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大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养与多向分化鉴定
目的::建立体外分离、培养及纯化大鼠骨髓间充质干细胞( mesenchymal stem cells, MSCs)的方法,并对细胞进行形态学观察、表面标志物鉴定及分化潜能检测,为大鼠MSCs 进行细胞移植治疗脑损伤的研究奠定基础。方法:用全骨髓贴壁培养法分离、培养、纯化大鼠MSCs,倒置相差显微镜进行形态学观察,流式细胞仪检测细胞表面标记物,定向诱导向成脂、成骨方向分化。结果:72小时首次全量换液7天后观察可见呈放射状排列的细胞集落,以梭形细胞为主,细胞规则、生长旺盛,可连续传代10代以上;取3代MSCs流式细胞仪检测,CD90呈阳性表达,CD34、CD45均呈阴性表达;细胞传代后加入成脂、成骨诱导剂定向诱导分化,油红O染色及茜素红染色均呈阳性。结论:全骨髓贴壁筛选培养法可大量分离、纯化、扩增大鼠MSCs。经诱导鉴定MSCs 具有多项分化潜能。
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"胰岛代理细胞"的构建:在HepG2细胞中获得胰岛素分泌
目的:利用转基因技术将HepG2细胞改建为具有生理性胰岛素分泌能力的"胰岛代理细胞".方法:以携葡萄糖激酶(glucokinase,gk)基因的逆转录病毒及携人胰岛素原基因突变体(mutant proinsulin gene,mpin)的逆转录病毒共同感染肝母细胞瘤细胞系HepG2,G418选择培养基挑选抗性细胞集落,放免法、SDSPAGE、Western-blot及反转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)鉴定HepG2细胞中两个目的基因的转录及表达;选取联合表达葡萄糖激酶及成熟胰岛素的HepG2细胞进行葡萄糖反应性胰岛素分泌的检测,以单独表达成熟胰岛素的HepG2细胞作对照.结果:在G418选择培养基中3 wk获阳性细胞克隆,采用放免法、SDS-PAGE、Western-blot从20个细胞克隆中挑选出联合表达葡萄糖激酶及成熟胰岛素的HepG2细胞4株,其中1株2个目的基因表达均较强,命名为细胞克隆"β";经RT-PCR检测证实细胞"β"中已有两个目的基因的转录.在细胞"β"中,葡萄糖浓度为0.5 mmol/L和0.75 mmol/L时,胰岛素的分泌无显著性差异(P>0.05);葡萄糖浓度为2.0 mmol/L,3.0 mmol/L,4.0 mmol/L,5.0 mmol/L,及6.0 mmol/L时,胰岛素的分泌无显著性差异(P>0.05);其余葡萄糖浓度条件下,胰岛素的分泌差异均有显著性意义(P<0.05).在单独表达胰岛素的HepG2细胞中,各葡萄糖浓度条件下,胰岛素的分泌均无显著性差异(P>0.05).说明在细胞"β"中获得了葡萄糖反应性胰岛素分泌,葡萄糖浓度约1.75-2 mmol/L时出现胰岛素分泌高峰.结论:成功构建了具有生理性胰岛素分泌能力的"胰岛代理细胞"系.
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来源于人胎肝干细胞的肝癌细胞系建立及初步研究
目的:研究肝癌细胞发生发展及变化规律,探讨胎肝干细胞体外长期培养的变异归宿问题.方法:原代分离培养人胎肝干细胞,从中筛选出一生长旺盛之集落,体外长期培养,并对其生物学特性进行初步鉴定.进行了细胞倍体分析;应用流式细胞仪分析了细胞周期;在Scid鼠体内接种细胞进行成瘤性验证.结果:从人胎肝组织中成功分离出一胎肝干细胞集落,在体外长期培养下可分化为肝癌细胞.其细胞增值核抗原指数高达100%;倍体分析常见多倍体细胞;流式细胞仪分析细胞周期,结果G1期细胞约占48%,G2期细胞约占18%,S期细胞约占34%.Scid鼠体内成瘤实验显示,接种细胞后2-3 wk成瘤,具有100%的成瘤性.显微镜下所见细胞大小不一,异型性明显,核仁大,核分裂活跃.结论:人胎肝中存在具有干细胞特性的原始细胞,确实可分化为肝癌细胞.从人胎肝干细胞中分离培养出肝癌细胞对于肝癌发生发展及其变化规律的深入研究奠定了基础.
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大鼠骨髓间充质干细胞原代培养换液频度与细胞增生的关系
目的:探索成体大鼠的骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离、体外培养方法,观察采用不同的换液频度与细胞增生和生长的关系,为其应用提供实验依据.方法:从大鼠股骨获取骨髓,采用梯度离心的方法进行分离,在含10 mL/L胎牛血清的DMEM中常规培养,以MTT法检测不同的时间换液时细胞的生长曲线,并用碱性磷酸酶(AKP)检测的方法对分离的细胞进行鉴定.结果:采用梯度离心方法分离的骨髓间质干细胞的纯度较高,细胞活性佳,AKP染色为强阴性.首次换液后,每天更换培养液比每隔3-4 d换液一次更有利于MSCs的增生,原代长满培养瓶底比每隔2-3 d换液一次平均提前2 d.结论采用梯度离心的方法分离可获得纯度较高的骨髓间质干细胞,是简单易行的分离方法,每天更换培养液比每隔3-4 d换液一次更有利于MSCs的增生和形成形态均一的细胞集落.
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肺癌微转移的分子诊断研究进展
近30年来,随着外科技术和相关学科的发展,早期和中期肺癌的手术切除率明显提高,但术后复发率仍有25%~50%,总5年生存率始终徘徊在40%左右.肿瘤患者的高病死率与癌细胞发生异位隐匿性微小转移有关.在病程的早期,癌细胞就可能播散到原发灶以外的远处部位,而传统的诊断学方法不能检测到这种发生异位播散的隐匿性单个癌细胞或癌细胞集落[1].
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地甘口服液对辐射损伤小鼠外周血TNF、SOD和微核的影响
在临床应用地甘口服液减轻放、化疗毒副作用较好疗效的基础上,为进一步探讨该药的作用机理,我们曾进行过系列的实验研究,包括免疫功能和造血干祖细胞集落的形成等[1,2].
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125I-G3的制备与示踪动力学初探
G3是重组人巨噬细胞粒细胞集落生成因子(GM-CSF)与白细胞介素-3(IL-3)融合蛋白的简称.国外报道称PIXY321(Saroj VR, Nicholas E, Papodopoulos MA, et al. J Clin Oncolo, 1994,12:715~724).G3是利用基因工程技术将GM-CSF与IL-3二者基因连接起来并在大肠杆菌体内表达而获得.
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抑制CD147表达对Jurkat T淋巴细胞集落形成的影响
目的 研究小干扰RNA抑制CD147基因对Jurkat T淋巴细胞集落形成的影响.方法 将CD147特异的siRNA,经LipofectamineTM2000转染Jurkat细胞48 h后,用半定量RT-PCR检测CD147 mRNA水平的变化,Western blot和流式细胞术(FCM)分别检测总蛋白和细胞表面蛋白水平的变化.通过荧光倒置显微镜比较特异性抑制CDl47表达后Jurkat细胞集落形成的变化.结果 与对照组相比siRNA干扰组细胞CD147 mRNA和蛋白水平的表达均降低,抑制率分别为(38.57±1.55)%和(47.4±1.47)%,细胞表面CD147的平均荧光强度(MFI)下降(50.5±4.7)%(P<0.05).随着CD147被抑制,siRNA干扰组细胞集落形成明显少于对照组(P<0.05).结论 通过siRNA能抑制Jurkat细胞CD147的表达,随着CD147表达下降细胞集落的形成减少,提示CD147可能在炎症细胞粘附聚集中起到一定作用.
关键词: 小干扰RNA CD147 Jurkat T 淋巴细胞 细胞集落 -
缺氧对人造血干细胞影响的观察
为进一步探讨缺氧对造血组织的损害情况,我们设置缺氧环境,观察了缺氧对正常造血干细胞的直接损伤及缺氧环境下人造血干细胞生成情况.1 材料与方法 (1)标本取自本院骨髓检查正常者,其中男19例,女11例,年龄21~45岁,随机分……
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再生障碍性贫血合并T细胞淋巴瘤一例
患者,男,26岁。因诊断为慢性再生障碍性贫血(再障)5年,反复发热、牙龈出血4月余、脐周疼痛3月余,于1999年10月28日入院。5年前,无诱因出现牙龈出血,头昏乏力,双下肢皮肤瘀点、瘀斑,口腔溃疡。后因鼻出血不止查血常规,示血细胞三系下降;骨髓涂片及活检示再障,予康力龙、左旋咪唑、再障生血片及输血等治疗,病情好转,坚持服药治疗。4个月前,反复低热,牙龈出血,面色苍白,进行性加重。3个月前出现脐周疼痛,无便血。遂来门诊检查血常规:WBC 2.6×109/L,Hb 30?g/L,BPC 13×109/L,收入院。查体:重度贫血貌,皮肤粘膜无出血斑点,全身浅表淋巴结未扪,双肺无异常体征,心率116次/min,心尖区可闻及Ⅱ级收缩期吹风样杂音。腹软,肝脾未扪及,右肝区叩痛,莫菲氏征(-),右腹部深压痛,无反跳痛。入院后查血常规示:Hb 48 g/L,RBC 1.2×1012/L,WBC 2.0×109/L,BPC 23×109/L,再次骨髓涂片及活检示:骨髓增生极度低下,非造血细胞增多。干细胞培养:每2×105个骨髓有核细胞粒细胞集落2个(正常人对照为43)、大丛18个(127)、小丛44个(47),细胞抑制试验不明显,血清抑制试验率51%;每1×105个骨髓有核细胞红细胞集落5个(正常人对照为135),细胞抑制试验(-),血清抑制试验率56%,符合慢性再障。B超示:胆囊结石,胆囊炎。予抗感染、解痉、免疫抑制剂环孢菌素A等治疗1月余无效,呈低至中度发热,且伴腹痛时便血。血培养(-)。再次B超示结肠肝曲到回盲部约10 cm肠壁增厚。内窥镜检查示:病变位于结肠肝曲至回盲部,约8 cm长,且见升结肠、盲肠有巨大溃疡,底不平,周边糜烂、充血、水肿,溃疡边缘不规则,并可见有息肉样隆起物,占据肠腔,肠壁僵硬,余肠腔可见出血点及出血斑。示结肠溃疡,多系淋巴瘤。转外科行根治性右半结肠切除术,回盲肠、横结肠吻合术。术中探查未见转移灶,肿块位于升结肠与回盲部交界处,约7 cm×6 cm大小,已突破肠管浆膜层,术中清扫周围淋巴结。术后剖开标本见肿块中央5 cm×3 cm大溃疡。病检示:回盲部非霍奇金淋巴瘤,多形性、中等细胞性。免疫组化染色瘤细胞:UCHLI(+)、L26(-)、CD68(-),浆细胞为Kappa(+)、Lambda(+),支持Tc来源。病变周围淋巴结病检未见浸润。术后伤口恢复欠佳,无发热、腹痛、腹泻、便血。1个月后复查骨髓涂片及活检示:增生极度低下,非造血细胞增多,符合再障。继续按再障治疗及CHOP方案化疗。
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脐血干/祖细胞的生物学特点
脐血是一重要的造血干/祖细胞(HSPC)来源,可用作临床干细胞移植,目前有关脐血的研究主要集中于HSPC的比例、细胞亚群的划分、对造血因子刺激的反应能力、增殖/扩增潜能的控制及HSPC体外扩增的条件等。研究表明,脐血和成人骨髓来源的HSPC功能有显著不同,我们力图在细胞和分子水平论述其生物学特点。1 脐血中HSPC的比例研究表明,1?ml脐血中大约有原始红系祖细胞(BFU-E)8?000个,髓系祖细胞(CFU-GM)13?000~24?000,多能祖细胞(CFU-GEMM)1? 000~10?000。由于培养条件的不同,各家报道有一定差异,特别是CFU-GM和CFU-GEMM两项指标差异更大。事实上,许多研究证实,在半固体培养中加入干细胞因子(SCF)会明显提高CFU-GM、CFU-GEMM检出率。脐血和骨髓中HSPC含量相似,但HSPC亚群比例尚有很大差异,主要表现在以下几个方面:①脐血中BFU-E水平高于骨髓;②脐血和骨髓中CFU-GM水平相似,但脐血中更幼稚的双能粒-单核祖细胞含量明显高于骨髓;③脐血中不成熟的巨核祖细胞集落(>200个细胞)较多;④脐血中CFU-GEMM数比骨髓高4倍。脐血中高增殖潜能集落形成细胞(HPP-CFC)比骨髓大约高8倍;体外检测中接近人干细胞的长期培养启始细胞(LTC-IC)的比例二者相似,骨髓和脐血LTC-IC培养5周和8周产生的鹅卵石区分别为1∶13?314和1∶33?949,1∶12?506和1∶34?546,从这些结果可推测脐血中干细胞数与骨髓相当。
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活动期强直性脊柱炎患者巨噬细胞集落刺激因子表达的研究
强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)是血清阴性脊柱关节病的代表疾病,骶髂关节是AS易受累的关节,骶髂关节炎也因此成为诊断AS的必备条件.国外研究证实AS患者骶髂关节局部存在巨噬细胞的异常浸润,表明其在骶髂关节炎形成过程中可能扮演重要角色.
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第12例——呕血、口干、眼干、粒细胞缺乏
1 病历摘要 患者:男,63岁。主因反复上腹不适1年,间断呕血2个月,高热3 d入院。始于1999年6月无诱因反复上腹不适、腹胀,大便次数增加,3~4次/d,有时不成形,无黑便,未诊治。2000年4月17日晚餐后2 h恶心、呕鲜血2次约1 000 ml,后排暗红色便2次,量不详,伴头晕、心悸。4月18日晨来我院急诊,查血:血红蛋白61 g/L。B超:肝回声不均、脾稍大。给予三腔管压迫、抑酸、止血、输血及补液治疗,出血停止。入院后查:乙型肝炎核心抗体(HBcAb)(+),甲型肝炎抗体(HAVAb)、丙型肝炎抗体(HCVAb)、戊型肝炎抗体(HEVAb)均阴性。胃镜示:重度食道下段、胃底静脉曲张。抗SSA 1∶4,ANA 1∶640 (+),口腔科及眼科检查符合口、眼干燥征。5月31日出院诊断:干燥综合征,肝硬化,门脉高压,重度食道下段、胃底静脉曲张,上消化道出血。出院后口服保肝药、速尿、高舒达和枸钾治疗。6月8日晚餐后3 h呕鲜血3次约1 500 ml,排暗红血便1次,量不详。测血压85/60 mm Hg,血红蛋白 73 g/L,白细胞2.1×109/L,血小板48×109/L,给予立止血、止血定、洛赛克及输血补液治疗,未再呕血。6月9日出现恶寒、寒战、发热,体温39.7 ℃,复查血白细胞(0.6~0.8)×109/L,予粒细胞集落生长因子(G-CSF) 300 U皮下注射,每天1次,罗氏芬2.0 g静点,每天1次,治疗3 d,仍发热,白细胞未上升,于6月12日二次入院。发病以来,患者有口干、眼干,无龋齿、无胸闷、气短及夜尿增多。既往史:1995年诊为2型糖尿病,空腹血糖高11.1 mmol/L,长期服降糖灵25 mg,每天3次。从事印染工作20年。少量饮酒10年,平均每日饮白酒一两,已戒酒5年。
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CF-1小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的制备
背景:小鼠胚胎成纤维细胞作为干细胞生长用饲养层,优于无饲养层,它能够分泌一些既促进干细胞生长又能抑制干细胞分化的因子.目的:建立CF-1 小鼠胚胎成纤维细胞饲养层佳的分离培养方法,分析丝裂霉素C 抑制成纤维细胞增殖的佳浓度与时间,用于培养诱导多能性干细胞.方法:取孕10~15 d CF-1 小鼠,分离胎鼠原代成纤维细胞,经不同质量浓度(5,10,15,20 mg/L)丝裂霉素C 处理不同时间(1,1.5,2,2.5,3 h)制备饲养层,并观察其增殖情况.将人诱导多潜能干细胞或胚胎干细胞在丝裂霉素C 处理过的饲养层上培养,观察细胞集落生长情况.结果与结论:制备CF-1 小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的佳胎龄为13.0~14.0 d.丝裂霉素C 抑制CF-1 小鼠胚胎成纤维细胞增殖的佳浓度及作用时间为10 mg/L,2.5 h,成纤维细胞饲养层可以维持5~7 d.诱导多能性干细胞与胚胎干细胞在经10 mg/L 丝裂霉素C 处理2.5 h 后饲养层上能发育成典型的"鸟巢"状干细胞集落.
关键词: 胚胎成纤维细胞 诱导多潜能分化干细胞 饲养层 丝裂霉素C 细胞集落 -
胎盘来源细胞与母血、脐血细胞的嵌合
背景:胎盘中含有丰富的细胞群,因其中 CD34+细胞含量高而受到越来越多学者的关注,有望成为临床造血干细胞移植治疗血液病及其他恶性疾病的新来源。
目的:探索胎盘来源细胞的数量、集落形成能力及其与母体的嵌合程度。
方法:采用健康足月剖腹产妇的胎盘,灌注法及组织块消化法收集胎盘中细胞;流式细胞仪检测胎盘及脐血中 CD34+细胞比例;培养细胞集落,定期观察集落形态并计数;序列特异性引物 PCR 扩增技术及序列特异性寡核苷酸探针方法检测胎盘、脐血和母亲外周血的HLA类型;短串联重复PCR方法检测胎盘细胞、脐血细胞和母亲外周血细胞的嵌合情况。
结果与结论:胎盘中 CD34+细胞数量明显优于脐血,且胎盘具有体外多种集落形成能力,集落形成良好,同时胎盘提取细胞中含有母体来源成分。提示胎盘中细胞数量及其基本生物学特性使其有潜力成为临床造血干细胞移植的新来源。 -
粒细胞集落刺激因子检测的临床意义/Ips Empress 2全瓷修复的临床体会/产后出血的临床分析及预防
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骨髓CD34+造血干/祖细胞的分离、纯化及鉴定
造血干细胞(HSC)工程是利用HSC的生物学特征,通过细胞工程的技术,在体外模拟或部分模拟体内的造血过程,对分离纯化的造血干/祖细胞(HSC/HPC)进行体外扩增、定向诱导分化、功能激活与调控、目的基因转染等,终将造血细胞治疗更广泛有效地应用于干细胞移植、生物免疫治疗、造血支持治疗和基因治疗等领域.可见,从骨髓、脐血和外周血中分选纯化HSC/HPC对造血细胞增殖分化的基础研究及临床应用至关重要.CD34抗原是常用来分选纯化HSC/HPC的表面标志[1].我们采用免疫磁珠阴性分选策略,从骨髓细胞中纯化CD34+HSC/HPC,经流式细胞术与免疫组织化学检测CD34+细胞的富集程度,并对分选细胞进行造血祖细胞集落鉴定.本研究旨在为研究造血干/祖细胞增殖分化的调控奠定实验基础.
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吉粒芬在2例复发性恶性淋巴瘤患者自体外周血干细胞移植中的应用
自体外周血造血干细胞移植是恶性淋巴瘤患者综合性治疗的重要手段.临床研究表明,高剂量化疗联合自体外周血造血干细胞移植治疗可以明显提高恶性淋巴瘤患者的缓解率,延长无病生存率和总生存率.重组人粒细胞集落生长因子(rhG-CSF)广泛应用于自体外周血造血干细胞移植.近,我们将国产rhG-CSF应用于2例行自体外周血造血干细胞移植的复发性恶性淋巴瘤患者,获得成功且未观察到明显的毒副作用.
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老人贫血
老年人所患血液疾病多的是贫血,其中有80%以上是源于造血功能下降和其他疾病而出现的继发性贫血.老年人各脏器萎缩,具有造血作用的骨髓组织也不例外.健康的老人也会随年龄增长,出现轻度红细胞减少和血红蛋白下降.老年人骨髓中脂肪组织增加,60岁以后腰椎椎体内骨髓组织可被脂肪取代50%以上,骨髓腔面积比青年时减少20%~25%,出入骨髓腔内循环血液量可减少55%~67%,同时造血干细胞中红细胞集落形成能力也明显下降.
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康力龙联用田可对慢性再障患者疗效及细胞集落影响的研究