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大鼠骨髓间充质干细胞原代培养换液频度与细胞增生的关系
目的:探索成体大鼠的骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离、体外培养方法,观察采用不同的换液频度与细胞增生和生长的关系,为其应用提供实验依据.方法:从大鼠股骨获取骨髓,采用梯度离心的方法进行分离,在含10 mL/L胎牛血清的DMEM中常规培养,以MTT法检测不同的时间换液时细胞的生长曲线,并用碱性磷酸酶(AKP)检测的方法对分离的细胞进行鉴定.结果:采用梯度离心方法分离的骨髓间质干细胞的纯度较高,细胞活性佳,AKP染色为强阴性.首次换液后,每天更换培养液比每隔3-4 d换液一次更有利于MSCs的增生,原代长满培养瓶底比每隔2-3 d换液一次平均提前2 d.结论采用梯度离心的方法分离可获得纯度较高的骨髓间质干细胞,是简单易行的分离方法,每天更换培养液比每隔3-4 d换液一次更有利于MSCs的增生和形成形态均一的细胞集落.
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大鼠肝卵圆细胞的分离与鉴定
目的:分离、培养和鉴定大鼠卵圆细胞.方法:以3'-me-DAB刺激卵圆细胞迅速增生,改良梯度离心法分离、培养大鼠卵圆细胞,观察其形态及增值特点并进行细胞免疫组织化学鉴定.结果:改良的梯度离心的方法能够有效地分离大鼠肝卵圆细胞,卵圆细胞胞体为卵圆形,代谢缓慢,具有干细胞的特点,可以形成集落,并且表达OV6、CD34及Nestin.结论:改良梯度离心法分离的细胞具有干细胞的特点,可以表达卵圆细胞特异性的表面标记OV6、造血干细胞表面标记CD34和神经中间丝蛋白Nestin,具有横向分化的可塑性,为进一步实验研究提供参考依据.
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无羟乙基淀粉条件下应用血细胞分离机采集中性粒细胞
由于中性粒细胞的比重(1.087～1.092g/ml)与红细胞的比重(1.088～1.096g/ml)相差很少,采用梯度离心原理的血细胞分离机采集中性粒细胞时,通常需要借助红细胞沉降剂--高分子量羟乙基淀粉(6%),将红细胞网络成钱串状以增大其比重,从而与中性粒细胞分开,同时将46.7%的枸橼酸钠注入羟乙基淀粉中充当血液抗凝剂.我们于2005年1月至2006年12月尝试在无羟乙基淀粉采样下,对4例健康供者采用粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和地塞米松动员后应用COBE Spectra血细胞分离机采集中性粒细胞,效果满意,报告如下.
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Nageotte计数方法改良分析
去白细胞成分血在我国已广泛应用,但多数医院输血科未能对去白细胞成分血的残留白细胞进行质量控制,主要原因是检测方法(常规Nageotte计数法)较难掌握.常规Nageotte计数法计数残留白细胞,其敏感度可达0.1个白细胞/μl.但细胞计数时,血样本须用Tuk's白细胞稀释液稀释10倍,以溶解红细胞.南于白细胞在破碎的红细胞层,龙胆紫染色后,在显微镜目镜20倍或物镜10倍强光下才能辨认,目前输血科多数显微镜达不到上述要求,我们尝试血标本用Percoll液梯度离心,取得良好效果,现报告如下.
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梯度离心法制备鸡肝微粒体方法的建立
目的:建立梯度离心法制备鸡肝微粒体的方法.方法:利用蔗糖密度梯度离心法制备鸡肝微粒体,经透射电镜和Western-blot检测肝微粒体纯度,BCA法检测总蛋白质含量,CO差示光谱法检测总CYP450含量.结果:电镜下,制备的肝微粒体可清楚见到大量膜囊泡状结构,其它污染细胞器成分较少见;制备的肝微粒体仅与GRP94抗体特异性结合;肝微粒体总蛋白质含量与总CYP450含量分别为8.749 mg/mL和0.763 nmol/mg.结论:利用蔗糖梯度密度离心法制备得到高质量鸡肝微粒体蛋白,为鸡细胞色素P450的深入研究奠定了基础.
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同一献血者血液两种方法制备浓缩血小板结果对比
尽管PRP-PC被认为是制备浓缩血小板的传统方法,但它与血小板激活相关[1,2].Hogman等认为BG-PC法制备血小板的血浆产量高,血小板损伤小,终PC中RBCs和WBCs较少[3].参照国际标准[4],我们对同一献血者血液采用改良富浆法和梯度离心结合白膜法制备的血小板浓缩液72例(36人份)进行检测对比,现将结果报告如下.
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梯度离心筛选制备浓缩血小板成分血的调查研究
筛选成分血献血者能保证细胞的量稳定,且可减少临床交叉配血次数[1].筛选工作不易常规进行,因此多数单位成分血多取自随机采取的全血.为摸索一种通过离心来达到筛选目的,笔者经长期观察和实践,根据全血梯度离心后白膜成形状态及数量差异,以白膜制备浓缩血小板,对制备的浓缩血小板制品与白膜形态及数量之间是否相关,以及离心后白膜数量的直观观察能否间接地达到替代筛选浓缩血小板成分血的目的进行了调查研究,现报告如下.
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蔗糖梯度离心技术方法在提取内质网的应用
目的:通过蔗糖梯度离心方法提取内质网,探讨在内质网提取过程中质量控制的关键要素.方法:本文利用蔗糖建立连续的密度梯度,通过超速离心提取HEK293/wt细胞中的内质网,并利用Western blot技术、内质网特异性抗体Bip/GRP78对内质网所处位置进行检测,确定内质网所在层面,成功提取高浓度、高质量的内质网.结果:通过对HEK293/wt细胞的破膜方法和离心时间进行调整,经Western blot技术检测,内质网位于蔗糖梯度的第10、11、12层.结论:选择合适的破膜方法和离心时间是成功提取高浓度、高质量内质网的关键.
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献血者血常规筛选对机采血小板的影响
机采血小板具有产量高、纯度高、红细胞及白细胞污染率低,临床治疗效果好、输血不良反应及经血传播疾病发生率低的优点,现受到临床的欢迎且被广泛应用[1].2002年我站引进了CS-3000PLUS血细胞分离机,该电机系微电脑控制,采用梯度离心原理分离血细胞.为给临床提供合格和优质的血小板制品,在实际工作中影响机采血小板的因素很多,诸如:血细胞分离机分离血小板的程序设置、收集夹类型、献血者血常规筛选等等.现就献血者血常规的筛选对机采血小板合格率及优质率的影响进行如下分析.
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卵圆细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞
背景:原代分离的肝卵圆细胞具有双向分化的能力和橫向分化的可塑性.目的:分离大鼠肝脏卵圆细胞,在化学诱导剂作用下使其定向分化为胰岛素分泌细胞.设计、时间及地点:对照观察细胞实验,于2007-05/2008-01在解放军总医院基础研究部,国家重点实验室完成.材料:SPF级SD大鼠,体质量(120±20)g.方法:采用改良梯度离心法分离、培养大鼠肝卵圆细胞,并行免疫组织化学鉴定.随后将卵圆细胞置于含有诱导剂Nicotimide和高浓度葡萄糖的RPMI 1640培养液继续培养,同时以不含诱导剂的RPMI 1640培养液培养的卵圆细胞作为阴性对照.主要观察指标:采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、酶联免疫吸附实验、放射免疫分析检测两组卵圆细胞胰岛素的表达.结果:改良的梯度离心方法分离的细胞具干细胞特点,可形成集落,并且OV6、CD34、Nestin染色呈阳性.分离的大鼠肝卵圆细胞,加入诱导剂Nicotimide和高浓度葡萄糖诱导培养l周后,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、酶联免疫吸附、RIA检测均显示胰岛素分泌量远高于不含诱导剂细胞(P<0.05).结论:化学诱导剂Nicotimide和高浓度匍萄糖可以在短时期内作用肝卵圆细胞可启动胰十二指肠同源盒基因-1基因,使之定向分化为胰岛素分泌细胞.
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兔骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定
目的:寻求家免骨髓间充质干细胞(BoneMesenchymal StemCells,BMSCs)培养与分离简单易行的方法,为下一步骨髓间充质干细胞在呼吸系统疾病的应用打好基础.方法:取3个月龄家兔1只,经双侧髂前上棘抽取骨髓共5.0ml,密度梯度离心法和贴壁筛选法相结合分离、纯化获得BMSCs,倒置差显微镜观察其形态学特性,流式细胞仪鉴定CD34、CD133表达.结果:接种细胞于24小时有少量细胞贴壁,72小时多数细胞可贴壁,贴壁细胞形态多为长梭型或多边形,原代细胞呈集落生长,12-16天可达90%融合,1%胰酶消化后传代培养,培养至第三代备用.流式细胞仪鉴定90%为骨髓间充质干细胞.结论:通过密度梯度离心法与贴壁筛选法可成功分离培养出骨髓间充质干细胞,此方法简单易行,成功率比较高.
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脑梗死病人急性期血小板密度、细胞内游离钙及其功能的变化
目的观察脑梗死病人急性期血小板密度、细胞内游离钙浓度及血小板聚集和释放的变化.方法以梯度离心法制备血小板密度亚群,激光共聚焦显微镜法测定Fluo-3/AM负载后血小板细胞内游离钙荧光强度的变化,以透光度法和介质中ATP的量评价血小板的凝集和释放反映.对照组和实验组血小板分别来自于正常志愿者和脑梗死病人急性期的静脉血.结果①Percoll梯度离心的结果表明,脑梗死病人急性期血液中高密度亚群(比重＞1.062)血小板的数量与对照组 [(24.6±8.6)%,n＝5]比较显著增多[(52.1±11.4)%,n＝6,P＜0.001],上述结果与共聚焦显微镜直接观察的结果一致.②与对照组相比3 μΜ ADP介导的聚集反应增强[(69.4±19.8)%,P＜0.01],介质中ATP的含量为1.26±0.44(P＜0.0 1) .③对照组和实验组细胞内钙的静息水平无明显差异,加10 μΜ ADP后,实验组细胞内钙的荧光强度增加明显(862±319,P＜0.01).结论与对照组比较,脑梗死病人急性期,高密度亚群血小板的数量显著增加.血小板聚集和释放功能明显增强,这一结果可能与细胞游离钙增加有关.
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树突状细胞的分离纯化与鉴定
树突状细胞以其独特的抗原递呈和免疫调控作用越来越引起人们的重视,通过梯度离心、尼龙毛分离、花环沉淀、免疫磁珠等方法可获得大量的高纯度树突状细胞,为其基础与临床研究开辟了广阔的前景.
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分步离心和梯度离心制备大鼠脑突触体方法的比较
通过比较了单层蔗糖分步离心和不连续蔗糖梯度离心制备的大鼠脑突触体对5-羟色胺和去甲肾上腺素的再摄取能力.结果表明,采用分步离心法可减少制备突触体的时间,降低操作难度,所得脑突触体具有有效蛋白含量较高、稳定性较好的优势.该法所制备的突触体对相应递质的特异性摄取能力有所提高.
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SD大鼠肝枯否细胞分离培养的改良方法与鉴定
目的 枯否细胞(Kupffer cells,KC)是肝内巨噬细胞群,活化的KC参与多种生物、病理学反应过程.然而,KC分离、培养技术进展缓慢.为研究KC致炎、抗炎活化机制,旨在建立经济、简便、有效、稳定分离培养SD大鼠肝KC的方法.方法 选用健康雄性SD大鼠,采用0.05%IV型胶原酶灌注肝,经25%和50%percoll密度梯度离心,提取肝KC.荧光显微镜下观察细胞自发荧光情况,锥虫蓝拒染实验鉴定细胞活力,倒置显微镜下观察KC培养过程中细胞形态变化,吞噬墨水、latex珠实验以及免疫细胞化学染色法鉴定细胞纯度.结果 大鼠肝KC得率为(3.22±0.31)×107(n=24),细胞活力为(92.35±0.13)%,细胞纯度均在(94.62±0.24)%.结论 该方法简单、可行,为进一步研究KC功能和作用机制奠定基础.
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改进的大鼠原代Kupffer细胞分离与鉴定方法
目的 改进原分离方法,探索出一种稳定性强、经济实用、高纯度的大鼠原代Kupffer细胞(Kupffer cells,KC)的分离方法.方法 (1)原位胶原酶灌注法;(2)Percoll液不连续的密度梯度离心以分离Kupffer细胞;(3)选择性贴壁纯化Kupffer细胞;(4)Kupffer细胞吞噬墨汁实验、CD68免疫荧光染色鉴定.结果 Kupffer细胞得率≥(7～8)×107/肝,纯度≥98.0%,Kupffer细胞吞噬活性强.结论 此方法稳定性强、经济实用、KC纯度高及性能优良,可满足PRC、Western blot等分子生物学所需要的原代细胞数.
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改良白膜法制备汇集浓缩血小板的临床应用
目的 本研究旨在改进手工制备浓缩血小板方法,提高血小板制备质量.方法 在白膜法的基础上,延长血小板解聚时间,汇集多人份白膜层,第2次离心时采用二元无聚梯度离心原理,收集血小板.结果 7份按本法制备的汇集浓缩血小板(10 U/袋).其血小板计数、血小板回收率及白细胞、红细胞混入量、容量分别为(2.90±0.32)×1011、(66±4)%、(4.2±1.9)×109/袋、(7.2±2.3)×109/袋、250～300 ml.结论 本法制备的手工血小板回收率较高,质量指标全部超过全血和成分血国家质量标准,适宜血站推广应用.
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梯度离心法在肿瘤药物敏感性试验中的应用研究
目的研究梯度离心法在肿瘤细胞药物敏感性试验中的应用.方法采用淋巴细胞分离液梯度离心法分离纯化癌细胞,MTT比色法测定45例体外原代癌细胞对8种常用化疗药物的敏感性.结果采用梯度离心法收集纯化癌细胞,癌细胞获得百分率为94.65±28.47,药敏阳性率为71.11%,与传统方法相比,差异有非常显著性(P＜0.01).结论梯度离心法MTT肿瘤体外药敏试验是一种良好的实验方法,值得在临床工作中推广.
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治疗性血液成分单采术18例护理体会
治疗性血液成分单采术是应用梯度离心原理,利用血液成分分离机,清除血液中的病态成分,以达到治疗相关疾病的目的[1].我科自1998年10月引进CS 3000PLUS血液成分分离机,进行各种治疗性血液成分单采术18例.现将护理体会介绍如下.
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两种方法分离小鼠脾原始T淋巴细胞效果比较
目的 比较Ficoll-Paque梯度离心法与免疫磁珠法分离T淋巴细胞的效果差异,筛选有效的、优异的分选小鼠脾原始T淋巴细胞方法. 方法 分别采用Ficoll-Paque梯度离心法及Miltenyi Biotec免疫磁珠进行小鼠淋巴细胞分离.血小板计数器统计单核淋巴细胞数,苔盼蓝染色判断细胞存活率,流式细胞术鉴定CD4+CD62+T淋巴细胞纯度,并进行统计学分析. 结果 免疫磁珠法CD4+CD62+T淋巴细胞纯度较高为(66.27±3.52)％,Ficoll-Paque梯度离心法细胞纯度为(15.27±4.16)％,两者比较差异有统计学意义(P＜0.01)；但Ficoll-Paque梯度离心法获取淋巴细胞数(1.47±0.35)×108较免疫磁珠法的(0.67±0.26)×108多,两者比较差异有统计学意义(t=8.199,P＜0.01),且Ficoll-Paque梯度离心法细胞存活率(93.9±2.6)％较免疫磁珠法的(89.9±2.9)％高,两者比较差异亦有统计学意义(P＜0.05). 结论 免疫磁珠法适合分离小鼠脾原始T淋巴细胞并用于细胞纯度要求高的免疫学实验,但细胞得率需进一步优化.
