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美国<科学>杂志评选出今年的十大科学成就:
美国<科学>杂志评选出今年的十大科学成就: --分子电子学获重大进展,微型计算机制造方面的突破,可用于翻译不同语言之间的对话 . --对核糖核酸(RNA)的研究证明,它在人体内的功能是多种多样的.RNA曾被视为携带遣传 密码的脱氧核酸(RNA)的操纵杆,但是,研究表明它会使基因"缄默",甚至会促基因毁灭 .核糖核酸在基因抑制和酶的活性中所起的作用大大出乎科学家的意料. --2001年2月公布了人类基因组详细测序结果. --开发了新型超导体,一种极小电阻导电的材料. --研制了能够在人体内找到并摧毁引起癌症病变细胞的"灵巧炮弹"式药物. --在称为神经原的脑细胞如何互相传递信号的研究中取得进展,即分子信号是如何吸引和 排斥生长的神经轴突--神经通信网络的. --国际气候变化委员会宣布,人类活动确实是造成全球变暖的一个主要原因.全球变暖是 由于二氧化碳等温室氧体造成的大气恶化. --在一个相关领域,发现美国有一个巨大的"碳吸纳池"--大片土地上生长着能从大气 中吸收多余二氧化碳的植物,它也许能减轻造成气候变化的全球变暖的影响. --发现了中微子在从太阳到地球的旅途中本身发生了变化--变为μ介子和τ介子这些已 知形式-解决了一个困扰人类40年已久的难题. --发现了被称为爱因斯坦--玻色凝聚物质.摘自<中华病理网>
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基因功能的抑制
随着人类基因组测序工作的完成,人类基因组109碱基序列中具有功能的基因约3万个,其功能基因的序列已经明了,这些基因功能的研究正在轰轰烈烈的进行中.生物体内编码基因要执行其功能,需要经历DNA的复制、转录和翻译,即基因表达的过程.因而,要了解基因的功能,可以采用转基因、诱导突变观察基因缺失型的表现,进而推测它的功能;或是从基因的DNA、RNA或蛋白水平进行干预,抑制其表达,观察基因抑制后表型变化,研究其功能.转基因和诱导特异的基因突变效率低,相对而言,随着生物技术的发展,后一种方案就简单多了,因此生命科学研究中,出现了多种在DNA、RNA和蛋白水平上抑制某个或某些特定基因发挥功能的方法,而且这些方法也越来越多地应用于基因过度表达的疾病的治疗中.
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瘤体内直接注射mIL-21基因抑制小鼠实验性淋巴瘤生长及其机制的初步研究
IL-21的生物学功能比较广泛,能促进骨髓中的NK细胞增殖与分化并表达CD16分子,与抗CD40单克隆抗体(McAb)协同可刺激B细胞增殖,与抗CD3 McAb协同可刺激T细胞增殖.我们利用先前构建的含小鼠IL-21基因重组质粒pcDNA3.1/mIL-21,直接在小鼠皮下Sp2/0肿瘤模型的瘤体局部注射治疗,探讨IL-21能否在肿瘤的基因治疗中发挥一定的作用,从而寻找新的用于肿瘤治疗的生物应答调节剂.
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逆转录病毒载体介导反义K-ras基因治疗胰腺癌的实验研究
目的:分离及克隆胰腺癌细胞基因组中K-ras基因片段,构建含反义K-ras癌基因逆转录病毒载体并探讨其对胰腺癌细胞增生、凋亡的影响及可能的分子机制.方法:设计2对PCR引物,分别在上下游引物中引进BamHI和EcoRI位点,以胰腺癌细胞株BxPC-3、PC-3基因组DNA为模板扩增K-ras基因外显子1、4及侧翼序列,将目的基因克隆入逆转录病毒载体pLXSN中,构建重组质粒,经PT-67细胞包装后获得重组逆转录病毒.将该重组逆转录病毒转染上述细胞,经G418筛选获得稳定细胞,应用MTT、流式细胞仪和免疫组化法分别研究其增生、凋亡和对胰腺癌p21蛋白表达;建立胰腺癌裸鼠移植瘤模型,观察反义K-ras基因体内治疗效果.结果:成功构建含反义K-ras基因的重组逆转录病毒载体.反义K-ras基因抑制胰腺癌细胞增生,诱导细胞凋亡、下调K-rasmRNA和P21蛋白表达,并抑制裸鼠胰腺癌移植瘤的生长.结论:反义K-ras基因可使胰腺癌细胞增生受到抑制,并可诱导细胞凋亡和下调K-rasmRNA和P21蛋白表达.
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乙型肝炎与肝癌关系
目的乙型肝炎病毒(HBV)持续感染和宿主免疫反应可导致肝细胞癌(HCC)发生.研究HBV感染致癌机制和乙肝免疫预防HCC具有重要的理论和实际意义.①从分子生物学观点出发探索HBV感染与HCC关系:与HCC相关的危险因素HBV的X ORF常整合于宿主DNA并高度表达.现有越来越多的证据表明反式激活剂HBx可能通过封闭抑癌基因p53的功能而致癌.结构与功能分析表明HBx的远C末端为其抑制p53诱导凋亡的必需区.近发现HBx基因反式激活功能区发生天然"突然”,即可消除其诱导细胞生长停顿和凋亡的效应.②HBx是一多功能调节因子:近来研究相对集中在HBx对肝细胞凋亡的作用上,促凋亡或抑凋亡.发现HBx可抑制cospase 3酶活性阻断细胞凋亡.但另有报告HBx可致敏细胞引起凋亡.联系上述HBx可封闭由于p53过表达而诱导的凋亡,可见病毒根据不同细胞环境或外来刺激采取不同的策略.③乙肝免疫预防HCC:HBV DNA,多在HBx基因整合于宿主DNA,可激活或抑制与生长增殖有关的细胞基因.如整合得到阻遏,细胞转化不至发生.台湾儿童广行乙肝免疫使HBV携带率10%降至0.9%,HCC发生率0.52%降至0.13%,证明控制乙肝是有效防癌措施.
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KAI1基因抑制胰腺癌细胞转移机制的探讨
目的本研究将pCMV-KAI1重组质粒转染人高转移胰腺癌细胞株PANC Ⅰ和MiaPacaⅡ中,观察转染前后KAI1基因对胰腺癌细胞侵袭转移能力和运动能力的影响,从基因水平探讨KAI1基因抗胰腺癌转移的能力.
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过表达P27基因抑制血管损伤后新生内膜的形成
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端粒酶催化亚基反义基因抑制卵巢癌裸鼠移植瘤生长作用的观察
端粒酶是一种具有逆转录作用的核酶,端粒酶催化亚基(hTERT)反义脱氧寡核苷酸能通过降低端粒酶活性、增强细胞周期阻滞及诱导细胞凋亡等途径,抑制卵巢癌细胞生长,与顺铂(C-DDP,简称DDP)联合应用能增强对癌细胞的杀伤作用[1-5].本研究旨在观察端粒酶hTERT反义脱氧寡核苷酸对卵巢癌裸鼠皮下移植瘤的作用,及其与DDP联合应用的效果.
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肝癌组织hSulf-1基因表达与其甲基化状态的关系
目的 研究肝细胞肝癌组织中人硫酸酯酶-1(hSulf-1)基因甲基化的状态,其mRNA以及蛋白表达情况及与甲基化状态的相关性,探讨hSulf-1基因甲基化在肝癌发生发展中的作用.方法 应用RT-PCR、甲基化特异性PCR及免疫印迹法,测定42例肝癌组织及其癌旁正常组织hSulf-1的mRNA、甲基化及蛋白表达水平,并分析hsulf-1基因表达水平及甲基化与肝癌临床特征的关系.结果 在肝癌组织中,hSulf-1 mRNA和蛋白表达水平明显低于癌旁正常组织,而正常肝组织几乎检测不到.肝癌组织hSulf-1甲基化率为66.7% (28/42),而在癌旁正常组织中hSulf-1甲基化率为7.1% (3/42),二者之间差异有统计学意义(P<0.05),在hSulf-1 mRNA表达缺失或下调的31例肝癌组织中,其中有25例发生甲基化(x2=8.45,P<0.05).在肝癌组织中,甲基化组hSulf-1 mRNA及蛋白表达明显低于非甲基化组(分别为0.687±0.092 vs 2.324±0.123,P<0.01;0.825±0.119 vs 2.212±0.178,P<0.01).hSulf-1基因甲基化与患者肝硬化密切相关.结论 肝细胞肝癌hSulf-1基因mRNA及蛋白表达明显下降、其甲基化程度明显增高,且hSulf-1基因的甲基化状态与mRNA及蛋白的表达情况具有某种联系,提示hSulf-1基因的甲基化状态可能与肝癌的发生、发展有关.
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人工遗传基因能抑制癌转移
日本大阪大学医学系和藤泽药品工业公司在用人工遗传基因抑制癌转移方面找出新方法,动物实验表明这种方法有一定效果。 癌细胞从初的患部随着血液流动到达其他器官,如果同该器官的正常细胞结合在一起就会造成癌转移。在正常细胞的表面有一种粘着因子,它能够左右癌细胞能否与正常细胞结合。 日本的实验人员通过破坏粘着因子的性能找到了抑制癌转移的途径。他们研制出与粘着因子遗传基因的碱基结构相同的人工遗传基因,用以干扰粘着因子的生成。 实验结果表明,注入这种人工遗传基因后,癌转移率明显降低。如果人工遗传基因同抗癌药物一起使用,抑制癌转移的效果更好。
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抑制Keap1基因对染砷HaCaT细胞Nrf2通路的影响
目的 观察无机砷混合物对Keap1抑制HaCaT细胞的活力及形态变化,探讨Keap1抑制及染砷对Nr2通路相关基因表达的影响,探究砷致皮肤早期氧化损伤的机制.方法 培养正常与Keap1抑制HaCaT细胞,将无机砷混合受试物按照LC50的1/100、1/50、1/10分为低、中、高3个不同浓度组,即为2.90 μmol/L、5.80 μmol/L、29.00μmoL/L,以0 μmol/L无机砷混合受试物染毒Keap1抑制HaCaT细胞组为阴性对照组,正常细胞组为空白对照组,于4个时间点(8、24、48、72 h)采用MTT法检测细胞活力,使用实时荧光定量PCR检测Nrf2通路相关基因(Nrt2、Keap1、Bach1及CBP) mRNA表达.结果 随染砷浓度增加,细胞收缩明显,边缘多不规则,脱壁明显.2.90 μmol/L混合砷染毒促进细胞增殖,≥5.80μmol/L混合无机砷染毒抑制细胞增殖.与空白对照组比较,阴性组Nrf2通路相关基因(Bach1,CBP)随时间延长,基因表达持续升高,差异均有统计学意义(F =200.261,P<0.05).与阴性组比较,2.90μmol/L染砷组24、48 h时Nri2基因表达无差异;Bach1、CBP基因表达均上调,差异均有统计学意义(F =29.015、43.964,P<0.01).5.80 μmol/L染砷组24h时Nrt2基因表达无差异,Bach1、CBP基因表达均上调;48、72 h时Nrf2、Bach1、CBP基因表达均下调,差异均有统计学意义(F =5.289、29.015、43.964,P<0.01).29.00 μmol/L染砷组24、48 h时Nrt2、Bach1、CBP基因表达均上调;72h时Nrf2、Bach1、CBP基因表达均下调,差异有统计学意义(F =34.275,P<0.01).经两两比较,72 h时随染砷浓度逐渐增加,Nrf2、Bach1、CBP基因表达逐渐下调,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 抑制Keap1基因会引起Nrf2持续激活.Bach1和CBP协同调控Nrf2通路可能在砷致氧化应激反应中起调节作用.
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Apoptin基因对小鼠S180荷瘤细胞抑制作用
目的 研究肿瘤物异性凋亡基因(apoptin gene)对肿瘤细胞的抑制作用.方法 以S-180肉瘤细胞的荷瘤小鼠为模型,用克隆的肿特异性凋亡基因的真核表达载体直接进行基因抑制,分别测定小鼠体内的肿留大小、荷瘤小鼠生存期和肿瘤细胞的凋亡.结果 与对照组相比,基因抑制组小鼠一般生长状态良好、体内肿瘤生长明显减缓(P<0.01)、生存期延长、体重增加,在基因抑制的肿瘤组织中可检测到肿瘤特异性凋亡基因mRNA的表达及肿瘤细胞的凋亡.结论 肿瘤特异性凋亡基因在体内具有明显的抗肿瘤作用,对开展肿瘤的基因治疗有一定意义.
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慢病毒介导的shRNA沉默PTTG基因抑制人PRL型垂体腺瘤细胞生长的体外实验研究的护理方式
大型生长激素( PRL)型垂体腺瘤是一种较为常见的激素分泌性垂体瘤[1],在此类型中所占的比重约为35%~45%[2],PRL垂体腺瘤种类中的侵袭性腺瘤具有全切率低、复发率高的特点[3],成为临床治疗的难点。但是经过医疗科学人员的不懈努力,终于研制出了对抗PRL垂体腺瘤的方式,但是在目前医疗技术水平条件的制约下,手术、放疗、药物等治疗措施仍很难将其彻底根治。经过体外实验研究表明,垂体肿瘤细胞转化基因( PTTG)成为了垂体腺瘤靶向治疗的重要基因之一,近年来成为垂体腺瘤基础研究的热点。
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JAZF1基因抑制对3T3-L1脂肪细胞糖、脂代谢的影响
目的 探讨JAZF1基因抑制对3T3-L1脂肪细胞糖、脂代谢相关基因的影响.方法 构建JAZF1小发夹RNA (shRNA)表达载体并转染3T3-L1细胞,实时荧光定量PCR(RT-QPCR)和蛋白印迹法检测JAZF1 mRNA和蛋白水平的表达;氢三放射示踪法检测3T3-L1细胞糖摄取率;蛋白印记法检测糖、脂代谢相关基因蛋白水平;油红O染色检测脂肪细胞甘油三酯(TG)含量变化.结果 成功构建JAZF1-shRNA;转染脂肪细胞48 h后,JAZF1 mRNA和蛋白水平明显低于对照组(P<0.05);氢3放射性示踪法显示转染组葡萄糖摄取率明显降低(P<0.05);PPAR-γ蛋白表达升高(P<0.05),激素敏感脂肪酶(HSL)、内脏脂肪素(Visfatin)、胰岛素诱导基囚-2 (Insig-2)蛋白表达降低(均P<0.05);油红O染色显示JAZF1转染组细胞内脂质积聚明显,比对照组升高约25%(P<0.05).结论 JAZF1基因抑制可减少基础糖转运,增加脂质与胆固醇合成,减少脂质分解并减少相关脂肪细胞因子的表达.
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CRISPR-Cas9技术在基因调节中的研究进展
CRISPR-Cas9技术来源于细菌的适应性防御系统,除了广泛应用的基因编辑功能之外,还可应用于基因激活或基因抑制(CRISPRa或CRISPRi)的功能研究,为研究基因调节提供了新的方法.目前,已有报道探讨了CRISPR技术在基因调节方面的潜能,该文就CRSIPR-Cas9技术在基因调节方面的研究进展以及与其它技术的比较进行了综述,并对该技术在将来的应用进行了展望.
关键词: CRISPR-Cas9技术 基因激活 基因抑制 -
短干扰RNA靶向制备的原则和方法
RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种基因表达抑制过程[1].是一种序列特异性的由双链RNA所诱导的基因沉默现象,即将特异性基因的双链RNA导入细胞或有机体,从而抑制该内源性同源基因的表达[2].
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导入细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4融合蛋白基因抑制大鼠移植肝组织中穿孔素mRNA的表达
研究表明,CD28-B7共刺激途径在T淋巴细胞活化中起主要作用,应用细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4融合蛋白(CTLA4Ig)分子阻断CD28-B7信号传导通路,导致T淋巴细胞对抗原的特异性免疫无反应性,从而抑制同种异体器官移植排斥反应.
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逆转录病毒介导的反义C-MYC的抗小鼠L6565白血病作用
目的和方法:L6565白血病是我国特有的T-S-Z淋巴瘤/白血病系统中的实验系统的瘤株之一,经检测c-myc基因高表达.本文针对c-myc基因构建一个含有小鼠反义c-myc基因片段的逆转录表达载体pGAM,用磷酸钙沉淀法将pGAM导入表达包装细胞PA317,经筛选获得病毒效价5×105 cfu/mL的病毒包装细胞,利用pGAM病毒成功的感染了L6565细胞,得到了G418抗性细胞L6565-as,经PCR分析病毒载体序列稳定地整合到PA317和L6565-as中,能够长期表达.结果:L6565-as和对照细胞光镜下形态均为圆形或椭圆形,细胞大小不一,但L6565as细胞核浆比例比对照细胞小.生长曲线和MTT法显示,L6565-as生长与对照细胞相比,生长明显受到抑制.流式细胞仪检测细胞周期:L6565as细胞G0-G1为45%,PGNsC对照和空白对照细胞分别为26%和29%.软琼脂克隆发现L6565as细胞形成克隆数量明显减少,为30个克隆/5000个细胞,空载病毒和空白对照分别为103和106个克隆/5000个细胞,二者有显著差异(P<0.001).免疫组化检测L6565as细胞c-myc蛋白表达为弱阳性(+),而对照细胞为强阳性(+++).Northern blot检测发现L6565as细胞c-myc mRNA表达比对照减少.结论:反义c-myc基因抑制了L6565白血病细胞的DNA合成,减缓了细胞的生长速度,并且使细胞恶性程度降低.本研究同时也是对我国T-S-Z系统白血病研究的一种深入.
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沉默Sam68基因抑制急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞增殖
目的:探讨Sam68对急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞增殖的影响。方法:针对Sam68 mRNA的第531~552靶位点,构建pLKO-Tet-On载体,制备慢病毒并感染、筛选Jurkat细胞,诱导干扰载体表达;采用real-time PCR和Western blot技术验证干扰效率;用体外细胞集落形成实验观察干扰Sam68基因表达后对细胞集落形成能力的影响;用流式细胞术检测分析Jurkat细胞细胞周期的变化。结果:Sam68基因表达下调能抑制了细胞的增殖和集落形成能力,导致S期细胞比例显著增加,G2期细胞比例显著降低,G1期细胞比例无明显差异。结论:shRNA靶向干扰Sam68基因的表达能有效抑制急性淋巴细胞白血病细胞系Jurkat细胞的增殖。
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沉默SIRT2基因抑制AML耐药HL60 A细胞株的增殖
目的:探讨靶向干扰SIRT2基因表达对急性粒细胞白血病( AML)多药耐药细胞株HL60A细胞增殖的影响。方法:针对SIRT2基因构建shRNA真核表达载体,制备慢病毒并感染HL60A细胞。沉默SIRT2基因之后,改良MTT法检测对HL60A细胞活力的影响;甲基纤维素集落形成实验观察对HL60A细胞集落形成能力的影响;采用流式细胞术检测分析对HL60A细胞的细胞周期的影响。结果:干扰组SIRT2基因的表达量被有效抑制;干扰SIRT2基因表达量后,HL60A细胞的细胞活力明显下降,集落形成数量减少及集落的形状减小,细胞被明显阻滞于G1/S期。结论:shRNA靶向干扰SIRT2基因的表达可有效抑制急性粒细胞白血病耐药细胞系HL60A细胞的增殖。