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腺相关病毒载体研究进展
腺相关病毒作为基因治疗的载体,具有感染范围广,可长效稳定地表达外源基因,可定点整合至宿主基因组等诸多优点而备受青睐.近年来,有关腺相关病毒及重组腺相关病毒的生物学特点有不少研究进展,本文就此做一综述.
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基因治疗中的腺相关病毒载体
腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)是基因治疗中有希望的载体之一,它具有非致病性,对宿主免疫原性弱及广泛的细胞和组织亲嗜性等优点.本文综述了AAV在基因治疗中的新研究进展,着重探讨了修饰AAV以改变它的亲嗜性及使用不同的启动子来进一步促进AAV在基因治疗中的应用.
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表达siRNA的重组腺相关病毒载体的构建和鉴定
腺相关病毒(AAV)载体介导的RNA干扰(RNAi)可在哺乳动物细胞中长期特异性抑制同源基因表达.本研究以AAV Helper-Free System中的转移质粒pAAV-MCS为基础,引入增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因和H1启动子,将该质粒改造为可表达小干扰RNA(siRNA)和EGFP的质粒pAAV-EGFP-H1.该质粒与辅助质粒共转染包装细胞后,获得了具有感染性的重组AAV(rAAV).以EGFP为靶基因的干扰实验证明;所得rAAV可以产生siRNA并能够特异性抑制EGFP靶基因表达;荧光显微镜观察、FACS分析和Real-timePCR方法均表明重组病毒rAAv-H1-shEGFP引起EGFP的表达降低大于60%.
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重组腺相关病毒2型/人肿瘤坏死因子受体:Fc(rAAV2/hTNFR:Fc)的构建和生物学活性研究
为研究腺相关病毒2型载体应用于类风湿性关节炎进行基因治疗的可行性,首先构建携带人肿瘤坏死因子Ⅱ型受体胞外区和人免疫球蛋白IgG1 Fc段融合基因的重组2型腺相关病毒(FAAV2/hTNFR:Fc),并对其生物学活性进行研究.以RT-PCR分别从U937和人淋巴细胞总RNA中扩增人肿瘤坏死因子Ⅱ型受体胞外区和人免疫球蛋白IgG1 Fc段基因,并以重叠延伸PCR的方法将二者融合后克隆入pSNAV1载体质粒进行重组病毒生产,在进行重组病毒理化分析后,以TNFα细胞毒中和试验来研究该重组病毒的生物学活性.结果显示:所构建的重组病毒rAAV2/hTNFR:Fc基因结构与预期一致;病毒在体外感染BHK-21细胞后,含TNFR:Fc融合蛋白的表达上清可以有效中和人、大鼠、小鼠TNFα对L929的细胞毒性.所研究构建的重组腺相关病毒可以用来作为阻断TNFα的手段,进行类风湿性关节炎的基因治疗研究.
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一种包装AAV2/5的重组单纯疱疹病毒的构建
为了得到一种可以包装AAV2/5和表达绿色荧光蛋白的重组单纯疱疹病毒,设计并构建了一个由AAV2 rep基因和AAV5 cap基因嵌合而成的rep2cap5基因,然后,利用一套携带HSV1基因组的粘粒系统(cos6、cos28、cos14、cos56、cos48),将rep2cap5基因插入cos6粘粒上HSV1基因组片段的UL2基因中,而将EGFP的表达单位插入cos56粘粒上HSV1基因组片段的UL44基因中,用这2个重组粘粒与其它3个粘粒(cos14、cos28、cos48)共转染BHK-21细胞获得了重组病毒HSV1-r2c5-EGFP并进行了空斑纯化.HSV1-r2c5-EGFP病毒能够在BHK-21细胞连续传代,并且可以观察到几乎所有的感染细胞都能产生绿色荧光.用PCR方法以及Southern杂交方法表明所获得的HSV1-r2c5-EGFP中携带有rep2cap5基因,用HSV1-r2c5-EGFP感染携带报告基因LacZ的AAV载体细胞株,获得了具有感染性的重组AAV2/5-LacZ.结果表明,所获得的重组单纯疱疹病毒HSV1-r2c5-EGFP可提供AAV2/5载体包装所需的全部辅助功能,是一种能简便、高效制备重组AAV2/5病毒的通用性辅助病毒.
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猪呼吸道上皮细胞体外分化模型的建立及其应用研究
猪是许多呼吸道病毒感染的天然宿主,其与人类在肺生理学、呼吸道形态学和呼吸道细胞类型以及受体分布都有相似之处.为了解呼吸道病毒感染机制和筛选呼吸系统疾病药物,选择以猪肺组织为原料采用无血清气液界面培养法构建一种猪呼吸道上皮细胞(Porcine airway epithelial cell,PAEC)体外分化模型,然后通过扫描电子显微镜、电生理和免疫组织化学等方法鉴定该模型.采用三质粒共转染法构建重组腺相关病毒rAAV6-GFP(rAAV6-green fluorescent protein,rAAV6-GFP),通过顶端表面感染PAEC模型,探讨AAV6在PAEC模型中基因治疗领域的应用.结果显示分化成熟的PAEC模型为多层上皮结构,顶端表面含有纤毛细胞、黏液分泌细胞和基底细胞.rAAV6-GFP能通过顶端表面感染PAEC,有效地介导外源基因的长期表达.本文建立的猪呼吸道上皮细胞体外分化模型为呼吸道病原体感染和呼吸系统疾病药物筛选和基因疗法等研究奠定了良好的基础.
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重组腺相关病毒2型转导人外周血单核细胞来源树突状细胞的研究
树突状细胞(dendritic cell,DC)是目前发现的功能强的专职抗原递呈细胞(antigen presenting cell,APC)，能捕获、加工和提呈抗原,参与淋巴细胞的生长分化,并产生原发性CTL反应的细胞,在激活T细胞介导的免疫反应中起关键性作用[1].
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aFGF重组腺相关病毒转染内皮祖细胞
目的 研究含分泌型人酸性成纤维细胞生长因子(sp-haFGF)基因的重组腺相关病毒(rAAV)感染内皮祖细胞(EPCs)的可行性.方法 用PCR法将FGF-4的信号序列与原始的aFGF基因连接,形成sp-haFGF基因.将此目的基因克隆到AAV载体质粒pAAV-IRES-hrGFP中,并与包装质粒(pAAV-RC)和辅助质粒(pHelper)共转染HEK293细胞,获得编码sp-haFGF的重组腺相关病毒.用浓缩的病毒感染体外培养的EPC,荧光显微镜下观察细胞表达绿色荧光蛋白情况,并用RT-PCR和Western blot方法鉴定sp-haFGF在EPC中的表达.结果 获得含有sp-haFGF的重组腺相关病毒,将其感染EPC后,约20%～30%的细胞出现绿色荧光.用RT-PCR法从被感染细胞中扩增出一条长约560 bp的基因条带,通过Western blot检测到被感染细胞中haFGF蛋白的表达.结论 编码sp-haFGF的重组腺相关病毒能够有效地感染EPC,并在EPC中表达haFGF,为进一步研究转基因的内皮祖细胞移植促血管新生奠定基础.
关键词： 酸性成纤维细胞生长因子 腺相关病毒 内皮祖细胞 -
利用GCaMP6f蛋白对小鼠伏隔核神经元活动的钙离子成像
目的 在小鼠伏隔核表达GCaMP6f蛋白,并在束缚状态下,应用钙成像技术实时监测小鼠伏隔核内活化的神经元.方法 首先,包装并纯化aav-Syn1-GCaMP6f-P2A-Tomato病毒,并通过感染原代神经元验证目的蛋白的表达和功能.然后,通过脑立体定位技术注射aav-Syn1-GCaMP6f-P2A-Tomato病毒于小鼠伏隔核脑区,动物恢复21 d后,插入光纤,在其清醒状态下,给予束缚刺激,用钙成像技术实时记录伏隔核神经元的活化.结果 表达GCaMP6f的原代神经元在给予谷氨酸刺激后,神经元被活化,Ca2内流而产生绿色荧光;通过在体实验,给予小鼠束缚刺激,可在视野内检测到因伏隔核神经元活化而发出的绿色荧光信号;鼠脑切片同样可检测到位于胞质的绿色荧光信号与位于细胞核的病毒红色荧光标记共定位于相同细胞.结论 aav-Syn1-GCaMP6f-P2A-Tomato腺相关病毒可成功用于在体活化神经元的实时监测.通过在小鼠伏隔核定点注射该病毒,给予束缚刺激,应用钙成像技术可实时记录到小鼠伏隔核的活化神经元.
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腺相关病毒与生物素葡聚糖胺顺行标记小鼠皮质脊髓束的比较
目的 比较腺相关病毒(AAV)与生物素葡聚糖胺( BDA)用于顺行标记小鼠皮质脊髓束( CST)的差异,探索AAV病毒应用于小鼠皮质脊髓束的顺行神经示踪的优势.方法 通过立体定位注射将AAV8-CAG-GFP-2A病毒与BDA分别注射到正常小鼠以及脊髓损伤小鼠大脑体感运动皮质,通过免疫组织化学法检测AAV与BDA标记到的CST轴突,并对轴突束(bundle)及轴突分支(branch)的荧光强度进行定量分析.结果 在正常小鼠的脊髓颈段、胸段及脊髓损伤小鼠胸段,AAV与BDA均可标记到经典的CST轴突束,及投射到脊髓灰质中的轴突分支.相较于BDA,AAV在小鼠脊髓颈段和胸段均能标记到更广泛的CST轴突分支.结论 AAV对于CST轴突的标记效果优于传统的神经示踪剂BDA,可作为一种更好的神经示踪方法应用于小鼠皮质脊髓束及相关神经环路的形态学研究.
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重组腺相关病毒表达干扰素α体外抑制乙肝病毒的复制
目的：探索腺相关病毒介导的IFNα体外抑制HBV的效果，寻求治疗HBV感染的新策略。方法3种质粒共转染制备重组病毒AAV－IFNα，用AAV－IFNα感染肝细胞系HepG2．2．15，感染后1、3、6和9 d，qPCR检测HBV DNA；ELISA方法检测HBsAg和HBeAg含量；MTT法检测HepG2．2．15细胞增殖的情况。结果 AAV－IFNα可通过抑制HepG2．2．15细胞增殖的方式显著抑制HBV的复制与表达（ P＜0．05）。结论 AAV－IFNα是一种有潜力的抗HBV的药物。
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Aβ单链抗体基因腺相关病毒的包装和纯化
目的 包装和纯化携带Aβ单链抗体基因的腺相关病毒,为阿尔茨海默病的基因治疗创造条件.方法 用Li-pofectamine 2000将pSNAV2.0-Abeta-scFv质粒转染BHK-21细胞,并用G418筛选稳定细胞系.培养稳定细胞系,用辅助病毒HSVl-rc/AUL2感染包装携带Aβ单链抗体基因的腺相关病毒.用氯仿-PEG/NaCl-氯仿法和离子交换层析法纯化重组腺相关病毒,SDS-PAGE和PCR方法检测纯化的病毒.用地高辛标记探针测定重组腺相关病毒的物理滴度.利用水迷宫测试重组病毒对转基因阿尔茨海默病小鼠模型的治疗效果.结果 带Aβ单链抗体基因的腺相关病毒的纯度为98%,物理滴度为1×1012vg/mL.经过治疗的小鼠模型潜伏期明显缩短.结论 利用HSV1系统成功包装和纯化了携带Aβ单链抗体基因的腺相关病毒,动物实验表明对阿尔茨海默病具有治疗作用.
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AAV-GDNF/TH双基因载体的构建及表达
目的 探讨构建于同一个重组腺相关病毒(rAAV)载体上的酪氨酸羟化酶(TH)基因和胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因是否能够同时表达.方法 应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测双基因在HEK293包装细胞中的转录;通过免疫细胞化学荧光染色和免疫组织化学染色技术分别检测双基因在体外培养大鼠骨髓基质细胞(BMSCs)和大鼠脑中的表达.结果 在HEK293包装细胞和BMSCs中分别同时检测到了GDNF和TH基因RNA和蛋白的表达.对照LacZ在HEK293包装细胞和骨髓基质细胞中的表达率分别为50%和15%.大鼠脑组织切片中注射AAV-GDNF/TH病毒的部位与注射PBS的对侧相比无论是GDNF还是TH的表达均显著增加(P＜0.01).结论 构建于同一个rAAV载体上的TH基因和GDNF基因体内体外都能够同时表达,此结果为PD的基因治疗提供了新的依据.
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腺相关病毒Rep78/68蛋白
腺相关病毒(AAV)编码的非结构蛋白Rep78/68具有抑制病毒和肿瘤转化的作用,并且对宿主细胞的增殖及代谢产生广泛地影响.本文将对此蛋白的新研究进展进行综述.
关键词： Rep78/68蛋白 腺相关病毒 肿瘤转化 -
含TK-IES-ES非融合基因重组腺相关病毒的构建及其功能的初步鉴定
目的 探讨重组腺相关病毒(rAAV)-胸苷激酶(TK)-核糖体插入位点(IRES)-内皮抑素(ES)(简称rAAV-TIE)非融合载体的构建及每个目的 基因相应生物学效应的初步鉴定.方法 (1)用PER分别扩增IRES、TK、ES序列至pMD-19T simple载体,构建pAAV-TK-IRES-ES;(2)分别采用从V-Helper Free System包装系统、"氯仿-PEG/NaCl沉淀-氯仿抽提"及冰乙醇沉淀法进行AAV的包装、纯化和浓缩.(3)用T24细胞及人脐静脉内皮细胞(HUVEC)对rAAV-TIE生物学效应进行初步鉴定.结果(1)成功构建pAAV-TIE非融合载体,并经酶切、PCR及测序证实;(2)rAAV病毒颗粒滴度达2×1010v.p/mL,浓缩后可达到2×1011-12 v.p/mL;(3)rAAV-TIE可以分泌内皮抑素,诱导T24细胞及HUVEC凋亡.结论 成功构建rAAV-TIE腺相关病毒,体外实验表明每个基因片段均能发挥相应的生物学功能.
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反义细胞周期蛋白B1重组AAV抑制骨肉瘤U2OS细胞增殖和诱导凋亡
目的 研究携带反义细胞周期蛋白B1(CCNB1)的腺相关病毒载体(rAAV-AS-CCNB1/Neo)对骨肉瘤细胞U2OS的细胞增殖抑制和诱导凋亡的影响. 方法 将构建的重组AAV载体pd16-95-AS-CCNB1/neo和AAV/腺病毒辅助质粒pSH3共转染HEK293细胞,得到表达AS-CCNB1的重组AAV,纯化并浓缩病毒,测定病毒滴度.用重组AAV感染人骨肉瘤U2OS细胞(感染复数为105～106 v.g./细胞),采用Western blotting、RT-PCR、四甲基偶氮唑盐(MTT)法、流式细胞术等检测或观察重组AAV对细胞周期蛋白B1表达,瘤细胞体外增殖、凋亡和细胞周期的影响.结果 成功构建rAAV-AS-CCNB1,病毒滴度为1.0×1011 v.g./ml,体外感染U2OS细胞后可明显降低其增殖活性,Western blotting和RT-PCR提示,rAAV-AS-CCNB1可抑制细胞周期蛋白B1表达,流式细胞术提示,细胞出现明显凋亡和G1期阻滞. 结论 反义CCNB1重组AAV具有明显的抗骨肉瘤U2OS细胞体外增殖作用,其作用可能与其诱导细胞凋亡和周期阻滞有关.
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腺相关病毒介导胰岛素样生长因子Ⅰ对高糖诱导神经元凋亡的保护作用
目的 研究重组腺相关病毒(AAV)载体介导胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF Ⅰ)在体外神经元表达的情况,及其对高糖诱导神经元凋亡的保护作用.方法 利用分子克隆技术将大鼠IGF Ⅰ基因克隆到pSNAV2.0质粒上,构建包含重组质粒pSNAV2.0-IGF Ⅰ的杂合型重组AAV载体rAAV2/1-IGF Ⅰ.将人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞分为正常组(A组)、无血清组(B组)、无血清高糖组(C组),无血清高糖+rAAV2/1-IGF Ⅰ组(D组),其中A组不做任何处理;B组使用无血清培养基培养;C组用含100mmol/L D-葡萄糖的无血清培养基培养;D组则先用rAAV2/1-IGF Ⅰ病毒载体感染后再用含100 mmol/LD-葡萄糖的无血清培养基处理.干预24 h后应用RT-PCR和Western免疫印迹检测各组IGF Ⅰ基因和蛋白的表达情况;应用Hoechst33342荧光染色法、AnnexinV-FITC/PI双染法流式细胞仪检测细胞凋亡.观察rAAV2/1-IGF Ⅰ感染后对高糖诱导SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用.结果 成功构建rAAV2/1-IGF Ⅰ重组AAV载体.感染SH-SY5Y细胞后,RT-PCR显示SH-SY5Y能表达大鼠IGF Ⅰ基因;Western免疫印迹检测发现D组IGF Ⅰ蛋白的表达水平(0.44±0.04)显著高于其他3组(A组0.29±0.02,B组0.17+0.02,C组0.08±0.02,均P<0.05).rAAV2/1-IGF Ⅰ能明显降低高糖诱导细胞捌亡的凋亡率:Hoechst33342荧光染色检测总凋亡率分别为A组(2.71±1.03)%,B组(9.17±1.72)%,C组(25.63±1.81)%,D组(14.50±2.27)%,各组间差异均有统计学意义(P<0.05);流式细胞仪分析结果表明AnnexinV-FITC~+/PI~+的早期凋亡细胞加上AnnexinV-FITC~+/PI~+的晚期凋亡细胞的总细胞凋亡率A组为(5.01±1.17)%,B组为(9.87±1.38)%,C组为(27.56±2.25)%,D组为(17.34±2.08)%,各组间差异均有统计学意义(P<0.05).结论 rAAV2/1-IGF Ⅰ感染体外神经元SH-SY5Y细胞能显著表达IGF Ⅰ蛋白,并有效地降低高糖对神经元的诱导凋亡作用.
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腺相关病毒-乙型肝炎病毒小鼠模型的建立
目的 建立一种有效的HBV感染小鼠模型.方法 采用三质粒共转染HEK293细胞生产腺相关病毒-乙型肝炎病毒(AAV-HBV)病毒,反复冻融后密度梯度离心法纯化病毒并进行鉴定.健康成年C57BL/B6小鼠20只按随机数字法分为实验组(n=10)和对照组(n=10),实验组小鼠尾静脉注射AAV-HBV病毒,对照组小鼠注射同等剂量的AAV-GFP病毒.观察两组小鼠一般情况,不同时间点采血检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)水平,采用荧光定量PCR法、化学发光法分别进行血清HBV DNA和HBsAg定量检测.处死小鼠后获取肝脏进行病理检查,免疫组织化学法检测肝脏组织HBsAg、HBcAg表达.结果 成功获得纯化的AAV-HBV病毒,病毒纯度大于97%.AAV-HBV病毒感染小鼠一般情况良好,无异常表现,且肝功能正常.光镜下观察肝脏组织未见明显病理损伤表现,免疫组织化学检测显示肝细胞质可见HBsAg阳性表达、细胞核可见HBcAg阳性表达.AAV-HBV病毒感染小鼠血液中可稳定检测到HBV DNA和HBsAg表达.结论 成功构建了一种接近人类的,可有效、持续产生病毒的HBV感染小鼠模型.
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重组变异体二氢叶酸还原酶和绿色荧光蛋白腺相关病毒载体的构建及外源基因表达
构建携带变异体二氢叶酸还原酶(mDHFR)和绿色荧光蛋白(GFP)融合基因的重组腺相关病毒(AAV)载体,并使其在NIH3T3细胞中表达,观察NIH3T3细胞的耐药性变化.先分别扩增mDHFR和GFP基因片段,并用甘氨酸接头以PCR的方法将其连接在一起,插入T载体,酶切后插入AAV载体,包装成病毒后感染NIH3T3细胞,通过PCR、荧光显微镜和流式细胞术对融合基因的表达进行观察.结果:PCR检测到NIH3T3细胞DNA基因组中mDHFR和GFP cDNA,荧光显微镜和流式细胞仪观察到绿色荧光蛋白表达的比率约为25%,MTT法检测转基因组对MTX的耐药性增强.结论:AAV载体可以将mDHFR和GFP融合基因导入NIH3T3细胞并成功表达,使其对MTX的耐药性增强,为mDHFR基因和AAV载体在基因治疗中的应用提供了理论依据.
关键词： 腺相关病毒 变异体二氢叶酸还原酶 绿色荧光蛋白 载体构建 基因表达 -
腺相关病毒载体介导造血干细胞基因转导的策略
腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)已被广泛用作基因治疗的载体.本文就提高AAV载体在HSCs中的基因转导效率的策略综述如下.
