首页 > 文献资料
-
Ad5F35重组腺病毒载体研究进展
在分子生物学领域,腺病毒载体是将外源基因导入动物细胞内经常使用的载体之一.由于其靶细胞种类多,转导效率高,对增殖期及静止期细胞均有很高的转导效率,不整合到宿主基因组中,不会引起插入突变,理化性质较稳定,易于分离纯化,可容纳较大的目的基因片段等优势,因而被广泛用于基因治疗、体外基因转染及基因疫苗制备等实验及临床研究中,其中Ad5F35型腺病毒载体为近年来研究热点之一,此文就其研究进展作一综述.
-
重组腺病毒载体靶向性策略的研究进展
近年来,研究者致力于突破基因治疗的瓶颈,极大推动了基因治疗的发展。载体系统是基因治疗的基础,截止2013年7月,在“Gene Therapy Clinical Trial Worldwide”网站登记注册的基因治疗方案中,重组腺病毒载体占476项(23.5%)。在6个亚群(A-F)、50多种血清型的腺病毒载体中,5型腺病毒(adenovirus type 5,Ad5)可特异性识别并结合多种正常组织高表达的柯萨奇病毒-腺病毒受体(coxsackie-adenovirus receptor,CAR)从而进入细胞发挥作用,基因转导效率高,因此,Ad5是目前应用广泛的腺病毒载体。
-
腺相关病毒载体介导造血干细胞基因转导的策略
腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)已被广泛用作基因治疗的载体.本文就提高AAV载体在HSCs中的基因转导效率的策略综述如下.
-
逆转录病毒转导内皮细胞的优化研究
内皮细胞位于血管腔的内表面,血液途径基因治疗时成为重要的转基因靶细胞。一般认为,逆转录病毒载体对内皮细胞的转导效率极低。常规使用多聚阳离子Polybrene预处理内皮细胞,在细胞可以忍受其毒性的大限度内,转导效率只有1%。逆转录病毒方法使外源基因整合入宿主基因组,可长期表达目的蛋白/多肽,一定意义上,其做为载体有不可替代性。
-
表达绿色荧光蛋白的重组腺病毒伴随病毒的产生
来源于维多利亚水母(Aequorea victoria)的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)是近年来发现的一种新的报告基因,由于其具有产生荧光不需任何底物或辅助因子、可以活体观察等特点,因此在目前的基因转移、基因治疗研究中得到了广泛的应用[1].重组腺病毒伴随病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)具有安全性好、可介导外源基因长期稳定表达等特点,是目前比较理想的基因治疗载体.构建表达GFP的rAAV载体(rAAV-GFP)对于应用rAAV进行基因转移和基因治疗研究非常必要,如评估rAAV生产系统的生产效率、估计rAAV的转导效率、研究rAAV进入体内后的分布及表达情况等.
-
含不同启动子的重组9型腺相关病毒载体转染大鼠心肌细胞表达效率的差异
9型腺相关病毒( AAV9)作为基因治疗心脏疾病的佳载体之一而成为近年来研究的热点[1],但影响AAV9转导效率的因素很多,其中载体上的启动子和受体细胞是否合适是直接影响到目的基因的转录效率和表达水平的重要因素[2],本研究分别选用含CMV启动子和CBA启动子的rAAV9携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转染心肌细胞,比较两个启动子在心肌细胞的转录活性以及对细胞生长的影响,从而为AAV9携带靶基因高效转染心肌细胞以及应用于心脏疾病的基因治疗提供实验资料.
-
头颈肿瘤基因治疗研究的进展
头颈肿瘤发病率较高,目前临床治疗仍以手术、放疗和化疗为主。这些治疗手段在晚期肿瘤的疗效及延长患者寿命方面有很大的局限性。近20年来,随着现代医学的发展,出现了肿瘤的生物疗法。尤其是近年来兴起的基因治疗为人类战胜肿瘤带来了新的希望。能否将外源基因导入靶细胞并表达,是基因治疗面临的首要问题。Clayman等[1]首先试验了正常及癌变口腔粘膜转染和表达外源基因的能力。发现局部应用腺病毒并不能将外源基因导入人或鼠的正常粘膜,而心内注射却能有效地将外源基因导入健康仓鼠的口腔粘膜。体外转导效率呈剂量依赖型。(2×108)pfu 2次注射可使100%癌细胞表达报告基因。向荷瘤裸鼠模型的肿瘤内注射腺病毒,可使包括远离注射部位的30%的癌细胞表达报告基因,从而为口腔癌的基因治疗奠定了基础。 一、基因替代疗法 现代肿瘤学证明,头颈肿瘤的发生、发展与多种癌基因激活及抑癌基因失活有关。利用基因工程手段向肿瘤内输入野生型抑癌基因已成为治疗口腔癌的一个方向。抑癌基因 p53的点突变是头颈鳞癌频率高的遗传改变,导致无活性的p53蛋白过度表达。许多学者尝试了用野生型p53基因转染治疗头颈肿瘤,体外与体内试验及临床应用均有一定的疗效。肿瘤细胞p53的表达比对照组高出10倍[2],体外肿瘤细胞生长受到抑制。在裸鼠体内实验中向瘤周注射p53基因,肿瘤体积也明显减小,该效应依赖于载体剂量而与内源性p53状态无关。在裸鼠体内皮下接种肿瘤细胞,模仿头颈肿瘤患者术后残瘤环境,野生型p53转染也可抑制其残存瘤细胞形成肿瘤[3]。
-
1型及2型腺相关病毒对视网膜细胞转导效率的比较研究
目的 探讨不同血清型的重组腺相关病毒(rAAV)对视网膜细胞的转导效率、基因表达水平以及感染细胞类型的差异,为眼底病基因治疗选择适当的载体提供实验依据.方法 采用携带绿色荧光蛋白报告基因的血清型1型(rAAV2/1-EGFP)和2型(rAAV2-EGFP)rAAV感染体外培养的RPE细胞株、原代培养的SD大鼠视网膜神经细胞和原代培养的成人RPE细胞,通过荧光显微镜和流式细胞仪观察和检测EGFP荧光出现的时间、阳性率及荧光强度.分别将二种不同血清型的rAAV注射到SD大鼠视网膜下间隙,通过荧光体视镜观察眼底出现EGFP荧光的时间、范围、强度和分布特点等.后通过眼组织切片和免疫组织化学染色观察被AAV感染的视网膜细胞的类型,以及是否有炎症反应和免疫反应.结果 流式细胞仪检测rAAV2-EGFP转导体外培养的RPE细胞株后第7、14天时EGFP阳性率分别为13.5%±1.7%和15.6%±0.8%,平均亮度为2.75±0.12和3.80±0.72;rAAV2/1-EGFP转导RPE细胞株后第7和14天时EGFP阳性率分别为1.1%±0.5%和2.0%±0.4%,平均亮度为1.12±0.09和1.75±0.20.rAAV2-EGFP感染活体视网膜后7、14、28、75d和4个月时,视网膜内EGFP荧光面积分别为(5389±211)μm2、(9832±364)μm2、(14 454±446)μm2、(20 528±648)μm2和(20 264±683)μm2;rAAV2/1-EGFP感染活体视网膜后在相同时间点测得EGFP荧光面积分别为(9666±348)μm2、(12 160±439)μm2、(19 794±621)μm2、(26 172±923)μm2、(26 022±965)μm2.每相同时间点的两组数据间差异具有统计学意义(均P<0.05).结论 2型rAAV能有效转导体外培养的视网膜细胞和活体视网膜细胞;但在活体视网膜内1型rAAV是一种比2型AAV更为有效的基因传递载体.
-
HIV-1慢病毒载体的构建及结构改造
目前很多基因治疗实验中选择造血干细胞(HSC)等非分裂期细胞作为靶细胞.常用病毒性载体为逆转录病毒和腺病毒载体系统[1,2].逆转录病毒只能转导分裂期细胞,腺病毒载体在体内不能实现目的基因稳定的长期表达,且反复应用容易引起免疫反应.来源于人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的慢病毒载体由于可以感染非分裂期细胞、容纳外源性目的基因片段大、免疫反应小等特点越来越受到人们的重视[3,4].我们成功构建了慢病毒载体的三质粒包装系统并重点对其中的转移质粒进行了改造,筛选出转导效率较高的慢病毒载体.
-
腺相关病毒在中枢神经系统的转导与表达特性
腺相关病毒( adeno-associated virus,AAV)由于自身独特的安全、高效、靶向性且可持续表达等优势在中枢神经系统( central nervous system, CNS)疾病治疗的应用上备受瞩目,本文主要讨论注射途径及时期、病毒类型、受体分布、启动子类型等对AAVs在CNS转导效率与表达的影响,安全性和免疫问题,旨在为AAV介导的中枢神经系统疾病的治疗提供较优的方案。
-
双链AAV载体的构建及其转导效率的检测
基因治疗为人类多种疾病的治疗带来了希望,但其临床应用的道路曲折,问题在于安全和有效的基因输送系统的开发.如何将治疗基因特异、有效地传递给靶细胞,这是基因治疗中的关键.
-
聚乙烯亚胺促进腺病毒体外基因表达
目的 筛选较合适相对分子质量的聚乙烯亚胺(PEI)用于提高腺病毒载体基因表达效率.方法 首先以物理吸附法使PEI与腺病毒相吸附,用噻唑蓝(MTT)法考察PEI-600、PEI-1 800、PEI-25 000复合腺病毒对细胞的毒性;利用体外A549细胞转导实验确定PEI-600、PEI-1 800和PEI-25 000复合腺病毒的佳剂量比,并对复合物的Zeta电位和粒径分布进行考察分析.结果 MTT实验证明PEI相对分子质量越大,细胞毒性越大,其中PEI-25 000毒性大;细胞转导试验中,PEI-1 800相对于PEI-600和PEI-25 000更显著促进腺病毒基因在A549细胞中的表达;Zeta电位测定结果显示PEI可以将腺病毒的表面负电荷转变为表面正电荷的粒子.结论 在3种聚合物/腺病毒的复合物中,细胞毒性与聚合物的相对分子质量和浓度呈正相关.相对分子质量越大,浓度越大则聚合物对细胞毒性越大.
-
成纤维细胞向心脏祖细胞重编程过程中能量代谢变化研究
目的:提高蛋白进入细胞的效率及细胞重编程效率,同时观察重编程过程中的能量代谢。方法:采用专利技术将GATA4、HAND2、MEF2C和TBX5(GHMT)高效转导到皮肤成纤维细胞株(HDF),检测转导效率和向心脏祖细胞的转分化效果,并检测能量代谢关键酶的变化。结果:纳米修饰后的蛋白能高效转导到细胞核内。心肌祖细胞标志基因GATA4等表达显著上调, Col1a2和vimentin表达显著下降。糖酵解途径关键调控因子葡萄糖转运蛋白1、己糖激酶和乳酸脱氢酶A在重编程后表达上调。有氧氧化途径的关键酶丙二酰辅酶A脱羧酶和脂酰转移酶1b表达下调。结论:采用GHMT诱导得到的心脏祖细胞有胚胎心肌类似的能量代谢方式,具体调控机制还需进一步研究。
-
肝细胞基因转导新载体-日本血凝病毒-脂质体
脂质体是基因转导的重要方法,其与日本血凝病毒(hemoagglutinating virus of Japan,HVJ)形成的融合脂质体(fusogenic liposomes,FLs)较传统脂质体在性能上有了很大提高,具有更高的稳定性、安全性和转导效率,制备、使用更加快捷方便。