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肝脏干细胞的研究进展
干细胞为机体进化过程中高度保守的细胞族,在机体细胞再生调控中具有特殊的作用.目前认为以肝内胆管系统源性为主的多潜能肝脏干细胞分化群,既可向胆管细胞分化,又可向肝细胞分化.近年来,在现代细胞生物学、分子生物学及分子遗传学研究推动下,有关肝脏干细胞定位、来源、发生、演变、功能及体外培养、鉴定技术等研究取得了较大进展,本文将近年来的主要进展作一综述.
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肝脏干细胞和胰脏干细胞与其他细胞的联系和转分化
肝脏和胰脏均属消化腺,都具有内分泌和外分泌功能,都来源于内胚层,在发生上有密切联系,肝脏干细胞、胰脏干细胞与其他细胞在发生、功能、再生中的联系和转分化研究得越来越深入,我们就有关这方面的进展作简要综述.
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肝脏干细胞研究进展
干细胞是不分化而长期生存,具有自我更新能力且保持多种分化潜能的一种细胞群.从功能上定义,肝脏干细胞(hepatic stem cell,HSC)是指在特定的条件下能增殖分化为有功能的肝脏组织的细胞.根据肝脏干细胞的存在位置,分为内源性肝脏干细胞和外源性肝脏干细胞2种.内源性肝脏干细胞存在于肝脏组织本身,是未分化的、多潜能的、具有干细胞以及肝细胞或胆管细胞标记的、非肝实质细胞的上皮细胞前体细胞,目前认为卵圆细胞和小肝细胞属于这一类.外源性肝脏干细胞,本身不存在于肝脏内,包括:骨髓细胞、胰腺细胞、胚胎干细胞、脐带血细胞等,但在特定的微环境中可以分化为肝细胞和(或)胆管上皮细胞.
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卵圆细胞及其与原发性肝癌关系的研究进展
尽年来,有关干细胞的研究已经得到广泛的注意,肝卵圆细胞(HOC)被认为是肝脏干细胞的子代,是肝脏干细胞到成熟肝细胞的中间体,他既可以向胆管细胞分化,又可向肝细胞分化.目前认为肝卵圆细胞分为三型,Ⅰ型细胞体积较小,核大,胞质少,此为原始的卵圆细胞.Ⅱ型细胞体积稍大,胞质稍多,此为向胆管上皮分化的胆管样卵圆细胞.Ⅲ型细胞体积稍大,内含稍多粗面内质网,此为向肝细胞分化的肝细胞样卵圆细胞.肝卵圆细胞定位于赫氏小管区(Hering管)和胆管树终末处,与骨髓干细胞有大量共同的表面标志,受多种细胞因子的调控,已经在体外分离培养成功,并发现存在于肝癌组织中.肝卵圆细胞"成熟受阻"可能是导致原发性肝癌的原因之一,其向原发性肝癌转化的机制仍不清楚,可能是多个癌基因和/或抑癌基因共同调控的结果.本文就此研究进展作一综述.
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肝脏干细胞
0引言近年来干细胞研究已成为世界生命科学领域的热点并取得了较大进展,目前研究认为,不仅胚胎组织含有干细胞,而且成年器官组织中也存在干细胞,如骨髓、中枢神经系统、皮肤、胰腺、胃肠、肝脏等都具有干细胞,本文将近年来肝脏干细胞的有关研究进行综述.
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病毒性肝炎及肝病学基础与临床研究的新进展
我国是"肝炎大国",是各型肝炎发病率较高的国家,多种病毒性肝炎及相关肝病是严重危害我国人民健康的常见病之一.由中国科学技术协会主办的第三届国际肝炎及肝病学研讨会于2001-10-18～22日在中国杭州召开.参加这次会议的国内外代表与专家对第二届国际肝炎及肝病学术会议(1999年,北京)以来国际学术界在病毒性肝炎与相关肝病在病毒学、生物医学、预防医学、临床医学、流行病学及传统医学防治等方面作了专题发言与讨论.本次会议大特点是在病毒性肝炎及相关肝病学的基础与临床研究方面研究的深入,涉及面广,研究的热点是肝脏干细胞、肝炎病毒基因变异、生物人工肝、肝纤维化与肝硬化及肝癌防治系列问题.会议还专门举行了临床医师人才培养特别研讨会,现将会议交流论文与专题内容作一述评.
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肝脏干细胞
人体持续更新的组织如骨髓、皮肤、肠上皮等存在干细胞池,通过干细胞不断的增殖、分化来产生成熟细胞.在肝脏,由于成熟的肝细胞仍然具备分裂、增殖的能力,肝组织内是否存在干细胞是一个长期以来颇有争议的问题.近年来随着发育生物学和干细胞生物学的飞速发展,肝脏干细胞在肝脏疾病发生中的意义越来越受到了广泛的关注.肝脏的多种病理过程可能与干细胞的异常增殖、分化密切相关,而肝脏干细胞的深入研究对各种肝脏疾病的治疗也显示出了诱人的前景.肝脏干细胞已成为现代干细胞生物学和临床医学研究的热点之一.
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肝干细胞与肝癌关系研究进展
目前,公认的肝癌发生机制有两种:其一,癌变由肝脏干细胞的异常分化引起;其二,癌变由成熟肝细胞去分化而致~([1]).
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肝脏微环境对肝脏干细胞调控机制的研究进展
随着对肝脏干细胞的深入研究,肝脏内存在具有向肝/胆系细胞双向分化潜能的成体肝脏干细胞的观点已经被广泛接受.在肝脏严重受损,成熟肝细胞增殖受抑制或增殖不能满足肝脏代偿时由肝脏成体干细胞增殖分化为成熟肝细胞.而由肝实质细胞,肝脏非实质细胞(肝星状细胞,Kupffer细胞,窦状内皮细胞),细胞外基质及神经系统等组成的肝脏微环境对肝脏干细胞增殖分化有重要作用.现对肝脏微环境对肝脏干细胞增殖分化调控作用的研究进展作一综述.
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成人肝脏干细胞研究现状及展望
Malcolm等[1]认为所谓干细胞(stem cell)为不分化而长期生存,且保持多种分化潜能的一种细胞群,而祖细胞(progenitor cell)则为一类具有分化能力、自我更新、自我维持能力受限制,仅有单向或双向分化潜能且生存时间相对较短的细胞群.近年来,成人肝脏干细胞(hepatic stem cell, HSC)的研究成了国内外研究的热点.胚胎4～6个月时,肝脏是造血的主要场所,即是红细胞、骨髓细胞、B细胞、T细胞和巨核细胞生成的场所.出生后不久,这些造血功能就停止.近年来,许多学者发现当肝组织受到严重破坏时,肝组织内幼稚细胞有分化的证据,如肝组织内一种卵圆细胞(oval cell )可分化为肝细胞、胆管上皮细胞[2,3].这种卵圆细胞被认为来自赫氏小管区(the canal of hering)和胆管树终末处[4].同时也发现了这种幼稚细胞表达大量干细胞表面的标志物,如CD34、CD45、CD38、CD69、C-kit等抗原[5-12].有学者成功分离和提纯C-kit阳性细胞,并进行了体外培养[7].于是许多学者确信成人肝组织内所存在的这种幼稚细胞来自于肝脏干细胞[5-7].但也有许多学者研究了骨髓干细胞在肝细胞再生中的作用,发现成人肝组织内的幼稚细胞直接来源于骨髓干细胞[1,8、13-15].也有学者推测这种幼稚细胞可能一部分来自于骨髓干细胞,一部分来自于肝脏自身干细胞[13].不管成人肝组织内是否真正存在自身干细胞,但祖细胞肯定存在.现已证实成人肝组织内确实存在着一种能使干细胞向淋巴细胞和肝细胞分化的微环境,且干细胞在肝损伤修复、免疫排斥和肿瘤免疫反应中发挥一定作用.我们就这些问题作一综述.
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小鼠肝脏干细胞提取法的优化
肝脏干细胞(liver stem cell,LSC)源于前肠内胚层,近年研究表明,除肝脏外,骨髓、胰腺等组织中也存在LSC.LSC主要包括胚胎时期的干细胞样肝原始细胞(liver original cell)和成体时期的肝卵圆细胞(hepatic oval cell,HOC).HOC是成年哺乳动物肝脏中一类直径约10 μm的卵圆形细胞,存在于终末小胆管(Hering),1956年由Farber[1]在大鼠肝癌模型中首先发现并命名,具有分化为肝细胞和胆管细胞的双向潜能[2,3]并与肝脏损伤后的强大再生修复能力密切相关.
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干细胞在肝损伤中的机制研究
正常的肝细胞和胆管上皮细胞（胆管上皮细胞）处于静态状态。但是肝脏在面对大规模的实质细胞损失时是一个具有高度再生能力的器官。在肝损伤及肝功能受损时，成熟肝细胞分化增殖是恢复动态平衡的第一道防线。尽管肝脏功能较正常肝脏时降低，但肝移植的研究表明，移植的肝细胞有生存优势，在增殖中占主导地位。但是肝移植患者数目的增加，肝源匹配困难等问题的凸显迫使我们不得不采用新的治疗手段刺激肝脏再生，延长终末期肝病患者的生存期。近研究证实，在终末期肝病患者和肝病模型中，干细胞在肝损伤修复中有重要作用，干细胞移植被看作为一个潜在的替代移植技术。然而，我们对肝脏干细胞、骨髓间充质干细胞的理解目前仍处于起步阶段。一方面，不断有文献证实肝脏干细胞可以成为肝星状细胞和肌成纤维细胞论证。另一方面，干细胞研究的不断深入，应用的更加谨慎也因为它可能显示出肝脏细胞癌的细胞特性。本篇综述将阐述在肝脏损伤后干细胞肝向分化的作用机制，重点阐述相关信号通路，以促进未来靶向治疗研究。
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肝脏干细胞移植治疗肝硬化的研究进展
文章就肝脏干细胞、移植肝脏干细胞的标记、肝脏干细胞的移植途径、移植后疗效的评价进行论述,提出肝脏干细胞移植在治疗肝硬化中存在的问题.
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骨髓间充质干细胞
骨髓是一个复合体,它由红细胞、白细胞、它们的前体细胞及被称为基质(stromal)的结缔组织网架组成.来自基质的细胞,在形态上分别与成纤维细胞、网状细胞、脂肪细胞和内皮细胞的形态相似 [1],这些细胞被称为骨髓基质干细胞.它们在体外能被不同的诱导因子诱导,分化为骨、软骨、肌肉、脂肪等 [2].干细胞的主要特点是结构比较简单,是不具有特定机能的原始细胞,能以自我复制的方式增生,在一定的条件下能向特定的方向分化,产生几个亚系的前体细胞 [3].骨髓基质干细胞就能分化为不同的间充质细胞,如成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞及脂肪细胞,因此Caplan等人也将基质干细胞称为间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs) [4].目前已经研究了造血系统干细胞、肝脏干细胞、肌肉系统的干细胞,研究的终目的是器官再造,在有些领域已经应用于临床,例如血液科利用造血干细胞治疗再生障碍性贫血和白血病;内分泌科利用胰岛干细胞治疗糖尿病;而骨科正在研究MSCs修复骨缺损.
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自体肝干细胞移植治疗慢性肝衰竭病人的护理
慢性肝衰竭为各种原因反复发作于肝脏而造成的弥漫性损害,当被病毒感染后,肝细胞损伤呈现广泛性,窦周细胞周围的成熟肝细胞和肝脏干细胞无法分裂、再生.
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成体肝脏干细胞的体外分离、培养及鉴定
背景:肝脏干细胞的多能性在肝脏移植方面具有重要价值.目前已经成功地鉴定并分离出动物肝脏干细胞,但人肝脏组织是否存在干细胞、如何对其进行分离鉴定的报道不多.目的:尝试从人类肝癌旁组织中分离和体外培养肝脏干细胞,并对其表面标志物进行鉴定,寻找肝脏干细胞新的来源.设计:细胞观察实验.单位:吉林大学第一医院普外科,东丰县中医院普外科.材料:①组织来源:10例标本来自2005-10/2006-06吉林大学第一临床学院肝胆外科收治的肝细胞癌患者,年龄45～58岁,在行肝叶切除术时切取距癌巢边2 cm处的肝组织,经病理证实无癌细胞,对本实验均签署知情同意书.②主要试剂:细胞培养用DMEM/F12干粉由美国Hyclone公司提供,新鲜胎牛血清由天津联星生物技术有限公司配制,各种细胞生长因子为美国Cytolay公司产品.方法:将肝脏癌旁组织剪碎,Hank's液冲洗,Ⅳ型胶原酶溶液消化后将细胞悬浮在含体积分数为0.15胎牛血清的DMEM/F12培养液中,加入肝细胞生长因子、表皮生长因子、α-成纤维细胞生长因子,浓度均为25 μg/L.待培养细胞约铺满2/3瓶底后,胰蛋白酶消化传代,按2×107 L-1密度接种继续培养.细胞传至3～4代时,加入胰酶制成浓度为2.60×109 L-1细胞悬液,依次加入抗人C-kit抗体、免疫磁珠、Buffer液,免疫磁珠法初步分离C-kit+细胞.HE染色和免疫荧光细胞化学染色检测癌旁组织中是否存在肝脏干细胞.制备C-kit+细胞爬片,免疫荧光化学染色鉴定肝脏干细胞表面标志物CK19及AFP的表达.主要观察指标:①细胞形态观察.②癌旁组织肝脏干细胞的鉴定.③C-kit+细胞免疫荧光化学鉴定.结果:①原代培养2周,贴壁细胞呈集落样生长,换液后成熟肝细胞逐渐破碎、消失,小圆形细胞增殖成片,多位于集落中央,呈簇状排列,多数细胞只有1个核,胞核较大,胞浆较少,细胞边界清楚.传至1～2代时仍可见细胞呈集落样生长,生长速度加快,经免疫磁珠分离获得的C-kit+细胞呈类圆形,胞核较大,胞浆较少,体外培养1周后呈栅栏状、漩涡、片状或不规则样生长.②癌旁组织HE染色后汇管区内可见不典型增生的小胆管,其内部存在小圆形细胞;免疫荧光细胞化学染色后癌旁组织汇管区内增生的小胆管内的小圆形细胞共表达红色荧光AFP和绿色荧光CK19,二者叠加部分呈黄色.③C-kit+细胞免疫荧光化学后,胞浆内表达AFP红色颗粒与CK19绿色颗粒,二者重叠部分即AFP+/CK19+双阳性细胞,呈黄色荧光.结论:人类肝癌旁组织中存在肝脏干细胞,可联合其表面标志物的表达,将C-kit+/AFP+/CK19+作为鉴定分离肝脏干细胞的一种方法.体外分离培养得到的小圆形细胞即卵圆细胞,具备向肝细胞及胆管上皮细胞双向分化的潜能.
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倒千里光碱对肝大部分切除小鼠肝脏损伤后再生修复的影响
背景:目前大多数应用倒千里光碱造成肝损伤模型都是以大鼠为实验对象,有研究报道倒千里光碱并不能抑制小鼠肝细胞增殖,也有报道倒千里光碱对小鼠的肝细胞具有增殖抑制作用.目的:观察单纯肝脏大部分切除及其联合应用倒千里光碱致小白鼠对肝损伤后再生修复的影响.方法:40只C57BL/6J小鼠随机数字表法分为2组,每组20只.倒千里光碱/肝脏部分切除组:腹腔注射倒千里光碱溶液70 mg/kg,注射2次,每次间隔2周,4周后肝脏2/3切除.肝脏部分切除组:腹腔注射生理盐水70 mg/kg,注射2次,每次间隔2周,4周后行肝脏2/3切除.观察术后14 d肝脏大体结构恢复情况;苏木精-伊红染色观察术后第3,7天肝细胞损伤情况;BrdU染色观察术后第3天成熟肝细胞增殖情况;CK19和C-kit免疫组织化学方法观察术后第3,7,14天肝脏卵圆细胞增生情况.结果与结论:肝脏部分切除组14 d肝大体结构基本恢复正常,而倒千里光碱/肝脏部分切除组肝脏大小没有明显的恢复.苏木精-伊红染色可见倒千里光碱/肝脏部分切除组明显的肝细胞变性改变;BrdU染色肝脏部分切除组术后第3天有明显肝细胞增殖,而倒千里光碱/肝脏部分切除组肝细胞增殖很少.CK19和C-kit免疫组织化学结果显示倒千里光碱/肝脏部分切除组术后第3天开始肝脏主要通过肝卵圆细胞增生并逐渐向肝细胞和小胆管分化,从汇管区开始向肝小叶内延伸以修复损伤.提示倒千里光碱可抑制小鼠肝脏损伤后肝细胞增殖再生.建立倒千里光碱/肝脏部分切除小鼠模型可诱导肝脏卵圆干细胞增生.
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卵圆细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞
背景:原代分离的肝卵圆细胞具有双向分化的能力和橫向分化的可塑性.目的:分离大鼠肝脏卵圆细胞,在化学诱导剂作用下使其定向分化为胰岛素分泌细胞.设计、时间及地点:对照观察细胞实验,于2007-05/2008-01在解放军总医院基础研究部,国家重点实验室完成.材料:SPF级SD大鼠,体质量(120±20)g.方法:采用改良梯度离心法分离、培养大鼠肝卵圆细胞,并行免疫组织化学鉴定.随后将卵圆细胞置于含有诱导剂Nicotimide和高浓度葡萄糖的RPMI 1640培养液继续培养,同时以不含诱导剂的RPMI 1640培养液培养的卵圆细胞作为阴性对照.主要观察指标:采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、酶联免疫吸附实验、放射免疫分析检测两组卵圆细胞胰岛素的表达.结果:改良的梯度离心方法分离的细胞具干细胞特点,可形成集落,并且OV6、CD34、Nestin染色呈阳性.分离的大鼠肝卵圆细胞,加入诱导剂Nicotimide和高浓度葡萄糖诱导培养l周后,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、酶联免疫吸附、RIA检测均显示胰岛素分泌量远高于不含诱导剂细胞(P<0.05).结论:化学诱导剂Nicotimide和高浓度匍萄糖可以在短时期内作用肝卵圆细胞可启动胰十二指肠同源盒基因-1基因,使之定向分化为胰岛素分泌细胞.
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肝脏干细胞研究及应用前景展望
背景:近年肝脏干细胞移植治疗终末期肝病得到人们的广泛关注,但临床应用中却面临来源有限,细胞数量不足,移植后干细胞往往弥散、流失,且分化率低,无法有效发挥其修复功能等技术问题制约.目的:总结肝脏干细胞组织工程的研究进展,并展望其应用前景.方法:应用计算机检索1999-01/2010-12 PubMed数据库相关文献,英文检索词"liver stem cell tissue engineering"分别与"three dimensional culture,biodegradable materials,biological reactor"组合,并限定文献语言种类为English.共检索到文献241篇,终纳入符合标准的文献43篇.结果与结论:肝脏干细胞来源有限,而肝脏组织工程需要大量可靠的种子干细胞,三维培养是目前发现行之有效的体外扩增手段.在三维培养条件下,使用不同支架材料和反应器扩增效率及移植效果存在巨大差异,如何确定具有肝脏干细胞特异性的理想扩增条件、改善支架生物相容性以提高移植效率是关键技术问题.未来的研究需要进一步探讨肝脏干细胞特异性扩增生物反应器及肝脏干细胞特异性支架构建等技术难点.
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人成体肝脏干细胞体外分离、培养及鉴定
目的:体外分离、培养人成体肝脏干细胞,确定肝癌干细胞的表面标志物,寻找肝脏干细胞新的来源.方法:以肝癌患者的癌旁组织做为肝脏干细胞的来源,进行体外培养,摸索培养条件,待细胞稳定传代后,通过免疫磁珠法初步分离C-kit+细胞,对肝脏干细胞进行初步筛选,后对肝癌的癌旁组织及C-kit+细胞利用免疫组化及免疫荧光化学染色鉴定AFP+、CK19+双阳性表达,证实癌旁组织中存在肝脏干细胞.结果:肝细胞生长因子(HGF)、α-成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)及白血病抑制因子(LIF)对肝癌癌旁组织细胞的原代培养非常重要,可以获得比较稳定的细胞以便传代.免疫荧光组织化学染色证实癌旁组织中存在肝脏干细胞,经体外培养,免疫磁珠初步分离C-kit+细胞后,获得小圆形细胞,此类细胞共同表达AFP及CK19.结论:人类肝癌的癌旁组织中存在肝脏干细胞,可以联合其表面表达的标志物,将C-kit+/AFP+/CK19+做为鉴定分离肝脏干细胞的一种方法.体外分离培养得到的小圆形细胞即卵圆细胞具备向肝细胞及胆管上皮细胞双向分化的潜能.
