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microRNAs在肝再生中的作用研究进展
目的 microRNAs是一类非编码蛋白的小RNA分子,通过与靶基因mRNA 3'端的非编码区(3'UTRS)结合而在转录后水平调控基因表达,调节细胞增殖、分化、代谢、凋亡、器官发育等生物学过程.肝脏有很强的再生能力,是研究再生的重要材料.因此,我们在文中总结了microRNAs对肝再生调节作用的研究进展.
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消瘢方对体外CCl4损伤大鼠原代肝细胞保护作用的研究
目的:探讨消瘢方抗肝纤维化作用的机理.方法:采用Ⅳ型胶原酶消化及Hcoll密度梯度离心的方法,分离、培养大鼠肝细胞,先加入5%、10%、20%药物血清干预体外培养的肝细胞24 h,再用四氯化碳(CCl4)蒸熏法制造肝细胞损伤模型.分别用MTT法及荧光实时定量RT-PCR法检测CCl4损伤后肝细胞的增殖、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)mRNA表达,并检测细胞培养上清中的谷草转氨酶(AST)活性.结果:消瘢方药物血清能显著地促进CCl4损伤后肝细胞的增殖(P<0.05,P<0.01).CCl4损伤模型肝细胞内有一定量的caspase-3mRNA表达(6.96±0.69 ng),加5%、10%、20%正常大鼠血清干预后,肝细胞caspase-3mRNA的表达(6.31±0.64,6.01±0.68,5.54±0.58 ng)稍低于CCl4损伤模型,加5%、10%、20%消瘢方药物血清干预后,肝细胞caspase3mRNA的表达(5.51±0.72,4.87±0.45,3.08±0.82 ng)显著下调(P<0.05,P<0.01).CCl4损伤模型肝细胞培养上清中AST活性为1203.91±86.85 nkat,加5%、10%、20%正常大鼠血清干预后,其培养上清中AST活性降低为1092.39±57.01,1025.54±29.17,996.03±53.68 nkat,加5%、10%、20%消瘢方药物血清干预后,其培养上清中AST活性(998.70±30.67,885.51±44.82,753.48±35.17nkat)显著降低(P<0.05,P<0.01).消瘢方药物血清对CCl4损伤后肝细胞增殖的影响、下调肝细胞caspase-3mRNA的表达及降低肝细胞培养上清中AST活性的作用,均呈明显的血清浓度依赖关系.结论:消瘢方抗肝纤维化机理与其保护肝细胞免受损害、抑制肝细胞凋亡有关.
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脐带间充质干细胞旁分泌物质对暴发性肝衰竭大鼠肝功能及肝细胞增殖的影响
目的 探索人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs)旁分泌物质对实验性暴发性肝衰竭大鼠的治疗作用,研究其对大鼠肝功能及肝细胞增殖的影响.方法 体外分离培养人脐带间充质于细胞,流式细胞仪检测UC-MSCs的表面标志,制备含有UC-MSCs旁分泌物质的条件培养基(MSC-CM),腹腔注射D-氨基半乳糖制备暴发性肝衰竭大鼠模型.实验分为3组:MSC-CM组、生理盐水(NS)组和促肝细胞生长素(PHGF)组.在模型制备后24 h从大鼠尾静脉分别注射三组治疗药物.每组8只大鼠治疗后12 h、24 h、36 h、60 h分别经内眦取血测定谷丙转氨酶(ALT)和总胆红素(TBIL)含量.每组另取5只大鼠在治疗后36 h取肝脏组织制备切片进行PCNA免疫组化染色,检测大鼠肝细胞增殖情况.观察并记录各组大鼠的生存状态及生存时间.结果 MSC-CM组及PHGF组大鼠治疗后24 h ALT及TBIL的含量均低于NS组(P<0.05),MSC-CM组与PHGF组比较差异无统计学意义.大鼠治疗后36 h肝脏切片PCNA染色显示,MSC-CM组和PHGF组PCNA肝细胞阳性数显著高于NS组(P<0.01),MSC-CM组与PHGF组比较差异无统计学意义.生存分析显示,MSC-CM组和PHGF组大鼠的生存率高于NS组(P=0.049),MSC-CM组与PHGF组比较差异无统计学意义.结论 人脐带间充质干细胞的旁分泌物质可以刺激暴发性肝衰竭大鼠肝细胞增殖,改善暴发性肝衰竭大鼠的肝功能,为暴发性肝衰竭的治疗提供了一种新途径.
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肝再生分子机制及中药干预研究进展
部分肝切除术是治疗各种肝脏肿瘤的有效方法,而肝再生功能障碍则是其严重并发症之一.因此,部分肝切除术后肝再生(LR)能力显得尤为重要.本文从细胞因子、生长因子、代谢和信号通路等方面对肝再生的分子机制进行综述,并介绍近年来中药促进肝再生的研究进展,以进一步明确肝再生发生发展的分子机制,为治疗肝再生障碍类疾病的药物研发提供有价值的研究信息.
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联合肝脏分割和门静脉结扎的分阶段肝切除术与肝再生
肝脏是人体内大的腺体器官,具有强大的自我再生能力。当肝脏受到严重损伤刺激,如手术、创伤、感染、坏死、中毒等,机体会启动再生程序,促进残肝细胞增殖。肝脏因受严重刺激导致部分肝组织丧失后,肝细胞重新修复、增殖的过程,称为肝再生。早在数千年前的古希腊时期,人们就已经认识到肝脏具有很强的再生能力[1]。20世纪30年代研究者发现大鼠肝脏被切除70%后,2周内肝脏可恢复至原来的重量。肝再生不同于其它器官的再生过程,为残余细胞的增生,而非重新再生出原来被切除的肝叶组织,肝再生过程中并不会出现典型的去分化细胞[2-3]。联合肝脏分割和门静脉结扎的分阶段肝切除术(associating liver partition and portal vein ligation for staged hepatectomy,ALPPS)正是基于肝脏的强大再生能力而发展起来的手术方式。
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肝脏微环境对肝脏干细胞调控机制的研究进展
随着对肝脏干细胞的深入研究,肝脏内存在具有向肝/胆系细胞双向分化潜能的成体肝脏干细胞的观点已经被广泛接受.在肝脏严重受损,成熟肝细胞增殖受抑制或增殖不能满足肝脏代偿时由肝脏成体干细胞增殖分化为成熟肝细胞.而由肝实质细胞,肝脏非实质细胞(肝星状细胞,Kupffer细胞,窦状内皮细胞),细胞外基质及神经系统等组成的肝脏微环境对肝脏干细胞增殖分化有重要作用.现对肝脏微环境对肝脏干细胞增殖分化调控作用的研究进展作一综述.
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Keap1-Nrf2- ARE 和 p53/p21信号通路在对乙酰氨基酚引起肝损伤后肝再生中的作用
对乙酰氨基酚(acetaminophen,APAP)过量使用是引起肝损伤的主要原因。代偿性肝再生是药物性肝损伤的关键因素。但是 APAP 引起的肝损伤后肝再生的分子机制尚不清楚。本文旨在讨论 Keap1-Nrf2-ARE 和 p53/ p21信号通路在 APAP 引起肝损伤后肝再生中的作用。研究人员通过给予小鼠400 mg/ kg 的 APAP 体内注射后发现,小鼠在12 h 内表现出巨大的肝毒性,而肝脏功能的恢复却要在24 h 之后。注射 APAP 后转录因子 NF-E2相关因子2( nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)的表达量和在细胞核中的积累量都有增加。在注射APAP 后的第一个24小时内,醌NADH 脱氢酶1(NQO1)、谷氨酸半胱氨酸连接酶( GCLM)和血红素氧合酶1(HO-1)的表达被抑制,然后抑制氧化应激反应。注射APAP 后,p53及其下游靶基因p21含量显著增加,但是在48 h 内又降至正常水平。此外,细胞周期蛋白D1、细胞周期依赖性激酶4(CDK4)、增殖细胞核抗原(PCNA)和肝再生增强因子( ALR)水平在48 h 时明显增强,提示肝细胞增殖和组织修复的启动。这些结果表明,Keap1-Nrf2-ARE 和p53/ p21信号通路在对乙酰氨基酚引起肝损伤后肝再生中的作用。
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重组人肝再生因子可溶性表达及活性鉴定
目的 探索重组人肝细胞生成素Cn(HPPCn)蛋白可溶性表达方法和纯化工艺,提高其比活性和蛋白产量,为发展新的急性肝病治疗药物奠定基础.方法 利用分子生物学方法构建4个HPPCn原核表达载体,分别与不同的分子伴侣融合表达,助其表达后正确折叠.利用亲和层析方法纯化获得的融合蛋白,MTS法检测所得重组蛋白促进细胞增殖活性.结果 成功构建了4个HPPCn表达载体,其中pMBP-P-HPPCn实现了rhHPPCn的可溶性表达.结论 首次建立了重组HPPCn蛋白的可溶性生产方法,并对其蛋白活性进行分析和鉴定.
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骨髓干细胞移植诱导肝细胞再生的研究进展
终末期肝病一直是临床治疗的难题,近年来肝移植的广泛开展为此病的治疗提供了光明的前景,但由于供体器官紧缺、费用昂贵以及移植后的并发症等问题,使临床应用受到很大限制.随着对干细胞研究的逐步深入,已证实干细胞具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能,而且能够分化为神经细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞等多种组织细胞,在肝脏严重受损、肝细胞增殖受抑制时,骨髓干细胞还具有定向分化为肝前体细胞、肝细胞、胆管上皮细胞的能力,并可能提供即时有效的肝功能,为宿主肝脏再生恢复赢得时间.
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表皮生长因子受体对肝细胞增殖的调控作用
表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)属于受体酪氨酸激酶超家族成员,广泛表达于哺乳动物的各种组织细胞,是一多功能的膜蛋白.它能与多种配体结合而发生二聚化,从而调节细胞的生长、增殖和分化.在包括肺癌、膀胱癌和乳腺癌等多种组织中,存在EGFR信号通路的高度激活.近年来的研究表明,EGFR信号转导网络在肿瘤的发生和发展过程中发挥了重要的作用.新的研究表明,EGFR与肝细胞的增殖密切相关.
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肝炎、肝硬化、肝癌患者血清转化生长因子β1测定及临床意义
转化生长因子β是一个结构和功能相关的多功能肽家族,由三个同功型组成,人体内转化生长因子β1(TGF-β1)含量丰富,它是肝细胞增殖、分化、细胞外基质合成的重要递质,近年有关它在肝癌发病中的作用以及对肝癌的诊断价值也受到普遍关注.
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肝再生的分子生物学研究进展
肝细胞具有很强的增殖能力.肝损伤后机体能精确地调控肝细胞增殖、生长,迅速恢复其原有体积和重量.当肝细胞复制被阻断或延误时,肝内就会启动干细胞增生.近研究发现再生肝基因表达可分几个阶段:肝再生的启动始于大量即刻基因表达,G1期的肝细胞对生长因子肝细胞生长因子(HGF),转化生长因子α、β(TGFα、β)、表皮生长因子(EGF)和肿瘤坏死因子(TNF)及IL-6等细胞因子有反应;至少有四种转录因子即NFkB、STAT3、AP-1 和C/EBPβ在起动肝再生中发挥重要作用.本文对近年这方面研究进展作一综述.
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前列腺素介导部分生长因子的促肝细胞分裂与细胞保护作用
肝细胞生长因子 (HGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(TGFα) 以及肝刺激因子(HSS) 等作为有丝分裂剂,在肝细胞增殖和肝再生过程中起着重要的作用[1].近年来又有较多的研究证实,HGF、HSS等生长因子对肝毒剂(CCl4、半乳糖胺等) 损伤肝细胞具有细胞保护作用[2,3].另外,再生肝本身也具有很强的抗损伤能力,其机制之一就是再生肝中含有HSS等生长因子[4].
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乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒感染与原发性肝癌研究进展
原发性肝癌(primary hepatocarcinoma,PHC)是人类常见的恶性肿瘤之一,目前全世界每年新增50万~100万病例.研究发现,PHC与乙型肝炎病毒(HBV)及丙型肝炎病毒(HCV)感染密切相关.肝炎病毒感染导致肝脏损伤后伴有持续的肝细胞增殖,细胞增殖加速,使肝细胞增殖周期中的调控基因更容易发生随机改变,同时细胞增殖加速也容易使慢性肝病过程中致病因子所导致的DNA突变得以保留并迅速克隆性扩张,后导致肝癌的发生[1].本文就HBV、HCV感染与PHC研究进展简要综述如下.
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FXR-FGF19肠肝轴:一种新的肝属性
肝实质细胞死亡或者部分肝叶切除后,触发肝脏异常强大的再生能力,当肝脏受到内外源性毒素的损伤时,这种再生能力可以保护肝脏,从而保持全身代谢稳定[1]。多年来,发现了很多参与肝脏再生的起始和终止的化学物质,Nelson Fausto将这些相互关联的通路分三类,细胞因子、生长因子和代谢网络[2]。关于这些化学物质的知识,大部分来自于动物模型中进行部分肝叶切除、肝细胞移植、肝脏移植的实验。研究发现肝细胞具有几乎不受限制的克隆潜能及增殖能力,也发现肝脏再生能力与部分肝叶切除情况下切除的肝脏质量成正比,移植肝脏的体积大小调整(如增大或者缩小)与受试者体积的大小相关,这些发现预示着有一种密切控制成人肝脏生长和终止的机制存在,也就是肝属性(hepatostat),或者特殊的维持适当肝脏体积大小的感受器[1]。考虑到肝脏在全身代谢中的基本功能,肝属性可能至少部分功能包含在代谢网络中,在这一前提下,胆汁酸日益被认为是肝脏再生调节的关键因素,并成为调节肝属性的引人注目的因素。在啮齿类动物和人类,部分肝脏切除后短时间内全身及肝脏内胆汁酸水平增高,胆汁酸肠肝循环的调整明显影响着肝脏的再生[4]。早期的实验也显示喂养富含胆汁酸的食物可以诱发肝细胞增殖及肝脏生长[4-5]。对比而言,胆汁酸水平需要被精细的调整以免其过度增高和产生肝脏毒性作用。正如初在肝叶切除的无法尼酯 X 受体(FXR)的小鼠中证明的那样,FXR 是胆汁酸代谢级联反应的中心转录感受器[6]。肠细胞和肝脏高度表达 FXR[7]。在肠道内主要FXR 靶基因是纤维母细胞生长因子15(FGF15,人类为FGF19),一旦受到胆汁酸刺激 FGF15由肠因子(enterokine)分泌并进入门静脉血液。FGF15/19到达肝脏后,活化了位于肝细胞基底膜侧的二聚体 FGFR4/β-KLOTHO,其抑制胆固醇7-α羟化酶(CYP7A1)胞内通路,CYP7A1是胆汁酸合成的限速酶[8]。通过肠内 FXR/FGF15的活化降低胆汁酸的合成,即使当 FXR 从肝脏脱离时,也可以保护肝脏免于胆汁淤积性损伤[9]。事实上 FGF15/19以一种复杂的机制抑制肝细胞CYP7A1表达。如 FXR,FGF15/19也依赖于转录抑制因子小异二聚体伴侣分子[SHP]发挥作用,但是 FGF15/19没有改变SHP 蛋白水平或者它在 CYP7A1启动子上的位置,提示有其他因素与 SHP 复合体相互作用[10]。通过感应转录因子FoxM1b,FXR 在肝脏中似乎直接促进肝细胞增殖[6]。对比而言,当 FGF15结合到 FGFR4/β-KLOTHO 复合体时,可以减少胆汁酸的负荷和肝叶部分切除后的损伤,推断其通过上调FoxM1b 而不是其他增殖基因促进肝脏再生,提示 FoxM1b 也可以通过 FXR 被活化[11,12]。总之,这些发现指出胆汁酸-法尼酯 X 受体-纤维母细胞生长因子15轴(BA-FXR-FGF15 axis)在调节肝脏生长过程中的重要作用。有趣的是当肝脏急性胆汁淤积时,或者在某些胆汁淤积的情况下,FXR 的表达被下调[11-13],这一结果可能表明进化防止肝脏过度生长的适应性机制。Naugler 等人应用人源化肝脏的实验性小鼠模型,为胆汁酸在肝属性调节中作为关键因素提供了有力的事实论据。
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人鼠嵌合肝模型的建立与鉴定
动物模型在肝病学的发展中起重要作用.近几年,在了解特异基因功能、代谢通路和疾病进程方面,啮齿类动物模型发挥了巨大作用.人鼠嵌合肝是利用人肝细胞异种移植到受体鼠肝内建立的新型动物模型.受体鼠可分为免疫缺陷小鼠或诱导免疫耐受大鼠[1,2],两者均能初步建立HBV感染的人鼠嵌合肝动物模型.本文主要介绍人鼠嵌合肝相关内容,包括移植细胞来源、建立途径、诱导肝细胞增殖及移植肝细胞标记与定性、定量检测手段,同时探讨该模型存在的问题及应用前景.
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逆转录病毒载体介导β-gal基因在原代大鼠肝细胞的表达
逆转录病毒载体被广泛用于移植肝细胞的基因标记和肝病的体外基因治疗.但重组逆转录病毒的感染需要靶细胞处于分裂增殖状态,而原代大鼠肝细胞增殖能力弱,逆转录病毒感染效率低,近年来采用生长因子刺激肝细胞增殖,取得了较好效果[1].本实验观察了含表皮生长因子(EGF)的培养条件下,双顺反子逆转录病毒载体介导β-gal基因表达于肝细胞的效率.
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鲨鱼肝刺激物的促肝细胞增殖和抗小鼠急性肝损伤作用
肝刺激物(hepatic stimulator substance,HSS)是从初断乳大鼠肝和部分肝切除后的再生肝中发现的一种肝脏刺激因子,它存在于新生肝和再生肝的肝细胞胞液中,能刺激肝细胞有丝分裂,促进肝细胞再生和肝细胞DNA的合成.与其他肝细胞因子不同,HSS的作用只有组织特异性,而没有种属特异性,目前已从猪、狗、兔等多种动物的乳肝组织及人胎肝组织提取出HSS.大量研究证明,从哺乳动物提取的HSS对CCl4、D-(+)-氨基半乳糖、硫代乙酰胺(TAA)、乙醇造成的大鼠急性肝损伤有明显的保护作用[1,2].研究表明鲨鱼组织提取物有可能用于提高和改善人类机体免疫状况[3].本文探讨了其对小鼠急性肝损伤的影响.
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肝刺激因子对肝癌细胞增殖的调节作用
初断乳雄性SD大鼠的肝匀浆以超速离心和柱层析法分离纯化肝刺激因子(HSS),观察其对肝癌细胞增殖、细胞表皮生长因子(EGF)受体表达及受体磷酸化的影响.结果表明,HSS具有明显的促肝癌细胞分裂增殖能力,提高细胞周期中S期细胞所占比例.HSS促肝癌细胞增殖作用与其促EGF受体表达有关,表现为:(1)HSS上调170 kD EGF受体蛋白表达,此作用与EGF合用后明显加强,即呈协同效应;(2)HSS上调EGF受体表达呈剂量-效应和时间-效应关系;(3)HSS可刺激EGF受体酪氨酸残基的磷酸化,调节受体活性.本研究结果提示,HSS可能是通过调节肝癌细胞EGF受体的表达及受体介导的信号传导通路而起到促增殖的作用.
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条纹斑竹鲨鱼DNA结合抑制因子cDNA的克隆、序列特征及其在肝再生过程中的表达分析
DNA结合抑制因子(Inhibitor of DNA binding,Id)又称分化抑制因子(Inhibitors of Differentiation,Id),属于负调控因子HLH家族的成员,其功能是与DNA结合并抑制细胞的分化和促进细胞的增殖.为揭示Id蛋白在鲨鱼肝脏再生过程中的作用,作者从前期构建的条纹斑竹鲨鱼肝脏cDNA文库中克隆到编码Id蛋白的cDNA全序列并预测了其编码产物(CpId)的结构,探讨了该基因在鲨鱼体内的时空表达方式,结果表明:CpId cDNA全长为1074bp,编码一个由135个氨基酸残基组成的无跨膜区的胞内蛋白,理论分子质量(Mr)为14 857.2,理论等电点(pl)为5.35.CpId蛋白序列与其他生物来源的Id蛋白的同源性介于42% ~ 62%之间,其N端第31~87aa组成一个相对保守的Myc型helix-loop-helix结构域.CpId基因在鲨鱼各种组织中均有表达,但以在肝脏、脑和生殖腺中的表达高;肝部分切除后,CpId基因的表达迅速上调,在切除1h后到达高值(为正常肝组织的18倍左右),其后逐渐下降,并在24h时恢复至正常肝组织中的水平;CpId基因的表达在肝部分切除后的第48 h出现第2个相对较高的表达峰.上述结果表明CpId基因参与了肝脏再生调控的过程,其作用可能与促进肝细胞的增殖再生过程有关.