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慢病毒载体与基因治疗
载体是供插入目的基因并将其导入宿主细胞内表达或复制的运载工具.常用的有SV40衍生载体、逆转录病毒载体、腺病霉载体、腺病毒相关病毒载体、细小病毒载体、疱疹病毒载体、痘苗病毒载体等.近几年来,慢病毒载体受到高度重视,慢病霉载体来源于人类免疫缺陷病霉HIV-1、HIV-2、SIV,具有转染分裂和非分裂的T细胞、树枝状细胞、造血干细胞及巨噬细胞[1],基因疗法是一种新方法.Hawley[2]等的文章中指出,由于慢病毒载体可作用于细胞周期的G0/G1期,成为遗传性疾病治疗的有效手段.基因治疗的初目的是传送特殊的基因至预定的靶细胞,并且直接表达该基因的性质,达到治疗效果.在治疗遗传性、代谢性、神经系统疾病、癌症及艾滋病方面有广泛的应用前景[3].
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小鼠H-2Dd基因的克隆及其逆转录病毒表达载体的构建
目的:构建BALB/c小鼠H-2Dd基因的逆转录病毒表达载体.方法:采用反转录PCR从BALB/c小鼠脾细胞基因组中,扩增H 2Dd的编码基因,插入克隆载体pGEM-T中.经EcoR I和Xho I双酶切后,亚克隆法于逆转录病毒载体pMSCV的相应酶切位点,构建pMSCV-H2Dd重组表达质粒,并经双酶切和序列测定鉴定.结果:用EcoR I和Xho I双酶切鉴定证实,克隆基因正确插入载体pMsCV.克隆H-2Dd的编码基因经序列测定证实,与文献报道完全一致.结论:成功构建小鼠H 2Dd编码基因的逆转录病毒载体,为进一步研究MHC分子在移植免疫中的作用及临床移植的基因治疗应用奠定了基础.
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泡沫病毒载体的研究进展
以逆转录病毒为载体的基因转移系统在80年代得到了一定的发展,迄今用于研究和临床基因治疗的载体种类也日渐增加,应用也逐渐广泛,其中应用广的是腺病毒和逆转录病毒载体.
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cmv-3′LTR嵌合启动子对逆转录病毒载体MFG滴度及外源基因表达的影响
为减轻逆转录病毒载体介导的外源基因的沉默,进一步提高逆转录病毒载体MFG介导的外源基因的表达水平,同时探讨逆转录病毒3′端长末端重复序列(long-terminal repeat,LTR)内U3区对病毒基因表达的影响,将逆转录病毒载体3′端LTR内的U3区用cmv核心增强子、启动子序列替代,同时去除了3个与逆转录病毒载体启动子甲基化有关的序列NCR、DR,并以egfp为报告基因,构建了MFG-egfp和MFG-egfp-cmv表达载体.结果显示:利用cmv启动子替代MFG载体3′端LTR的U3启动子序列,会显著降低MFG载体的病毒滴度及其介导的外源报告基因的表达.提示利用cmv启动子替代病毒载体的3′端LTR内的U3区,并不是提高MoMLV(moloney murine leukemi virus)逆转录病毒载体介导外源基因的表达及其病毒滴度的理想策略.结果也同时提示:在MoMLV逆转录病毒3′端LTR的U3区,可能存在与病毒RNA加工、成熟及稳定性有关的信号序列.
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逆转录病毒载体介导的端粒酶抑制基因促胰腺癌细胞凋亡
目的 研究逆转录病毒载体介导的端粒酶反义RNA促进胰腺癌细胞Can-pan-2凋亡的作用.方法 通过电穿孔法将携带正反义端粒酶RNA基因的逆转录病毒载体导入PT67包装细胞,G418筛选抗性细胞,获取稳定表达病毒的产病毒细胞株,以病毒上清感染Can-pan-2细胞,G418筛选获得稳定转染细胞集落并扩增培养,PCR鉴定端粒酶RNA基因的表达,TRAP-PCR-ELISA法检测端粒酶活性,免疫荧光化学检测不同处理组细胞的增殖情况,流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡.结果 两种逆转录病毒上清的滴度分别为0.95×106 CFU/mL和1.1×106 CFU/mL,PCR法可于约500 bp处观察到目的基因的表达,反义端粒酶RNA作用后,Can-pan-2细胞端粒酶活性和细胞增殖受到明显抑制,并出现明显的细胞凋亡.结论 反义端粒酶RNA可抑制胰腺癌细胞端粒酶活性,促进胰腺癌细胞的凋亡.
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胰岛素样生长因子-1基因真核表达载体的构建
目的构建胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因重组逆转录病毒,为将IGF-1基因应用于神经系统疾病的治疗打下基础.方法质粒pcDNA3.1-IGF-1经EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后亚克隆至逆转录病毒载体pLXSN,构建成重组逆转录病毒表达载体pLXSN-IGF-1,采用酶切及测序对重组体进行鉴定.而后脂质体转染pLXSN-IGF-1至包装细胞pA317,检测培养上清病毒滴度.结果重组真核基因表达载体pLXSN-IGF-1经EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后,得到了400 bp和6.0 kb两条带;以重组体为模板进行PCR检测,400 bp的目的基因片段呈阳性;重组体测序结果与预期结果完全一致;建立了细胞系PA317-IGF-1,其培养上清平均病毒滴度为6.5×105 CFU/ml.结论成功构建了IGF-1基因重组逆转录病毒.
关键词： 胰岛素样生长因子-1 逆转录病毒载体 病毒滴度 基因重组 质粒 -
逆转录病毒介导的人CNTF在嗅神经鞘细胞中的表达及其对神经细胞存活和突起生长的影响
目的研究含有睫状神经营养因子(CNTF)表达调控系统修饰的嗅神经鞘细胞(OECs)对神经细胞存活和突起生长的影响. 方法通过基因克隆,用KpnⅠ+XbaⅠ将pcDNA\-3-S(NGF信号肽)-hCNTF质粒中含有NGF信号肽的CNTF切下,插入逆转录病毒表达载体pRev-TRE中.酶切鉴定后,将其与本系统的调控质粒pRev-Tet-On转入Ecopack-293细胞进行病毒包装,制备重组缺陷型hCNTF和Tet-On逆转录病毒感染原代培养的大鼠OECs,用不同浓度的强力霉素诱导,以Western-blot法对hCNTF的表达培养上清进行检测.将转染hCNTF的OECs与新生2d大鼠DRG联合培养,用其上清培养视网膜节细胞(RGCs).经β-tubulin免疫组织化学染色后,分别测量DRG神经突起的长度并统计阳性RGCs数目. 结果 1.经HindⅢ和BamHⅠ酶切鉴定,pRev-TRE-S-hCNTF重组体分别被切下630bp和400bp片段,插入子的方向和完整性经确认与预期相符.2.以不同浓度强力霉素诱导hCNTF修饰的OECs,其培养上清均有分子量约24 kD的hCNTF蛋白质的显著特异表达,此表达与强力霉素的浓度呈正相关.未诱导组和对照组未见明显蛋白带.3.同单纯OECs(23.15±4.7)、空载(24.55±5.8)、空白(16.8±6.5)等对照组相比,经hCNTF转染的OECs上清组的存活RGC数显著增高(41.34±5.4).4.与单纯OECs(418±45μm)和空载(400±65μm)对照组相比,与hCNTF修饰的OECs联合培养的DRG神经突起显著增长(660±67μm),且更为密集,而空白对照组未见向外延伸的突起. 结论 hCNTF可经逆转录病毒载体转染OECs,其表达依赖于强力霉素浓度,并对神经细胞存活和突起生长具有显著的促进作用.
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携带酪氨酸羟化酶基因的质粒和逆转录病毒在大鼠成纤维细胞和脑胶质细胞中表达效率的比较
目的为提高体外转基因(ex vivo)治疗帕金森病大鼠模型的疗效,本实验拟比较两种基因表达载体介导的外源基因在两种不同运载细胞的瞬时表达效率. 方法分别将酪氨酸羟化酶(TH)基因的重组表达质粒和重组逆转录病毒导入原代培养的大鼠成纤维细胞和脑胶质细胞,用免疫组织化学检测TH的表达效率;Western blot法检测样品中TH特异性条带并转换成A值,以比较其在不同细胞中表达的相对含量. 结果免疫组织化学检测表明,表达质粒的转染率为5%～7%,逆转率病毒的感染率为18%～20%;根据GDNF标准品蛋白条带含量与Western blot结果的相应A值的标准曲线,推断出质粒转染和逆转率病毒感染的成纤维细胞中单个阳性细胞表达的TH相对平均含量分别为4.76×10-2A和4.35×10-2A,质粒转染和逆转率病毒感染的脑胶质细胞分别是5.45×10-2A和5.05×10-2A. 结论不论是质粒载体还是逆转录病毒载体所携带的外源基因在两种细胞的单个阳性细胞中的表达无显著性差异.但由于逆转录病毒载体的感染率高于质粒载体,对于原代培养的成纤维细胞和脑胶质细胞,逆转率病毒载体是一种更好的表达载体.
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费城染色体阳性急性淋巴细胞白血病小鼠模型的建立和鉴定
目的:建立Ph+急性淋巴细胞白血病(ALL)小鼠模型,为Ph+ ALL研究提供工具.方法:用Mig190逆转录病毒转染BABL/c小鼠骨髓细胞产生CML样小鼠,分选CML样小鼠BCR-ABL+B细胞,输注同系小鼠建立Ph+ ALL模型;应用流式细胞术鉴定免疫表型,RT-PCR和Westem blot鉴定BCR-ABL转录和蛋白表达.结果:Mig190逆转录病毒转染后小鼠迅速发生CML样病变,输注来自CML样小鼠的BCR-ABL+B细胞后受鼠均发生急性淋巴细胞白血病,免疫分型显示白血病细胞CD19+;RT-PCR和Western Blot均检测到BCR-ABL,符合Ph+ALL的免疫表型和分子生物学特征.结论:成功开发了一种新型Ph+ ALL小鼠模型的建立方法,能够为研究Ph+ALL提供一有力工具.
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一种改良的Ph+急性淋巴细胞白血病小鼠模型快速建立方法
目的:改良建立Ph+急性淋巴细胞白血病(ALL)小鼠模型的方法,为Ph+ ALL提供更加便捷的研究工具.方法:使用Mig190逆转录病毒转染BABL/c小鼠前体B细胞,输注同系小鼠,建立Ph+ ALL模型;应用外周血涂片,流式细胞术鉴定免疫表型,RT-PCR和Western blot方法鉴定BCR-ABL转录和蛋白表达,并分离发病小鼠的白血病细胞进行再次输注.结果:Mig190逆转录病毒转染后小鼠发生急性淋巴细胞白血病,在血涂片观察到原始和幼稚淋巴细胞,免疫分型示白血病细胞CD19+;RT-PCR和Western blot均检测到BCR-ABL,符合Ph+ ALL的免疫表型和分子生物学特征;再次输注未经照射的同系小鼠能迅速发生B-ALL.结论:改良建立的Ph+ ALL小鼠模型,能够为研究Ph+ ALL提供更简便而有效的工具.
关键词： Ph阳性急性淋巴细胞白血病 小鼠模型 逆转录病毒载体 前体B细胞 -
增强型绿色荧光蛋白逆转录病毒载体的构建和表达
逆转录病毒载体被广泛用作对造血细胞进行基因转移的工具,转导方法的改进有赖于应用可快速分析并被高效选择的基因标志.为此,我们克隆了增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因,并构建可表达EGFP的逆转录病毒载体LGSN,通过脂质体转染和交互感染方法建立高滴度的逆转录产病毒细胞,用以分析对造血细胞标记EGFP基因的可行性.流式细胞术和荧光显微镜检测发现,EGFP病毒转录的GP+envAm12细胞和K562细胞均可发出稳定的绿色荧光信号,阳性率可分别达97%和86%;聚合酶链反应分析显示LGSN转导细胞内有原病毒的整合.上述结果提示,作为新一代选择性标志,EGFP是适于研究对造血细胞基因转移与表达的报告基因,对促进人类基因治疗的研究有重要意义.
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Fas靶向RNA干扰逆转录病毒载体的构建及生物活性鉴定
本研究构建Fas靶向RNA干扰逆转录病毒载体,为探讨抑制Fas表达在再生障碍性贫血等疾病治疗中的意义、以及为促进RNA干扰技术的广泛开展奠定基础.用PCR方法获得小鼠U6+27启动子盒及产生siRNA的相应DNA模板,然后连同增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因克隆入商业化逆转录病毒载体pLXSN,以获得逆转录病毒载体穿梭质粒pLXSN/EGFP-siFas.包装、滴定重组逆转录病毒载体,并感染P815细胞,检测绿色荧光蛋白表达情况及对细胞Fas表达的抑制情况.结果表明:构建的逆转录病毒载体pLXSN/EGFP-siFas能够有效被包装并感染靶细胞,在靶细胞内可同时表达siRNA、绿色荧光蛋白以及新霉素抗性.结论:成功构建了抑制小鼠Fas表达的RNA干扰逆转录病毒载体.
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CDglyTK自杀基因系统治疗小鼠慢性粒细胞白血病皮下移植瘤的研究
为了探讨逆转录病毒介导的CDglyTK自杀基因系统对K562细胞的体内外杀伤作用,将逆转录病毒介导的CDglyTK自杀基因转染入K562细胞,体外实验用MTT法观察5-氟胞嘧啶/丙氧鸟苷(5-fluorocytosine/ganciclovir,5-FC/GCV)对K562/CDglyTK细胞的生长抑制率.体内实验时将K562/CDglyTK细胞和K562细胞接种于裸鼠皮下,使用GCV和5-FC后,观察裸鼠肿瘤体积的变化及裸鼠的生存率.体外实验表明,GCV联合5-FC对K562/CDg-lyTK细胞具有明显的杀伤作用;体内实验结果显示,皮下注射K562细胞和K562/CDglyTK细胞后小鼠成瘤率无明显区别;使用5-FC/GCV可明显抑制裸鼠体内的肿瘤形成;经5-FC/GCV治疗后K562/CDglyTK组的肿瘤体积较对照组明显缩小,裸鼠生存率也较对照组明显提高.结论:双自杀基因在体内外对K562细胞均有杀伤作用.
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同源盒基因HoxA10的重组逆转录病毒载体及稳定包装细胞株的建立和鉴定
本研究构建携带同源盒基因hoxA10的重组逆转录病毒载体,并建立稳定产毒的包装细胞株.通过PCR扩增获得hoxA10基因编码区全长序列,克隆至逆转录病毒载体MSCVneo,并测序鉴定插入的hoxA10基因.将重组载体及空载体经脂质体分别转染包装细胞系PT67,以G418筛选稳定产毒细胞株.收集病毒悬液并测定病毒滴度.结果表明:重组逆转录病毒载体MSCVneo插入的hoxA10基因序列正确.将筛选所得的高效产毒细胞株命名为PT67/MSCVneo、PT67/MSCVneo-hoxA10.测定病毒滴度分别为5×105CPU/ml、4×104CFU/ml.结论:成功构建了同源盒基因hoxA10的重组逆转录病毒载体,建立了稳定、高效、准确产生逆转录病毒的细胞株,为探讨hoxA10基因在造血干细胞的增殖和分化功能提供了实验基础.
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过氧化氢酶在人脐带间充质干细胞中作用的研究
本研究通过携带过氧化氢酶(catalase,CAT)基因的逆转录病毒载体转染人脐带组织源间充质干细胞(UC-MSC),探讨CAT对人UC-MSC增殖以及多向分化潜能的影响.将携带绿色荧光蛋白(GFP)空载体质粒pMSCV-GFP和携带CAT基因的pMSCV-GFP-CAT逆转录病毒载体分别转染体外培养的人UC-MSC,用流式细胞仪分析并分选获得MSC-GFP、MSC-GFP-CAT两种细胞株;用过氧化氢酶检测试剂盒检测上述细胞株和UC.MSC中过氧化氢酶活力;用cell counting kit-8检测转染后细胞的增殖能力;用von Kossa和油红O染色观察成骨和成脂定向诱导分化.结果表明:转染48小时后即可观察到UC-MSC发出绿色荧光,3天后达到稳定状态,随着细胞的传代荧光强度不会减弱.流式细胞仪检测GFP+转染率显示,MSC-GFP为(25.54 ±8.65)%,MSC-GFP-CAT为(35.4±18.57)%;体外传代培养后检测UC-MSC、MSC-GFP、MSC-GFP-CAT细胞CAT活性分别为:19.5、20.3、67.2 U;MSC-GFP-CAT能被诱导分化为成骨和脂肪细胞;携带CAT基因载体转染对UC-MSC的增殖无显著影响(p>0.05).结论:成功获得高表达CAT的UC-MSC,其CAT的表达水平为对照组的3.4倍.转染对UC-MSC的增殖和分化能力无显著影响,基因转移使UC-MSC保留了成骨和成脂的能力.
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实时PCR定量分析体内基因转染效率的可行性
为了探索实时PCR技术评价基因转染效率的可行性,利用克隆PCR检测逆转录病毒载体介导的neo基因导入原代成肌细胞的转染效率,同时行实时PCR检测,对二者结果进行对比分析;利用线性扩增介导的PCR(LAM-PCR)技术和逆转录病毒5′LTR插入细胞基因组位点的分析,确定单细胞内基因转染的拷贝数.结果显示:①在低转染率的情况下(<36%)二者的结果相近,但是在高转染率情况下二者的结果差别明显; ②逆转录病毒载体介导的转染,在原代成肌细胞中为单拷贝基因导入基因组内.结论:实时PCR可以比较精确地估计体内病毒载体介导的基因转染效率;而在体外由于多为高转染率,不适合用此方法进行检测.
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逆转录病毒转导内皮细胞的优化研究
内皮细胞位于血管腔的内表面，血液途径基因治疗时成为重要的转基因靶细胞。一般认为，逆转录病毒载体对内皮细胞的转导效率极低。常规使用多聚阳离子Polybrene预处理内皮细胞，在细胞可以忍受其毒性的大限度内，转导效率只有1％。逆转录病毒方法使外源基因整合入宿主基因组，可长期表达目的蛋白/多肽，一定意义上，其做为载体有不可替代性。
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PGK驱动逆转录病毒载体介导HSV-TK/GCV控制GVHD的研究
目的 研究磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子驱动的逆转录病毒载体介导单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦(HSV-TK/GCV)系统在小鼠异基因骨髓移植(allo-BMT)后能否减轻移植物抗宿主病(GVHD).方法 将转HSV-TK基因的逆转录病毒感染供鼠(C57BL/6鼠)脾淋巴细胞,感染后细胞与供鼠骨髓细胞混合移植给60Coγ射线照射后的受鼠(BALB/c鼠).移植后腹腔注射GCV,用药1周,按移植后首次给药时间,分为GCV 0 d组、GCV 7 d组、GCV 12 d组.观察移植后受鼠生存期、存活率、GVHD发生率及严重程度、T细胞免疫重建(CD3、CD4、CD8)及异基因嵌合等指标.结果 TK/GCV 0 d组、TK/GCV 7 d组小鼠平均生存时间分别为(26.90±4.88)d、(27.00±4.80)d,较TK/GCV 12 d组(21.50±3.26)d和移植对照组(15.10±0.43)d明显延长(P＜0.05),Tk/GCV 0 d组与TK/GCV 7 d组之间比较差异无统计学意义(P＞0.05).对照组小鼠12～14 d 100%发生Ⅲ～Ⅳ级GVHD,实验组死亡小鼠有Ⅱ～Ⅳ级GVHD病理学改变,而长期生存小鼠仅出现Ⅰ～Ⅱ级GVHD.TK/GCV 0 d组、TK/GCV7 d组、TK/GCV 12 d组在移植后5、10、15 d 3个时间点检测CD4+ T细胞均高于对照组(P＜0.05),CD8+ T细胞均低于对照组(P＜0.05).移植后30 d检测10只受鼠异基因嵌合率均在95%～100%.结论 PGK启动子驱动的逆转录病毒载体介导HSV-TK/GCV系统能有效控制小鼠allo-BMT后GVHD,移植后早期预防性用药效果优于发生GVHD后治疗性用药.
关键词： 逆转录病毒载体 HSV-TK/GCV 移植物抗宿主病 异基因移植 -
IL-4RA基因转染对哮喘模型的干预性作用研究
目的 IL-4RA基因转染对哮喘模型过敏性炎症的干预性研究.方法 选择雌性BALB/c小鼠作为动物模型,随机分为5组(每组10只):空白对照组、哮喘模型组、空载体(104 CFU/ml pLNC-laz)干预组、激素治疗组、目的基因(104 CFU/ml pLNC-IL-4RA)干预组.各组在后一次激发后24 h放血杀死小鼠,检测血中嗜酸性粒细胞(eosinophils,EOS)计数,用ELISA检测支气管肺泡灌洗液(broncho alveolar lavage fluid,BALF)中的各种细胞因子水平,并对BALF中各种炎症细胞计数,肺组织切片做HE染色.结果 哮喘模型鼠BALF中有大量嗜酸性粒细胞浸润,肺组织病理切片可见大量炎症细胞浸润、杯状细胞增生、黏膜壁破坏.哮喘模型的这些改变在激素和基因干预后明显减轻,差异有统计学意义(P＜0.01),而在空载体干预后则无明显的变化(P＞0.05).空白对照组的BALF中IL-5、IL-13低于检测水平,哮喘模型组BALF中IL-5、IL-13水平明显增高,而基因治疗组和激素治疗组IL-5、IL-13水平明显减少,差异有统计学意义(P＜0.01),空载体干预组BALF中细胞因子水平与哮喘模型组比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 通过逆转录病毒转染的IL-4RA的基因高表达成功地阻止在哮喘模型鼠气道由IL-4和IL-13诱发的气道嗜酸性粒细胞浸润,另外,逆转录病毒介导的IL-4RA在气道的表达明显地阻止了哮喘模型气道黏液的分泌,同时也减少了过敏性哮喘相关的TH2细胞因子水平,因此,基因治疗可能会成为治疗慢性哮喘气道炎症和哮喘症状的极有潜力的药物.
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人乳头瘤病毒16型(湖北株)E7基因逆转录病毒重组体的构建及在真核细胞中表达
近年来的研究进一步证实HPV16 E7基因是其主要的恶性转化因子.我们将HPV16 E7基因克隆到逆转录病毒载体pLXSN上,并对其在真核细胞中的表达进行了研究.
