫苗的免疫效价,这为更有效、安全的核酸疫苗的研制开发开辟了新的思路.本文就应用免疫佐剂提高寄生虫核酸疫苗免疫效价的新研究进展做一综述.
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弓形虫ROP11核酸疫苗免疫保护作用的研究
目的 观察ROP11核酸疫苗对BALB/c小鼠的免疫保护作用. 方法 40只BALB/c小鼠随机分为实验组、空质粒对照组、PBS对照组和空白对照组,每组10只,均通过股四头肌注射免疫小鼠.其中实验组每鼠注射pcDNA3.1(+) ROP11重组质粒100 μg(1 μg/μl),空质粒对照组注射pcDNA3.1(+)质粒100 μg(1μg/μ1),PBS对照组注射无菌PBS缓冲液100μl,空白对照组不注射.共免疫3次,每次间隔2周,末次接种量均加倍.分别于每次注射前和末次注射后第2周检测小鼠血清特异性IgG和细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10.末次注射后2周各组小鼠腹腔攻击感染RH株弓形虫速殖子1×10 3个/只,观察其存活时间,评价免疫效果. 结果 ROP11核酸疫苗能诱发小鼠产生细胞免疫和体液免疫反应,实验组小鼠血清特异IgG随着免疫次数的增加而显著增高(P＜0.05).血清IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10均不同程度升高(P＜0.05).重组质粒免疫组、空质粒免疫组、PBS和空白对照组小鼠经RH株弓形虫攻击感染后的平均存活时间为236.3、97.8、96.3和96.2h,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 ROP11核酸疫苗对BALB/c小鼠弓形虫感染有一定的免疫保护性,为进一步研究ROP11核酸疫苗的生物学功能提供了实验基础.
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弓形虫GRA1基因核酸疫苗的实验研究
目的 构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA1基因的真核重组表达质粒,研究其在Hela细胞中的表达情况及其对动物弓形虫感染的免疫保护作用. 方法 以弓形虫总RNA为模板,利用设计合成的一对引物,通过RT-PCR方法体外扩增GRA1基因cDNA片段,构建pVAX1-GRA1重组真核表达质粒,并将其转染Hela细胞,验证其在真核细胞中的表达；用pVAX1-GRA1真核表达质粒注射免疫小鼠,通过检测血清特异IgG水平及血CD4+、CD8+细胞百分率并观察弓形虫感染小鼠的存活时间,评价其免疫保护力. 结果 PCR扩增出573 bp的GRA1开放阅读框,成功构建重组表达质粒pVAX1-GRA1.用间接免疫荧光方法在重组质粒转染后的Hela细胞中检测到特异蛋白,Western blot证实该蛋白具有反应原性,SDS-PAGE检测该蛋白分子质量单位为24 ku.用构建的核酸疫苗免疫小鼠,随着免疫次数的增加血清特异性IgG抗体滴度逐渐增加,CD4+与CD8+T淋巴细胞百分率与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.01).弓形虫RH速殖子攻击感染疫苗免疫组小鼠存活时间为(165±23.1)d,PBS对照组、pVAX1对照组分别为(144±16.3)d和(148±16.3)d,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 构建的真核表达质粒pVAX1-GRA1有一定的免疫保护性,为弓形虫基因疫苗的进一步研究奠定了基础.
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丙型肝炎病毒多表位基因载体的构建与表达
目的 构建编码多个丙型肝炎病毒(HCV)抗原表位的真核表达载体,建立稳定转染的细胞株,并利用小鼠移植瘤模型初步评估疫苗在动物体内的免疫反应状况.方法 合成含10条CTL细胞表位的M2基因,与含多条B细胞及T细胞表位的M1基因连接合成M1M2基因;将M2、M1M2基因分别与pcDNA3.1(+)连接,构建真核表达载体pcD-NA3.1(+)/M2及pcDNA3.1(+)/M1 M2;将上述两种载体与pcDNA3.1(+)/M1分别转入SP2/0细胞中,并检测目的蛋白表达;用3种重组质粒分别免疫BALB/c小鼠移植瘤模型,初步评估疫苗引起的免疫反应.结果 3种真核表达载体在SP2/0细胞中均能得到稳定表达,免疫荷瘤小鼠后,小鼠瘤体的大小M1M2组＜M2组＜M1组＜空质粒对照组,实验组均能观察到肿瘤组织的坏死现象.结论 成功构建了HCV多表位基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)/M1 M2,用该表达载体免疫小鼠可引起较强的特异性免疫应答.
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核酸疫苗VR1012/Sj31粘膜免疫诱导小鼠抗攻击感染的研究
目的探讨日本血吸虫核酸疫苗VR1012/Sj31粘膜免疫诱导小鼠抗攻击感染的保护力. 方法将实验小鼠随机分为5组,每组12只.A组为单磷脂(MPL)组,B组为VR1012组,C组VR1012+ MPL组,D组为VR1012/Sj31组,E组为VR1012/Sj 31 + MPL组.滴鼻免疫.在第3次免疫后2周,每只鼠经腹部感染40±1条尾蚴,45 d后宰杀,观察减虫率和减卵率.在初次免疫前和攻击感染前尾静脉采血并收集粪便,ELISA检测血清内特异性IgA、IgG及粪内sIgA水平. 结果与对照组相比,VR1012/Sj 31及VR1012/Sj 31加MPL滴鼻免疫均可引起小鼠血清IgG、IgA和粪内sIgA升高,且VR1012/Sj 31加佐剂滴鼻免疫组抗体的增幅>不加佐剂组.VR1012/Sj31和 VR1012/Sj31加MPL滴鼻免疫诱导小鼠产生的减虫率分别为21.70%和28.82%,减卵率分别为27.98% 和40.72%.二者的减虫率差异无显著性(P>0.05),但减卵率后者显著高于前者(P<0.05). 结论 VR1012/Sj31滴鼻免疫可引起小鼠产生全身和粘膜免疫应答及部分抗攻击感染的免疫保护力.
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共表达PRRSVORF5和ORF6基因重组核酸疫苗对断奶仔猪的免疫效果研究
目的 评价猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组核酸疫苗pVAX-ORF5-2A-ORF6对断奶仔猪的免疫效果. 方法 分别以pVAX-ORF5-2A-ORF6+ QuilA、pVAX-ORF5-2A-ORF6、pVAX空质粒和PRRSV弱毒疫苗对断奶仔猪进行免疫接种,检测各免疫组血清中特异性抗体效价、细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ的水平、T淋巴细胞增殖程度和CTL杀伤活性,评价其免疫效果. 结果 重组核酸疫苗pVAX-ORF5-2A-ORF6能够刺激猪体产生PRRSV特异性抗体,促进致敏T淋巴细胞增殖,诱导产生特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性;免疫仔猪血清IL-2和IFN-γ水平与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05),加入免疫佐剂Quil A的实验组IFN-γ水平显著高于未加佐剂的实验组(P＜0.05). 结论 重组核酸疫苗pVAX-ORF5-2A-ORF6可诱导免疫仔猪产生特异性的体液免疫和细胞免疫应答,有望成为抗PRRSV感染的新型候选疫苗.
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尿路致病性大肠埃希菌Ⅰ型菌毛fimH基因真核表达载体pcDNA3.0-fimH的构建及鉴定
目的 构建尿路致病性大肠埃希菌Ⅰ型菌毛的fimH基因真核表达载体,为尿路致病性大肠埃希菌的核酸疫苗研制奠定基础.方法 通过PCR扩增尿路致病性大肠埃希菌临床分离株的fimH全基因序列,克隆至pMDl9-T载体,PCR、酶切及测序鉴定后,将fimH基因片段克隆至真核表达载体pcDNA3.0,构建pcDNA3.0-fimH重组质粒,并进行PCR和酶切鉴定.结果 PCR扩增尿路致病性大肠埃希菌fimH基因片段为910 bp;构建的pcDNA3.0-fimH重组质粒经BamH Ⅰ和XhoⅠ双酶切,产生1个与fimH基因PCR产物大小一致的小片段和1个不同于pcDNA3.0-fimH重组质粒的大片段,表明fimH基因已成功插入pcDNA3.0质粒中.结论 成功构建尿路致病性大肠埃希菌fimH基因真核表达载体pcDNA3.0-fimH.
关键词： 尿路致病性大肠埃希菌 fimH 核酸疫苗 -
HPV16 E2与IL-12联合基因疫苗的免疫效果初步研究
目的 将HPV16 E2与IL-12真核表达载体联合免疫小鼠,检测小鼠产生的特异性体液免疫和细胞免疫应答水平,为HPV16诱发的宫颈癌治疗性核酸疫苗的研制奠定实验基础. 方法 40只BALB/c小鼠随机分成PBS组、pcD-NA3.1(+)空质粒组、pcDNA3.1(+)/IL-12组、pcDNA3.1(+)/HPV16 E2组以及pcDNA3.1(+)/HPV16 E2+pcD-NA3.1(+)/IL-12联合组,每组8只,共免疫4次,每2周1次.于免疫前1d及第8周采血,分离血清,-20℃保存；颈椎脱臼处死小鼠,无菌取脾脏,制备脾细胞悬液.ELISA法测定小鼠血清HPV16 E2 IgG抗体水平及脾细胞培养上清IFN-γ、IL-4水平；MTT比色法检测脾淋巴细胞的增殖. 结果 免疫8周后,血清IgG抗体A450值E2组和联合组与PBS组和空质粒组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；但在每个时间点,联合组与E2组比较差异无统计学意义(P＞0.05).IL-12组、E2组、联合组脾淋巴细胞培养上清中的IFN γ和IL-4含量与PBS组和空质粒组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；联合组与E2组比较IFN-γ含量差异有统计学意义(P＜0.05),两组的IL-4含量差异无统计学意义(P＞0.05).IL-12组、E2组、联合组脾淋巴细胞SI值与PBS组和空质粒组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；联合组与E2组比较差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 HPV16 E2单基因疫苗及其与IL-12联合基因疫苗能刺激小鼠产生特异性抗体,脾淋巴细胞培养上清IFN-γ含量升高,且联合基因疫苗优于E2单基因疫苗.
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MIP-1α基因佐剂对NTHi P6 DNA疫苗免疫效果的影响
目的 观察小鼠巨噬细胞炎性蛋白1α (macrophage inflammatory protein 1α,MIP-1α)基因佐剂对不可分型流感嗜血杆菌(nontypeable Haemophilus influenzae,NTHi)外膜蛋白P6(outer membrane protein P6,P6) DNA疫苗免疫效果的影响.方法 将92只BALB/c小鼠随机分为4组,分别用pcDNA3.1、pcDNA3.1/MIP-1α、pcDNA3.1/P6和pcDNA3.1/MIP 1α+pcDNA3.1/P6,肌肉注射免疫,每2周免疫1次,共3次,质粒每次每只接种100 μg.末次免疫后14 d,每组取10只小鼠,采血,分离血清,采用ELISA法检测特异性IgG抗体;每组取3只小鼠,制备脾淋巴细胞,采用CCK-8法检测脾淋巴细胞增殖活性,采用ELISA法检测小鼠脾淋巴细胞分泌IL-4和IFN-γ水平.用8LD50NTHi攻击每组剩余10只小鼠,观察免疫保护作用.结果 末次免疫后,pcDNA3.1/MIP-1α+pcDNA3.1/P6组小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ水平为(1726.45±184.48) ng/L,增殖指数2.06±0.04,与pcDNA3.1/P6组(1443.09±187.70)ng/L和1.90±0.04比较差异均有统计学意义(P＜0.05);抗体滴度和IL-4水平两组间差异无统计学意义(P＞0.05).经NTHi攻击后,pcDNA3.1/MIP 1α+pcDNA3.1/P6免疫组小鼠14d生存率达70％,与pcDNA3.1组0％和pcDNA3.1/MIP-1α组0％相比与差异有统计学意义(P＜0.05),与pcDNA3.1/P6组60％相比差异无统计学意义(P＞0.05).结论 MIP-1α基因佐剂在一定程度上能增强NTHi P6基因疫苗的免疫保护作用.
关键词： 不可分型流感嗜血杆菌 核酸疫苗 巨噬细胞炎性蛋白1α 小鼠 -
弓形虫pc-DNA3-ROP2核酸疫苗的研制
目的 研究廉价有效的抗弓形虫核酸疫苗,以用于人类和畜类弓形虫病的防治.方法 收集、纯化RH株弓形虫速殖子,提取基因组DNA;根据ROP2基因序列,设计合成ROP2基因引物,应用PCR、酶切、连接、测序等技术,扩增ROP2基因片段,克隆于真核表达载体pc-DNA3质粒中,制备抗弓形虫pc-DNA3-ROP2核酸疫苗.应用该疫苗免疫小鼠,通过ELISA检测血清抗体,Western blot鉴定该疫苗的免疫原性;应用RH株弓形虫进行动物攻击实验,评价其安全性及免疫保护性. 结果 以弓形虫基因组DNA为模板,PCR扩增出1.7 kb ROP2基因片段,克隆于pc-DNA3质粒中,成功构建了pc-DNA3-ROP2重组质粒.测序结果显示,重组质粒包含了ROP2蛋白基因读码框内的完整序列,能完整表达ROP2的抗原蛋白.应用该疫苗免疫小鼠,能诱导产生强烈的细胞、体液免疫反应,使实验组小鼠攻虫感染后的存活时间明显延长,攻虫感染192 h后的存活率为77.8%,空质粒及PBS对照组存活率为0,差异有统计学意义(P＜0.001);实验全程免疫小鼠未发生毒性及异常反应. 结论 该核酸疫苗具有很强的免疫原性,安全可靠,能诱导小鼠产生良好的免疫保护作用,具有很好的开发应用价值.
关键词： 刚地弓形虫 棒状体蛋白2(ROP2) 基因重组 核酸疫苗 免疫保护作用 -
核酸疫苗递送与免疫增强方法研究进展
在全球免疫计划中,DNA疫苗是理想的候选者.由于它成本低并且容易大规模生产,使得低收入国家也能受益.然而,目前核酸疫苗的真正潜力还没有被发掘出来,主要由于它在体内的吸收效率低导致该疫苗的免疫原性不强.本文对近年来一些具有创新性和发展前景的提高核酸疫苗细胞转递和有效性的方法进行综述.
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弓形虫主要抗原及核酸疫苗研究进展
弓形虫分布广泛,且人畜感染弓形虫会带来很严重的后果,所以弓形虫病的防治一直困扰着各国学者.近年来,随着对弓形虫研究的深入以及分子生物学的发展,弓形虫核酸疫苗的研究也取得了较大的进展.本文综述了弓形虫主要抗原以及弓形虫核酸疫苗的研究现状,探索弓形虫疫苗的发展前景,并对核酸疫苗的优缺点进行讨论.
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疟疾疫苗研究概况
目前疟疾仍是严重危害人类健康的热带传染病,据WHO近5年的统计,每年平均约有2.1亿人发病,100多万人死于疟疾,世界上有100多个国家有疟疾流行,这些国家中一半的人口生活在疟区,热带非洲国家的人群疟疾发病率均呈上升趋势.而疟原虫抗药性及蚊媒耐药性的产生和迅速扩散,给疟疾的控制带来了更大的难度,似乎我们已经不可能指望采取单一的措施便能降服一种由生活史复杂、抗原高度变异的疟原虫引起的传染病.疟疾疫苗的研制和运用可为疟疾的综合治理提供有力的武器,但对疟原虫免疫机制的肤浅认识及缺乏适当的动物模型,使得有效的临床疟疾疫苗在经历半个世纪后的今天仍是凤毛鳞角.不过随着分子生物学技术的提高和分子免疫学研究的深入,疟疾疫苗已步入核酸疫苗时代,约氏疟原虫核酸疫苗的问世及显示对68%小鼠具有保护作用的结果[1],极大地鼓舞了疟疾疫苗的研究者.本文依据疟疾疫苗的发展,简介几种重要的疟疾候选疫苗及其作用机理,并简述对影响疟疾疫苗效果的相关因素.
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CML28树突状细胞核酸疫苗的构建及其表达研究
为了构建负载CML28的核酸疫苗,并在树突状细胞中进行表达,用分子克隆的方法,从K562细胞中克隆出CML28的cDNA全长,将其亚克隆至pGEM-T载体,经测序后酶切,克隆至真核表达载体pcDNA3.1HisA,将重组质粒pcDNA3.1HisA-CML28进行酶切分析和测序鉴定;从正常人外周血中分离外周血单个核细胞(PBMC),在IL-4和GM-CSF条件下诱导分化为树突状细胞(DC),并进行鉴定;用电穿孔的方法将重组质粒pcDNA3.1HisA-CML28导入到DC中,Western Blot检测His-CML28融合蛋白的表达.结果表明:经酶切分析和测序鉴定,重组质粒pcDNA3.1HisA-CML28含有正确的CML28全长序列;经电穿孔导入DC后,重组质粒能表达His-CML28蛋白.结论:成功构建了CML28树突状细胞核酸疫苗.
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DNA疫苗非病毒载体的研究进展
DNA疫苗(DNA vaccine)又称为核酸疫苗或基因疫苗,是将编码特异性抗原的基因构建在表达性质粒中,经某种方法导入体内后,利用宿主细胞表达系统合成相应的病原体蛋白,诱导机体产生免疫应答以达到预防和治疗疾病的目的.DNA疫苗自1990年发现以来,因具有良好的安全性及可诱导广泛的体液免疫和细胞免疫,已越来越受到人们的关注,是继减毒疫苗、基因工程疫苗之后的第三代疫苗,在人和动物的各种细菌性疾病、病毒性疾病、寄生虫病及肿瘤性疾病等领域发挥作用.
