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结核分支杆菌抗原ESAT-6基因真核表达质粒的构建及蛋白表达的鉴定
目的:用结核分支杆菌早期分泌性抗原靶ESAT-6基因构建真核表达重组质粒pcDNA3.1(+)-ESAT-6,并鉴定其在真核细胞(COS-7)中表达的蛋白.
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DNA疫苗非病毒载体的研究进展
DNA疫苗(DNA vaccine)又称为核酸疫苗或基因疫苗,是将编码特异性抗原的基因构建在表达性质粒中,经某种方法导入体内后,利用宿主细胞表达系统合成相应的病原体蛋白,诱导机体产生免疫应答以达到预防和治疗疾病的目的.DNA疫苗自1990年发现以来,因具有良好的安全性及可诱导广泛的体液免疫和细胞免疫,已越来越受到人们的关注,是继减毒疫苗、基因工程疫苗之后的第三代疫苗,在人和动物的各种细菌性疾病、病毒性疾病、寄生虫病及肿瘤性疾病等领域发挥作用.
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猪囊尾蚴保护性抗原cC1的疫苗研究
囊虫病是由猪带绦虫幼虫-囊尾蚴寄生于人和猪体引起的人、畜共患病,在我国囊虫病也有广泛的流行区域.抗原cC1是以囊虫病患者、病猪血清为探针从猪囊尾蚴cDNA文库中筛选出的具有高度特异性的人、猪共同抗原[1].以抗原cC1为目的基因构建了含有全长cC1 cDNA的重组质粒p3-cC1,同时制备并纯化了重组抗原cC1,以p3-cC1为DNA疫苗,cC1蛋白加弗氏佐剂为抗原佐剂疫苗,用这两种不同形式的疫苗免疫接种小鼠观察免疫应答.
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变异链球菌表面蛋白质抗原真核表达质粒的构建及免疫动物的研究
变异链球菌(Streptococcus mutans, S.mutans)是龋病主要致病菌,S.mutans的表面蛋白质抗原PAc是其主要毒力因子之一,参与了唾液介导的S.mutans在牙面的粘附。S.mutans PAc分子的氨基端不仅富集免疫显性T、B细胞表位,而且含有唾液糖蛋白结合区,因此氨基端是理想的表位多肽防龋疫苗选择区。此外,Streptococcus sobrinus(S.sobrinus)的PAg分子与S.mutans PAc分子的氨基端具有保守的B细胞表位,以PAc分子该区段制备的多肽疫苗可激发宿主对S.sobrinus的交叉保护性反应。因而,初次以变异链球菌表面蛋白质抗原PAc氨基端的编码基因构建真核表达质粒,免疫BALB/c小鼠,观察所诱导的体液免疫应答,为基因疫苗防龋的动物实验提供资料。
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微小RNA介导的基因沉默与神经退行性疾病
微小RNA(microRNA,miRNA) 是一类内源性的22个核苷酸左右的非蛋白编码单链短序列RNA,介导同源序列依赖的基因沉默.目前,miRNA数据库miRBase(16.0版)已收录了人类miRNA 1048个.miRNA及其靶基因构建了细胞内全方位多层次的基因表达调控网络系统,参与众多生命活动的调节并与人类疾病密切相关.miRNA的功能失常在多种神经退行性疾病的发生发展中均具有重要作用.
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免疫毒素IL-18-PE38原核表达载体的构建及其鉴定
目的构建绿脓杆菌外毒素PE38融合鼠IL-18基因的原核表达载体,并鉴定其产物在大肠杆菌中的表达.方法首先经逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)获得小鼠IL-18基因,再通过酶切及连接反应,构建小鼠IL-18与PE38融合基因的原核表达载体PRKL-IL18-PE38,重组载体经PCR、限制性内切酶及DNA序列测定证实连接片段正确后,转染感受态大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE和蛋白免疫印迹法分别测定其相对分子质量及特异性.结果成功构建了IL-18-PE38免疫毒素的原核表达载体,重组载体在大肠杆菌中获得了稳定的表达,表达产物的相对分子质量与预期值一致,且所表达蛋白可被抗IL-18的特异性抗体所识别.结论获得了IL-18-PE38融合基因在原核系统的表达,为进一步研究其对Th1细胞的靶向细胞毒性及临床应用奠定了基础.
关键词: IL-18-PE38 重组免疫毒素 原核表达 基因构建 -
分泌性靶向促凋亡分子基因构建、表达及其对HER2阳性肿瘤细胞的杀伤作用
为建立更敏感而特异的用于肿瘤基因治疗新策略,本研究将一段信号肽、抗肿瘤表面抗原HER2的抗体、具有膜转位作用的肽段和几种促凋亡分子融合,构建了几种靶向促凋亡蛋白.体内外实验研究证实,这种重组分子表达分泌后,能够特异性识别和内化进入HER2阳性肿瘤细胞,继而带有部分PEA Ⅱ转膜结构域的促凋亡蛋白转位进入胞质,诱导细胞凋亡,实现特异性杀伤HER2阳性肿瘤细胞和抑制HER2阳性肿瘤生长的作用.
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分泌型rIL-10基因在正常大鼠肝细胞系BRL中的稳定表达
目的:建立稳定表达分泌型大鼠白细胞介素10(rIL-10)基因的正常大鼠肝细胞系(BRL细胞),为研究IL-10抗纤维化的基因治疗打下基础.方法:通过RT-巢式PCR技术从大鼠外周血单核细胞(PBMC)中扩增出rIL-10全长基因,克隆入pcDNA3真核表达载体构建重组表达载体pcDNA3-rIL-10.鉴定正确后,用受体介导的脂质体转染试剂将pcDNA3-rIL-10转染BRL细胞,高浓度G418筛选,RT-PCR及ELISA法证实rIL-10在BRL细胞中的稳定表达.结果:构建的真核表达载体pcDNA3-rIL-10经质粒双酶切及测序鉴定证实载体构建的正确性.RT-PCR及ELISA法检测出经G418筛选的BRL细胞稳定表达IL-10.结论:成功构建分泌型pcDNA3-rIL-10真核表达质粒及筛选出稳定表达分泌型rIL-10的BRL细胞株,为进一步研究IL-10抗纤维化的基因治疗打下基础.
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免疫基因CD1d和绿色荧光蛋白融合基因慢病毒载体的构建
目的:构建人免疫基因CD1d与绿色荧光蛋白(GFP)融合基因慢病毒载体.方法:实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增获得CD1d的全外显子片段,使之克隆到带GFP荧光报告基因慢病毒表达载体质粒中,慢病毒包装质粒和穿梭质粒转染293T细胞,包装成功后收集上清,浓缩,鉴定.取浓缩纯化后的病毒上清感染293T细胞,荧光显微镜观察荧光表达.结果:电泳鉴定结果与目的基因表达条带完全吻合,克隆测序结果与NCBI收录的CD1d基因序列完全一致.重组慢病毒质粒可高效转染293T细胞,荧光显微镜下可观察到大量绿色荧光.结论:成功构建了CD1d与GFP融合基因慢病毒表达载体,为进一步研究CD1d基因的相关功能提供了适合的稳定转染载体.
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重组瘦素基因构建及其对骨髓间充质干细胞增殖分化的影响
瘦素(Leptin)是由脂肪细胞分泌的一种内分泌激素,可以使骨髓间充质干细胞(BMSCs)向成骨细胞分化,我们构建了重组真核质粒pTracer-Leptin,并转染BMSCs,研究Leptin基因对BMSCs成骨活性的影响.
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HCV 5′非编码区和核心区重组真核表达质粒的构建及其细胞内定位
目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)重组真核表达载体,为HCV感染基因免疫和基因治疗的研究奠定基础.方法:构建含HCV 5′非编码区(NCR)及编码核心蛋白C区基因片段的重组真核表达质粒pBBS212-HCV,通过脂质体介导转染入人肝癌细胞株HepG2中,应用RT-PCR及免疫组织化学方法鉴定HCV核心蛋白的表达及其在细胞内的定位.结果:重组真核表达质粒在HepG2细胞中有稳定表达,HCV核心蛋白以胞浆内表达为主.结论:成功构建了含HCV 5′NCR和核心C区基因片段的真核表达载体,明确核心抗原的细胞内定位主要在细胞胞浆内.
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APOBEC3G真核表达载体的构建及其对HBV复制表达的影响
目的:构建APOBEC3G真核表达载体,在体外初步探讨APOBEC3G对HBV复制表达的影响.方法:应用RT-PCR法从人PBMC细胞中扩增APOBEC3G基因,分子克隆法构建表达APOBEC3G蛋白的真核表达载体pcDNA3.1-APOBEC3G,并脂质体法转染HepG2 2.2.15细胞.Western-blot鉴定细胞中APOBEC3G蛋白的表达.ELISA法检测细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg水平,实时定量PCR检测HBV DNA和HBV mRNA水平.结果:经酶切鉴定及测序证实APOBEC3G真核表达载体被成功构建,APOBEC3G蛋白可在HepG2 2.2.15细胞中表达.转染APOBEC3G重组质粒的HepG2 2.2.15细胞的HBsAg、HBeAg、HBV DNA及HBV mRNA水平均明显低于未转染重组质粒的HepG2 2.2.15细胞.结论:APOBEC3G明显抑制了HepG2 2.2.15细胞中HBV的复制与表达,成功构建APOBEC3G真核表达载体,为深入研究APOBEC3G抗HBV的作用机制奠定实验基础.
关键词: APOBEC3G 基因构建 真核表达 乙型肝炎病毒 HepG2-2.2.15细胞 -
逆转录病毒介导的反义C-MYC的抗小鼠L6565白血病作用
目的和方法:L6565白血病是我国特有的T-S-Z淋巴瘤/白血病系统中的实验系统的瘤株之一,经检测c-myc基因高表达.本文针对c-myc基因构建一个含有小鼠反义c-myc基因片段的逆转录表达载体pGAM,用磷酸钙沉淀法将pGAM导入表达包装细胞PA317,经筛选获得病毒效价5×105 cfu/mL的病毒包装细胞,利用pGAM病毒成功的感染了L6565细胞,得到了G418抗性细胞L6565-as,经PCR分析病毒载体序列稳定地整合到PA317和L6565-as中,能够长期表达.结果:L6565-as和对照细胞光镜下形态均为圆形或椭圆形,细胞大小不一,但L6565as细胞核浆比例比对照细胞小.生长曲线和MTT法显示,L6565-as生长与对照细胞相比,生长明显受到抑制.流式细胞仪检测细胞周期:L6565as细胞G0-G1为45%,PGNsC对照和空白对照细胞分别为26%和29%.软琼脂克隆发现L6565as细胞形成克隆数量明显减少,为30个克隆/5000个细胞,空载病毒和空白对照分别为103和106个克隆/5000个细胞,二者有显著差异(P<0.001).免疫组化检测L6565as细胞c-myc蛋白表达为弱阳性(+),而对照细胞为强阳性(+++).Northern blot检测发现L6565as细胞c-myc mRNA表达比对照减少.结论:反义c-myc基因抑制了L6565白血病细胞的DNA合成,减缓了细胞的生长速度,并且使细胞恶性程度降低.本研究同时也是对我国T-S-Z系统白血病研究的一种深入.
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沉默CIAPIN1基因对K562细胞增殖能力的影响
目的:探讨靶向干扰 CIAPIN1基因表达对慢性粒细胞白血病( CML)细胞系K562细胞增殖能力的影响。方法:针对CIAPIN1基因构建shRNA真核表达载体并稳定转染K562细胞系。 Real-time PCR及Western blotting技术鉴定干扰效率;CIAP-IN1基因沉默之后,改良MTT法检测细胞活力的变化;甲基纤维素集落形成实验观察细胞集落形成大小和数量的变化;流式细胞术检测细胞周期的改变;将K562细胞接种到裸鼠体内皮下,观察细胞在裸鼠体内成瘤能力的变化。结果:CIAPIN1基因表达下调后,K562细胞的活力下降;集落形成数量减少和集落减小;G1期细胞数量增加;小鼠体内成瘤能力明显降低。结论:下调CIAPIN1基因表达能够抑制K562细胞在体外及体内的增殖能力。
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沉默SIRT2基因抑制AML耐药HL60 A细胞株的增殖
目的:探讨靶向干扰SIRT2基因表达对急性粒细胞白血病( AML)多药耐药细胞株HL60A细胞增殖的影响。方法:针对SIRT2基因构建shRNA真核表达载体,制备慢病毒并感染HL60A细胞。沉默SIRT2基因之后,改良MTT法检测对HL60A细胞活力的影响;甲基纤维素集落形成实验观察对HL60A细胞集落形成能力的影响;采用流式细胞术检测分析对HL60A细胞的细胞周期的影响。结果:干扰组SIRT2基因的表达量被有效抑制;干扰SIRT2基因表达量后,HL60A细胞的细胞活力明显下降,集落形成数量减少及集落的形状减小,细胞被明显阻滞于G1/S期。结论:shRNA靶向干扰SIRT2基因的表达可有效抑制急性粒细胞白血病耐药细胞系HL60A细胞的增殖。
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shRNA干扰CIAPIN1基因表达对K562细胞粒系分化的影响
目的:探讨沉默CIAPIN1基因对慢性粒细胞白血病K562细胞向粒系分化的影响。方法:针对CIAPIN1基因构建短shRNA真核表达载体并转染细胞。瑞氏染色观察细胞形态学变化;电镜观测细胞超微结构的改变;real-time PCR方法检测粒系分化标志基因mRNA水平的改变;Western blotting检测ERK1/2、JNK、p38 MAPK及Akt磷酸化水平的改变。结果:CIAPIN1基因沉默后,K562细胞的形态和超微结构趋向成熟粒细胞,表面分化抗原CD11b、NCF1、ORM1、C/EBPα和HIF1α的mRNA表达水平升高,ERK1/2磷酸化水平升高。结论:抑制CIAPIN1基因表达能促进K562细胞分化,ERK1/2磷酸化水平的升高可能参与了该分化过程。
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DNA疫苗的发展现状及前景
DNA疫苗(DNA vaccine),又称"裸"DNA疫苗(naked DNA vaccine)、基因疫苗(genetic vaccine),是将编码特异性抗原多肽或蛋白的基因构建在表达性DNA质粒中,经一定途径进入机体内,被宿主细胞摄取后转录和翻译表达出目的抗原多肽或蛋白,诱导机体产生针对目的蛋白的特异性的免疫应答从而起到免疫保护作用[1].它既具有亚单位疫苗或灭活疫苗的安全性,同时具有如减毒疫苗或重组疫苗等,可诱导持久而特异的细胞及体液免疫应答的特点,同时还具有广谱、简便、廉价等特点,因此是未来新型疫苗的重点发展方向之一,在病毒性疾病以及肿瘤等的防治中有广阔的应用前景[2].
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人死亡受体5全长基因的构建及转染胶质瘤细胞
目的 构建人死亡受体5(death receptor 5,DR5)全长基因真核细胞表达载体pcDNA3.1/DR5,pcDNA3.1/GFP/DR5,并观察其转染胶质瘤细胞U138的效果.方法 通过重叠PCR获得DR5全长编码序列,构建pcDNA3.1/GFP/DR5,pcDNA3.1/DR5表达载体,利用脂质体转染试剂盒,分别将2种质粒pcDNA3.1/GFP/DR5、pcDNA3.1/GFP共转染胶质瘤细胞U138,转染后72 h,半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测DR5mRNA的表达,流式细胞术检测DR5的表达强度、检测Anti-DR5对胶质瘤细胞U138生长的影响.结果 获得了DR5全长编码序列,成功瞬时转染U138,RT-PCR、流式细胞术检测结果表明,转染后U138细胞DR5 mRNA、蛋白水平的表达明显增加,Anti-DR5可以明显抑制U138细胞的生长.结论 获得了DR5全长编码序列,探索到成功转染DR5的佳方法,为稳定筛选高表达DR5的U138细胞提供依据.
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人胎脑NT-4基因的体外构建
目的 体外构建人神经生长因子-4(neumtrophin-4,NT-4)与质粒载体pEGFP-N1(卡那霉素抗性)的重组体,为后续的转基因移植治疗脊髓损伤创造条件.方法 用Trizol法提取人胎脑组织总RNA,经RT-PCR扩增,EorR I和BamH I核酸内切酶酶切电泳纯化获得人神经营养因子-4(NT-4)DNA.用含质粒载体pEGFP-N1DNA的大肠杆菌接种经划板,挑选菌落、振荡培养,并用碱裂解法提取质粒载体pEGFP-N1DNA,经酶切、电泳纯化后,通过连接、转化感受态细胞,DNA小量提取法获得NT-4目的基因与质粒载体pEGFP-N1 DNA的重组体,经DNA测序证实.结果 用上述方法成功获得NT-4-pEGFP-N1重组体.结论 此方法是一种体外构建人胎脑NT-4基因的成熟、稳定而有效的方法,可为后续的神经干细胞转染NT-4基因移植治疗神经系统损伤创造条件.
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诱骗受体DcR3的基因构建、表达及特异性鉴定
目的: 构建适于原核表达的人诱骗受体DcR3基因, 并进行重组蛋白的表达纯化及特异性鉴定.方法: 查得人DcR3 Cdna全序列, 将其分段设计引物, 通过重叠PCR获得DcR3基因.构建Pet-22b(+)/DcR3表达载体, 转化大肠杆菌Rosseta-gami, IPTG诱导表达, Ni柱纯化.采用ELISA进行特异性鉴定.结果: 通过重叠PCR获得了编码正确氨基酸序列的目的基因.目的蛋白以包涵体的形式表达, 表达量占菌体总蛋白的30%以上.纯化后, 蛋白纯度达95%以上.ELISA结果表明所纯化的蛋白可与抗DcR3抗体发生特异结合.结论: 诱骗受体DcR3基因的成功构建、表达及纯化, 为进一步的功能研究奠定了基础.