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酵母双杂交系统的研究进展与应用
酵母双杂交系统作为发现和研究在活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台,在近几年来得到了广泛运用.酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的,研究活细胞内蛋白质相互作用,对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到,它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术.大量的研究文献表明,酵母双杂交系统既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的相互作用,也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的相互作用.因此,它在许多的研究领域中有着广泛的应用.本文就酵母双杂交的技术平台和应用加以介绍.
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不同产地10种卷柏雌激素样活性筛选的实验研究
目的:研究不同产地的10种卷柏雌激素样活性.方法:采用MCF-7细胞增殖实验与小鼠子宫增重实验结合,进行不同产地卷柏雌激素样活性筛选;结合血清药理学实验综合评价雌激素样活性;以pERE-TAL-luc、p β gal-Control、pCXN2-hER α或pCXN2-hER β转染HEK293细胞,雌激素应答元件(ERE)调控的报告基因瞬时表达检测,探讨卷柏发挥雌激素样作用的途径.结果:卷柏属植物卷柏(JB6)和江南卷柏(JB7)能明显升高小鼠的子宫系数,与空白组相比有显著性差异(P＜0.01);JB6和JB7可显著促进MCF-7细胞增殖;JB6和JB7不论由雌激素受体(ER)α或ERβ介导均具有雌激素活性,与ERα的亲和力高于ERβ.结论:JB6和JB7具有雌激素样活性,其中JB6的雌激素样作用强于JB7.卷柏激活基因转录发挥雌激素样作用主要是通过ERα介导的.
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大豆甙元对子宫内膜癌细胞增殖的影响及其受体作用机制研究
目的 观察大豆甙元对子宫内膜癌细胞增殖及其雌激素受体(ER)表达的影响.方法 体外培养子宫内膜癌HEC-1B细胞,采用MTT法检测不同浓度大豆甙元对子宫内膜癌细胞增殖的影响,同时检测大豆甙元对启动子(ERE)调控的ERα和ER β的荧光素酶报告基因表达的影响.结果 大豆甙元对HEC-1B细胞体外增殖有明显抑制作用,其抑制作用在一定范围内呈剂量及时间依赖性.大豆甙元在低浓度时已可显著诱导报告基因luc的表达,在80 × 10-6 mol/L时达到高值;在高浓度时,其诱导作用逐渐下降;大豆甙元通过ER β介导的报告基因表达水平的升高程度强于ERα.结论 大豆甙元可抑制子宫内膜癌细胞的增殖,这种抑制作用可通过调节子宫内膜癌细胞ER α和ER β的表达、调整ERα/ER β比例而实现.
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卷柏等5种中药植物雌激素活性筛选的实验研究
目的:对几种中药进行了植物雌激素的活性筛选.方法:采用动物实验结合报告基因技术,对5种中药进行了植物雌激素活性的研究.在体动物实验:采用出生21 d刚断乳昆明种雌性小鼠,随机分组,分别给予卷柏、松针、石胆草、贯众、益母草水提取物,阳性药为尼尔雌醇,持续给药7 d后处死小鼠,子宫称重,计算子宫系数;以雌激素应答元件(ERE)调控的报告基因瞬时表达检测,用荧光素酶检测试剂盒检测细胞上清液荧光素酶的活性,筛选出对α亚型雌激素受体(ERα)或β亚型雌激素受体(ERβ)有作用的中药.结果:卷柏提取物可使小鼠子宫重增加(P＜0.01);且ERE调控的报告基因瞬时表达检测中,不论由ERα或ERβ介导均具有雌激素活性(P＜0.01).进一步子宫增重实验,对卷柏的有效部位进行了筛选,确定卷柏的有效部位为水部位和正丁醇部位.结论:卷柏及其水部位和正丁醇部位具有雌激素活性,且卷柏与ERβ的亲和力比与ERα的亲和力大,说明卷柏激活基因转录主要是通过ERβ介导的.
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基于报告基因的化学预防剂细胞筛选模型的建立
目的:建立基于报告基因和抗氧化反应元件(anti-oxidative response element,ARE)的药物筛选细胞模型,为化学预防剂的筛选奠定基础.方法:构建重组报告基因表达载体p4ARE-TK-GFP/neo,并将其转入HepG_2细胞中,利用已知化学预防剂检测该细胞模型,并观察白藜芦醇、原儿茶醛、熊果酸和齐墩果酸4种中药单体不同浓度(0,12.5,25,50,100,200 μmol·L~(-1))对GFP报告基因表达活性的影响.结果:表达载体p4ARE-TK-GFP/neo中GFP的表达受ARE的调控,其表达水平高于对照载体且在一定范围内与化学预防剂的浓度呈剂量效应关系.4种中药单体中白藜芦醇有较好的诱导效果.结论:利用此模型通过测定GFP报告基因的诱导表达水平可筛选得到新结构的化学预防剂.
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报告基因方法监测重金属汞及其化合物的早期毒性
目的:基于热休克信号响应和分泌型碱性磷酸酶(SEAP)报告基因,建立HSE-SEAP-HeLa细胞模型,预测重金属(汞及其化合物)的早期毒性.方法:将pHSE-SEAP质粒转染到人子宫颈癌HeLa细胞中,建立瞬时HSE-SEAP响应模型.热休克(42℃,1 h)或重金属化合物(CdCl2,5 μmol·L-1,4 h)处理后,在完全DMEM培养基中恢复48h后,检测细胞上清液中的分泌型碱性磷酸酶的含量(表示该状态下细胞中的热休克蛋白表达量),同时用MTT方法检测对应浓度下的细胞活性,以验证模型的有效性和重复性.并用亚致死浓度(由MTT实验确定)的无机和矿物汞(HgCl2,HgS和朱砂)和柳硫汞钠处理细胞,检测诱导的细胞热休克响应.结果:热休克和CdCl2作用HSE-SEAP-HeLa细胞模型后,细胞上清液中的分泌型碱性磷酸酶的含量显著升高;热休克蛋白表达早于Cd2+对细胞活性的降低.4种汞化合物在亚致死浓度均诱导细胞内热休克蛋白的变化,但4种化合物的作用时间和浓度效应不同,显示不同类型的汞化合物早期毒性存在差异.结论:HSE-SEAP-HeLa细胞模型可有效检测重金属诱导的热休克应激作用,并具有良好的重复性,可应用于重金属有关的早期毒性预测或药物毒性评估.
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基于雌激素应答元件转录调节的药物筛选模型的建立
目的:建立靶向雌激素应答元件(ERE)的药物筛选模型,为筛选雌激素受体(ER)配体奠定基础.方法:构建重组报告基因载体pERE-TAL-SEAP,与对照载体pCMVβ瞬时共转染表达人ERα或ERβ的Hela细胞株,观察化合物对SEAP报告基因表达活性的影响.结果:雌二醇(E2)诱导表达人ERα或 ERβ的 Hela细胞株 SEAP的表达, EC50 分别为(80.58±8.51) pmol*L-1和(103.90±5.29) pmol*L-1,大效应浓度为10 nmol*L-1;金雀黄素 (Gen) 也诱导表达人ERα和 ERβ Hela 细胞株 SEAP 的表达,EC50分别为(39.38±2.26) nmol*L-1和(10.86±0.75) nmol*L-1;大效应浓度为1 μmol*L-1;E2和Gen诱导SEAP表达的大水平较对照孔细胞高7～14倍.ER拮抗剂ICI182,780可完全抑制E2和Gen对SEAP的诱导作用.结论:利用此模型检测化合物诱导报告基因的表达水平可筛选和发现ER配体.
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醋制法对瑞香狼毒毒效影响的研究
目的:为探讨有毒中药瑞香狼毒炮制解(减)毒理论的科学性,并了解瑞香狼毒醋制前后对药效的影响.方法:PHLC-MS技术比较瑞香狼毒醋制前后成分差异；建立H22皮下移植瘤模型,比较醋制前后对荷瘤小鼠与正常小鼠的致死作用及体重变化；荷瘤小鼠连续灌胃给药后比较醋制前后对肿瘤及免疫器官的影响；荧光报告基因法研究瑞香狼毒提取物对肿瘤细胞作用的靶标基因TGF-β,AP1,NF-κB的影响.结果:瑞香狼毒提取物Zp1102与醋制后的提取物Zp1103的LD50分别为9.89,16.85 g· kg-1,Zp1103半数致死剂量高于Zp1102.药效试验表明,药物为2g·kg-1时,Zp1102对小鼠皮下移植瘤H22有显著抑制作用,抑瘤率为36.24％(P ＜0.01),Zp1103的抑瘤率略低,为34.40％ (P＜0.05)；药物为1g·kg-1时,Zp1102抑瘤率为34.52％ (P ＜0.05),而Zp1103抑瘤率明显降低,为21.55％.Zp1102,Zp1103对报告基因AP1基本无影响；Zp1102对HepG2细胞经刺激内源性NF-κB浓度升高后的报告基因有上调作用,且能下调TGF-β的表达,但Zp1103仅能上调NF-κB的表达,对TGF-β无影响.结论:瑞香狼毒醋制后的提取物较未经炮制而提取工艺相同的提取物毒性降低,同时体内药效学实验结果表明其抗肿瘤活性也略有降低,其机制可能与药物对转化生长因子TGF-β的调节有一定关联.
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人参茎叶皂甙增强糖皮质激素受体转录激活效应的实验研究
目的探讨人参茎叶皂甙(ginsenosides-stem-leaves,GSL)对糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)转录激活效应的影响.方法将糖皮质激素受体荧光素酶报告基因pGRE-tk-Luc与内参照基因pRL-SV40共同瞬时转染细胞,利用双荧光素酶报告基因检测方法(Dual-Luciferase Reporter Assay),观察地塞米松(dexamethasone,Dex)和GSL对报告基因表达的影响.结果Dex诱导HL7702细胞内报告基因的表达呈剂量和时间依赖性,Dex的大诱导倍数达93倍.糖皮质激素受体的拮抗剂RU486可以阻断Dex对报告基因的诱导;GSL不能诱导报告基因的表达,但可使Dex对GR报告基因的诱导表达效应提高61.4%.结论在体外GSL能增强Dex对GR的转录激活效应.
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环介导间接PCR鉴别高、低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒方法的建立
建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)环介导间接PCR检测方法,用于该病毒的感染检测和高致病性毒株与低致病性毒株的鉴别诊断.根据GenBank数据库中PRRSV中国流行株ORF7和ORFla基因序列的保守性,设计2对特异性探针,分别标记于大豆Lectin基因两端,作为报告基因,经过一步链置换反应后,采用反向PCR扩增报告基因,建立PRRSV环介导间接PCR检测方法,该方法扩增HP-PRRSV可得大小为193bp和355bp的特异片段,扩增LP-PRRSV可得大小为193bp和442bp的特异片段.试验结果表明,该方法能成功鉴别HP/LP-PRRSV,可检测出5.6 TCID50/mL LP-PRRSV和18 TCID50/mL HP-PRRSV的病毒RNA,HP/LP-PRRSV混合感染不影响检测灵敏度,与CSFV、PPV、PRV、PCV2、ETEC和Haemophilus parasui等常见猪源性病原的检测无明显交叉反应；对20份临床样本进行比较检测,环介导间接PCR检测出14份PRRSV阳性样本,其中4份LP-PRRSV、9份HP-PRRSV和1份LP/HP-PRRSV,与常规PCR检测结果一致.环介导间接PCR是一种简便快速、灵敏、特异的病原学诊断工具,适合PRRSV感染的快速检测和HP/LP-PRRSV鉴别诊断,尤其适合HP/LP-PRRSV混合感染的鉴别.
关键词： 猪繁殖与呼吸综合征病毒 环介导间接PCR 报告基因 -
发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒微复制子的建立
发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(SFTSV)是我国新发现的一种布尼亚病毒,可引起人类严重发热伴血小板减少综合征.我们利用RNA聚合酶Ⅰ体系,分别构建SFTSV三个片段L、M、S微复制子,研究其非编码区调控功能.将报告基因绿色荧光蛋白( GFP)或荧光素酶(Luciferase)分别插入SFTSV三个片段5′和3′非编码区之间,所形成的嵌合cDNA反向插入含RNA聚合酶Ⅰ的表达载体pHH21中,获得SFTSV微复制子重组质粒L-GFP-pHH21、M-GFP-pH H21、S-GFP-pHH21、L-Luc pHH21、M-Luc-pHH21和S-Luc-pHH21,分别与成功表达SFTSV聚合酶蛋白(L蛋白)和结构蛋白(N蛋白)的质粒VR1012-L和VR 1012-NP共同转染293T细胞,24～48h后观察GFP表达情况或检测萤光素酶表达量.L、M、S片段GFP微复制子均可观察到特异性绿色荧光.荧光素酶定量结果显示其在不同节段非编码区中的表达量不同,提示SFTSV三个节段的非编码区启动微复制子转录和复制的强度不同.
关键词： 发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒 反向遗传学 微复制子 报告基因 -
人肠道病毒D68型微复制子的建立
建立人肠道病毒D68型(EV-D68)微复制子体系.利用增强绿色荧光蛋白(EGFP)或萤火虫荧光素酶(FLuc)报告基因替换病毒编码区,通过酶切连接,构建EV-D68 T7和Pol Ⅰ系统微复制子体系,获得重组质粒pT7-miniEGFP、pT7-miniFLuc、pH H21-miniEGFP、pHH21 miniFLuc和pH H21-miniFLucap.lyC.微复制子转染RD细胞,48h后荧光显微镜观察EGFP表达情况或用双报告系统检测荧光素酶表达水平.T7和Pol Ⅰ系统微复制子均可表达报告基因,但Pol Ⅰ系统荧光素酶表达水平是T7系统的5倍.并且病毒非编码区的PolyC区域对于病毒蛋白的表达起着重要的作用.本研究成功构建了EV-D68微复制子体系,为EV-D68非编码区功能研究提供工具.
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基于双探针杂交的AIV、NDV和FAV-4三重环介导PCR鉴别检测方法的建立及应用
本研究目的是建立禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)和禽腺病毒4型(FAV-4)三重环介导PCR检测方法,用于3种病毒混合感染的鉴别诊断.根据GenBank数据库中AIV的HA基因、NDV的F基因和FAV-4的Hexon基因序列保守性,分别设计两条序列相邻的特异性探针,标记于不同大小的拟南芥TOC1基因片段两端,作为报告基因,用于环介导PCR检测,成功建立了AIV、NDV和FAV-4三重环介导PCR鉴别诊断方法,扩增片段大小分别为200bp、270bp和360bp.特异性试验结果表明,环介导PCR对含有AIV、NDV和FAV-4核酸的样品可扩增出特异性目的片段,而含有IBDV、IVB、FPV和MDV核酸的样品则未见明显扩增,特异性良好;灵敏性试验结果表明,环介导PCR对AIV、NDV和FAV-4的低极限浓度分别为25pg/μL、12.5pg/μL和12.5pg/μL的核酸样品,检测灵敏度高;多病原同时检测不影响环介导PCR检测特异性和灵敏性.利用该方法对117份临床样本进行检测,结果显示,环介导PCR对AIV、NDV和FAV-4阳性检出率分别为15.4％,27.4％和34.2％,分别高于常规PCR 12.8％,23.9％和32.5％,接近于SybrGreen实时PCR 15.4％,28.2％和35％;kappa一致性检验显示,环介导PCR、SybrGreen实时PCR两种方法对AIV、NDV和FAV-4检测结果高度符合,Kappa值分别为κ=0.93、κ=0.89和κ=0.94.本研究成功建立了AIV、NDV和FAV-4三重环介导PCR检测方法,适用于临床上3种病原的快速鉴别诊断.
关键词： 双探针 环介导PCR 报告基因 禽腺病毒4型(FAV-4) -
将人的皮肤成纤维细胞直接诱导为神经干细胞
目的 探讨将人的皮肤成纤维细胞诱导为神经干细胞.方法 将成人的皮肤成纤维细胞用带有Pax6报告基因和绿色荧光蛋白的慢病毒感染,并经历其病毒载体的抗性基因嘌呤霉素筛选后的细胞作为初始细胞,转入在维持神经干细胞生长发育、分化、保持功能稳定性和可塑性中起非常重要作用的10个基因Sox2、Klf4、c-Myc、Tcf3、Ascl1、Brn2、Neurog2、Foxg1、Hes1和Id1,对经过重新编程表达GFP绿色荧光蛋白的细胞用流式细胞仪进行筛选,并对其进行免疫荧光染色和分化的鉴定.结果 转入基因后成功诱导为神经干细胞(iNSCs).iNSCs能表达神经干细胞的标志性基因(Nestin),能分化为神经元(βⅢ-tubulin)和星形胶质细胞(GFAP).结论 通过转入外源因子的方式可以将人的皮肤成纤维细胞诱导为神经干细胞.
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艾美耳球虫转基因研究进展
艾美耳属Eimeria球虫是寄生于多种动物的一类细胞内寄生原虫。近年来随着荧光报告基因及药物筛选基因的应用，艾美耳属球虫的转基因研究取得了较为可喜的突破。转基因艾美耳球虫为球虫生物学、免疫学和遗传学研究提供了很好的研究材料。本文将对艾美耳球虫转基因研究取得的突破、所使用的转基因及鉴定技术，以及转基因球虫的潜在应用作一综述。
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报告基因技术的理论基础及其应用
报告基因技术广泛地应用于监测细胞的信号转导和基因表达,通过把转录控制元件剪接到报告基因,可以直观地"报道"细胞内与基因表达有关的信号级联.这种检测具有敏感性高、方便、可靠而且适用于大规模检测等优点.随着报告基因技术及其检测方法的不断改进,荧光素酶、绿色荧光蛋白以及新近克隆出的红色荧光蛋白作为无害性的检测工具,将在检测活体组织和细胞基因表达方面得到越来越广泛的应用.此外,在研究疾病发生的分子机制,基因治疗和药物开发方面,报告基因技术也将发挥出重要作用.本文对报告基因技术的基础理论、常用报告基因的种类和特点,以及其目前的主要应用作了概括性介绍.
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报告基因的选择及其研究趋向
报告基因是一种编码某种易于检测蛋白质或酶的基因,通过它的表达产物来标定目的基因的表达调控.由于具有灵敏度高、检测方便等特点,报告基因技术在转基因、启动子分析以及药物筛选等领域有了广泛的应用.近年来,随着荧光分析方法和技术的进步,荧光素酶和绿色荧光蛋白成为众多报告基因中的后起之秀,本文以这两个报告基因为重点,综述了报告基因的特点、应用、近年来的进展以及未来发展方向.
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增强型绿色荧光蛋白逆转录病毒载体的构建和表达
逆转录病毒载体被广泛用作对造血细胞进行基因转移的工具,转导方法的改进有赖于应用可快速分析并被高效选择的基因标志.为此,我们克隆了增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因,并构建可表达EGFP的逆转录病毒载体LGSN,通过脂质体转染和交互感染方法建立高滴度的逆转录产病毒细胞,用以分析对造血细胞标记EGFP基因的可行性.流式细胞术和荧光显微镜检测发现,EGFP病毒转录的GP+envAm12细胞和K562细胞均可发出稳定的绿色荧光信号,阳性率可分别达97%和86%;聚合酶链反应分析显示LGSN转导细胞内有原病毒的整合.上述结果提示,作为新一代选择性标志,EGFP是适于研究对造血细胞基因转移与表达的报告基因,对促进人类基因治疗的研究有重要意义.
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略谈肾病研究中的基因转移技术
自1991年Koseki等[1]首先以逆转录病毒为载体,将体外转染报告基因-β半乳糖苷酶基因(lac Z基因)的胚肾种植于新生小鼠的肾包膜下,观察其在肾小球和远端肾小管上皮细胞(肾小管上皮细胞)成功表达以来,国内外已有许多作者采取不同的转基因方法和载体注入途径观察了一些报告基因对肾损伤或肾疾病发生发展过程的影响,从而为实施对肾损伤的保护或肾病的基因治疗提供了重要的理论和实验依据.
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表达绿色荧光蛋白的重组腺病毒伴随病毒的产生
来源于维多利亚水母(Aequorea victoria)的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)是近年来发现的一种新的报告基因,由于其具有产生荧光不需任何底物或辅助因子、可以活体观察等特点,因此在目前的基因转移、基因治疗研究中得到了广泛的应用[1].重组腺病毒伴随病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)具有安全性好、可介导外源基因长期稳定表达等特点,是目前比较理想的基因治疗载体.构建表达GFP的rAAV载体(rAAV-GFP)对于应用rAAV进行基因转移和基因治疗研究非常必要,如评估rAAV生产系统的生产效率、估计rAAV的转导效率、研究rAAV进入体内后的分布及表达情况等.
