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逆转录病毒转导内皮细胞的优化研究
内皮细胞位于血管腔的内表面,血液途径基因治疗时成为重要的转基因靶细胞。一般认为,逆转录病毒载体对内皮细胞的转导效率极低。常规使用多聚阳离子Polybrene预处理内皮细胞,在细胞可以忍受其毒性的大限度内,转导效率只有1%。逆转录病毒方法使外源基因整合入宿主基因组,可长期表达目的蛋白/多肽,一定意义上,其做为载体有不可替代性。
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口腔癌细胞HSV-tk基因的转导及其鉴定
单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(herpes simplex virus thymidine kinase, HSV-tk)是自杀基因的代表。我们将HSV-tk基因转导入口腔癌细胞系Tca8113和ACC-M细胞并对基因转导细胞进行鉴定,以便为体内外及临床前期试验打下基础。 材料与方法:①人舌鳞状细胞癌细胞系Tca8113和人高转移性涎腺腺样囊性癌细胞株ACC-M由上海第二医科大学口腔医学院口腔颌面外科建立[1,2]。逆转录病毒包装细胞PA317细胞、NIH3T3细胞由上海第二医科大学人类基因治疗中心保存。含HSV-tk基因的逆转录病毒载体pL(TK)SN由上海第二医科大学人类基因治疗中心构建。②脂质体介导基因转移: PA317细胞中加入DNA与脂质体混合物1 ml,6 h后,以400 mg/L G418筛选至克隆出现并扩增,命名为PA317TK细胞和PA317LN细胞。③逆转录病毒载体上清液的收集及滴度测定: 收集PA317TK和PA317LN细胞培养上清液。NIH3T3细胞中加入8 mg/L的polybrene和适量病毒悬液,8 h后以G418筛选至克隆出现。根据克隆形成数计算病毒滴度。④肿瘤细胞tk基因的转导:肿瘤细胞中加入polybrene和适量病毒上清液,24 h后,以G418筛选至克隆出现并扩增。⑤PCR鉴定外源基因整合: 细胞总DNA进行PCR:NeoR基因5′端引物为5′-CAAGATGGATTGCACGCAGG-3′,3′端引物为5′-CCCGCTCAGAAAGAACTCGTC-3′。⑥RT-PCR检测外源基因表达 TRIzol RNA抽提试剂盒抽提细胞RNA并进行RT-PCR,产物做PCR,β-actin作内参照。⑦安全性检测: 1 μg细胞DNA进行PCR:env基因5′端引物为5′-ACCTGGAGAGTCACCAACC-3′,3′端引物为5′-TACTTTGGAGAG GTCGTAGC-3′。
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腺相关病毒载体与中枢神经系统疾病的基因治疗
中枢神经系统疾病分子改变的深入研究和基因治疗技术的不断发展为临床治疗这些疾病带来了希望.但基因治疗临床应用的大障碍之一便是转基因技术中载体系统的选择.理想的体内基因转移载体应具有较好的细胞靶向性,目的基因表达的可控性以及转移方法的简单易行.自七十年代末病毒载体的概念提出以来,用于基因治疗研究的缺陷性病毒载体种类日渐增加,应用也愈加广泛.其中,腺相关病毒(AAV)载体是目前病毒类转基因系统中较新的成员.由于该系统大的优点之一是它的安全性较好,并且有可能发展成为将外源基因整合入宿主细胞染色体的非病毒载体系统,因此倍受关注,并已开始应用于临床试验[1].